CN104244975A - 用于制备树突细胞疫苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于获得载有抗原之树突细胞的方法，所述载有抗原之树突细胞表现出更高的生存力以及向淋巴结迁移的能力。本发明还涉及包含所述树突细胞的疫苗及其用于治疗感染性疾病(特别是AIDS)的用途。

Description

用于制备树突细胞疫苗的方法
技术领域
本发明涉及一种用于获得载有抗原之树突细胞的方法，所述载有抗原之树突细胞表现出更高的生存力以及向淋巴结迁移的能力。本发明还涉及包含所述树突细胞的疫苗及其用于治疗感染性疾病(特别是人类免疫缺陷病毒，HIV)的用途。
背景技术
虽然组合抗逆转录病毒治疗(cART)在抑制HIV-1复制以及允许重建CD4T细胞数方面有效，但是其不能根除HIV-1。此外，cART不能恢复HIV-1特异性T细胞免疫应答。事实上，HIV-1的复制迅速回弹至与治疗前水平相近，甚至更高。结果，HIV对象不得不终身接受cART，考虑到顺应性、发展出抗病毒物质抗性的风险、价格以及副作用，这是一个特别难以负担的选择，所述副作用包括严重代谢异常，例如脂肪再分布综合征。参见Martínez E等，Lancet 2001；357：592-598。
有证据表明，针对HIV-1的强的并且特异性的CD4+辅助T细胞应答是取得持续、有效并且特异性的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的关键，而后者能够控制HIV-1在猕猴和人中的复制。这些发现与最近在小鼠模型中的慢性病毒性感染的数据一致。虽然在大多数HIV-1感染的个体中可发现分泌干扰素γ(IFN-γ)的HIV-1特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞，但是不存在CD4+T细胞的增殖性应答，同时CD8T细胞的溶细胞活性存在缺陷。一些数据表明，在HIV-1感染的对象中，树突细胞(DC)的抗原呈递细胞(APC)功能也受损，这可能导致HIV-1特异性辅助应答和CTL应答功能紊乱。
已经提出了将治疗性免疫接种作为一种方法来限制对持续的终身性cART的需求。髓样树突细胞(myeloid dendritic cell)是最有效的专职性APC，其具有诱导对CD4+T细胞和CD8+T细胞二者的初级免疫应答和次级免疫应答的独特能力。体内和体外实验数据都表明，DC能够吞噬外源可溶蛋白、肿瘤细胞裂解物、失活的病毒以及凋亡的受病毒感染细胞，对这些材料进行加工并呈递衍生的抗原肽。除了通过II类MHC通路将抗原呈递至辅助CD4+T细胞(Th)外，DC还可通过I类MHC通路将抗原呈递至细胞毒性CD8+T淋巴细胞(CTL)，这种现象称为“交叉引发(cross-priming)”或“交叉呈递(cross-presentation)”。参见Banchereau，Nature 392(1998)：245-252和Annu.Rev.Immunol.(2000)18；767-811，以及Larsson M等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.2003；276：261-275。
在人类传染病和肿瘤的实验小鼠模型中，用多种失活病原体和肿瘤抗原离体脉冲的自体髓样DC(例如单核细胞衍生的DC，MDDC)表现为诱导强效保护性免疫。一些动物研究表明，载有HIV-1病毒裂解物、包膜糖蛋白、失活病毒或纳米颗粒的DC引起强的针对HIV-1的免疫应答。
迄今，已经刊载了一些基于DC的疫苗接种对于人类HIV-1感染的临床试验。参见Kundu S等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 1998；14：551-560，Lu w等，Nat.Med.2004；10：1359-1365，García F等，J.Infect.Dis.2005；195：1680-1685，Ide F等，J.Med.Virol.2006；78：711-718，Connolly N等，Clin.Vaccine Immunol.2008；15：284-292，Gandhi R等，Vaccine 2009；27：6088-6094，Kloverpris H等，AIDS 2009；23：1329-1340，Routy J等，Clin.Immunol.2010；134：140-147，以及Garcia F等，J.Infect.Dis.2011；203：473-478。还有一些使用DC作为治疗性疫苗的临床试验正在进行。遗憾的是，可能由于所选择的免疫原、失活方法、DC的培养和脉冲条件以及疫苗的施用方案广泛变化，所报道的结果并不一致。本领域仍然需要在能增强其安全性和效力特性的标准化方法下制备的基于树突细胞的HIV-1疫苗。
发明内容
在第一个方面，本发明涉及用于获得载有抗原的树突细胞的体外方法，其包括使未成熟树突细胞在足以使所述未成熟树突细胞成熟的条件下和防止细胞附着于基底的条件下与包含所述抗原的免疫原接触。
在另一个方面，本发明涉及可通过根据本发明的方法获得的抗原脉冲的树突细胞。
在另一个方面，本发明涉及包含根据本发明的抗原脉冲之树突细胞的树突细胞疫苗。
在另一个方面，本发明涉及根据本发明的树突细胞疫苗用于医疗。
在另一个方面，本发明涉及根据本发明的树突细胞疫苗用于治疗或预防HIV感染或与HIV感染有关的疾病，其中所述免疫原是HIV免疫原。
附图说明
图1.从经治疗的HIV对象中分离的MDDC中的CD80和CD83表达水平。
图2.从经治疗的HIV对象中分离的MDDC的生存力和数量。
图3.从经治疗的HIV对象中分离的MDDC的趋化性特性。
图4.从经治疗的HIV对象中分离的MDDC的T细胞特异性HIV应答。
图5.在免疫接种和抗逆转录病毒治疗第二次中断后pVL由基线(进行任何抗逆转录病毒治疗之前)的改变。(A)中值。(B)单个值。底部的数字表示有风险的患者。在第0、8、12、24、36和48周时示出Mann-Whitney U检验的P值。曲线下面积(AUC)的P值也示出。(C)在接种疫苗8、12、24、36和48周后经治疗的HIV对象中的HIV病毒载量。针对分支(ARM)I、分支II和分支III，示出了一些周(-4、-2、0、8、12、24、36和48)的值。
图6.临床试验设计方案。对三十六位进行了抗逆转录病毒治疗的慢性HIV-1感染患者随机接受三次免疫接种，其中至少107个为用热失活的自体病毒脉冲的MD-DC(每次剂量109拷贝)。在第一次免疫接种后对患者随访48周。将第二次中断cART的那天(第二次停止)视为第0周。DC-HIV-1组在-4、-2和0周时有12位患者接受免疫接种，且在0、2和4周时有12位患者接受免疫接种。选择这两个不同的时间表以评估cART能否对免疫接种的应答产生任何影响。由于这两个时间表之间在pVL改变或HIV特异性T细胞应答方面没有观察到显著差异，所以将接受免疫接种的患者作为单个组来分析。DC对照组患者在-4、-2和0周时接受注射。
具体实施方式
本发明公开了用于用基本失活的人类免疫缺陷病毒(HIV)的裂解物脉冲单核细胞衍生之树突细胞(MDDC)的新的和有利的方法。具体地，将本发明的经脉冲MDDC培养在含有由IL-1-β、IL-6、TNF-α和PGE2构成之成熟化混合物(maturation cocktail)的超低附着烧瓶中。细胞黏着性的缺乏与培养基的组合显著提高了MDDC中成熟标志物(即，CD80、CD83)的表达，以及经脉冲MDDC的总量和生存力。本发明的方法还提高了MDDC的离体迁移能力，并改进了其向T细胞的HIV-1抗原呈递，因此有利于针对HIV-1的更高的特异性免疫应答。由此脉冲的MDDC可用作树突细胞疫苗用于人类健康。
1.一般术语和表述的定义
本文所用术语“AIDS”是指HIV感染的症状阶段，包括获得性免疫缺陷综合征(通常称为AIDS)和“ARC”或AIDS相关复合征。参见Adler M等，Brit.Med.J.1987；294：1145-1147。AIDS的免疫学表现和临床表现在本领域是公知的，包括例如因免疫缺陷导致的机会性感染和癌症。
术语“佐剂”是指在添加至免疫原性药剂中时，非特异地增强或加强暴露于该混合物后的接受者宿主对所述药剂的免疫应答的物质。
本文所用术语“IL-1受体的激动剂”是指充当白细胞介素-1受体(IL-1R)的激动剂的细胞因子。IL-1受体的激动剂包括但不限于IL-1α和IL-1β。
本文所用术语“aldrithiol-2”或“2，2′-二硫二吡啶”是指一种也称为“aldrithiol”或AT-2的化学试剂，其为温和的氧化剂，能通过优先对内部病毒体蛋白(特别是核衣壳蛋白)的半胱氨酸的游离巯基进行共价修饰来消除HIV的感染性。经AT-2失活的病毒体没有感染性，但是能够与细胞表面受体以及树突细胞相互作用。
本文所用术语“氨托沙林(amotosalen)”是指可逆地插入DNA和RNA螺旋区域的合成的补骨脂素化合物。因为氨托沙林是光活化(photoactive)化合物，需要使用长波长紫外(UVA)照明对HIV进行光化学处理。通过用320nm至400nm的UVA光照明，氨托沙林与核酸中的嘧啶碱基形成共价键。通过这种方式交联的病原体和白细胞的基因组不再具有功能，也不能进行复制。
本文所用术语“抗原”是指当引入身体时，通过免疫系统诱导特异性免疫应答(即，体液的或细胞的)的任何分子或分子片段。抗原具有结合于抗体的抗原结合位点的能力。抗原通常是蛋白质或多糖。适于本发明的抗原是细菌、病毒、寄生物和其他微生物的一部分，例如外壳、荚膜、细胞壁、鞭毛、纤毛和毒素。根据本发明的抗原的实例包括来自以下的抗原：小核糖核酸病毒、冠状病毒、囊膜病毒、黄病毒(flavirvirus)、棒状病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亚病毒、沙粒病毒、呼肠孤病毒、逆转录病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、疱疹病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)以及海绵状病毒家族；或者来自其他病原体，例如锥虫、绦虫、蛔虫、蠕虫或疟疾。适合的病毒抗原的实例非限制地有：来自人类免疫缺陷病毒(HIV)的逆转录病毒抗原，包括gag基因、pol基因、env基因和nef基因的基因产物，以及其他HIV组分；肝炎病毒抗原，例如乙肝病毒的S蛋白、M蛋白和L蛋白，乙肝病毒的前S抗原，和其他肝炎的(例如，甲肝、乙肝和丙肝，病毒组分例如丙肝病毒RNA)；流感病毒抗原，例如血凝素和神经氨酸酶，以及其他流感病毒组分；麻疹病毒抗原，例如麻疹病毒融合蛋白和其他麻疹病毒组分；风疹病毒抗原，例如E1蛋白和E2蛋白，以及其他风疹病毒组分；轮状病毒抗原，例如VP7sc和其他轮状病毒组分；巨细胞病毒抗原，例如包膜糖蛋白B和其他巨细胞病毒抗原组分；呼吸道合胞病毒抗原，例如RSV融合蛋白、M2蛋白以及其他呼吸道合胞病毒抗原组分；单纯性疱疹病毒抗原，例如立即早期蛋白、糖蛋白D以及其他单纯疱疹病毒抗原组分；水痘带状疱疹(varicella zoster)病毒抗原，例如gpI、gpII，以及其他水痘带状疱疹病毒抗原组分；日本脑炎病毒抗原，例如蛋白E、M-E、M-E-NS1、NS1、NS1-NS2A、80％E，以及其他日本脑炎病毒抗原组分；狂犬病病毒抗原，例如狂犬病毒糖蛋白、狂犬病毒核蛋白以及其他狂犬病病毒抗原组分。另一些病毒抗原实例参见Fields B，Knipe D编辑，“Fundamental Virology”，第二版(Raven Press，New York，NY，US，1991)。
本文所用术语“载有抗原的抗原呈递细胞”是指捕获了抗原并将其加工以分别呈递至与II类HLA分子和I类HLA分子缔合的CD4辅助T细胞和CD8细胞毒性T淋巴细胞的树突细胞。
本文所用术语“抗逆转录病毒治疗”或“ART”是指施用一种或更多种抗逆转录病毒药物以抑制HIV的复制。一般来说，ART包括施用至少一种抗逆转录病毒试剂(或通常施用抗逆转录病毒试剂的混合物)，例如，核苷逆转录酶抑制剂(例如齐多夫定、AZT、拉米夫定(3TC)和阿巴卡韦)、非核苷逆转录酶抑制剂(例如奈韦拉平和依法韦仑)，以及蛋白酶抑制剂(例如茚地那韦、利托那韦和洛匹那韦)。术语高效抗逆转录病毒治疗(“HAART”)是指旨在强烈抑制病毒复制以及HIV疾病进展的治疗方案，通常由三种或更多种不同药物组成，例如，两种核苷逆转录酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂。
