CN1489630A - Hiv样颗粒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了表达HIV－1的env，gag，pro，和/或pol基因的基于甲病毒属的表达载体，它们的转录物，和转化的宿主细胞。本发明描述了使用上面的表达载体表达Env，Gag，Pol，和/或Pro蛋白，和由上面的重组蛋白组成的HIV样颗粒(HIVLPs)。本发明的病毒样颗粒(VLPs)作为成熟和有感染性的颗粒，作为HIV感染的诊断试剂盒和预防HIV感染的疫苗组合物的抗原非常有效。

Description

HIV样颗粒及其用途
技术领域
本发明涉及表达HIV的Gag蛋白的表达载体，表达HIV的Env蛋白的表达载体，同时表达Gag和Env蛋白的表达载体，表达HIV的Gagpol多蛋白的表达载体和同时表达Gagpol多蛋白和Env蛋白的表达载体。
背景技术
已知人免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的成因物质。特别是，HIV-1和HIV-2属于慢病毒亚科(Lentiviridae)逆转录病毒，携带单链RNA。一旦在易感宿主细胞中，RNA基因组即被病毒反转录酶反翻译而产生双链DNA，双链DNA被整合到宿主的染色体中，产生原病毒。
为了更好理解本发明的背景，参考图1，那里给出了大小9.2kb的HIV-1基因组的结构。HIV-1基因组具有由gag，pol和env组成的结构基因，和包括tat，rev，nef，vif，vpu和vpx的附加基因。
HIV Gag多蛋白前体Pr55gag从全长gag-pol RNA表达，大小55kDa。HIV Gag前体被N末端肉豆蔻酸部分运输到细胞质膜的内表面，在那里指导病毒粒体的装配。病毒粒体的成熟需要HIV的pol基因编码的蛋白酶(Pro)将Pr55gag蛋白水解切割为基质蛋白(MA，pl7)，衣壳蛋白(CA，p24)，核壳蛋白(NA，p9)和p6蛋白(Gheysen D.等，Cell，59，103-112(1989)；Bray，M.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，1256-1260(1994)；Cann，A.J.，和J.Karn，AIDS 3(Suppl.l)，S19-S34(1989)；Ratner，L.，W.等，Nature313，277-284(1985)；Wain-Hobson，S.等，Cell 40，9-17(1985))。
包膜糖蛋白(Env)前体gp160从剪接RNA表达。在病毒感染的细胞中，前体被来自宿主或病毒的蛋白酶在N末端侧切割为gp120亚单位，在C末端侧切割为gp41亚单位，它们被正确靶向质膜，分别固定在外表面和插入到细胞膜中。在成熟病毒粒体中，gp120和gp41亚单位形成异源二聚体，其中两个亚单位非共价连接，已知它直接负责HIV的感染性，细胞向性和致细胞病变作用(Robey，E.和Axel，R.，Cell 60，697-700(1990))。由于与免疫原性的密切关系，HIV的Env蛋白是HIV疫苗开发的目标。
蛋白酶(Pro)是由Prl60 gag-pol前体的自身切割产生的，在翻译gag-pol mRNA的同时由gag mRNA区域3’末端核糖体移码翻译(Jacks，T.and Varmus，H.E.Science 230，1237-1242(1985)；Jacks，T.等，Nature 331，280-283(1988)；Sonigo，p.等，Cell 45，375-385(1986))。蛋白酶参与Prl60gag-pol多蛋白和env蛋白的加工，产生成熟感染性病毒粒体(Kohl，N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，4686-4690(1988))。
迄今为止，提议的AIDS疫苗包括灭活疫苗，减毒疫苗，重组活疫苗，病毒样颗粒疫苗和亚单位疫苗。
灭活完整病毒疫苗是由化学或物理处理分离的病毒颗粒从而破坏它们的感染性而制备的。这种类型的疫苗容易制备并且能够使用大多数的表位，相比之下，当病毒没有被完全灭活时，它可能引起疾病，另一方面，完全灭活的强烈处理可能引起很多表位破坏。尽管有一些灭活SIV疫苗的成功报道(Scott E.J.Nature 253，393(1991)；Le Grand R.等，Nature 355，684(1992)；Crange M.P.等，Nature 355，685-686(1992)；Arthur L.O.等，J Virol 69，3117-3124(1195)；Neidrig M.等，Vaccine 11，67-74(1993))，但是不认为它可用作安全和有效的AIDS疫苗，因为已经对培养的宿主细胞中包含的外抗原的作用引起成功免疫产生怀疑。
活减毒疫苗是由部分删除HIV基因组制备的，如删除nef基因或nef和vpr基因(Descrosiers R.C.AIDS Res Hum Retroviruses8，411-421(1992)；Gibbs J.S.等，AIDS Res Hum Retroviruses10，607-616(1994)；Cranage M.P.等，Virology 229，143-154(1997)；Wyand M.S.等Nature Med 3，32-36(1997))。然而，这种疫苗可在接种动物中恢复删除的基因，允许它们具有感染性。因此，活减毒疫苗可能不完全安全，因为它们可在接种个体(或动物)引起AIDS。
活重组疫苗是非致病性病毒的非必需基因被编码HIV免疫原的基因取代的载体。公开了gag，pol或env基因和免疫原性区域包括HIV的V3环在痘苗病毒，痘病毒，金丝雀痘病毒，禽痘病毒和脊髓灰质炎病毒或流感病毒中表达为嵌合形式(Tartaglia J.等，Virology，188，217-232(1992)；Abimiku A.等，Nature Med，1，321-329(1995)；Natuk R.J.等，AIDS Hum Retroviruses9，395-404(1993)；Li S.等，J Virol，67，6659-6666(1993)；Muster T.等，J Virol 69，6678-6686(1995))。因为这个技术通常使用蛋白的一部分作为疫苗材料，不能提供有效的免疫原。而且，活重组载体不稳定(Morrow.C.D.等，AIDS Res HumRetroviruses，10，S61-S66(1994)；Anderson M.J.等，AIDSRes Hum Retroviruses，13，53-62(1997))。
亚单位疫苗是HIV编码的蛋白的亚单位，是天然分离或由重组DNA技术表达的。这些疫苗容易操作，但它们与病毒颗粒中存在的最初蛋白具有不同构象。使用哺乳动物和昆虫细胞表达系统表达了重组Env糖蛋白，gp120和gp160(Lasky，L.A.，等，Science，249，932-935(1986)；Barr，P.J.等，Vaccine 5，90-101(1987)；Hu，S-L.等，J Virol 61，3617-3620(1987)；Rusche，J.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，84，6924-6928(1987)；Berman，P.W.，等J Virol 63，3489-3498(1989)；Ivey-Hoyle，M.，andRosenberg，M.，Mol.Cell.Biol.，10，6152-6159(1990)；Lasky，L.A.等，Cell，50，975-985(1987))。被注射给黑猩猩，在CHO细胞中表达的gp120亚单位疫苗不能提供抗病毒攻击实验的保护(Berman，P.W.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，85，5200-5204(1988))。
通常，病毒颗粒形式的疫苗比亚单位形式的疫苗更具有免疫原性和更稳定。最近开发了不携带遗传物质的非感染性病毒样颗粒(VLPs)用作疫苗的新技术。例如，包装基因成熟可提供没有RNA基因组的VLP，含未加工gag蛋白的VLP可使用重组杆状病毒或痘苗病毒制备(Gorelink R.J.等，J Virol 64，3207-3211(1990)；Gheysen D.E.等，Cell 59，103-112(1989))。也报道了从分别含gag-pol基因和env基因的两个重组痘苗病毒共转染的细胞中制备病毒样颗粒(Haffar O.K.等，Virology，183，487-495(1991))。这种假颗粒可有效制备中和抗体，env-CD4保护抗体和合胞体抑制，但它们具有它们不是成熟病毒颗粒和缺乏感染性的缺陷。
作为其它形式的含HIV免疫决定簇的病毒样颗粒，描述了包括脊髓灰质炎病毒capsovector，乙型肝炎病毒(HBV)核心颗粒，HBsAg颗粒和酵母逆转录转座子病毒样颗粒的杂种颗粒。但是，这些杂种颗粒仅含有HIV免疫决定簇的部分区域，产生非有效的疫苗(Grene E.等，AIDS Res Hum Retroviruses，13，41-51(1997)；SchliengerK.，等J Virol 66，25702576(1991)；Adams S.E.等，Nature329，68-70(1987)；Layton G.T.等，J Immunol，151，1097-1107(1993)；Eckart L.等，J Gen Virol 77，2001-2008(1996))。