本文所用术语“自体”意为HIV-1病毒颗粒和树突细胞的供体和受体是同一对象。
本文所用术语“细胞”等同于“宿主细胞”，旨在表示被引入了本发明的病毒基因组、载体或HIV-1病毒颗粒的细胞。应理解，该术语不仅表示特定的对象细胞，还表示该细胞的后代细胞或可能的后代细胞。由于突变或环境影响，在随后的世代中可能存在某些修饰，因此，这样的后代细胞可能事实上与亲代细胞不同，但仍然可以包括在本文所用术语的范围内。
根据普遍接受的专利实践，本文所用术语“包括”或“包含”还涵盖“由......组成”。
本文所用表述“足以成熟的条件”是指在适合于使所述细胞达到成熟的条件下培养未成熟树突细胞。成熟的适合条件是为本领域技术人员所公知的。成熟树突细胞可通过使未成熟树突细胞与有效量或有效浓度的树突细胞成熟化试剂接触来制备(即，成熟化)。树突细胞成熟化试剂可包括例如，BCG、IFN-γ、LPS、单磷酰基脂质A(MPL)、eritoran(CAS号185955-34-4)、TNF-α及其类似物。BCG的有效量通常为约105cfu至107cfu每毫升组织培养基。IFN-γ的有效量通常为约100U至1000U每毫升组织培养基。卡介杆菌(BCG)是牛分枝杆菌(M.bovis)的无毒株。本文所用的BCG是指完整BCG、以及细胞壁组分、BCG来源的脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabidomannan)，以及与诱导2型免疫应答有关的其他BCG组分。BCG任选地是失活的，例如热失活的BCG或福尔马林处理的BCG。通常使未成熟的DC与有效量的BCG和IFN-γ接触约1小时至约48小时。合适的培养基包括、RPMI 1640、DMEM或X-VIVO15TM。可在组织培养基中补充氨基酸、维生素、细胞因子(例如GM-CSF)或二价阳离子来促进细胞的成熟。通常使用约500单位/mL的GM-CSF。
本文所用表述“适合免疫原加工和通过抗原呈递细胞呈递的条件”是指在合适的介质中孵育树突细胞以使得能够捕获免疫原并加工，并将所述免疫原呈递给免疫系统的其他细胞。
本文所用术语“接触”是指在预期载入至树突细胞之免疫原存在下孵育未成熟树突细胞。未成熟的DC能够捕获并内化所述免疫原从而成为载有抗原的树突细胞(也称为抗原脉冲的树突细胞)。未成熟DC的抗原捕获是通过大胞饮作用、受体介导的抗原捕获以及对凋亡小体的内吞来介导的。优选地，所述孵育在37℃下进行6小时。抗原载入步骤或脉冲的成功可通过以下来评估：洗涤经脉冲的树突细胞以去除未捕获的免疫原，并裂解所述经脉冲的树突细胞以通过ELISA测定来测量胞内抗原含量。例如，当免疫原是HIV病毒颗粒时，可测定展示于病毒颗粒衣壳表面的p24Gag抗原的胞内含量。
本文所用的术语“树突细胞”是指在淋巴组织或非淋巴组织中发现的多样化的形态类似之细胞类型的群中的任意成员。树突细胞是一类“专职性”抗原呈递细胞，并且具有高的使HLA限制性T细胞敏化的能力。具体地，树突细胞包括例如，浆细胞样树突细胞、髓样树突细胞(通常使用的树突细胞，包括未成熟树突细胞和成熟树突细胞)、郎格汉斯细胞(作为皮肤中抗原呈递细胞的重要的髓样树突细胞)、交错突细胞(分布在淋巴结以及脾T细胞区中，并且其被认为起到将抗原呈递给T细胞的作用)。所有这些DC群都来源于髓样造血细胞。树突细胞还包括滤泡树突细胞，其为重要的针对B细胞的抗原呈递细胞，但是其并非来源于髓样造血细胞。树突细胞可通过功能或表型(特别是细胞表面的表型)来识别。这些细胞以其独特的形态(细胞表面上具有幕状突起)、中至高水平的表面II类HLA表达以及将抗原呈递给T细胞(特别是幼稚T细胞)的能力为特征。参见Steinman R等，Ann.Rev.Immunol.1991；9：271-196。树突细胞的细胞表面以表达细胞表面标志物CD1a+、CD4+、CD86+或HLA-DR+为特征。
本文所用术语“树突细胞成熟化试剂”是指这样的化合物：当用所述化合物孵育树突细胞时能够使所述树突细胞成熟。
本文所用术语“树突细胞前体”是指能够在合适的细胞因子(即，G-CSF、GM-CSF、TNF-α、IL-4、IL-13、SCF(c-kit配体)、Flt-3配体或其组合)存在下分化成未成熟树突细胞的任何细胞。树突前体细胞的实例包括但不限于髓样树突前体细胞、淋巴树突前体细胞、浆细胞样树突前体细胞以及特别是单核细胞。由多种亚群的树突前体细胞表达的表型表面标志物在本领域是公知的，并且可用于鉴定目的，例如通过流式细胞术或使用免疫组化技术。
本文所用术语“树突细胞疫苗”是指包含树突细胞的疫苗，所述树突细胞载有免疫反应所期望针对的抗原。
本文所用表述“HIV感染相关的疾病”包括对象已发展成AIDS的状态，同时也包括感染了HIV的对象未表现出任何疾病的病征或症状的状态。
本文所用表述“需要针对载于抗原呈递细胞中之抗原的免疫应答的疾病”是指能够通过施用抗原来预防或治疗的任何疾病。合适的疾病包括但不限于感染性疾病(例如HIV)和癌症。
本文所用术语“双硫仑(disulfiram)”是指也被称为或二硫化四乙基秋兰姆二硫化物的化学药剂，其是FDA批准的广泛用于治疗酒精中毒的药物。所述化合物还促使金属从HIV核衣壳蛋白锌指结构域中排出。
本文所用术语“GM-CSF”是指来自任意物种或来源的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor或granulocyte macrophage colony stimulation factor)，并且包括小鼠GM-CSF(GenBank NM 009969)和人GM-CSF(GenBank BC108724)的全长蛋白质以及蛋白质的片段或部分。在一个实施方案中，所述GM-CSF来自人或小鼠。在另一个实施方案中，所述GM-CSF蛋白与全长GM-CSF相比缺少最后10个羧基端氨基酸序列。本文所用术语“GM-CSF片段”意为GM-CSF肽的一部分，其包括能够刺激干细胞产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞的GM-CSF多肽全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。
本文所用术语“利用gp130的细胞因子(gp130utilizing cytokine)”是指通过包含gp130的受体来转导信号的细胞因子。信号转导组件糖蛋白130(gp130)也称为CD130，是形成IL-6受体家族中的I型细胞因子受体的一个亚单位的跨膜蛋白。可用于本发明的利用gp130的细胞因子(也称为IL-6样细胞因子)包括：白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素11(IL-11)、白细胞介素27(IL-27)、睫状神经营养因子(CNTF)、心肌营养蛋白-1(CT-1)、心肌营养蛋白样细胞因子(CLC)、白血病抑制因子(LIF)、抑癌蛋白M(OSM)以及卡波西肉瘤相关的疱疹病毒白细胞介素6样蛋白(KSHV-IL6)。
本文所用术语“HIV免疫原“是指来源于HIV的能够在对象中产生免疫应答的蛋白质抗原或肽抗原，并且还指HIV病毒颗粒，所述颗粒是完整的病毒颗粒或缺少一个或更多个病毒组分但保留了产生免疫应答能力的病毒颗粒。根据本发明使用的HIV免疫原可选自任何HIV分离株(例如，任何原代的或培养的HIV-1、HIV-2或HIV-3分离株、毒株或分化株)。现在HIV分离株被归类为分立的遗传亚型。已知HIV-1包含至少十种亚型(Al、A2、A3、A4、B、C、D、E、PL F2、G、H、J和K)。参见Taylor B等，New Engl.J.Med 2008；359(18)：1965-1966。已知HIV-2包括至少五个亚型(A、B、C、D和E)。B亚型与在世界范围的男同性恋以及静脉内药物使用者中的HIV流行有关。大多数HIV-1免疫原、实验室适应分离株、试剂和绘制的表位都属于B亚型。在撒哈拉以南的非洲、印度和中国这些新增HIV感染发生率高的地区中，HIV-1B亚型仅占感染的小部分，而HIV-1C亚型表现为最常见的感染亚型。因此，在某些实施方案中，可优选从特定的亚型(例如，HIV-1B亚型或C亚型)中选择免疫原。可期望在单个的免疫学组合物中包含来自多个HIV亚型(例如，HIV-1B亚型和C亚型，HIV-2A亚型和B亚型，或HIV-1、HIV-2或HIV-3亚型的组合)的免疫原。
本文所用术语“HIV-1病毒颗粒”是指约120nm直径的大致球形的结构，其由被锥形衣壳封装的两个拷贝的正单链RNA构成，所述衣壳由2,000个拷贝的病毒蛋白p24构成，所述RNA编码病毒的九个基因。单链RNA与核衣壳蛋白p7以及病毒体发育所需的酶(例如逆转录酶、蛋白酶、核糖核酸酶和整合酶)紧密结合。由病毒蛋白p17构成的基质包围衣壳以确保病毒体颗粒的完整性。即，在新形成的病毒颗粒从细胞出芽时，其进而被由两层获自人细胞膜的被称为磷脂的脂肪分子构成的病毒包膜包围。包埋于病毒包膜中的是来自宿主细胞的蛋白质，以及约70个拷贝的穿过病毒颗粒表面而突出的复合HIV蛋白。该蛋白称为Env，其由三个被称为糖蛋白(gp)120的分子构成的帽以及将该结构锚定在病毒包膜内的由三个gp41分子组成的主干组成。该糖蛋白复合物使得病毒附着于靶细胞上，并与靶细胞融合，以起始感染周期。
本文所用术语“人类免疫缺陷病毒”或“HIV”意为包括HIV-1和HIV-2。“HIV-1”意为1型人类免疫缺陷病毒。HIV-1包括但不限于胞外病毒颗粒以及与被HIV-1感染的细胞相关联的HIV-1形式。“HIV-2”意为2型人类免疫缺陷病毒。HIV-2包括但不限于胞外病毒颗粒以及与被HIV-2感染的细胞相关联的HIV-2形式。优选地，HIV是HIV-1。
本文所用术语“未成熟树突细胞”是指与成熟状态的树突细胞相比具有显著低的T细胞活化能力的树突细胞。特别地，未成熟树突细胞可具有的抗原呈递能力为低于1/2，优选低于1/4的通过添加LPS(1μg/mL)并培养两天所诱导成熟之树突细胞的抗原呈递能力。抗原呈递能力可使用例如异型(allo)T细胞活化能力(混合淋巴细胞测试)来量化：在1∶10的T细胞∶树突细胞比率下，或优选在不同的比率下，将异型T细胞和树突细胞进行共培养；在培养结束前8小时添加3H-胸腺嘧啶，并基于整合进T细胞DNA中3H-胸腺嘧啶的量来评估T细胞生长能力。参见JonuleitH等，Gene Ther.2000；7：249-254。可替选地，可通过使用肽测试诱导特异性细胞毒性T细胞(CTL)的能力来评估，其中向树突细胞添加某种抗原的已知的I类限制性肽；将树突细胞与由采集所述树突细胞的同一健康供体的外周血中得到的T细胞共培养(在第三天或更晚的时候添加25U/mL或优选100U/mL的IL-2)。优选在21天期间用树突细胞刺激T细胞三次，更优选在14天期间用树突细胞刺激两次。将所得到的效应细胞与51Cr标记的靶细胞(肽限制性的I类阳性肿瘤细胞)以100∶1至2.5∶1(100∶1、50∶1、25∶1、20∶1、12.5∶1、10∶1、5∶1或2.5∶1)的比率、优选10∶1的比率共培养4小时；量化从靶细胞释放的51Cr。参见Hristov G等，Arch.Dermatol.Res.2000；292：325-332。此外，未成熟树突细胞优选具有对抗原的吞噬能力，并且更优选示出低表达(例如比上述由LPS诱导的成熟DC显著更低)或阴性表达诱导共刺激T细胞活化的受体。未成熟树突细胞表达可用于通过流式细胞术或免疫组化染色来鉴定该类细胞的表面标志物。
本文所用术语“免疫原”是指如果将其本身注入的话能够引发适应性免疫应答的抗原。所有免疫原也都是抗原，但并非所有抗原都是免疫原。
本文所用术语“免疫原性组合物”是指在对象中引发免疫应答的组合物，所述免疫应答为针对特异性免疫原产生抗体或细胞介导的免疫应答。免疫原性组合物可制备为例如可注射物，例如液体溶液剂、混悬剂和乳剂。术语“抗原组合物”是指可被宿主免疫系统识别的组合物。例如，抗原组合物包含能够被宿主免疫系统的体液组分或细胞组分识别的表位。
本文所用术语“失活的HIV病毒”是指完整的、失活的HIV病毒。失活的HIV是指不能感染或复制的病毒。完整的失活HIV病毒一般保持天然的病毒抗原结构，以维持免疫原性，并刺激针对天然病毒的免疫应答。
本文所用术语“孵育”是指将树突细胞的培养物在成熟化介质中保持特定的时间，优选48小时，直至未成熟树突细胞转化成成熟树突细胞。术语“介质”是包含合适的培养基、一种或更多种成熟化试剂以及任选其他补充剂的成熟化基质。
本文所用术语“IL-4”是指任意物种的天然或重组的白细胞介素-4，其具有天然人IL-4(SEQ ID NO：1)的129个通常存在的氨基酸序列，以及其保持了促进Th2细胞分化、免疫球蛋白类型转换和B细胞中的抗体产生之能力的变体。参见Lee F等，US 5,017,691。IL-4的活性可通过例如免疫学方法(例如ELISA或EIA)来测量。
术语“基本失活的HIV的裂解物”是指当细胞被破坏时产生的包含HIV病毒体的溶液，其溶液经受使用化学试剂的失活方法，其中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的所述病毒失活。
本文所用术语“成熟树突细胞”是与未成熟状态的树突细胞相比对T细胞等具有显著较强的抗原呈递能力的细胞。特别地，与通过添加LPS(1μg/mL)并培养两天来诱导成熟之树突细胞的抗原呈递能力相比，所述成熟树突细胞可具有一半或更强，优选与其相等或更强的抗原呈递能力。成熟的DC显示出共刺激细胞表面分子的上调表达，并且分泌多种细胞因子。具体地，成熟的DC表达更高水平的I类HLA抗原和II类HLA抗原(HLA-A、B、C，HLA-DR)，并且对于CD80、CD83和CD86表面标志物的表达一般是阳性的。
本文所用表述“半数组织培养感染剂量”或“TCID50”意为将在50％的所接种细胞培养物中产生病理学改变的病原体的量。
本文所用术语“药剂”应被理解为包含本发明之免疫原性组合物的药物组合物，特别是疫苗。
本文所用术语“单核细胞树突细胞前体”或MoDC前体包括在其表面上具有GM-CSF受体的单核细胞，以及对GM-CSF有响应的其他髓样前体细胞。所述细胞可得自它们所存在的任何组织中，特别是淋巴组织，例如脾、髓样、淋巴结和胸腺。单核细胞树突细胞前体还可从循环系统中分离。外周血是单核细胞树突细胞前体的容易获得的来源。脐带血是单核细胞树突细胞前体的另一个来源。
本文所用术语“有效(operably)连接”旨在表示目的核苷酸序列与一个或更多个调控序列以允许所述核苷酸序列表达的方式连接(例如，在体外转录/翻译系统中，或者当载体被引入宿主细胞中时在宿主细胞中)。参见Auer H，Nature Biotechnol.2006；24：41-43。
术语“可药用载体”、“可药用稀释剂”、“可药用赋形剂”或“可药用载剂”在本文中可互换使用，表示任何常规类型的无毒的固体、半固体或液体填料、稀释剂、封装材料或制剂辅料。在所使用的剂量和浓度下，可药用载体对接受者是基本无毒的，并且与制剂的其他成分是可相容的。可药用载体的数量和性质取决于所期望的施用形式。可药用载体是已知的，并且可通过本领域公知的方法来制备。参见Faulí i Trillo C，“Tratado deFarmacia Galénica”(Ed.Luzán 5，S.A.，Madrid，ES，1993)，以及Gennaro A编辑，“Remington：The Science and Practice of Pharmacy”第20版(Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA，US，2003)。
本文所用术语“预防”意为在感染的初始阶段或早期施用本发明的免疫原性组合物或含有所述组合物的药剂以避免出现临床病征。
本文所用表述“促炎性细胞因子混合物”是指能够引起未成熟树突细胞成熟的两种或更多种细胞因子的混合物。这样的细胞因子的实例非限制地有：IL-1-β、IL-6、TNF-α、IL-18、IL-11、IL-27和IFN-α。合适的促炎性细胞因子混合物非限制地有：TNF-α与CD40L形成的混合物；IFN-α与TNF-α形成的混合物；IFN-α与CD40L形成的混合物；1FN-α、TNF-α与CD40L形成的混合物；TNF-α、IL-1-β与IL-6形成的混合物；IL-1β、TNF-α、IFN-α、IFN-γ与聚(I：C)形成的混合物；IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-α与CD40L形成的混合物。
本文所用术语“前列腺素”是指由脂肪酸酶促衍生的一组脂质化合物的成员，并且在动物体内起着重要作用。每种前列腺素含有20个碳原子，包含5-碳环。可用于本发明的前列腺素的实例非限制地有：前列环素I2(PGI2)、前列腺素E2(PGE2)和前列腺素F2α(PGF2α)。
本文所用术语“补骨脂素化合物”是指属于被称为呋喃香豆素(furocoumarin)的天然产物家族的化合物，所述呋喃香豆素是光活化化合物。所述化合物插入DNA中，并且在暴露于紫外(UVA)辐射时，优选可与基因组中的5′-TpA位点处的胸腺嘧啶形成共价的链间交联。
本文所用术语“TLR4配体”或“toll样受体4配体”是指toll样受体4(TLR4)的配体。TLR4还被称为CD284(分化簇284)，是Toll样受体家族的成员，其在病原体识别和先天免疫系统的活化方面起重要作用。
本文所用术语“TNF超家族成员”是指属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的细胞因子。TNF超家族细胞因子表示促炎性细胞因子的多功能群，其激活细胞存活、凋亡、炎性反应以及细胞分化的信号通路。TNF超家族成员的实例非限制地包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、LIGHT、CD40配体(CD40L)、4-1BB配体(4-1BBL)、APRIL、CD27配体(CD27L)、CD30配体(CD30L)、Fas配体、糖皮质激素诱导的TNFR相关配体(GITRL)、淋巴毒素α(LTα)、淋巴毒素β(LTβ)、OX40配体(OX40L)、NF-κB配体的受体激活剂(RANKL)、TNF家族的B细胞激活因子(BAFF)、TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、TNF样弱凋亡诱导物(TWEAK)以及VEG1。
本文所用术语“治疗”是指在临床病征出现之前或之后施用本发明的免疫原性组合物或包含该组合物的药剂以控制疾病的发展。对疾病发展的控制应理解为意为有益的或期望的临床结果，其包括但不限于：症状的减少、疾病持续时间缩短、病理状态稳定化(特别是避免进一步恶化)、延迟疾病的发展、改善病理状态以及缓解(部分地和完全地二者)。对疾病发展的控制还包括与未施加治疗的预期存活相比延长存活。在本发明的上下文中，术语“治疗”特别是指防止或减缓被HIV-1感染之对象中健康的CD4+T细胞的感染和破坏。该术语还指防止和减缓获得性免疫缺陷疾病的症状的发作，例如极低的CD4+T细胞数以及被机会病原体例如分支杆菌属(Mycobacteria spp)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)和隐球菌肺孢子菌(Pneumocystis cryptococcus)反复感染。有益或期望的临床结果包括但不限于，幼稚CD4+T细胞的绝对数的升高(10至3520的范围)，CD4+T细胞占总循环免疫细胞百分率的升高(1％至50％的范围)，和/或CD4+T细胞数升高(1％至161％的范围)为未被感染的对象中正常CD4+T细胞数的百分率。“治疗”还可意为与没有接受任何HIV靶向治疗之对象的预期存活相比延长被感染对象的存活。
本文所用术语“疫苗”是指用于向宿主体内施用以提供针对疾病(特别是病毒性疾病)之防护的免疫原性组合物，所述宿主可为灵长类宿主，尤其是人宿主。
本文所用术语“载体(vector)”表示线性或环状的核酸分子，其包含编码形成病毒颗粒之所有蛋白质(除了部分或完整的整合酶蛋白质)的基因组，所述基因组与为其在目的宿主细胞中的自主复制所提供的额外片段有效连接。优选地，所述载体是表达载体，其被定义为这样的载体，其除了宿主细胞中的自主复制区域外，还包含与本发明的基因组有效连接并且能够增强根据本发明的基因组产物之表达的区域。
本文所用术语“病毒颗粒”是指完整的病毒颗粒，而不是指蛋白亚基或肽。病毒颗粒(也称为病毒体)由两部分或三部分组成：由DNA或RNA构成的病毒遗传物质；保护这些基因的蛋白质外壳；以及在一些情况下，当它们处于细胞外时包围所述蛋白质外壳的脂质包膜。取决于病毒，病毒颗粒的形状为从单螺旋和二十面体形式至更复杂的结构。
2.用于体外获得载有抗原之抗原呈递细胞的方法
在第一个方面中，本发明涉及用于获得载有抗原的树突细胞的体外方法(下文中称为“本发明的第一种方法”)，其包括：使未成熟树突细胞在足以使所述未成熟树突细胞成熟的条件下并且在防止细胞附着于基底的条件下与包含所述抗原的免疫原接触。
本发明的方法包括在足以a)使抗原呈递细胞成熟，以及b)防止细胞附着于基底的条件下使未成熟树突细胞与包含抗原的免疫原接触。
在一个优选实施方案中，所述免疫原是病毒颗粒，优选HIV病毒颗粒，更优选HIV-1病毒颗粒。所述病毒颗粒可包含若干抗原。
HIV-1病毒的整个基因组表现出异常高度的遗传变异性。序列对比已鉴定了HIV-1的三个遗传群，命名为M、O和N。根据2009年分离的一株病毒，猜测存在第四群“P”。M群进一步分为系统发生相关的主要遗传亚型(或分枝)，命名为A、B、C、D、E、F、G、H、J和K。不同亚型的共感染产生流行重组型(CRF)。M群与流行亚型间重组型(CRF)一起包括了当今世界大多数的HIV-1变体。本发明的HIV-1病毒可表示能够感染人类的任何遗传群或遗传亚型，并且还包括流行重组型、实验室毒株以及原代分离株。因此，在一个优选实施方案中，免疫原是HIV免疫原。
合适的HIV免疫原包括：HIV包膜(env；例如NCBIRef.Seq.NPJ357856)、gag(例如p6、p7、p17、p24、GenBankAAD39400.1)、pol编码的蛋白酶(例如UniProt P03366)、nef(例如GenBankCAA41585.1，Shugars D等，J.Virol.1993；67(8)：4639-4650)，以及其变体、衍生物和融合蛋白。参见Gómez C等，Vaccine 2007；25：1969-1992。合适的毒株和组合可由本领域技术人员根据需要来选择。
本发明的HIV免疫原能够引发免疫应答。特别地，“免疫应答”是指CD4+T细胞或CD8+T细胞介导的针对HIV感染的免疫应答。针对HIV的免疫应答可通过测量例如以下因子来确定：病毒载量、T细胞增殖、T细胞存活、T细胞进行的细胞因子分泌或抗原特异性抗体产量(例如，抗体浓度)的增加。
所述方法的第一步是在足以使所述抗原呈递细胞成熟的条件下进行的。在一个优选实施方案中，足以使所述未成熟树突细胞成熟的条件包括与GM-CSF和IL-4的组合接触。
GM-CSF可以以100IU/mL至1500IU/mL的浓度使用，优选300IU/mL至1300IU/mL，更优选500IU/mL至1200IU/mL，例如700IU/mL至1100IU/mL，并且最优选约1000IU/mL。纯化的GM-CSF或重组的GM-CSF(例如重组人GM-CSF(R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，US)或沙格司亭(，Bayer Healthcare Pharmaceuticals，Inc.，Wayne，NJ，US))都可用于本文所述的方法。
IL-4可以以100IU/mL至1500IU/mL的浓度使用，优选300IU/mL至1300IU/mL，更优选500IU/mL至1200IU/mL，例如700IU/mL至1100IU/mL，并且最优选约1000IU/mL。
在一个优选实施方案中，两种细胞因子(GM-CSF和IL-4)都以1000IU/mL的浓度使用。
在再造用于DC成熟之生理环境的尝试中，可使用成熟化试剂的一些平衡混合物。因此，在另一个优选实施方案中，所述细胞成熟化试剂是促炎性细胞因子混合物。在一个优选实施方案中，所述促炎性细胞因子混合物至少包含IL-1受体的激动剂、利用gp130的细胞因子以及TNF超家族成员。所述细胞因子混合物可包含其他化合物。
在一个优选实施方案中，所述IL-1受体激动剂是IL-1β。优选地，有效的IL-1β浓度为300U/mL。在另一个优选实施方案中，所述利用gp130的细胞因子是IL-6。优选地，有效的IL-6浓度为1000U/mL的IL-6。在另一个优选实施方案中，所述TNF超家族成员是TNF-α。优选地，有效的TNF-α浓度为1000U/mL。