本发明的发明人尝试使用甲病毒属载体系统开发含成熟病毒样颗粒的新AIDS疫苗。本发明人相信该病毒样颗粒将提供预防AIDS的方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供表达Gag蛋白的表达载体，表达HIV的Env蛋白的表达载体，同时表达HIV的Gag和Env蛋白的表达载体，表达HIV的Gagpol多蛋白的表达载体和同时表达H1V的Gagpol多蛋白和Env蛋白的表达载体。
本发明的另一个目的是提供用上面的表达载体转化的转化体。
本发明更进一步目的是提供HIV样颗粒(HIVLPs)，及其制备方法，其用途，其中，上面的表达载体或其RNA转录物被导入动物细胞。
提供使用成熟HIV样颗粒检测HIV的方法及其在诊断HIV感染中的应用是本发明更进一步的目的。
提供包含成熟HIV样颗粒的疫苗组合物，和提供了包含该表达载体或其RNA转录物的AIDS疫苗组合物是本发明更进一步的目的。
提供检测测试样品中HIV抗原特异性抗体存在的方法是本发明更进一步的目的，该方法包括步骤：(a)收集可能含有抗HIV的特异性抗体的测试样品；(b)将该测试样品与根据权利要求21的方法制备的成熟HIV样颗粒在允许抗原-抗体免疫复合物形成的条件下发生反应；和(c)检测抗原-抗体复合物。
附图简述
图1是显示HIV-1基因组结构的简图；
图2是显示表达载体pSFV和pSFV-helper的结构的限制性图谱；
图3是显示表达载体pSFV/gag构建过程的示意图；
图4是显示表达载体pSFV/gagpro构建过程的示意图；
图5是显示HIV样颗粒与AIDS患者血清的western印迹的照片，其中HIV样颗粒产生于pSFV-helper和pSFV/gag，或pSFV-helper和pSFV/gagpro，和pSFV/gagpro的RNA转录物转染的BHK-21细胞；
图6是显示HIV样颗粒与AIDS患者血清的western印迹的照片，其中HIV样颗粒产生于体外活化HIV样颗粒感染的BHK-21细胞，所述体外活化HIV样颗粒从pSFV-helper和pSFV/gag，或pSFV-helper和pSFV/gagpro，和pSFV/gagpro的RNA转录物转染的BHK-21细胞中制备；
图7是显示pSFV/gag或pSFV/gagpro载体转染的BHK-21细胞中Gag蛋白的免疫细胞化学结果的照片，用抗p24多克隆抗体染色；
图8是显示从pSFV/gag载体(A)或pSFV/gagpro RNA转录物(B)转染的BHK-21细胞的培养基上清分离的VLPs的负染色电子显微镜观察结果的照片(X140,000)；
图9是显示pSFV/env表达载体构建过程的概图；
图10是显示pSFV/env RNA转录物和pSFV-helper RNA转录物转染的BHK-21细胞中Gag蛋白的免疫细胞化学结果的照片，用抗gp160单克隆抗体染色；
图11是显示体外活化缺陷性SFV颗粒感染的BHK-21细胞溶解产物与AIDS患者血清的western印迹的照片，其中缺陷性SFV颗粒从pSFV/env RNA转录物和pSFV-helper RNA转录物转染的BHK-21细胞制备；
图12是显示pSFV/gag和pSFV/env RNA转录物共转染BHK-21细胞中HIV-1的Gag和Env蛋白的免疫细胞化学结果的照片；用抗gp160单克隆抗体(B)或AIDS患者血清(C)染色；
图13是显示包装在VLPs中的RNA基因组的RT-PCR和PCR产物琼脂糖凝胶电泳模式的照片，VLPs产生于pSFV/gag RNA转录物、或pSFV/gag和pSFV/env RNA转录物转染的BHK-21细胞；
图14是显示体外活化的缺陷性SFV颗粒感染的BHK-21细胞中Gag和Env组成的VLPs的产生的western印迹照片，所述颗粒在pSFV-helper和pSFV/gag RNA转录物或pSFV-helper和pSFV/envRNA转录物共转染的BHK-21细胞中制备；
图15是显示表达载体pSFV/pro构建过程的概图；
图16是显示表达载体pSFV/env-gag构建过程的概图；
图17是显示表达载体pSFV/env-gag-pro构建过程的概图；
图18是显示来自pSFV/env-gag RNA转录物转染的BHK-21的细胞溶解产物或VLPs与AIDS患者血清的western印迹的照片；
图19是pSFV/env-gag-pro的RNA转录物转染的BHK-21细胞的免疫细胞化学的照片，显示Gag，Env和Pro蛋白的表达；
图20是显示表达载体pSFV/CTE构建过程的概图；
图21是显示表达载体pSFV/gagpro-CTE构建过程的概图；
图22是显示表达载体pSFV/env-gag-gagpro-CTE构建过程的概图；
图23是显示表达载体pSFV/env-gag-gagΔpro-CTE构建过程的概图，显示gagΔpro基因插入pSFV/env-gag载体，gagΔpro通过删除负责在gag mRNA区域的3’末端核糖体移码的序列而制备；
图24是显示表达载体pSFV/gagpol构建过程的概图；
图25是显示pSFV/gagpol载体转染的BHK-21细胞中Gag和Gagpol多蛋白表达的免疫细胞化学照片，使用抗p24多克隆抗体和抗蛋白酶多克隆抗体；
图26是使用抗p24多克隆抗体的、pSFV/gagpol RNA转录物转染的BHK-21细胞的western印迹照片；
图27是显示表达载体pSFV/envMCTE构建过程的概图；
图28是显示表达载体pSFV/gag-envMCTE构建过程的概图；
图29是显示表达载体pSFV/gagpol-envMCTE构建过程的概图；
图3o是显示pSFV/gag-envMCTE载体转染的BHK-21细胞中Gag和Env蛋白表达的免疫细胞化学的照片，使用抗p24多克隆抗体和抗蛋白酶多克隆抗体；
图31是显示pSFV/gagpo1-envMCTE载体转染的BHK-21细胞中Gagpol多蛋白和Env蛋白表达的免疫细胞化学的照片，使用抗p24多克隆抗体，抗蛋白酶多克隆抗体，和抗env单克隆抗体；
图32是显示pSFV/gag-envMCTE和pSFV/gagpo1-envMCTE的RNA转录物转染的BHK-21细胞的western印迹照片，使用抗p24多克隆抗体和抗env单克隆抗体。
发明的最佳实施方式
本发明提供了表达HIV结构蛋白的基于甲病毒属的表达载体。本发明中使用的术语“HIV”包括所有类型的人逆转录病毒如HIV-1，HIV-2，HTLV-1和HTLV-2。
本发明中使用的术语“甲病毒属(Alphaviruses)”包括分类为生物工艺学和病毒学领域中的甲病毒属及其亚型的病毒种，如Estern马脑炎病毒(EEE)，Venezuelan马脑炎病毒(VEE)，Everglades病毒，Mucambo病毒，Pixuna病毒，西方脑炎病毒(WEE)，新培斯病毒，南非虫媒病毒NO.86，Girdwood S.A.病毒，Ockelbo病毒，赛姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)，Middleburg病毒，屈曲病毒，O’Nyong-Nyong病毒，Ross River病毒，Barmah Forest病毒，Mayaro病毒，Getah病毒，Sagiyama病毒，Bebaru病毒，Mayaro病毒，Una病毒，Aura病毒，Whataroa病毒，Babanki病毒，Kyaylagach病毒，Highlands J病毒，Fort Morgan病毒，Ndumu病毒，Buggy Creek病毒和已被国际病毒分类委员会分类为甲病毒属的其它病毒。
甲病毒属，属于披膜病毒科(Togaviridae)，是有包膜的正链RNA病毒，具有广范围易感细胞，包括昆虫、鸟和哺乳动物。甲病毒RNA基因组本身有感染性并编码RNA复制酶，允许甲病毒属用作能够执行RNA复制和翻译的表达载体(Liljestrom，P和Graoff，Biotechnology，9，1356-1361(1991))。
优选甲病毒属选自“赛姆利基森林病毒”(SFV)和“新培斯病毒”。最优选，甲病毒属选自赛姆利基森林病毒(SFV)。本发明实施方案中提供的基于SFV的表达载体，pSFV，是由SFV cDNA基因组插入到包含SP6启动子的质粒中制备的，提供使用SP6聚合酶体外翻译和在26S亚基因组启动子控制下，代替结构基因插入的外来基因的表达。
重组RNA通过感染导入细胞需要体内包装系统。pSFV-helper载体含有SFV的RNA复制信号和表达结构基因的遗传信息，但它缺乏基因组RNA的包装信号。因此，当pSFV载体与pSFV-helper共转染时，可产生在SFV结构蛋白内部仅携带重组RNA的病毒颗粒。感染易感细胞时，病毒颗粒表达重组基因，但不能重新组成病毒颗粒。参考图2，那里图解了本发明实施方案中使用的pSFV和pSFV-helper载体的结构。本发明中利用的所有DNA载体及其RNA转录物在本发明的范围内。