最常使用的混合物包含TNF-α、IL-1β和IL-6。因此，在一个优选实施方案中，所述促炎性细胞因子混合物包含IL-1β、IL-6和TNF-α的混合物。更优选地，所述介质的组成为：300U/mL的IL-1β、1000U/mL的TNF-α和1000U/mL的IL-6。
已公开，向促炎性细胞因子混合物中添加前列腺素改进了所生成之DC的产量、成熟、迁移和免疫刺激能力。参见Jonuleit H等，Eur.J.Immunol.1997；27：3135-3142。因此，在一个优选实施方案中，所述促炎性细胞因子混合物还包含前列腺素。更优选地，所用的前列腺素是前列腺素E2(PGE2)。优选地，有效的PGE2浓度为1μg/mL。更优选地，所述介质的组成为：300IU/mL的IL-1β、1000IU/mL的TNF-α、1000IU/mL的IL-6和1ug/mL的PGE2。
在另一个实施方案中，所述接触步骤包括第一步，其中使细胞与GM-CSF和IL-4的组合接触；以及第二步，其中使所述细胞与上述促炎性细胞因子混合物接触。在另一个实施方案中，所述接触步骤包括第一步，其中使细胞与GM-CSF和IL-4的组合接触；以及第二步，其中使所述细胞与GM-CSF和IL-4以及上述促炎性细胞因子混合物的组合接触。
本发明的第一种方法还在防止细胞附着于基底的条件下进行。如果细胞可在施加轻柔的机械力(例如轻拍烧瓶)以使弱附着的细胞分离后通过来自培养容器的上清液来收集，则该细胞被视为非黏着的。在一个优选实施方案中，使用低附着性的基底来防止细胞附着于基底。这些基底是广泛可获得的，并且通常由亲水并且电中性的水凝胶形成，从而防止细胞通过与带负电或带正电的表面蛋白质的相互作用或者疏水相互作用而附着。当基底导致单核细胞群的附着比对附着基底(例如聚苯乙烯基底)的附着低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更低，则该基底被视为低附着。用于确定表面是否是低附着的合适测定在本领域是已知的。参见Shen M等，J.Biomed.Mater.Res.2001；57：336-345。
本发明的方法使用未成熟树突细胞来进行，当与成熟化组合物接触时，其发育成成熟的树突细胞。
未成熟树突细胞可从树突细胞前体群得到。优选地，所述树突细胞前体可在四周或更短时间内分化成未成熟树突细胞的细胞，所述时间更优选20天或更短时间，甚至更优选18天或更短时间，且更优选16天或更短时间。在一个优选实施方案中，所述树突细胞前体在GM-CSF和IL-4的存在下，在小于7天内，更优选5天内，分化成未成熟树突细胞。
在一个优选实施方案中，所述树突前体细胞群是单核细胞树突细胞前体群。更优选地，所述单核细胞树突细胞前体来源于外周血单个核细胞(PBMC)。PBMC可从用缓冲盐水1∶1稀释的全血中得到，或者通过Ficoll-Paque PLUS(不含内毒素，货号17-1440-03，Amersham PharmaciaBiotech AB，Uppsala，SE)进行标准离心从白细胞浓缩物(“血沉棕黄层”级分，MSKCC血库)中得到。MoDC前体是组织培养塑料附着性的(货号35-3003，Falcon，Becton-Dickinson Labware Inc.，Franklin Lakes，NJ，US)PBMC，并且可如上所述在GM-CSF(1000IU/mL)和IL-4(500IU/mL)的存在下，在加有1％正常人血清(NHS)(或10％胎牛血清)的全RPMI 1640中进行培养，每两天更换一次培养液。参见Thurner B等，J.Immunol.Meth.1999；223：1-15以及Ratzinger G等，J.Immunol.2004；173：2780-2791。
可在培养之前用CD14+抗体从PBMC分离纯化的单核细胞群，以得到未成熟树突细胞。单核细胞通常通过染色的涂片中大的两叶核来鉴定。除了表达CD14外，单核细胞还表达一种或更多种以下表面标志物：125I-WVH-1、63D3、亲脂素(adipophilin)、CB12、CD1Ia、CD1Ib、CD15、CD54、Cdl63、胞苷脱氨酶和FIt-I。参见Feyle D等，Eur.J.Biochem.1985；147：409-419，Malavasi F等，Cell Immunol.1986；97(2)：276-285，Rupert J等，Immunobiol.1991；182(5)：449-464；Ziegler-Heitbrock H，J.Leukoc.Biol.2000；67：603-606，以及Pilling D等，PLoS One 2009；4(10)：e-7475。
一般而言，单核细胞树突细胞前体可通过标志物(例如CD13和CD33)的表达来鉴定。髓样树突前体可经CD14或CD1a通路分化成树突细胞。因此，本发明的树突前体细胞可为CD14+CD1a-树突前体细胞或CD14-CD1a+树突前体细胞。在本发明的某些实施方案中，髓样树突前体细胞可以以表达SCA-1、c-kit、CD34、CD16和CD14标志物为特征。在一个优选实施方案中，髓样树突前体细胞为CD14+单核细胞。所述CD14+单核细胞还可表达GM-CSF受体。
用作本发明第一种方法的起始材料的未成熟树突细胞可为待治疗对象自体的。在另一些实施方案中，用作本发明方法的起始材料的未成熟树突细胞是异源的树突细胞。例如，如果要治疗移植物抗宿主疾病，用作起始材料的所述未成熟树突细胞是从供体获得的树突细胞。对象可为例如小鼠、大鼠、狗、鸡、马、山羊、驴或灵长类。最优选地，所述对象是人。在一个优选实施方案中，所述未成熟树突细胞是单核细胞来源的未成熟树突细胞。
本发明的第一种方法包括：使未成熟树突细胞在足以使所述抗原呈递细胞成熟的条件下和防止细胞附着于基底的条件下与包含所述抗原的免疫原接触。结果，得到了载有抗原的抗原呈递细胞。
在孵育时间结束时得到成熟的载有抗原的树突细胞(即，携带目的抗原的成熟树突细胞)。树突细胞的成熟可通过本领域已知的方法监测。可在例如流式细胞术和免疫组化染色的测定中检测mDC表面标志物。还可通过细胞因子的产生(例如通过另一种免疫测定ELISA，或者通过使用寡核苷酸测定)来监测mDC。树突细胞的成熟可通过免疫分型来进一步确认。可例如基于选自CD80和CD86的标志物来区分未成熟树突细胞和成熟树突细胞。未成熟树突细胞这些标志物呈弱阳性，优选阴性，而成熟树突细胞呈阳性。
当在含有未成熟树突细胞群的培养物中进行本发明的方法时，足以成熟的条件使得实现至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或优选100％的未成熟树突细胞成熟。
在一个优选实施方案中，本发明的第一种方法还包括回收免疫原脉冲的树突细胞。所述回收可通过任何本领域已知的方法进行。在一个优选实施方案中，所述免疫原脉冲的树突细胞的回收通过使用对成熟树突细胞标志物特异的抗体免疫隔离(immunoisolation)来进行，例如以下的一种或更多种：CD4、CD8、CD54、CD56、CD66b和CD86。
在一个优选实施方案中，待载入树突细胞的免疫原是病毒颗粒，优选逆转录病毒颗粒。在另一个优选实施方案中，所述免疫原是慢病毒颗粒，优选HIV病毒颗粒。更优选地，所述免疫原是HIV-1病毒颗粒。
HIV-1病毒通过使用细胞表面的协同受体来与人CD4细胞结合，随后感染人CD4细胞。不同的HIV-1毒株使用不同的协同受体来进入人CD4细胞。因此，当毒株仅使用C-C趋化因子受体5型(CCR5)协同受体感染CD4细胞时，HIV-1病毒可能是CCR5向性的(CCR5-tropic)；当毒株仅使用C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)协同受体感染CD4细胞时，是CXCR4向性的；并且当毒株既能使用CCR5协同受体又能使用CXCR4协同受体感染CD4细胞时，是双向向性的(dual-tropic)。参见Whitcomb J等，Antimicrob.Agents Chemother.2007；51(2)：566-575。存在若干种可用的测定来区分不同向性的病毒(例如，MonogramBiosciences，Inc.，San Francisco，CA，US)。在一个优选实施方案中，所述HIV-1病毒选自CXCR4向性病毒和CCR5向性病毒；优选为CXCR4向性病毒。
在另一个实施方案中，所述免疫原是失活的HIV颗粒，或基本失活HIV的裂解物。可使用常规方法使病毒或其裂解物失活，例如加热、化学试剂以及光化学试剂。
失活的病毒在体外检测不到感染性。为了量化由所施加的失活方法产生的感染剂量的降低，以及为了量化在失活后的样品中仍然存在的残余感染剂量，对失活的HIV进行测定。可用于该目的的方法在本领域是已知的。参见Agrawal K等，PLoS One.2011；6(6)：e21339。所述方法包括使用失活的上清液来感染允许(permissible)细胞，然后检测新形成的病毒。所述检测可通过测量由细胞产生的HIV RNA拷贝数/mL，或者通过ELISA法来测量每毫升上清液中HIV p24抗原的量来进行。HIV p24抗原的产生的检测可例如通过在本发明的实验部分描述的ELISA来进行。
失活步骤进行足够的时间以导致相对于对照上清液(即，未用失活试剂处理的上清液，或者在类似的条件下用本应提供失活试剂的载剂处理的上清液)，所述上清液感染性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。适于评估HIV失活的方法包括但不限于，取出血液培养物，然后在T细胞介质中培养，并测量感染性。一种替选方法是在以周期性的方式(例如，每1天至7天)在进行失活尝试或处理之前和之后测定血液中存在的病毒拷贝数。
在一个实施方案中，所述免疫原是加热失活的病毒或病毒裂解物。病毒(例如HIV-1)可通过本领域已知的数种方案来加热失活。参见HarperJ等，J.Virol.1978；26(3)：646-659，Einarsson R等，Transfusion 1989；29(2)：148-152，以及Gil C等，Vaccine 2011；29(34)：5711-5724。
在另一个实施方案中，所述免疫原是化学失活的病毒或病毒裂解物。可通过用化学试剂孵育病毒来实现所述失活。在本发明的另一个方面，对病毒与化学试剂的混合物进行辐照。优选地，用紫外光辐照混合物直至病毒失活。
在一个优选实施方案中，所述化学试剂是锌指修饰性化合物。术语“锌指修饰性化合物”是指共价修饰HIV病毒体核衣壳蛋白中必需的锌指，从而使其失去感染性的化合物。这种失活模式的一个优点是，保存了病毒体表面上的蛋白质的构象完整性和功能完整性。已鉴定了多种化合物，其通过多种不同机制以共价修饰核衣壳锌指，导致配位的锌释放并失去感染性来起作用。虽然这些化合物的具体作用机制各不相同，但是其共同的机制特征涉及对组成核衣壳蛋白锌指的残基中配位锌的半胱氨酸硫进行优先化学攻击。参见Rossio J等，J.Virol.1998；72(10)：7992-8001)。
用于根据本发明方法的合适锌指修饰性化合物包括但不限于：
(i)C-亚硝基化合物，
(ii)偶氮二甲酰胺，
(iii)具有R-S-S-R结构的二硫化物，
(iv)具有以下结构的马来酰亚胺
(v)具有以下结构的α-卤代酮
(vi)具有式R-NH-NH-R的酰肼(hidrazide)，
(vii)一氧化氮以及包含NO基团的其衍生物，
(viii)铜离子以及包含Cu2+的配合物，
(ix)铁离子以及包含Fe3+的配合物，
其中R是任意原子或分子，并且X选自F、I、Br和Cl。
二硫化物化合物的实例包括但不限于以下物质：四甲基秋兰姆二硫化物、四乙基秋兰姆二硫化物、四异丙基秋兰姆二硫化物、四丁基秋兰姆二硫化物、二环戊烷亚甲基秋兰姆二硫化物、异丙基黄原酰二硫化物、O，O-二乙基二硫双-(硫代甲酸)、二硫化苯甲酰、苯甲酰甲基二硫化物、甲脒二硫化物2HCl、2-(二乙基氨基)乙基二硫化物、aldrithiol-2、aldrithio-4、2，2-二硫双(吡啶N-氧化物)，6，6-二硫烟碱二酸、4-甲基-2-喹啉基二硫化物、2-喹啉基二硫化物、2，2-二硫双(苯并噻唑)、2，2-二硫双(4-叔丁基-1-异丙基)-咪唑、4-(二甲基氨基)苯基二硫化物、2-乙酰胺基苯基二硫化物、2，3-二甲氧基苯基二硫化物、4-乙酰胺基苯基二硫化物、2-(乙氧基酰胺基)苯基二硫化物、3-硝基苯基二硫化物、4-硝基苯基二硫化物、2-氨基苯基二硫化物、2，2-二硫双(苄腈)、对甲苯基二亚砜、2，4，5-三氯苯基二硫化物、4-甲磺酰基-2-硝基苯基二硫化物、4-甲磺酰基-2-硝基苯基二硫化物、3，3-二硫二丙酸、N，N-二甲酰-L-胱氨酸、反式-1，2-二噻烷-4，5-二醇、2-氯-5-硝基苯基二硫化物、2-氨基-4-氯苯基二硫化物、5，5-二硫双(2-硝基苯甲酸)、2，2-二硫双(1-萘胺)、2，4-二硝基苯基-对甲苯基二硫化物、4-硝基苯基-对甲苯基二硫化物，以及4-氯-3-硝基苯基二硫化甲脒二硫化二盐酸化物。
在一个优选实施方案中，所述二硫化物化合物选自双硫仑或aldrithiol-2(2，2'-二硫二吡啶)。在另一个优选实施方案中，所述锌指修饰性化合物是aldrithiol-2。在另一个优选实施方案中，所述锌指修饰性化合物是双硫仑。
马来酰亚胺的一个实例是N-乙基马来酰亚胺。
酰肼的一个实例是2-(氨基甲酰硫代)-乙酸2-苯基酰肼。
在另一个实施方案中，所述失活是光化学的。在一个优选实施方案中，所述光化学失活通过使用补骨脂素化合物并在能够活化所述补骨脂素化合物的波长下辐照病毒与补骨脂素化合物的混合物来进行。
可用于失活步骤的补骨脂素类包括补骨脂素和经取代的补骨脂素，其中取代基可为烷基，特别是具有1至3个碳原子的烷基(例如甲基)；烷氧基，特别是具有1至3个碳原子的烷氧基(例如甲氧基)；以及具有1至6个碳原子、更通常地1至3个碳原子以及1至2个杂原子的经取代的烷基，其可为含氧的，特别是羟基或具有1至3个碳原子的烷氧基(例如，羟甲基和甲氧基甲基)，或者氨基，包括具有总共0至6个碳原子的单烷基氨基和二烷基氨基或氨基烷基(例如氨基甲基)。可存在1至5个、通常2至4个取代基，其通常处于4、5、8、4′和5′位，特别是4′位。
补骨脂素类的实例包括：补骨脂素；5-甲氧基补骨脂素；8-甲氧基-补骨脂素；5，8-二甲氧基补骨脂素；3-乙酯基补骨脂素；3-乙酯基-假补骨脂素；8-羟基补骨脂素；假补骨脂素；4，5′，8-三甲基-补骨脂素；别补骨脂素(allopsoralen)；3-乙酰-别补骨脂素；4，7-二甲基-别补骨脂素；4，7，4′-三甲基-别补骨脂素；4，7，5′-三甲基-别补骨脂素；异假补骨脂素；3-乙酰异假补骨脂素；4，5′-二甲基-异假-补骨脂素；5′，7-二甲基-异假补骨脂素；假异补骨脂素；3-乙酰-假异补骨脂素(seudoisopsoralen)；3/4′，5′-三甲基-氮杂-补骨脂素；4，4′，8-三甲基-5′-氨基-甲基补骨脂素；4，4′，8-三甲基-酞氨基-补骨脂素(4，4′，8-trimethyl-phthalamyl-psoralen)；4，5′，8-三甲基-4′-氨甲基补骨脂素；4，5′，8-三甲基-溴补骨脂素；5-硝基-8-甲氧基-补骨脂素；5′-乙酰基-4，8-二甲基-补骨脂素(5′-acetyl-4，8-dimethyl-psoralen)；5′-乙酰-8-甲基-补骨脂素(5′-aceto-8-methyl-psoralen)；以及5′-乙酰-4，8-二甲基-补骨脂素。在一个更优选的实施方案中，所述补骨脂素化合物是氨托沙林，优选为盐形式如氨托沙林盐酸盐(S-59)。预期没有残余氨托沙林的体内药理学作用。
UV辐照的时间将根据光强度、补骨脂素浓度、病毒浓度以及病毒接受的辐照方式而变化，其中辐照强度可根据介质而变化。辐照时间将与光强度成反比。总时间通常是至少约5分钟并且不长于约30分钟，一般为约5分钟至10分钟。
所采用的光一般具有约300nm至400nm的波长。通常，与滤波器一起使用紫外光源以除去UVB光。强度一般为约150μW/cm2至约1500μW/cm2，但是在一些情况下，可为更高强度。
可期望从辐照混合物中去除未消耗的补骨脂素或其副产物。这可通过数种标准实验室方法中的一种来容易地完成，例如在完成辐照后经过适当大小的膜透析，或者通过适当大小的中空纤维系统。替选地，可使用亲和法来去除一种或更多种低分子量材料。
3.载有抗原的树突细胞以及树突细胞疫苗
根据本发明的方法能够得到抗原脉冲的树突细胞。因此，在另一个方面，本发明涉及可通过使用根据本发明之方法得到的抗原脉冲的树突细胞。
适用于本发明的树突细胞可以是不同类型，例如，但不限于，髓样DC、浆细胞样DC、朗格汉斯氏细胞以及间质DC(insterstitial DC)。最强效的专职性APC是骨髓来源的DC。因此，在一个优选实施方案中，所述DC是髓样DC。
树突细胞可通过它们特定的细胞表面标志物特征来鉴定。该测定可通过例如流式细胞术使用常规方法和设备来实施。例如，可使用荧光激活的细胞分选(Becton Dickinson Calibur FACS，Becton-Dickinson LabwareInc.，Franklin Lakes，NJ，US)系统和市售可得到的抗体，按照本领域完备建立的方案来进行。因此，可选择在流式细胞术中对特异性的细胞表面标志物展示的信号高于背景信号的细胞。背景信号的定义为，在常规FACS分析中，由与用于检测每种表面标志物的特异性抗体相同同种型的非特异性抗体发出的信号强度。为了判断标志物的阳性，所观察到的特异性信号必须具有相对于使用常规方法和设备的背景信号强度强多于20％，优选30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、500％、1000％、5000％、10000％或以上。
树突细胞具有强的诱导和协调T细胞免疫性的能力。这使它们成为用于增强针对HIV感染的T细胞免疫性的免疫治疗策略的理想生物学药剂。因此，在另一个实施方案中，本发明涉及包含可使用根据本发明的方法得到的抗原脉冲的树突细胞的疫苗。
所述树突细胞疫苗优选是对象自体的。本文所用术语“自体”意指获得自的对象并随后将再引入同一对象的任何材料。最有效的免疫治疗疫苗利用基于自体HIV(即，每个宿主独有的准病毒种类)的抗原。迄今在抗HIV免疫治疗试验中最令人印象深刻的结果使用了载有完整的失活HIV病毒体的树突细胞，所述病毒体来源于对象的自体病毒。所述树突细胞也得自同一对象。在一个优选实施方案中，所述树突细胞制备物是对象自体的，CD4+T细胞以及CD14+单核细胞从所述对象分离。
在另一个方面，本发明涉及根据本发明的树突细胞疫苗用于医疗。
在另一个方面，本发明涉及根据本发明的树突细胞疫苗用于治疗或预防HIV感染或与HIV感染有关的疾病，其中所述免疫原是HIV免疫原。
在另一个方面，本发明涉及根据本发明的树突细胞疫苗用于制备治疗患有HIV-1感染或与HIV感染有关之疾病的对象的药剂的用途，其中所述免疫原是HIV免疫原。
在另一个方面，本发明涉及治疗患有HIV-1感染或者与HIV感染有关的疾病的对象的方法，所述方法包括将根据本发明的树突细胞疫苗施用于所述对象，其中所述免疫原是HIV。
本发明的树突细胞疫苗可为治疗性疫苗，即，给予已发展成AIDS的感染了HIV的对象以通过调节他们的免疫应答来帮助对抗该疾病的物质。作为现有针对HIV的抗逆转录病毒治疗选择的补充或替代，治疗性HIV疫苗代表有前景的策略。
本发明的树突细胞疫苗可为设计成施用于尚未发展成AIDS的已感染了HIV之对象的预防性AIDS疫苗。本发明的疫苗不是设计成防止健康对象感染HIV的预防性AIDS疫苗。
在一个优选实施方案中，将本发明的树突细胞疫苗施用于处于抗逆转录病毒治疗(ART)，优选处于高效抗逆转录病毒治疗(HAART)中的对象。在另一个优选实施方案中，将本发明的树突细胞疫苗施用于已中断抗逆转录病毒治疗的对象。
因此，所述治疗性疫苗可用于降低已被感染对象中HIV-1的复制，以及限制接种了疫苗的对象中病毒的感染性。
所述树突细胞疫苗可为自体树突细胞疫苗。因此，在一个优选实施方案中，待治疗对象是与从其分离CD4+T细胞和CD14+单核细胞的对象为同一对象。
将所述树突细胞HIV治疗性疫苗组合物再注射于所述对象。树突细胞HIV治疗性疫苗的合适递送途径是静脉内、皮下、皮内或鼻内途径。还可为不同途径的组合。
本发明的树突细胞疫苗是载有抗原的树突细胞制剂，其包含免疫原性有效量的根据本发明的基本失活HIV以及可药用载体。
在另一个实施方案中，本发明的基于树突细胞的疫苗可例如通过本领域已知的方法将载有失活的特定亚型的HIV的APC直接递送(例如，通过皮下注射器)至对象来施用。
在另一个实施方案中，用载有特定亚型之失活HIV的APC来治疗个体。首先离体使APC负载失活的HIV。然后通过任何合适的技术将经负载的APC施用于对象。优选地，通过皮下、皮内或肌内向个体注射经负载的APC，优选通过皮下注射。更优选地，通过预先从处于治疗中的对象采集PBMC样品来得到所述APC。使分离自PBMC的单核细胞(CD14+)分化成未成熟树突细胞，后者随后发育成成熟树突细胞。这样的方法在本领域是公知的。
在另一个实施方案中，失活的完整HIV与佐剂组合以诱导针对HIV-1的细胞免疫应答。合适的佐剂包括：完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂角苷、矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、复合多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、油乳剂或烃乳剂、钥孔戚血蓝蛋白、二硝基苯酚、常规细菌制品(例如霍乱毒素、热不稳定肠毒素、减毒的或杀死的BCG(卡介杆菌)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)，或BCG卡介菌衍生蛋白)、生化分子(例如TNF-α、IL-1-β、IL-6、PGE2或CD40L)，或包含CpG基序的寡聚脱氧核苷酸。先前已经公开了适用于疫苗组合物中的材料实例。参见Osol A编辑，Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.，Easton，PA，US，1980，第1324-1341页)。
可用于本发明的佐剂可为适于激活表达于树突细胞、T细胞、B细胞或其他抗原呈递细胞中及其上的病原体识别受体(PRR)的任何配体。激活核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)受体通路的配体可适用于本发明的目的。适合这些配体的佐剂可为胞壁酰二肽衍生物。激活toll样受体(TLR)的配体也可用于本发明的目的。这些受体是PRR家族的成员，并且在多种天然免疫细胞中广泛表达，包括在DC、巨噬细胞、肥大细胞和嗜中性粒细胞中。
作为激活TLR之配体的实例，可提及的有：对于TLR4，单磷酰基脂质A、3-O-脱酰基单磷酰基脂质A(3-O-deacytylated monophosphoryllipid A)、来自大肠杆菌(E.coli)的LPS、紫杉醇、RSV融合蛋白以及宿主热休克蛋白60和70；对于TLR2，脂肽例如N-棕榈酰基-S-2，3(双棕榈酰氧基)-丙基-半胱氨酰-丝氨酰-(赖氨酰)3-赖氨酸(N-palmitoyl-S-2，3(bispalmitoyloxy)-propyl-cvsteinyl-seryl-(lysil)3-lysine)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)的肽聚糖、来自结核分支杆菌(M.tuberculosis)的脂蛋白、酿酒酵母(S.cerevisiae)酵母聚糖以及高度纯化的牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)LPS；对于TLR3，dsRNA；TLR5，鞭毛蛋白；TLR7，合成化合物例如咪唑并喹啉；或者对于TLR9，某些种类的富CpG DNA。本发明的另一些有用佐剂可为T辅助表位。
本发明的疫苗可配制成药物组合物(也称为“药剂”)用于治疗慢性HIV感染个体。本发明的药物组合物优选为无菌的并且不含致热原，并且还包含可药用载体。合适的可药用载体包括水、盐水溶液(例如，生理盐水)、粘度调节剂以及其他用于配制人用药物组合物的常规药用赋形剂或添加剂。合适的药用赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲剂以及pH调节剂。合适的添加剂包括生理学上可生物相容的缓冲剂(例如氨丁三醇盐酸盐)、螯合剂(例如DTPA、DTPA-双酰胺)或钙螯合物(例如DTPA钙、CaNaDTPA-双酰胺)，或者任选地添加钙盐或钠盐(例如氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙)。本领域技术人员能够配制本发明的药物组合物。参见Gennaro，2003，同上。