在本发明的一个方面，提供了分别携带gag，gagpro，gagpol和env基因的基于甲病毒的表达载体，携带env-gag基因的表达载体，携带env-gagpro基因的表达载体，携带env-gag-gagpro基因的表达载体，携带env-gag-gagΔpro基因的表达载体和携带gagpol-env基因的表达载体，其中每个HIV基因通过分别将基因插入26S亚基因组启动子下游，被甲病毒属亚基因组启动子调节。已知Pro合成表达依赖于Gag蛋白的量(Velissarios K.等，Virology，193，661-672(1993)；Magdeleine H.等，J Virol.72，4819-4824(1998)；Joel G.等，Virology，244，87-96(1998))。为了通过加工Gag蛋白获得Pro蛋白的最大表达，构建表达载体，其特征是，负责核糖体移码的核苷酸在gag和pro基因连接处被删除的gagΔpro基因或gagpro基因分别与26S启动子连接，而且位于gagpol基因下游的env基因与26S启动子连接。
本发明提供了基于甲病毒属的表达载体，其中HIV-1的gag基因与启动子可操作连接。这里使用的术语“可操作连接”是指被连接的DNA序列典型地是相邻的和在阅读框架中。在本发明的一个实施方案中，描述了pSFV/gag载体(参见实施例1)。本发明提供了基于甲病毒属的表达载体，其中gagpro基因与启动子可操作连接。本发明的一个实施方案示例了pSFV/gagpro载体(参见实施例1)。而且，本发明提供了基于甲病毒属的表达载体，其中HIV-1 env基因与启动子可操作连接。本发明的一个实施方案示例了pSFV/env载体(参见实施例4)。
本发明提供了同时表达HIV-1 env和gag的基于甲病毒属的表达载体。更优选地，本发明提供了基于甲病毒属的表达载体，它包含与第一亚基因组启动子可操作连接的HIV env的核苷酸序列，和与第二亚基因组启动子可操作连接的HIV gag的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，示例了质粒pSFV/env-gag(参见实施例9)。而且，本发明提供了基于甲病毒属的表达载体，它包含与启动子可操作连接的HIV pro的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，示例了质粒pSFV/pro(参见实施例9)。
在本发明更进一步的方面，提供了同时表达HIV-1的env，gag和pro的甲病毒属载体。更优选，本发明提供了基于甲病毒属的表达载体，其包含分别与第一，第二和第三亚基因组启动子可操作连接的env，gag和pro基因。示例了载体pSFV/env-gag-pro(参见实施例9)。
本发明提供了表达HIV-1的gagpro基因和编码组成型转运元件(constitutive transport element)(CTE)的基因的甲病毒属载体，还提供更优选的基于甲病毒属的表达载体，除了编码CTE的基因外，它还包含与启动子可操作连接的gagpro基因。示例了载体pSFV/pagpro-CTE(参见实施例9)。
而且，本发明提供了表达HIV-1的env，gag，gagpro基因和编码CTE的基因的甲病毒属载体，和更优选基于甲病毒属的表达载体，除了编码CTE的基因外，后者还包含分别与第一，第二和第三亚基因组启动子可操作连接的env，gag和gagpro基因。示例了载体pSFV/env-gag-gagpro-CTE(参见实施例12)。
本发明提供了表达HIV-1的env，gag和gagΔpro基因和编码CTE的基因的甲病毒属载体，更优选基于甲病毒属的表达载体，除了编码CTE的基因外，它还包含分别与第一，第二和第三亚基因组启动子可操作连接的env，gag和gagΔpro基因。这里，应该注意的是gagΔpro是指在gag和pro基因接头区域删除了核苷酸序列而制备的gagpro基因，提供开放阅读框架并允许pro蛋白在没有gag mRNA的3’末端移码翻译时表达。示例了pSFV/env-gag-gagΔpro-CTE载体(参见实施例13)。
本发明提供了表达HIV-1的全长gagpro基因的甲病毒属载体，更优选基于甲病毒属的表达载体，其包含与亚基因组启动子下游可操作连接的全长gagpro基因，pSFV/gagpol载体是一个实施方案(参见实施例14)。
本发明提供了同时表达HIV-1的env和gag基因的甲病毒属载体，更优选基于甲病毒属的表达载体，除了编码MCTE的基因外，其包含分别与第一和第二亚基因组启动子可操作连接的env和gag基因。示例是pSFV/gag-envMCTE载体(参见实施例16)。
本发明提供了同时表达HIV-1的gagpol和env基因的甲病毒属载体，更优选基于甲病毒属的表达载体，除了编码MCTE的基因外，其包含分别与第一和第二亚基因组启动子可操作连接的gagpol和env基因。示例是pSFV/gagpol-envMCTE载体(参见实施例16)。
可以使用本发明所属领域已知的重组DNA技术制备本发明的表达载体，做一些改动。
本发明提供了使用上述基于甲病毒属的表达载体制备前体或已加工亚单位形式的HIV-1结构蛋白(包括Gag，Pro和/或Env)的方法。本发明基于甲病毒属的表达载体可在广范围的宿主细胞中表达蛋白。而且，本发明提供了通过在宿主细胞，或更优选在动物细胞中表达表达载体或其RNA转录物制备HIV-1的Gag，Pro和/或Env蛋白的方法。优选动物细胞从鸟、哺乳动物、爬行动物、两栖动物、昆虫和鱼(水生动物)制备，哺乳动物的实例包括人、猴、仓鼠、大鼠(或小鼠)和猪。最优选，由宿主细胞和载体组成的表达系统是BHK-21细胞/pSFV载体或COS细胞/pSFV载体，但本发明的表达系统不限于它们。
甲病毒属表达载体和它们的RNA转录物可通过常规转染方法，包括DEAE葡聚糖介导的转染、磷酸钙共沉淀和更优选电穿孔，导入动物细胞，如BHK-21细胞。在本发明的一个实施方案中，pSFV载体的RNA转录物通过电穿孔有效转染宿主细胞。而且，上述转染方法可用于共转染。
通过导入感染性病毒颗粒可使外来基因在动物细胞中的表达最大化。关于此，本发明提供了制备上面的HIV蛋白的方法，包括用包含RNA转录物的感染性病毒颗粒感染宿主细胞，病毒颗粒使用辅助病毒产生。在实施例2和6中，示例了该方法。通过使用辅助病毒或本发明表达载体的RNA转录物产生的缺陷性病毒颗粒感染宿主细胞制备的HIV-1蛋白可使用常规方法分离，包括离子交换层析、亲和层析和凝胶渗透层析。
此外，本发明提供了用本发明表达载体的RNA转录物和包含重组RNA的VLP瞬时转化的宿主细胞，也提供了用该表达载体永久转化的宿主细胞。永久转化的细胞可以以具有HIV基因组cDNA整合进入宿主细胞的染色体所需的巨细胞病毒(CMV)启动子，用于逆转录酶非依赖性表达的编码组成型转运元件(CTE)的基因，和作为选择性标记的抗新霉素基因的动物细胞系提供。更优选CTE基因是编码MPMV(Mason-Pfizer猴病毒)的基因。
本发明提供了使用上述表达载体和宿主细胞制备感染性HIVLP的方法，更特别的是，通过将表达Gag蛋白的表达载体导入宿主细胞制备含Gag的未成熟HIVLP的方法。当蛋白酶没有加工Gag时，不产生成熟病毒颗粒，导致未成熟病毒样颗粒(VLPs)。“病毒样颗粒(VLP)”是指不等同于野生型(成熟)病毒颗粒，但与野生型具有相似的物理化学性能的病毒颗粒。“未成熟病毒样颗粒(未成熟VLP)”是显示出病毒颗粒形态学特征，而它不能够完成野生病毒粒体产生所需的加工的病毒颗粒。“复制子”是指含基因复制的必需基因的自身复制RNA，因此能够被用作表达外来基因的表达载体，同时与外来基因组合使病毒增殖。
仅含Gag蛋白的HIV能够产生没有感染性的未成熟病毒颗粒。而且，已知抗HIV的中和抗体主要与具有可变氨基酸序列的位于包膜(Env)蛋白的表位结合。因此，Env蛋白是开发HIV疫苗的主要目标，对开发携带Env蛋白的含Gag的重组病毒颗粒的关注不断增长。为了获得这种HIV疫苗，本发明提供了通过在宿主细胞中同时表达两种蛋白制备由Gag和Env蛋白组成的未成熟HIVLP的方法，其中宿主细胞用包含gag和env基因的表达载体共转染。
在另一方面，用于制备HIVLP的共转染方法需要很多步骤且效率低。为了克服这些问题，本发明的发明人使用携带2或3个靶基因的重组质粒，提供了制备和回收HIVLP的经济和有效方法。因此，本发明提供了由Gag和env蛋白组成的未成熟HIVLP的制备方法，这通过将gag和env基因每个都插入甲病毒属复制子的每个启动子下游和将所得复制子载体导入宿主细胞而提供。
在装配或出芽过程中，或在病毒颗粒中，gag蛋白被蛋白酶切割，切割的亚单位蛋白装配，产生成熟颗粒。仅由gag蛋白组成的HIVLP在大小和形态学上与天然HIVLP变化很大。而且，除非由Gag和Env组成的HIVLP经历蛋白酶的加工，否则不能产生成熟病毒颗粒。为了诱导有效的免疫反应，提供与野生型HIV相似的免疫原(抗原)很重要。因此，成熟HIVLP的产生是制备HIV疫苗的有力工具。在本发明中，发明人发展了通过同时表达Gag和Pro蛋白，或Gag，Env和Pro蛋白制备成熟HIVLP的方法。“成熟病毒样颗粒(成熟VLP)”是指(定义为)具有蛋白酶(Pro)完全加工的结构蛋白并显示出与野生型HIV相似的形态学和大小的HIVLP。在本发明中，发现当gagpol和env基因同时表达时产生大量成熟HIVLP。