可通过主动疗法的细胞免疫应答减轻之慢性HIV感染个体的治疗的典型方案包括：施用有效量的上述疫苗组合物，可作为单次治疗施用，或在长达并包括1周至约24个月的时间段内重复施用，伴有或不伴有增强剂量或加强剂量。
根据本发明，本发明的基本失活的HIV或免疫原性组合物的“免疫原性有效量”是足以使对象产生特异性的并且充足的免疫学应答从而向对象提供针对随后HIV暴露之保护的量。在这种情况下，有效量引起针对HIV的细胞应答或体液应答，优选细胞免疫应答。
所述免疫原性有效量导致减轻一种或更多种病毒性病症之症状，或防止病毒性疾病的发展，或者使疾病消退或降低病毒的传播。例如，免疫原性有效量优选是指治疗剂的这样的量：使传播速率降低、HIV病毒载量降低或受感染细胞数降低至少5％，优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多。针对HIV，免疫原性有效量还指治疗剂的这样的量：使CD4+细胞数升高、发展成AIDS的时间增加或存活时间增加至少5％，优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多。
应理解，所述有效剂量将取决于接受者的年龄、性别、健康状况和体重、共同进行的治疗种类(如果有的话)、治疗频率以及期望效果的性质。最优选剂量将根据个体对象而制定，这是本领域技术人员不需要过多实验就能理解和确定的。参见Gennaro，2003，同上。
本发明的治疗效力可通过不同方法来评估，例如，通过监测被感染对象血液中的病毒载量和CD4+T细胞数，或通过测量细胞免疫。
对血液中的病毒载量和CD4+T细胞数的监测通过标准方法来进行。如果该疫苗是有效的，则病毒载量应存在大于或等于1的对数降低，优选应当在治疗开始后的2至4周内达到低于10,000拷贝/mL HIV-RNA。如果病毒载量实现了小于0.5倍的对数降低，或HIV-RNA处于100,000以上，则应通过添加药物或更换药物来调节该治疗。如果对象的临床状况稳定，则应每4至6个月重复一次病毒载量测量。如果病毒载量回到治疗前水平的0.3至0.5倍的对数，则该治疗不再有效，应当改变。在治疗开始的2至4周内，CD4+T细胞数应增加至少30个细胞/mm3。如果达不到这点，则应当改变治疗。在临床稳定期间，应当每3至6个月监测一次CD4+T细胞数，且如果发生的是有症状的疾病，则应更频繁。如果CD4+T细胞数降至基线(或低于治疗前升高的50％)，则应当改变治疗。
为了测量细胞免疫，使用来自淋巴组织的富含CD4+T细胞和CD8+T细胞的细胞悬液通过细胞因子特异性ELISPOT测定来量化抗原特异性的T细胞应答。参见Wu S等，1995，1997，同上。这样的测定可测量分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IFN-γ的抗原特异性T细胞的数目。所有ELISPOT测定都通过使用市售可获得的捕获mAb和检测mAb(R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，USA；BD BiosciencesPharmingen，San Diego，CA，USA)来进行。参见Wu S等，1995，1997，同上；Shata M，2001，同上。每种测定包括促细胞分裂原(motogen)对照(Con A)和卵白蛋白对照。
在本发明上下文中，“HIV抗原”是能够在对象中产生免疫应答的完整的失活HIV病毒。所述免疫应答可为抗体的产生或细胞介导的针对该病毒的免疫应答。
特别地，“免疫应答”是指CD8+T细胞介导的针对HIV感染的免疫应答。针对HIV的免疫应答可通过测量以下数种参数中的任一种来测定：例如病毒载量、T细胞增殖、T细胞存活、T细胞进行的细胞因子分泌或抗原特异性抗体产量的增加(例如抗体浓度)。
因此，本发明的免疫原性组合物可用于预防HIV感染或在受感染个体中减缓发展成AIDS。包含由在化学物质明确、不含蛋白质的培养基中生长的HIV产生的HIV抗原的组合物以及使用该组合物的方法可用于引发特异性针对保守HIV表位的强效的Th1细胞免疫应答和体液免疫应答，引发HIV-特异性CD4辅助T细胞，HIV特异性细胞毒性T淋巴细胞活性，刺激产生趋化因子和细胞因子，例如β-趋化因子、IFN-γ、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素15(IL-15)或者α-防御素，以及增加记忆细胞。这样的疫苗可通过多种施用途径来施用。这样的疫苗可用于防止HIV的母婴传播，用于新生儿、儿童以及高风险个体的疫苗接种，以及用于受感染个体的疫苗接种。这样的疫苗可任选包含免疫聚体(immunomer)或免疫刺激序列(ISS)以增强针对HIV抗原的免疫应答。这样的疫苗还可与其他HIV治疗组合使用，包括采用核酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂以及阻断病毒(例如T20)之进入的药剂的多种组合的抗逆转录病毒治疗。参见Baldwin C等，Curr.Med.Chem.2003；10：1633-1642。
当施用于没有感染之临床病征的对象时，本发明的免疫原性组合物可具有预防活性，因为它们能够防止疾病的发作。
HIV免疫原性组合物与HIV感染或AIDS症状有关的有益预防性或治疗性效果包括例如：防止或延缓暴露于HIV之个体的初始感染；降低感染了HIV的个体中的病毒负荷；延长HIV感染的无症状阶段；在通过抗逆转录病毒治疗已降低了病毒水平的感染了HIV之对象中维持低的病毒负荷；在初次用药(drug naive)对象和经ART治疗过的对象中提高CD4T细胞水平或减少CD4T细胞的降低，所述CD4T细胞既有HIV-1特异性的也有非特异性的；提高患有AIDS个体的总体健康状况或生活质量；以及延长患有AIDS个体的预期寿命。临床医生可将免疫法的效果与治疗前对象的状况进行比较，或与未经治疗对象的预期状况进行比较，来确定所述治疗是否对抑制AIDS有效。
在一个优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物可为预防性组合物。
本发明的免疫原性组合物可用于治疗HIV-1感染。虽然所有可被HIV-1或其同类物感染的动物都可通过这种方式治疗(例如，黑猩猩、猕猴、狒狒或人)，但是本发明的免疫原性组合物特别针对其在人中的治疗用途。通常而言，需要超过一次的施用来获得期望的治疗效果；可通过标准的临床方法来建立精确的方案(剂量和频率)。
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上文提到的所有出版物均通过引用以其整体并入本文。
虽然为了清楚和理解的目的一定程度地详细描述了前述发明，但是本领域技术人员将从对本公开内容的阅读中理解，可进行形式和细节上的多种变化而不脱离本发明及所附权利要求的真正范围。
实施例
一般方法
1.自体HIV的分离和扩增
从HIV阳性供体对象抽取新鲜血液，并储存于装有ACD(酸性柠檬酸葡萄糖)、CPD(柠檬酸磷酸葡萄糖)或EDTA(乙二胺四乙酸)作为抗凝剂的管中。然后通过Ficoll密度梯度(Accuspin，Sigma-Aldrich Corp.，Saint Louis，MO，US)从血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。根据制造商的方法通过CD14抗体磁性微珠系统(CD14Microbeads，Miltenyi Biotech GmbH，BergischGladbach，DE)从PBMC中选择CD14+单核细胞。然后，根据制造商的方法通过CD4抗体磁性微珠系统(CD4Microbeads，Miltenyi Biotech GmbH，Bergisch Gladbach，DE)从剩余溶液(PBMC-CD14(-))中分离CD4+T细胞。最后，将CD14+单核细胞和CD4+T细胞混悬于补充有10％人AB血清的不合造血细胞的X-VIVO15血清培养基(BioWhittaker Inc.，Walkersville，MD，US)中。
2.CD4+T细胞与MΦ共培养
用CD3(Orthoclone，Janssen-Cilag，Johnson&Johnson，New Brunswick，NJ，US)和IL-2(18.00IU×106，，PrometheusLabs.，San Diego，CA，US)活化前一步骤的CD4+T细胞。使CD14+单核细胞分化成巨噬细胞。然后，将CD4+T细胞与巨噬细胞共培养。
在开始共培养CD4+T细胞与巨噬细胞之前5至7天，开始用CD3活化CD4+T细胞的方法。首先，用5μg/mL CD3的DPBS(即杜氏(Dulbecco，s)磷酸盐缓冲盐水)溶液预处理培养烧瓶，并在水平位置于37℃孵育至少2小时，以使CD3抗体附着于烧瓶壁上。接着弃掉溶液，并用DPBS洗涤烧瓶两次。然后，将从PBMC得到的CD4+T细胞重悬于离体活化培养基中，所述培养基由补充有10％人AB血清和100U/mLIL-2的X-VIVO 15介质组成。在先前用CD3活化的烧瓶中，将所述悬液在水平位置于37℃和5％CO2下孵育约24小时至48小时。
在共培养开始之前五天，结束用CD3活化CD4+T细胞，并添加新鲜的IL-2。简略而言，将预活化的CD4+T细胞重悬在培养基中，并用DPBS洗涤两次。然后，以106细胞/mL将细胞重悬在不含CD3的活化介质(X-VIVO 15+10％人AB血清+100U/mL IL-2)中，并在竖直位置于37℃和5％CO2下在烧瓶中再孵育3至5天，以完成CD4+T细胞增殖。
在共培养CD4+T细胞与巨噬细胞之前的5至7天还开始使CD14+单核细胞向巨噬细胞分化。将从PBMC分离的CD14+单核细胞重悬于离体培养基中，所述培养基由补充有10％人AB血清的X-VIVO 15介质组成。在竖直位置于37℃和5％CO2下，在ULA烧瓶(，Cultek SUL，Barcelona，ES)中孵育该悬液5至7天，以得到成熟的巨噬细胞。
抽取血液后的5至7天之间开始共培养CD4+T细胞与巨噬细胞。在ULA烧瓶中共培养CD4+T细胞与巨噬细胞，其中发生CD14+单核细胞的分化。在由补充有10％人AB血清的X-VIVO15介质构成的培养基中以1∶1的CD4+T细胞∶巨噬细胞关系和106细胞/mL的密度开始共培养。当CD4+T细胞数低而不能使共培养物为1∶1(CD4+T细胞∶巨噬细胞)时，可通过调节介质来使共培养物为1∶10或1∶100(CD4+T细胞∶巨噬细胞)，以使共培养物中的细胞密度达到106细胞/mL。如果需要，添加IL-2以使共培养物中的IL-2终浓度为100IU/mL。在竖直位置于37℃和5％CO2下孵育烧瓶7至60天，优选7至21天。用于分离和产生病毒的CD4+T细胞与巨噬细胞的共培养最短为7天，并且可延长至48至60天。当建立共培养后，必须每7天换一次介质。
在共培养期间监测病毒培养物以分析病毒产量，其通过在细胞共培养的第7、14、21天等时间通过ELISA(Ag，Innogenetics NV，Ghent，BE)测试上清液的HIV-1p24抗原产量/mL上清液以及通过实时RT-PCR(PCR Real Time COBAS TAQMAN HIV-1Test，v1.5，Roche DiagnosticsInc.，Indianapolis，IN，US)测试HIV-1RNA拷贝数/mL上清液来进行。
该方法使得在第7天，可从具有＞500CD4和4倍对数拷贝的HIV-1RNA/mL血浆的HIV-1阳性对象产生微克级的HIV-1p24抗原/mL上清液。
3.HIV的热失活
在先前公开的方案之后，使含在步骤2之上清液中的HIV热失活，以得到基本失活的HIV的裂解物。参见Gil，2011，同上。
a)停止cART的供体对象
通过使用热混合器(model AG 22331，EppendorfAG，Hamburg，DE)在56℃下以750rpm进行30分钟的伴随搅动的热处理来使数个包含HIV的CD4+T细胞与MΦ共培养物上清液的10mL等分试样失活。通过使用无菌离心过滤单元(VivaSpin 20，300kDa，model VS2051，Sartorius AG，，DE)在21℃下以6000×g超滤60分钟对热失活的上清液进行浓缩。对于每个供体对象，需要多个VivaSpin 20过滤器来进行浓缩，合并的上清液总体积为约80mL。使用生理盐水溶液洗涤离心过滤浓缩物(21℃，6000×g，60分钟，三次)。合并由每个离心过滤器回收的0.5mL终体积，并在4℃下以15,000×g离心(CH 007466rotor and HeraeusMultifuge 1LR，Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，US)2小时。将沉淀(pellet)重悬并合并在1mL生理盐水溶液中，并分成5个各自为0.2mL的免疫原等分试样。将溶液冻存于-80℃下待用。
b)处于cART中的供体对象
通过使用热混合器(model AG 22331，Eppendorf AG，Hamburg，DE)在搅动下在56℃下以750rpm进行30分钟伴随搅动的热处理来使数个包含HIV的CD4+T细胞与MΦ共培养物上清液的10mL等分试样失活。热失活的上清液通过超速离心而不是如前一步中的超滤来进行浓缩。使用T1250fiberlite转子在无菌异质同晶聚合物瓶(model S5083，SetonScientific Inc.，Petaluma，CA，US)中于4℃下，以100,000×g超速离心32分钟，然后使用F45L-24X1，5fiberlite转子和Sorvall WX Ultra 80离心机(Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，US)在4℃下和无菌1.5mL管(model 357448，Beckman Coulter Inc.，Brea，CA，US)中以192,000×g再超速离心10分钟来对上清液进行浓缩。将最后的沉淀合并到1mL生理盐水中，并分成各自为0.2mL的5个免疫原等分试样。将溶液冻存于-80℃下待用。
4.HIV化学失活
根据本领域已知的方法使用化学试剂使含在步骤2之上清液中的HIV失活，以得到基本失活的HIV的裂解物。参见2011年11月22日提交的EP 11382358.7。使用以下化学试剂：
a)Aldrithiol-2(2，2′-二硫二吡啶)
根据本领域已知的方案，用aldrithiol-2(2，2′-二硫二吡啶)(AT-2，，货号143049，Sigma-Aldrich Corp.，Saint Louis，MO，US)来处理10mL含有HIV的CD4+T细胞与MΦ的共培养物上清液。参见，Rossio J等，J.Virol.1998；72(10)：7992-8001以及Arthur L等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 1998；Suppl 3：S311-S319。在连续搅拌下，将上清液与1mM AT-2一起在37℃下孵育2小时或在4℃下孵育24小时。
b)双硫仑
根据Chertova E.等，Preparation of inactivated autologous subjectderived HIV-1for therapeutic vaccination，HIV Immunobiology：FromInfection to Immune Control(X4)2009，Keystone，Colorado，US，用双硫仑(，Odyssey Pharmaceuticals Inc.，East Hanover，NJ，US)处理10mL含有HIV的CD4+T细胞与MΦ的共培养物上清液。将上清液与0.3mM双硫仑一起在37℃下孵育3小时。
c)偶氮二甲酰胺
向由先前步骤得到的含有HIV的上清液添加第一量的偶氮二甲酰胺(ADA)(HPH116，CAS号123-77-3)，以使病毒失活，并在37℃下孵育2小时。通过向溶液添加第二量的偶氮二甲酰胺来进一步增强该失活。将溶液孵育2小时，从而完成总时间为4小时的孵育。然后，对溶液进行离心以得到第一沉淀。将第一沉淀溶解于生理盐水溶液中。对所得的溶液进行超速离心以得到第二沉淀。再将第二沉淀溶解于生理盐水溶液中以得到失活HIV的浓缩物。
d)氨托沙林
向由先前步骤得到的含有HIV的上清液添加第一量的氨托沙林(AMT HCl，CAS号161262-45-9，，CerusCorp.，Concord，CA，US)，并孵育30分钟。用紫外辐射处理溶液以使病毒失活。然后，对溶液进行超速离心以得到第一沉淀。将第一沉淀溶解于生理盐水溶液中。对所得的溶液进行离心以得到第二沉淀。再将第二沉淀溶解于生理盐水溶液中以得到失活HIV的浓缩物。
5.质量控制
为了计算病毒储液的半数组织培养感染量(TCID50)并量化由失活方法导致的感染性降低和在失活方法后样品中剩余的残留感染性，在PBMC中进行滴定HIV的测定。
首先，从健康供体获取新鲜血液，并储存于装有ACD(酸性柠檬酸葡萄糖)、CPD(柠檬酸磷酸葡萄糖)、EDTA(乙二胺四乙酸)或肝素作为抗凝剂的管中。在开始滴定前三天，通过Ficoll密度梯度从血液中分离PBMC。HIV-1、HBsAg和HCV抗体以及HCV PCR都为阴性。接着，通过在CO2孵育器中在含有5μg/mL植物血凝素的RPMI基础培养基(RPMI 1640+20％胎牛血清+抗生素)中于37℃孵育细胞1至3天，用植物血凝素磷酸盐PHA-P(Sigma-Aldrich Corp.，Saint Louis，MO，US)使PBMC活化。
然后，将之前用植物血凝素刺激的细胞重悬于病毒培养基(RPMI1640+10IU/mL IL-2+20％胎牛血清+抗生素)中。对200μl浓缩并在生理盐水溶液中稀释至1/15稀释度的失活的自体HIV-1进行分析。所述稀释度与将用于脉冲树突细胞的稀释度相等。此外，在病毒培养基((RPMI1640+10IU/mL IL-2+20％胎牛血清+抗生素)中分析200μl未失活并且未浓缩的自体HIV-1。细胞与病毒稀释物一起在37℃，CO2下孵育过夜。
使用氨托沙林、双硫仑、aldrithiol-2或偶氮二甲酰胺的失活方法不影响p24蛋白的构象。因此，在感染后，洗涤经病毒孵育的细胞，弃掉上清液中多余的p24蛋白，并使其与感染后产生的新产物区分。然后，在37℃、CO2下将重悬于病毒培养基中的细胞再孵育10至11天。在第5天或第6天更换培养基。
通过ELISA(HIV-1p24抗原-ELISA，货号K1048，Innogenetics NV，Gent，BE)测定抗原p24。上清液样品是阳性还是阴性的推断标准基于来自用来检测p24抗原的试剂盒的HIV p24抗原标准对照的结果，其具有22pg/mL的平均灵敏度。
因此，当[(实验孔(problem well)中的OD Ag p24)-(对照孔p24背景中的OD Ag p24)]大于22pg/mL对照所对应的OD时，培养物的上清液被定性为阳性。当[(实验孔中的OD Ag p24)-(对照孔p24背景中的ODAg p24)小于或等于22pg/mL对照所对应的OD时，培养物的上清液被定性为阴性。OD：光密度。
根据公式来计算TCID50：
M＝xk+d[0.5-(1/n)(r)]
其中
xk＝最高稀释度的剂量
r＝阴性反应的总和
d＝稀释度之间的间距
n＝每种稀释度的孔数
然后，通过浓缩系数(CF)来校正TCID50值。参见G，Arch.Exper.Pathol.Pharmakol.1931；162：480-483以及Spearman C，Br.J.Psychol.1908；2：227-242。
实施例1
单核细胞衍生的树突细胞(MDDC)的离体产生
从携带HIV的供体对象抽取150mL新鲜血液。然后通过Ficoll密度梯度(Accuspin，Sigma-Aldrich Corp.，Saint Louis，MO，US)从血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。所得的溶液以1200rpm离心5分钟。
将悬液分成18mL的等分试样。将这些等分试样倒入处于水平位置的75cm2的附着培养烧瓶(Corning Inc.，Corning，NY，US)中，并放置于37℃的具有潮湿的5％CO2气氛的孵育器中2至3小时。通过抽吸分离未附着的细胞(淋巴细胞)。附着的细胞大部分是单核细胞。
用15mL在37℃下预热过的X-VIVO10(cGMP，Biowhittaker Inc.，Walkersville MD，US)洗涤附着的细胞(单核细胞层)4次。小心搅拌溶液以在不去除附着的单核细胞的情况下去除因重力沉积而可能存在的淋巴细胞污染物。
然后弃掉溶液上清液。以3至4×106细胞/mL的浓度将细胞重悬于由补充有1％失活的自体血清、庆大霉素(50μg/mL，货号636183，B.Braun Medical S.A.，Barcelona，ES)、二性霉素(2.5μg/mL，货号760645，Bristol-Myers Squibb SL，Elche，ES)以及AZT(1μM，，GlaxoSmithKline plc，London，GB)的X-VIVO15(cGMP，BiowhittakerInc.，Walkersville MD，US)构成的介质(“基础培养基)中。
附着的单核细胞在同一烧瓶中培养5天。18mL由补充有1％失活的自体血清、庆大霉素(50μg/mL，货号636183，B.Braun Medical S.A.，Barcelona，ES)、二性霉素(2.5μg/mL，货号760645，Bristol-Myers SquibbSL，Elche，ES)以及AZT(1μM，，GlaxoSmithKline plc，London，GB)的X-VIVO15(cGMP，Biowhittaker Inc.，Walkersville MD，US)构成的介质(“基础培养基)。还向每个烧瓶中添加1000IU/mL IL-4和1000IU/mL重组人(rh)GM-CSF(cGMP quality CellGenix GmbH，Freiburg，DE)。每两天以相同浓度向培养物添加IL-4和GM-CSF。
在培养5天后，通过用15mL X-VIVO10洗涤烧瓶4次来收集MDDC，以利于去除仍然附着在底部的MDDC。将MDDC收集于50mL的管中，并用50mL X-VIVO10通过离心(2000rpm，5分钟)洗涤两次。将MDDC沉淀重悬于10mL X-VIVO10中，并储存于4℃下待用。分离200μl等分试样用于质量控制。
实施例2
在具有附着表面的烧瓶中进行自体MDDC的成熟并
用失活的HIV-1进行脉冲
培养5天后，将1050万在实施例1中得到的MDDC以2000rpm离心5分钟。将沉淀重悬于2.8mL基础介质中。参见实施例1。添加0.2mL先前已经用X-VIVO15介质重悬的失活HIV的等分试样，其包含＞108拷贝的HIV-1RNA。将细胞置于处于竖直并轻微倾斜位置的75cm2的具有附着表面的培养烧瓶上。向每个烧瓶添加1000IU/mL IL-4和1000IU/mL重组人(rh)GM-CSF(cGMP quality CellGenix GmbH，Freiburg，DE)，并在37℃下孵育细胞。
孵育后，添加22mL基础培养基，其伴有1000IU/mL的GM-CSF和IL-4以及含有分别为每毫升1000IU、1000IU和300IU的细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1-β(cGMP quality，CellGenix GmbH，Freiburg，DE)的成熟化混合物。在所述介质中再培养细胞44小时。
培养48小时后，取脉冲的MDDC的等分试样用于质量控制，其包括：有活力的成熟细胞计数、确定生存的百分比、免疫分型以及通过革兰氏染色进行微生物学对照。
将细胞在补充有1％药用人白蛋白的临床盐水溶液中洗涤三次：通过以2000rpm离心5分钟和将细胞沉淀重悬于临床盐水溶液中的顺序循环。将细胞重悬于0.5mL所述溶液中。
实施例3
在超低附着的烧瓶中进行自体MDDC的成熟并
用失活的HIV-1进行脉冲