HIV样颗粒(HIVLP)被认为是HIV疫苗或诊断HIV感染的抗原最优选的形式。然而，除了建立产生HIVLP的稳定细胞系很困难外，在每个不同载体中表达Gag，Env和/或蛋白酶产生HIVLP复杂且效率低。在本发明中，成功开发了同时表达大量足以产生HIVLP的Gag，Env和蛋白酶的基于甲病毒属的表达载体，并成功制备和分离了感染性HIVLP。
本发明进一步提供了诱导免疫反应足够量的上面的表达载体的制备方法，包括表达载体的RNA转录物或HIVLP的疫苗组合物，和预防或治疗AIDS的方法，包括给予该疫苗组合物。优选，HIVLP是成熟HIVLP，未成熟HIVLP，感染性HIVLP或非感染性HIVLP，最优选成熟HIVLP。由于其三维结构，HIVLP，当它用作疫苗时，可诱导很好的免疫反应。
本发明的疫苗组合物可以以适合活体的类型给予人。适合活体的类型是指能够以比其毒性作用更高的治疗或预防作用给予活体的物质类型。该物质可给予动物，更优选给予人。
本发明的疫苗另外包括合适的稀释剂、赋形剂和/或载体。赋形剂包括能够提高疫苗免疫原性的合适佐剂。佐剂可选自革兰氏阴性细菌的内毒素脂质A、分枝杆菌属物种的trehalos dimycholate、磷脂溶血卵磷脂、溴化二甲基双十八烷基铵(DDA)、聚氧丙烯-聚氧乙烯(POP-POE)嵌段共聚物，氢氧化铝和脂质体。载体可以是任何物质，除非在所给予的个体内诱导不希望的抗体。特别是，各种合适载体或稀释剂如盐水、缓冲盐水，和盐水和非特异性血清白蛋白的混合物可以用于本发明。药物组合物可以包括载体、缓冲液、抗氧化剂、碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或糊精和螯合剂如EDTA，另外包括水、盐水、甘油、乙醇、乳化剂、加湿剂或pH调节剂。
疫苗组合物可以包括能够增强免疫反应的佐剂。佐剂的实例包括氢氧化铝(alum)，thr-MDP，nor-MDP和MPT-PE。而且，疫苗可以包括细胞因子如GM-CSF，IL-2，IL-12，TNF和IFN，已知它们可增强免疫反应。
疫苗的剂量可以依赖于因素如健康情况、年龄、性别、体重和疫苗的免疫反应能力。而且，为了达到最大反应，剂量可以变化。例如，可以每天以相同剂量给予疫苗，或在紧急情况下，可以逐渐减少剂量。可以如通常皮下、静脉内、肌内、口服或真皮内给予疫苗。可以应用吸入或栓剂给药。加强给药可以在4至6周后给予。
本发明提供了HIV感染的诊断试剂盒和使用它们的诊断方法。诊断试剂盒包括步骤：(a)将HIVLP与来自动物，特别是人的生物学样品发生反应；和(b)检测样品中抗体与HIVLP的结合。而且，提供了使用诊断试剂盒诊断HIV感染的方法。测定抗原和抗体结合程度的方法是本发明所属领域熟知的。ELISA(酶链免疫吸附试验)是适用方法之一。诊断中抗原-抗体结合可直接或竞争进行。
从上面观点看，本发明提供了测试样品中特异性抗HIV抗原的抗体的检测方法，包括步骤：(a)收集怀疑含有特异性抗HIV的抗体的测试样品；(b)将测试样品与根据实施例18所述方法制备的成熟HIV样颗粒在允许样品中形成抗原-抗体免疫复合物的条件下发生反应；和(c)检测测试样品中形成的抗原-抗体复合物。
本发明的成熟HIV样颗粒作为抗原，可用于执行免疫试验，包括ELISA，RIA和其它非酶链抗体实验，或检测逆转录病毒抗原(如HIV抗原)和抗逆转录病毒抗体(如抗HIV抗体)。在ELISA中，成熟HIV样颗粒可粘附到特定表面，如聚苯乙烯微量滴定平板的孔，其中蛋白可结合。洗涤平板以去除未结合成熟HIV样颗粒。经洗涤去除未完全粘附的成熟HIV样颗粒后，用非特异性蛋白如牛血清白蛋白(BSA)或酪蛋白封闭平板，降低成熟HIVLP与表面的非特异性结合。
其后，临床或生物样品可以施加到固定表面，允许免疫复合物(抗原-抗体复合物)形成。这里，可以用稀释剂如BSA，牛γ球蛋白(BGG)或磷酸缓冲溶液(PBS)/Tween溶液稀释样品，后随25℃和随后37℃温育2至4小时。接着通过洗涤从表面去除非免疫复合物。可以用PBS/Tween或硼酸缓冲溶液进行洗涤。
洗涤后，向一抗中添加特异性二抗可进行定性或定量测试，其中二抗与成熟HIVLP形成免疫复合物。在样品来自人的情况下，二抗主要特异性抗人免疫球蛋白中的IgG。为了容易检测免疫复合物，二抗与能够使用产色底物的酶结合，因此允许使用分光光度计进行定性分析。
为了鉴定与多个HIV分离株反应的多个抗体，免疫学不同的多个HIV样颗粒可与特定表面粘附。为了检测识别HIV分离株中保守表位的抗HIV抗体，可粘附一个或有限数量的成熟HIVLP。为了鉴定与一个HIV分离株(如LA1，MN，SF2或HXB2)反应的抗体，可粘附本发明HIV分离株特异性的一个成熟HIVLP。这个另外的诊断系统可用于检测临床测试和医学或法医领域的特定HIV分离株。
此外，可能需要另一个诊断方法鉴定属于不同分类的免疫学不同的HIV分离株。免疫学不同的HIV分离株实例包括LA1，MN，SF2，HXB2和最初HIV-1分离株。在这个诊断方法的一个方面，本发明的成熟HIVLP可用于制备抗体，包括能够特异性识别免疫学不同的HIV分离株的单克隆抗体。可能免疫学不同的本发明的成熟HIVLP可用作疫苗和诊断免疫原。混合成熟HIVLPs的混合物可提供混合分离株的保护和/或诊断。在这种情况下，免疫原的混合物可以称作“鸡尾酒(cocktail)”。
本发明的具有免疫性能的组合物，以非混合或鸡尾酒形式，可用于检测样品(包括生物学样品)中的HIV抗原，或产生HIV特异性抗体(包括单克隆抗体)中和HIV。
在进一步的诊断应用中，为了诊断和治疗目的，本发明的成熟HIVLP可用于刺激从HIV感染患者得到的生物学样品中的HIV特异性T细胞。
参考下列实施例结合所附附图将更详细解释本发明。然而，提供下列实施例仅用来举例说明本发明，且本发明不限于它们。
实施例1：表达载体pSFV/gag和pSFV/gagpro的构建
HIV的Gag蛋白及其蛋白水解切割产物是病毒粒体的主要结构成分，没有其它任何病毒蛋白，Gag本身足以指导病毒样颗粒的装配和释放。Gag蛋白被pol蛋白编码的病毒蛋白酶(PR)切割，产生基质蛋白(MA，pl7)，衣壳蛋白(CA，p24)，核壳蛋白(NA，p9)和p6，它们装配以产生成熟病毒颗粒(Gheysen D.等，Cell，59，103-112(1989))。因此，在本研究中，通过如下将gag基因插入复制子构建了能够表达Gag的表达载体。为了扩增全长gag基因，用下面的引物1和2组成的引物组，使用含全长gag基因(832-2328bp)的HIV进化枝E(cladeE)基因组(Genbank登记号U51188，Journalof Virologly，1996)作为模板实施PCR。而且，为了除了gag基因外扩增pro基因，用下面的引物1和3，使用含gag基因，移码位点和pro基因(832-2577bp)的HIV进化枝E基因组作为模板实施PCR。在两种情况下，如下制备PCR化合物：携带全长HIV-1进化枝E基因组的质粒pUHD(100ng/μl)用作模板，与4μl 2.5mMdNTP(Boehringer Mannheim(BM)，德国)，1μl正义引物(100pmol/μl)，1μl反义引物(100pmol/μl)，5μl 10×Taq聚合酶缓冲液，37μl蒸馏水混合。PCR混合物在98℃预温育5分钟，然后补充1μl Taq聚合酶，随后是30个循环的PCR反应，其中每个循环由94℃1分钟，55℃2分钟和72℃3分钟组成。HIV-1 gag和gagpro的扩增产物分别克隆进入pSFV载体的BamHI位点，得到重组载体pSFV/gag(参见图3)和pSFV/gagpro(参见图4)。
引物1：正义(SEQ ID NO.：1)
5′-GCGGATCCCGGGATGGGTGCGAGAGCGTCAATATTAAGT-3′
引物2：反义(SEQ ID NO.：2)
5′-CGCGGATCCCTGTTACTGTGAC从GGGGTCGTTGGCAAA-3
引物3：反义(SEQ ID NO.：3)
5′-CGCGGATCCCTGCAGTTAAAGTACAACCAATCTGAGTCAACA-3′
实施例2：使用pSFV-helper和pSFV/gag，或pSFV-helper和pSFV/gagpro制备VLP
HIV-1的蛋白酶(Pro)在病毒粒体出芽过程中或之后活化，并参与结构多蛋白包括Gag和Gagpol前体的加工。在这个实施例中，在宿主细胞中与pSFV-helper一起表达实施例1中制备的重组载体pSFV/gag和pSFV/gagpro。
使用限制性酶PvuI使pSFV/gag和pSFV/gagpro载体完全线性化，用酚/氯仿提取法纯化。10μl质粒10μl DNA，5μl 10×SP6缓冲液(TaKaRa)，2.5μl 100mM DTT，5μl rNTP混合物(10mM ATP，10mM CTP，10mM UTP，10mM GTP，BM)，2μl Rnasin(BM)，1.5μlSP6 RNA聚合酶(TaKaRa)和19μl蒸馏水制备反应混合物，接着在37℃温育1小时30分钟。然后电穿孔进行转染，如下：25μl(1μg)pSFV-helper RNA转录物，50μl所得gag或gagpro基因RNA转录物添加到800μl悬浮于PBS(磷酸缓冲盐水，1.37mM氯化钠，0.02mM氯化钾，0.1mM磷酸缓冲液/ml)中的BHK-21细胞(107个细胞/ml)，接着，在室温下，0.4cm电穿孔杯中，使用Bio-Rad基因脉冲发生器，830V/25μF的两次脉冲进行电穿孔。转染48小时后，培养基以3500rpm离心15分钟，接着使用Beckman SW41转子对所得上清以30,000rpm在4℃超离心2小时，得到含病毒颗粒的沉淀。沉淀重悬于TNE缓冲液中(50mM Tris-HCl，pH7.4，100mMNaCl，0.5mM EDTA)并保存在-70℃。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶对沉淀中所含的缺陷性VLPs进行电泳，使用来自AIDS患者的血清用western印迹分析(见图5，泳道M：阴性对照；泳道1：从pSFV-helper和pSFV/lacZ制备的VLP；泳道2：从pSFV-helper和pSFV/gag制备的VLP；泳道3：从pSFV-helper和pSFV/gagpro制备的VLP)。在图5的泳道2中，检测到gag蛋白。这表明Gag蛋白在pSFV/gag RNA转录物转染的BHK-21细胞中表达，Gag蛋白组成的HIVLPs和SFVLP释放到培养基中。揭示了为表达Pro蛋白以及Gag蛋白而制备的pSFV/gagpro产生Gag蛋白比pSFV/gag少(参见图5的泳道3)。用制备的病毒颗粒感染BHK-21细胞，如下：为活化缺陷性VLPs，TNE缓冲液中的100μl缺陷性VLPs悬浮液与5μl糜蛋白酶(10mg/ml)，5μl 50mMCaCl2在冰上孵育30分钟，然后添加45μl抑酶肽(2mg/ml，Sigma，USA)终止蛋白酶活性。活化的VLPs添加到单层70％汇合的BHK-21细胞中，然后在37℃，5％CO2下孵育90分钟，允许VLPs感染BHK-21。接着抽吸培养基，提供新的培养基，进行孵育48小时。用200μl裂解缓冲液(1％NL40，50mMTris-HCI，pH7.6，150mM NaCl，2mM EDTA，1μg/ml PMSF)裂解BHK-21细胞，以12000rpm，4℃离心5分钟。上清与样品缓冲液混合，然后煮沸5分钟。用SDS-PAGE(12％)分离变性样品。分离的蛋白转移到PVDF膜(BM)上，在15V和7mA的条件下进行2小时，并使用特异性抗体进行western印迹，在那里来自AIDS患者的血清用作一抗和生物素化抗人IgG作为二抗。接着，膜与抗生物素蛋白-生物素溶液反应，用DAB溶液进行颜色显影(参见图6，泳道1：来自pSFV/gag的VLP感染的BHK-21细胞；泳道2：来自pSFV/gagpro的VLP感染的BHK-21细胞)。再次感染的结果，55kDa条带代表BHK-21细胞的细胞质中产生Gag蛋白。因此，这些结果提示从pSFV/gag或pSFV/gagpro得到的VLP含gag基因且有感染性。
实施例3：使用pSFV/gag和pSFV/gagpro表达载体制备VLP
实施例2中制备的VLPs是SFV核心(SFVLPgag或SFVLPgagpro)组成的VLP和HIV-1核心(HIVLPgag或SFVLPgagpro)组成的VLP的混合物。为了仅得到HIV-1核心组成的VLPs，根据上面实施例2的方法，将实施例1中制备的pSFV/gag和pSFV/gagpro在体外转录并在没有pSFV-helper RNA转录物下转染BHK-21细胞。用冷纯甲醇固定转染的细胞，在-20℃冷却4至6分钟，用1％明胶封闭，用抗p24(病毒衣壳)多克隆抗体(抗兔)，接着用二抗生物素化抗兔IgG免疫染色。结果，发现Gag蛋白在转染的BHK-21细胞中表达(参见图7，A：阴性对照，没有转染的BHK-21细胞；B：pSFV/gag转染的BHK-21细胞；C：pSFV/gagpro转染的BHK-21细胞)。细胞质中检测到Gag蛋白，使用实施例2的方法从培养基的上清中分离VLPs，在电子显微镜下观察(图8，A：pSFV/gag的VLPs；B：pSFV/gagpro的VLPs)。发现甚至当pSFV/gag或pSFV/gagpro RNA转录物在没有pSFV-helper RNA转录物下表达时，仍产生仅由Gag蛋白组成的VLP(HIVLPgag)。
实施例4：pSFV/env表达载体的构建
为了扩增HIV的gp160基因，用下面的引物4和5组成的引物组，使用在6264-8879bp之间含gp160基因的HIV进化枝E基因组(Genbank登记号U51188，Journal of Virologly，1996)作为模板实施PCR。
引物4：正义(SEQ ID NO.：4)
5′-CGCGCCTCGAGCGGGATCCCATGAGAGTGAAGGGGACACGGA-3′
引物5：反义(SEQ ID NO.：5)
5′-AATGGATCCTATAGCAAAGCCCTTTCCAAGCCC-3′
PCR混合物制备如下：携带全长HIV-1进化枝E基因组的质粒pUHD(100ng/μl)用作模板，与4μl 2.5mM dNTP(BM，德国)，1μl正义引物(100pmol/μl)，1μl反义引物(100pmol/μl)，5μl Taq聚合酶10×缓冲液和37μl蒸馏水混合。PCR混合物在98℃预温育5分钟，然后补充1μl Taq聚合酶，随后是30个循环的PCR反应，其中每个循环由94℃1分钟，55℃2分钟和72℃3分钟组成。将Gp160基因的扩增产物克隆进pSFV载体的BamHI位点，得到重组载体pSFV/env(参见图9)。
实施例5：使用pSFV-he lper和pSFV/env表达载体制备VLP
因为仅HIV-1的Env不能产生VLP，所以由pSFV-helper和pSFV/env制备VLP。用SpH I使实施例4中制备的pSFV/env完全线性化，酚/氯仿提取法纯化。为了得到env基因的RNA转录物，用10μl线性化质粒DNA，5μl 10×SP6缓冲液(TaKaRa)，5μl 10mMm7G(5’)ppp(5’)G(BM)，2.5μl 100mM DTT，5μl rNTP混合物(10mMATP，10mM CTP，10mM UTP，10mM GTP，BM)，2μl Rnasin(BM)，1.5μl SP6 RNA聚合酶(TaKaRa)和19μl蒸馏水制备反应混合物，在37℃温育1小时30分钟。接着根据与实施例2相同的电穿孔进行转染，除了使用50μl pSFV/env RNA转录物和25μl pSFV/辅助RNA转录物作为RNA转录物。转染后48小时，培养基以3500rpm离心15分钟，接着使用Beckman SW41转子对上清超离心(2小时，30000rpm，4℃)，得到含病毒颗粒的沉淀。沉淀重悬于TNE缓冲液中(50mM Tris-HCI，pH7.4，100mM NaCl，0.5mM EDTA)并保存在-70℃。而且，用冷纯甲醇固定转染的细胞，-20℃冷却4至6分钟，用1％明胶封闭，以抗gp160单克隆抗体(1mg/ml)和接着以生物素化抗小鼠IgG二抗(5μl/ml)免疫染色。接着，感染细胞与AB溶液(5μl抗生物素蛋白，5μl生物素/1ml PBS，VECTOR)孵育30分钟，用DAB(3，3’-二氨基联苯胺)溶液(VECTOR)显色(见图10，A：阴性对照，没有转染的BHK细胞；B：pSFV/env载体转染的BHK细胞)。结果，发现Env蛋白在pSFV/env载体转染的BHK-21细胞中表达。
为了活化VLPs，TNE缓冲液中100μl病毒颗粒悬浮液与5μl糜蛋白酶(10mg/ml)，5μl 50mM CaCl2冰上温育30分钟，然后添加45μl抑酶肽(2mg/ml，Sigma，USA)终止蛋白酶活性。活化的VLPs添加到70％汇合的单层BHK-21细胞中，然后在37℃，5％CO2下孵育90分钟，允许VLPs感染BHK-21。接着抽吸培养基，提供新的培养基，进行孵育48小时。孵育后，200μl裂解缓冲液(1％NL40，50 mMTris-HCI，pH7.6，150mM NaCl，2mM EDTA，1μg/ml PMSF)裂解BHK-21细胞并离心(12000rpm，5分钟，4℃)。上清与样品缓冲液混合，然后煮沸5分钟。用SDS-PAGE(12％)分离变性样品。分离的蛋白转移到PVDF膜(BM)上，在15V和7mA的条件下转移2小时，使用特异性抗体进行western印迹，在那里来自AIDS患者的血清用作一抗和生物素化抗人IgG作为二抗。接着，膜与抗生物素蛋白-生物素溶液反应，用DAB溶液进行显色(参见图11，泳道1：阴性对照，BHK-21细胞；泳道2：VLP转染的BHK-21细胞)。结果，体外活化的VLPs感染了BHK-21细胞，发现BHK-21细胞的细胞质中产生了Env蛋白，证明感染性SFVLPenv的产生。
实施例6：使用pSFV/gag和pSFV/env表达载体制备VLP
熟知HIV的Gag蛋白指导未成熟VLP的装配，和HIV的Env蛋白是开发中和抗体的主要目标(Gheysen D.等，Cell，59，103-112(1989)；Lasky，L.A.等，Science，249，932935(1986)；Lasky，L.A.等，Cell，50，975-985(1987))。因此，为了将Env蛋白掺入由Gag蛋白组成的病毒颗粒中，将实施例1制备的pSFV/gag的RNA转录物和实施例4制备的pSFV/env共转染易感宿主细胞。根据与实施例2相同的方法(没有pSFV-helper)，表达载体pSFV/gag和pSFV/env在体外转录，并共转染BHK-21细胞。转染后48小时，用AIDS患者血清和能够识别Env蛋白的抗gp160单克隆抗体免疫染色转染的细胞。用AIDS患者血清免疫染色的样品(参见图12的C)比抗gp160抗体(参见图12的B)显示多得多的染色。这个结果表明产生了由HIV-1的Gag和Env蛋白组成的HIVLP(图12A：阴性对照；B：抗gp160单克隆抗体；C：AIDS患者血清)。