培养5天后，将1050万MDDC以2000rpm离心5分钟。将沉淀重悬于2.8mL基础介质中。参见实施例1。添加0.2mL先前已经用X-VIVO15介质重悬的失活HIV的等分试样，其包含＞108拷贝的HIV-1RNA。将细胞置于处于竖直并轻微倾斜位置的75cm2的具有超低附着表面的培养烧瓶(，货号153814，Cultek，SLU，Madrid，ES)上。向每个烧瓶添加1000IU/mL IL-4和1000IU/mL重组人(rh)GM-CSF(cGMP quality CellGenix GmbH，Freiburg，DE)，并用处于轻微倾斜位置的烧瓶在37℃下孵育细胞2至4小时。
孵育后，添加22mL基础培养基，其伴有1000IU/mL的GM-CSF和IL-4以及含有浓度分别为每毫升1000IU、1000IU和300IU的细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1-β的成熟化混合物。在所述介质中以水平位置再培养细胞44小时。
培养48小时后，取脉冲的MDDC的等分试样用于质量控制，其包括：有活力的成熟细胞计数、确定生存的百分比、免疫分型以及通过革兰氏染色进行微生物学对照。
将细胞在补充有1％药用人白蛋白(Grifols，SA，Barcelona，ES)的临床盐水溶液中洗涤三次：通过以2000rpm离心5分钟和将细胞沉淀重悬于临床盐水溶液中的顺序循环。将细胞重悬于0.5mL所述溶液中。
实施例4
PGE2以及使用超低附着烧瓶对MDDC成熟的影响
培养5天后，将1050万MDDC以2000rpm离心5分钟。将沉淀重悬于2.8mL基础介质中。参见实施例1。添加0.2mL先前已经用X-VIVO15介质重悬的失活HIV的等分试样，其包含＞108拷贝的HIV-1RNA。将细胞置于处于竖直并轻微倾斜位置的75cm2的具有超低附着表面的培养烧瓶(，货号153814，Cultek，SLU，Madrid，ES)上。向每个烧瓶中添加1000IU/mL IL-4和1000IU/mL重组人(rh)GM-CSF(cGMP quality，CellGenix GmbH，Freiburg，DE)，并用处于轻微倾斜位置的烧瓶在37℃下孵育细胞2至4小时。
孵育后，添加22mL基础培养基，其伴有1000IU/mL的GM-CSF和IL-4以及含有浓度分别为每毫升1000IU、1000IU、300IU和1μg的细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1-β和PGE2的成熟化混合物。在所述介质中以水平位置再培养细胞44小时。
在48小时的培养后，取脉冲的MDDC的等分试样用于质量控制，其包括：有活力的成熟细胞计数、确定生存的百分比、免疫分型以及通过革兰氏染色进行微生物学对照。
将细胞在补充有1％药用人白蛋白(Grifols，SA，Barcelona，ES)的临床盐水溶液中洗涤三次：通过以2000rpm离心5分钟和将细胞沉淀重悬于临床盐水溶液中的顺序循环。将细胞重悬于0.5mL所述溶液中。
进行实验以评估向成熟化混合物中添加PGE2是否提高HIV阳性对象的MDDC中的成熟标志物CD80和CD83(有PGE2或没有PGE2，超低附着烧瓶和IL-15)。参见图1。在成熟后通过流式细胞术分析细胞。用特异针对相应簇(cluster)的抗体来评估标志物CD80和CD83的荧光强度。与不存在PGE2时相比，用细胞因子和PGE2混合物的成熟诱导了更高数量的CD80(高近2倍)和CD83(高近1.5倍)标志物。组合使用抗附着烧瓶和向成熟化混合物添加PGE2在成熟、生存力、产率和总免疫原性效力方面相当大程度地改进了终产物(mDC)的质量，因为脉冲的有活力细胞的更高数目与更强的免疫应答相关联。参见图1和2。令人印象深刻的是，使用抗附着烧瓶(超低附着烧瓶)使所得的mDC的量提高了3倍。通过应用Mann-Whitney非参数统计函数检验，在几种方法(用或没用超低烧瓶、PGE2和IL-15)与阶段II方法之间观察到显著差异(p＜0.05)。参见图2。
MDDC必须表达CCR7受体等，以使它们能够在成熟后迁移至淋巴结。这是通过数种细胞因子(即，CCL19、CCL21)的作用实现的，所述细胞因子与CCR7受体结合并将MDDC吸引至淋巴结。
为了评估使用了或未使用PGE2得到的成熟MDDC的迁移能力，在transwell板(Corning Inc.，Corning，NY， US)中进行离体迁移测定。简言之，用含有或不含PGE2的细胞因子混合物诱导4个HIV阳性对象的MDDC成熟。使所述MDDC(50,000每孔)在孔的上部隔室沉积。MDDC培养基用作阴性对照，同时在MDDC培养基中使用CCL19来评估特异性迁移。使CCL19趋化因子在下部隔室沉积，并用5μm的膜使之与上部隔室分隔。在孵育3小时后，收集迁移至下部隔室的MDDC，并通过流式细胞术来量化(60秒)。通过使用针对未配对数据的学生T统计函数，观察到在这两种方法之间存在显著差异(p≤0.005)。当使用含有PGE2的细胞因子混合物时，CCL19介导的迁移更多。参见图3。
用来源于具有HIV特异性T细胞应答的HIV阳性对象的MDDC进行额外实验来评价通过这两种方法得到的成熟MDDC是否能够促进特异性细胞应答。用HIV Bal病毒脉冲MDDC。然后，用含有或不含PGE2的细胞因子混合物诱导它们成熟。成熟后，洗涤细胞4次，并使其在96孔板中与自体T细胞(来自同一对象)接触。通过测量MDDC与淋巴细胞共培养物上清液中由淋巴细胞分泌的IFN-γ得到针对HIV的特异性应答。通过使用针对未配对数据的学生T统计函数，观察到在这两种方法之间存在显著差异(p≤0.01)。参见图4。与不用PGE2相比，用细胞因子加PGE2混合物诱导成熟的MDDC引发更强的针对HIV的特异性应答。
实施例5
在停止cART的对象中用失活HIV-1脉冲的MDDC进行疫苗接种
将进行了成功cART并且具有＞450细胞/mm3CD4+的36个对象随机化成盲方案(2∶1)以接受：分支1(案例组或DC-HIV-1)：用使用约109自体失活的HIV-I病毒体脉冲的外周血MDDC(107细胞)每两周进行一次免疫接种(总共三次)(n＝24)；或分支2(DC安慰剂分支或DC对照)：未脉冲的DC(n＝12)。参见图6。将中断cART的那天认作W0。初级终点是安全性、当与任何cART之前的基线vs中断cART后第12周和第24周相比时，病毒载量的改变以及病毒载量降低了≥1log10的对象比例的改变。第二终点是每个方案规定的需要重启cART的对象比例(在相隔15天的至少2次测定中CD4T细胞降至300细胞/mm3以下)，CD4细胞数的改变和HIV-1特异性应答的改变。
所述树突细胞疫苗耐受性良好，没有任何显著的副作用。与cART前的水平相比，病毒载量的平均降低在案例组和对照中分别是：第12周-1.0对-0.46log10，以及第24周-0.86对-0.22log10(p＝0.04和p＝0.03)。在第12周和第24周，分别在案例组和对照中的10/22(45％)对2/11(18％)以及7/20(35％)对0/10(0％)个对象中观察到≥1log的病毒载量降低(p＝0.10，p＝0.03)。在曲线下面积(auc)分析中，观察到免疫接种的对象和对照对象之间在病毒载量改变方面存在显著差异(分别为-0.72对-0.33，p＝0.05)。参见图5C。
分支1(DC-HIV-1，12个对象)和分支3(DC-HIV-1，12个对象)融合的曲线重新解释了实施例5的结果。曲线分支2仍然为对照(DC-对照，12个对象)。总计36个对象。(参见www.ScienceTranslationalMedicine.org，2013年1月2日，第5卷，166期，166ra，1-9页的出版)。还参见图5A和5B。

Claims (25)

1.一种用于获得载有抗原的树突细胞的体外方法，其包括：使未成熟树突细胞在足以使所述未成熟树突细胞成熟的条件下并且在防止细胞附着于基底的条件下与包含所述抗原的免疫原接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括回收所述载有抗原的树突细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述足以使所述未成熟树突细胞成熟的条件包括与GM-CSF和IL-4的组合接触。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述足以使所述未成熟树突细胞成熟的条件还包括与促炎性细胞因子混合物接触。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述促炎性细胞因子混合物至少包含IL-1受体的激动剂、利用gp130的细胞因子以及TNF超家族成员。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述IL-1受体的激动剂是IL-1β，其中所述利用gp130的细胞因子是IL-6和/或其中所述TNF超家族成员是TNF-α。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述促炎性细胞因子混合物还包含前列腺素。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述前列腺素是前列腺素E2(PGE2)。
9.根据权利要求8所述的方法，其中介质的组成为：300IU/mL的IL-1β、1000IU/mL的TNF-α、1000IU/mL的IL-6和1μg/mL的PGE2。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述防止细胞附着于基底的条件包括使用低附着基底。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述未成熟树突细胞是单核细胞衍生的未成熟树突细胞。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述免疫原是HIV免疫原。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述HIV免疫原是失活的HIV颗粒。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述失活的HIV颗粒选自热失活的HIV颗粒、化学失活的HIV颗粒和光化学失活的HIV颗粒。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述失活的HIV颗粒是使用干扰CCHC锌指之试剂获得的化学失活的HIV颗粒。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述失活的HIV颗粒是热失活的HIV颗粒。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述干扰CCHC锌指的试剂选自：
(i)C-亚硝基化合物，
(ii)偶氮二甲酰胺，
(iii)具有R-S-S-R结构的二硫化物，
(iv)具有以下结构的马来酰亚胺
(v)具有以下结构的α-卤代酮
(vi)具有式R-NH-NH-R的酰肼，
(vii)一氧化氮及包含NO基团的其衍生物，
(viii)铜离子以及包含Cu2+的配合物，
(ix)铁离子以及包含Fe3+的配合物，
其中R是任意原子或分子，并且X选自F、I、Br和Cl。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述二硫化物是双硫仑或aldrithiol-2(2，2’-二硫二吡啶)。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述失活的HIV颗粒是使用补骨脂素化合物并在能够活化所述补骨脂素化合物的波长下辐照获得的光化学失活的HIV颗粒。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述补骨脂素化合物是氨托沙林。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述HIV是HIV-1。
22.可通过权利要求1至21中任一项所限定的方法来获得的抗原脉冲的树突细胞。
23.一种树突细胞疫苗，其包含根据权利要求22所述的抗原脉冲的树突细胞。
24.根据权利要求23的树突细胞疫苗，其用于医疗。
25.根据权利要求24的树突细胞疫苗，其用于治疗或预防HIV感染或与HIV感染有关的疾病，其中所述免疫原是HIV免疫原。
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