实施例7：HIV样颗粒相关核酸的分析
我们研究了实施例3和6制备的，分别通过仅用pSFV/gag RNA转录物转染，或用pSFV/gag和pSFV/env RNA转录物共转染的VLPs是否携带核酸。VLPs通过10％蔗糖垫。用1mg Rnase A和70单位无RNase的Dnase I在Mg2S04-醋酸缓冲液中室温消化1小时去除其它RNA和DNA污染物。用病毒RNA纯化试剂盒(Viogene)纯化RNA，然后使用纯化的RNA进行PCR，扩增大小650bp的mRNA片段作为gag，特别是p24的产物，和350bp的mRNA片段作为env的产物。对于纯化RNA的RT-PCR，RNA与4μl 5 Superscript II逆转录酶缓冲液(250mM Tris-HCI，pH8.5，375mM KCI，15mM MgCl2)，2μl 0.1M DTT和4μl脱氧核苷三磷酸(dNTP；每种25mM；TaKaRa)和引物，和蒸馏水混合达到20μl。混合物42℃孵育2分钟，补充1μlSuperscript II逆转录酶(来自Molony小鼠白血病病毒pol基因(Gibco BRL))，随后42℃孵育50分钟得到RNA/DNA杂种形式的第一条DNA链。这里，对于gag RNA使用1μl 100pmol的引物6，对于env RNA使用1μl 100pmol的引物7。
引物6：反义(SEQ ID NO.：6)
5′-CCCAAGCTTTTAGCATGCTGTCATCATTTC-3
引物7：反义(SEQ ID NO.：7)
5′-GGTTCTGCAGAAGCTTCCTTGTTATTTCAAACCA-3
在70℃孵育15分钟使RNA/DNA杂种变性和灭活逆转录酶。用Ztag DNA聚合酶(TaKaRa)和引物组(对于gag RNA检测，用引物8和引物6；对于env RNA检测，用引物9和引物7)，使用从上面RT-PCR得到的cDNA作为模板进行DNA扩增。这里，10μl模板cDNA与4μl 2.5mM dNTP(BM，德国)，1μl正义引物(100pmol/μl)，1μl反义引物(100pmol/μl)，5μl 10×Z Taq聚合酶缓冲液，28μl蒸馏水和1μl Z Taq聚合酶(TaKaRa)混合。PCR混合物在94℃预温育5分钟，然后用35个循环进行PCR，其中每个循环由94℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟组成，随后72℃孵育7分钟。
引物8：正义(SEQ ID NO.：8)
5′-CCCAAGCTTCATCAGGCCTTATCACCT-3
引物9：正义(SEQ ID NO.：9)
5′-TCCCCCGGGAAGCTTGCGCAGCAGCATCTGTTG-3
扩增产物施加到琼脂糖凝胶上分离，溴化乙锭染色后在UV照明下可视化。发现从仅用pSFV/gag RNA转录物转染后得到的HIVLP以及pSFV/gag和pSFV/env RNA转录物共转染后得到的HIVLP扩增了p24基因(见图13的泳道1和2)。相比之下，在两个VLPs中根本没有检测到gp41基因的扩增(见图13的泳道1和3)。这个结果提示仅对应于gag基因的RNA被包装进入VLPs(见图13，泳道1：来自pSFV/gag的VLP；泳道2和3：pSFV/gag和pSFV/env共转染得到的VLP；泳道1和2使用p24的引物扩增，泳道3使用gp41的引物扩增；650bp片段是gag基因的PCR产物，350bp片段是env基因的产物)。
实施例8：通过缺陷性SFVLP感染来制备VLP
我们研究了当从实施例2和5得到的VLPs体外活化并感染COS-1细胞时，是否产生VLPs。从用实施例2或5的VLP感染的COS-1细胞制备的培养基上清得到细胞裂解物和VLPs后，用AIDS患者血清，抗p24多克隆抗体(抗兔)和抗p24单克隆抗体的western印迹分析它们(参见图14，A：AIDS患者血清；B：抗p24多克隆抗体；C：抗p24单克隆抗体；阴性对照(泳道1，4，7，10和13)；SFVLPgag感染(泳道2，5，8，11和14)；SFVLPgag和SFVLPenv共感染(泳道3，6，9，12和15)；细胞溶解产物(泳道1，2，3，7，8，9，10，11和12)；VLP(泳道4，5，6，13，14和15))。
如图14的A和B所示，当含gag基因的缺陷性SFVLP感染COS-1细胞时，在COS-1细胞的细胞质(泳道2和8)和上清的VLPs中检测到Gag蛋白。此外，当含gag和env基因的SFV复制子共转染COS-1细胞时，在COS-1细胞的细胞质(泳道3和9)和上清的VLPs(泳道6)中检测到Gag和Env蛋白两者。因此，证实了当Gag和Env蛋白同时在细胞中表达时，产生由这两种蛋白组成的VLPs。如图14的C所示，用抗p24的单克隆抗体(Biogenesis，Cat.No.4999-8607)进行western印迹，检测到Gag前体Pr55和p24蛋白。这解释了Gag前体在没有HIV-1蛋白酶时，在COS-1细胞中可能被加工或变性。
实施例9：表达载体pSFV/env-gag和pSFV/env-gag-pro的构建
为了得到含26S  基因组启动子的pro基因(HIV-1进化枝E基因组的2268-2606bp)，用由含完整HIV-1进化枝E基因组的pUHD(100ng/μl)，4μl 2.5mM dNTP(BM，德国)，1μl正义引物(100pmol/μl)，1μl反义引物(100pmol/μl)，5μl 10×Taq聚合酶缓冲液，37μl蒸馏水和1μl Taq聚合酶组成的混合物进行PCR，94℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟的热循环重复40次。
引物10：正义(SEQ ID NO.：10)
5′-CCAAGATCTATGACAGCCTCCTCCTTTAGTTTC-3′
引物11：反义(SEQ ID NO.：11)
5′-CAACCCGGGTCGCGATTAAGTGTCAATAGGACTAAT-3′
使用在引物的两个末端的EcoRV和SmaI识别序列，将pro基因的扩增产物克隆进入pSFV的多克隆位点的SmaI位点。产生pSFV/pro载体(见图15)。为了构建pSFV/env-gag载体，使用实施例1制备的载体pSFV/gag作为模板，在对于26S亚基因组启动子的引物12(正义)和对于gag基因的引物2(反义)存在下首先扩增26Sgag基因。然后将扩增的26S gag基因插入载体pSFV/env的SmaI位点(见图16)。
引物12：正义(SEQ ID NO.：12)
5′-CCGGATATCACCTCTACGGCGGTCCTA-3′
引物13：反义(SEQ ID NO.：13)
5′-CGGCCGGGTTACTGTGACAAGGGGTCCTTGCCAAA-3′
使用pSFV/pro载体作为模板，用对于26S亚基因组启动子的引物12(正义)和对于pro基因的引物11(反义)的引物组扩增26Spro基因，接着扩增产物插入pSFV/env-gag载体的SmaI位点，得到pSFV/env-gag-pro载体(见图17)。这里，扩增的pro基因的核苷酸序列，与实施例1的gagpro的pro基因相比，在N末端被部分删除和在C末端被增加。由此得到的pro基因的序列含有自身加工所需的核苷酸序列(Viviane V等，J.Gen.Virol.73，639-651(1992))。载体pSFV/env-gag-pro于2000年12月根据国际承认用于专利程序微生物保藏布达佩斯条约保藏在国际保藏单位之一-韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号KCCM-10233。
实施例10：通过pSFV/env-gag载体的表达制备VLP
为了制备掺入了Env蛋白的含gag的VLPs，在含分开的亚基因组启动子的相同质粒中，将Gag和Env蛋白基因克隆到的的赛姆利基森林病毒(SFV)复制子中，如实施例9所述。实施例9所得pSFV/env-gag载体的RNA转录物转染BHK-21细胞。在转染后48小时，用AIDS患者血清以western印迹和随后ECL(增强化学发光)实验分析转染的细胞溶解产物和从上清得到的VLPs(见图18，泳道1：阴性对照；泳道2和泳道3：细胞溶解产物；泳道4和5：细胞上清)。结果，在VLPs中检测到Gag和Env蛋白，证明env和gag克隆到相同质粒中，其中两个基因的表达在不同亚基因组启动子下分开控制，同时在相同细胞中表达，通过两个蛋白的相互作用，允许VLP产生。在图18中，培养基的上清中，Gag蛋白的条带显示比细胞溶解产物中的大小稍小，因为被高含量的65kDa白蛋白推进。
实施例11：通过pSFV/env-gag-pro载体的表达制备VLP
将实施例9制备的pSFV/env-gag-pro载体转染宿主细胞并检测三个基因的表达水平。pSFV/env-gag-pro的RNA转录物转染BHK-21细胞。转染后48小时，用AIDS患者血清，抗gp160单克隆抗体，抗p24多克隆抗体和抗蛋白酶多克隆抗体(抗绵羊)免疫染色转染的细胞(见图19，A：阴性对照；B：AIDS患者血清；C：抗gp160单克隆抗体；D：抗p24多克隆抗体；E：抗蛋白酶多克隆抗体)。结果，Gag，Env和Pro蛋白全部被检测到。因此，表明Gag，Env和Pro在不同26S亚基因组启动子下分开表达，证明可以表达与基于甲病毒属的表达载体的亚基因组启动子分开连接的三个外来基因中的每一个。
实施例12：pSFV/env-gag-gagpro-CTE表达载体的构建
为了首先制备pSFV/CTE载体，用引物14和15，使用pGEM 7fz(-)/MPMV质粒DNA作为模板进行PCR。扩增的CTE基因插入pSFV的BamHI位点和SmaI位点之间的区域(见图20)。通过用BamHI消化从实施例1制备的pSFV/gagpro切割Gagpro基因，克隆到载体pSFV/CTE的BamHI位点，得到pSFV/gagpro-CTE(见图21)。接着，Maston-Pfzier猴病毒的CTE基因插入在pSFV/gagpro之后，产生pSFV/gagpro-CTE载体。
为了最终构建pSFV/env-gag-gagpro-CTE，使用载体pSFV/gagpro-CTE作为模板，用引物12和15，通过PCR扩增含26S亚基因组启动子的全长gagpro基因和CTE基因。所得产物插入实施例9的载体pSFV/env-gag的SmaI位点(参见图22)。PCR混合物制备如下：1μl pSFV/gagpro-CTE与4μl 2.5mM dNTP(BM，德国)，1μl正义引物(100 pmol/μl)，1μl反义引物(100 pmol/μl)，5μl 10×Taq聚合酶缓冲液和37μl蒸馏水混合。PCR混合物在98℃预孵育5分钟，然后补充1μl Taq聚合酶，随后时40个循环的PCR反应，其中每个循环由94℃1分钟，55℃1分钟和72℃2分钟组成。载体pSFV/env-gag-gagpro-CTE于2000年12月根据国际承认用于专利程序微生物保藏布达佩斯条约保藏在国际保藏单位之一-韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号KCCM-10234。
引物14正义(SEQ ID NO.：14)
5′-AATGGATCCCCTCCCCTGTGAGCTAGACT-3′
引物15反义(SEQ ID NO.：15)
5′-AATGATATCAGATCTCCAAGACATCATCCGGGCAA-3′
实施例13：pSFV/env-gag-gagApro-CTE表达载体的构建
从gagpro序列在核糖体移码信号处删除保守的五个T制备gagΔpro，如下。使用实施例1的载体pSFV/gag作为模板，使用下面的引物12和引物16，扩增含26S亚基因组启动子和gag基因的部分(832-2113)，位于位点上游。这里，PCR混合物制备如下：1μlpSFV/gag与4μl 2.5mM dNTP(BM，德国)，1μl正义引物(100pmol/μl)，1μl反义引物(100 pmol/μl)，5μl 10×Taq聚合酶缓冲液和37μl蒸馏水混合。PCR混合物在98℃预孵育5分钟，然后补充1μl Taq聚合酶，随后是40个循环的PCR反应，其中每个循环由94℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟组成。扩增的产物插入pGEMT载体(Promega)。而且，使用实施例12的载体pSFF/gagpro-CTE作为模板，用引物15和17的引物组，扩增除了移码信号的保守序列外的全长pro基因，接着根据上述相同的步骤插入pGEMT载体。
引物16反义(SEQ ID NO.：16)
5′-AATAGGCCTGTCTTTCAGTGCAGTCTT-3′
引物17正义(SEQ ID NO.：17)
5′-CACAGGCCTATAGGGAAAATCTGGCCTTC-3′
用限制性酶StuI消化两个得到的基因并连接，产生gagΔpro。在这个步骤中，用Tyr(酪氨酸)置换Asn(天冬酰胺)，两个Phe(苯丙氨酸)随保守的五个Ts缺失而删除。接着用EcoRV消化gagΔpro并插入载体pSFV/env-gag的SmaI位点，得到pSFV/env-gag-gagΔpro-CTE载体(参见图23)。
(SEQ ID NO.：18)F  F  R  E
CAG GCT AATTT TTT AGG GAA gag-pol
mRNA的核糖体移码位点
Q  A  N
(SEQ ID NO.：19)
CAG GCC TAT AGG GAA    GagΔpro的突变位点
Q  A  Y  R  E
实施例14：pSFV/gagpo1表达载体的构建
为了制备表达Gagpol多蛋白的表达载体，HIV-1的gagpol基因插入甲病毒复制子。用引物18和19，使用HIV-1进化枝E基因组作为模板，用聚合酶链式反应(PCR)扩增HIV-1的全长gagpol基因(832-5132bp)。PCR混合物制备如下：携带全长HIV-1进化枝E基因组的质粒pUHD(100ng/μl)作为模板，与4μl 2.5mM dNTP(BM，德国)，1μl正义引物(100pmol/μl)，1μl反义引物(100pmol/μl)，5μl 10×Taq聚合酶缓冲液和37μl蒸馏水混合。PCR混合物在98℃预孵育5分钟，然后补充1μl Taq聚合酶，随后时40个循环的PCR反应，其中每个循环由94℃1分钟，55℃1分钟和72℃3分钟组成。
引物18：正义(SEQ ID NO.：20)
5′-TTAGGATCCATGGGTGCGAGAGCGTCA-3′
引物19：反义(SEQ ID NO.：21)
5′-CGCGGATCCCTAATCCTCATTCTGTCTACC-3′
扩增产物插入pSFV载体的BamHI位点，得到pSFV/gagpol载体(参见图24)。
实施例15：使用pSFV/gagpol载体制备VLP
为了产生由加工的HIV-1核心蛋白组成的VLP，根据与实施例2相同的方法，将实施例14制备的载体pSFV/gagpol载体体外转录并在没有pSFV-helper RNA转录物时，转染BHK-21细胞。用冷无水甲醇固定转染细胞，在-20℃冷却4至6分钟，用1％明胶封闭，用AIDS患者血清，抗p24多克隆抗体和抗pro多克隆抗体免疫染色(见图25，A：阴性对照；B：AIDS患者血清；C：抗p24多克隆抗体；D：抗pro多克隆抗体)。发现Gagpol多蛋白以及Gag蛋白在转染的细胞中表达。用pSFV/gagpol RNA转录物转染BHK-21细胞，48小时的孵育期后，用抗p24多克隆抗体  western印迹，随后用ECL实验分析转染的细胞溶解产物和上清的VLPs(见图26，泳道1和4：阴性对照；泳道2和5：pSFV/gag的样品；泳道3和6：pSFV/gagpol的样品；细胞溶解产物(泳道1，2和3)；VLP(泳道4，5和6))。
如图26所示，pSFV/gag载体转染的BHK-21细胞仅表达Pr55和释放未成熟VLPs。相比之下，pSFV/gagpol载体转染的BHK-21细胞，除了Pr55，还表达p24，并释放加工的成熟VLPs，结果，加工的Pr55正面调节p24的表达。
实施例16：pSFV/gag-envMCTE和pSFV/gagpol-envMCTE表达载体的构建
为了制备携带Env蛋白的成熟VLP，扩增含26S亚基因组启动子和MCTE的env基因并插入载体pSFV/gagpol的SmaI位点，得到pSFV/gagpol-envMCTE载体。而且，作为比较构建，制备pSFV/gag-envMCTE载体。为了构建pSFV/gag-envMCTE载体，首先，重新制备pSFV/gag载体。因为实施例1制备的载体pSFV/gag在gag基因前含有SmaI位点，所以使用没有SmaI位点的引物18和引物2，根据与实施例1相同的方法，用PCR再次扩增HIV-1的全长gag基因(832-2328bp)。接下来，根据与实施例4相同的方法，在pSFV/MCTE的BamHI位点插入env基因制备pSFV/envMCTE(见图27)。使用pSFV/envMCTE作为模板，用对于26S亚基因组启动子的引物12(正义)和对于MCTE的引物15(反义)扩增26SenvMCTE，插入到pSFV/gag载体的SmaI位点，最后得到pSFV/gag-envMCTE(见图28)。而且，将扩增的26SenvMCTE基因插入载体pSFV/gagpol的SmaI位点，得到pSFV/gagpol-envMCTE载体(见图29)。载体pSFV/gagpol-env-MCTE于2001年12月根据国际承认用于专利程序微生物保藏布达佩斯条约保藏在国际保藏单位之一-韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号KCCM-10348。
实施例17：使用pSFV/gag-envMCTE和pSFV/gagpol-envMCTE表达载体制备VLP
根据与实施例2相同的方法，pSFV/gag-envMCTE在体外转录，在没有pSFV-helper RNA转录物时，将转录物转染BHK-21细胞。用冷纯甲醇固定转染细胞，在-20℃冷却4至6分钟，用1％明胶封闭，用AIDS患者血清，抗p24多克隆抗体，抗pro多克隆抗体和抗env单克隆抗体免疫染色(见图30，A：阴性对照；B：AIDS患者血清；C：抗p24多克隆抗体；D：抗env多克隆抗体)。发现Env蛋白以及Gag蛋白在转染的细胞中表达。
而且，使用与实施例2相同的方法转染pSFV/gagpol-envMCTE载体(参见图31，A：阴性对照；B：AIDS患者血清；C：抗p24多克隆抗体；D：抗pro多克隆抗体；E：抗env单克隆抗体)。也揭示了Env蛋白以及Gagpol蛋白在转染的细胞中表达。此外，在pSFV/gag-envMCTE和pSFV/gagpol-envMCTE的RNA转录物转染BHK-21细胞后48小时，用抗p24多克隆抗体和抗env单克隆抗体以western印迹，随后以ECL实验分析从培养基上清分离的VLPs(见图32，A：AIDS患者血清；B：抗env单克隆抗体；泳道1和4：pSFV/gag的样品；泳道2和5：pSFV/gag-envMCTE的样品；泳道3和6：pSFV/gagpol-envMCTE的样品)。结果，发现当pSFV/gagpol-envMCTE表达时，产生携带Env的加工的成熟VLPs。
                     PCT/RO/134表
           关于保藏微生物或其它生物材料的说明
                (PCT实施细则第13条之二)
A.以下所作的说明涉及说明书第 25页第 19-25行所指的微生物。
B.保藏物标识                       更多的保藏物标识见附页□
保藏单位名称：韩国微生物保藏中心(KCCM)
保藏单位地址(包括邮政编码和国家)：361-221，Yurim B/D，Hongje-1-dong，Seodaemun-gu，SEOUL 120-091，韩国
保藏日期：2000年12月11日 保藏编号：KCCM 10233
C.其它说明(如果不适用则留空)             该信息续在附页上□
D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国)
E.单独提交的说明(如果不适用则留空)
以下说明将在以后提交给国际局(指明说明的一般性质，如“保藏编号”)
    本栏由受理局填写
□本页和国际申请一起收到
核准人签字
    本栏由国际局填写
□国际局于以下日期收到本页：年  月  日
核准人签字
PCT/RO/134表
          关于保藏微生物或其它生物材料的说明
                 (PCT实施细则第13条之二)
A.以下所作的说明涉及说明书第 27页第 6-15行所指的微生物。
B.保藏物标识                        更多的保藏物标识见附页□
保藏单位名称：韩国微生物保藏中心(KCCM)
保藏单位地址(包括邮政编码和国家)：361-221，Yurim B/D，Hongje-1-dong，Seodaemun-gu，SEOUL 120-091，韩国
保藏日期：2000年12月11日 保藏编号：KCCM 10234
C.其它说明(如果不适用则留空)               该信息续在附页上□
D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国)
E.单独提交的说明(如果不适用则留空)
以下说明将在以后提交给国际局(指明说明的一般性质，如“保藏编号”)
    本栏由受理局填写
□本页和国际申请一起收到
核准人签字
    本栏由国际局填写
□国际局于以下日期收到本页：年  月  日
核准人签字
PCT/RO/134表
         关于保藏微生物或其它生物材料的说明
               (PCT实施细则第13条之二)
A.以下所作的说明涉及说明书第 30页第 14-22行所指的微生物。
B.保藏物标识                        更多的保藏物标识见附页□
保藏单位名称：韩国微生物保藏中心(KCCM)
保藏单位地址(包括邮政编码和国家)：361-221，Yurim B/D，Hongje-1-dong，Seodaemun-gu，SEOUL 120-091，韩国
保藏日期：2001年12月21日 保藏编号：KCCM 10348
C.其它说明(如果不适用则留空)             该信息续在附页上□
D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国)
E.单独提交的说明(如果不适用则留空)
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PCT/RO/134表

Claims (29)

1.一种基于甲病毒属的表达载体，包含与第一亚基因组启动子可操作连接的HIV env的核苷酸序列(6264-8879bp)，和与第二亚基因组启动子可操作连接的HIV gag的核苷酸序列(832-2328bp)。
2.权利要求1的表达载体，它是质粒pSFV/env-gag。
3.一种基于甲病毒属的表达载体，包含与第一亚基因组启动子可操作连接的HIV gag的核苷酸序列(832-2328bp)，和与第二亚基因组启动子可操作连接的HIV env的核苷酸序列(6264-8879bp)。
4.权利要求3的表达载体，它是质粒pSFV/gag-env。
5.一种基于甲病毒属的表达载体，包含与第一亚基因组启动子可操作连接的HIV env的核苷酸序列(6264-8879bp)，与第二亚基因组启动子可操作连接的HIV gag的核苷酸序列(832-2328bp)，和与第三亚基因组启动子可操作连接的HIV pro的核苷酸序列(2268-2606bp)。
6.权利要求5的表达载体，它是质粒pSFV/env-gag-pro。
7.一种基于甲病毒属的表达载体，包含与第一亚基因组启动子可操作连接的HIV env的核苷酸序列(6264-8879bp)，与第二亚基因组启动子可操作连接的HIV gag的核苷酸序列(832-2328bp)，和与第三亚基因组启动子可操作连接的HIV gagpro的核苷酸序列(832-2577bp)。
8.权利要求7的表达载体，它是质粒pSFV/env-gag-gagpro。
9.权利要求7的表达载体，它是质粒pSFV/env-gag-gagΔpro。
10.一种基于甲病毒属的表达载体，包含与第一亚基因组启动子可操作连接的HIV gagpol的核苷酸序列(832-5132bp)，和与第二亚基因组启动子可操作连接的HIV env的核苷酸序列(6264-8879bp)。
11.权利要求10的表达载体，它是质粒pSFV/gagpol-env。
12.权利要求1-11任一项的表达载体，它进一步包含组成型转运元件(CTE)。
13.权利要求12的表达载体，它是质粒pSFV/env-gag-gagpro-CTE。
14.权利要求12的表达载体，它是质粒pSFV/env-gag-gagΔpro-CTE。
15.权利要求12的表达载体，它是质粒pSFV/gagpol-env-MCTE。
16.权利要求12的表达载体，它是质粒pSFV/gag-env-MCTE。
17.保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)的保藏号为KCCM-10233的表达载体。
18.保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)的保藏号为KCCM-10234的表达载体。
19.保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)的保藏号为KCCM-10348的表达载体。
20.一种制备HIV样颗粒的方法，包括将权利要求1-19任一项的表达载体或其RNA转录物导入动物细胞，并允许该表达载体和RNA产生HIV样颗粒的步骤。
21.权利要求20的方法，其中HIV样颗粒是成熟HIV样颗粒。
22.权利要求21的方法，其中成熟HIV样颗粒有感染性。
23.一种由从权利要求1-19任一项的表达载体选择的表达载体转化的宿主细胞。
24.权利要求23的宿主细胞，其中宿主细胞是用表达载体稳定转化的。
25.一种AIDS疫苗组合物，包含诱导免疫反应足够量的权利要求1-19任一项的表达载体或其RNA。
26.一种AIDS疫苗组合物，包含根据权利要求21的方法制备的诱导免疫反应足够量的成熟HIV样颗粒。
27.一种给人接种抗AIDS的方法，包括将权利要求25或26的AIDS疫苗组合物给予人。
28.一种HIV感染的诊断试剂盒，包括根据权利要求21的方法制备的成熟HIV样颗粒。
29.一种检测测试样品中特异性抗HIV抗原的抗体的方法，包括步骤：
(a)收集怀疑含有特异性抗HIV的抗体的测试样品；
(b)将测试样品与根据权利要求21的方法制备的成熟HIV样颗粒在允许样品中形成抗原-抗体免疫复合物的条件下发生反应；和
(c)检测测试样品中形成的抗原-抗体复合物。
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