CN112029724A - 一种加速树突状细胞成熟的体外培养方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞体外培养技术领域，具体涉及一种加速树突状细胞成熟的体外培养方法及其应用。所述方法包括如下步骤：(1)将PBMC细胞用1640培养液重悬于培养容器中，然后将该培养容器至于恒温、并提供气体碳源的培养箱中培养；(2)培养至预定时间后晃动培养容器，弃去悬浮细胞，然后加入DC无血清培养基、GM‑CSF试剂、Il‑4试剂、cholesterol试剂，继续在所述培养箱中培养；(3)培养至第三天时加入LPS，IL‑1alpha，继续培养至得到成熟DC细胞，即得。本发明的方法能够显著促进树突状细胞成熟，缩短树突状细胞的培养时间，同时，在培养过程中避免了血清的应用，临床应用更加安全。

Description

一种加速树突状细胞成熟的体外培养方法及其应用
技术领域
本发明涉及细胞体外培养技术领域，具体涉及一种加速树突状细胞成熟的体外培养方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
树突状细胞(dendritic cell，DC)由Steinman和Cohn于1973年首先发现，因其表面具有星状多形性或树枝状突起而得名。DC具有其他细胞所没有得形态特点和运动能力，分布十分广泛。DC不但具有吞噬能力，而且是迄今已知的功能最强的抗原提呈细胞，可以有效地刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞活化，从而将固有免疫和获得性免疫有机地联系起来，在肿瘤等疾病治疗中发挥重要作用。
传统的DC细胞培养方法一般采用1640培养基加血清，并以GM-CSF以及Il-4做诱导辅以TNF-alpha作为促成熟剂，从外周血单个核细胞(PBMC)历时7-8天培养而成。然而，本发明人发现上述这种培养方法具有如下不足：1.含血清培养，具有异源成份，临床应用存在安全风险。2.培养时间较长，前后长达7-8天，可能对病情造成延误。3.特异性不强，造成治疗效果低下。
发明内容
针对上述的步子，本发明旨在提供一种加速树突状细胞成熟的体外培养方法及其应用，该方法能够显著促进树突状细胞成熟，缩短树突状细胞的培养时间，同时，在培养过程中避免了血清的应用，临床应用更加安全。
具体地，为实现上述目的，本发明的技术方案如下所示：
在本发明的第一方面，提供了一种加速树突状细胞成熟的体外培养方法，包括如下步骤：
(1)将PBMC细胞用1640培养液重悬于培养容器中，然后将该培养容器至于恒温、并提供气体碳源的培养箱中培养。
(2)培养至预定时间后晃动培养容器，弃去悬浮细胞，然后加入DC无血清培养基、GM-CSF试剂、Il-4试剂、cholesterol试剂，继续在所述培养箱中培养。
(3)培养至第三天时加入LPS，IL-1alpha，继续培养至得到成熟DC细胞，即得。
进一步地，步骤(1)中，所述培养箱的温度保持37℃恒温，并以体积浓度为5％的二氧化碳为碳源。
进一步地，步骤(2)中，所述预定时间为1～2h，培养至该时间后将培养容器从培养箱中取出，通过摇晃培养容器除去培养液中的悬浮细胞。
进一步地，步骤(2)中，所述GM-CSF试剂在培养容器中的浓度为300-800U/ml，所述Il-4试剂在培养容器中的浓度为10-30ng/ml，所述cholesterol试剂在培养容器中的浓度为0.2-0.5ul/ml。
进一步地，步骤(3)中，所述LPS(脂多糖)在培养容器中的浓度为10-30ug/ml。
进一步地，步骤(3)中，所述IL-1alpha在培养容器中的浓度为20-50ng/ml。
进一步地，步骤(3)中，至少继续培养至第四天时采集成熟DC细胞。
在本发明的第二方面，公开所述加速树突状细胞成熟的体外培养方法在用于肿瘤治疗的药物制备中的应用。
相较于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明在培养所述DC细胞时采用了无血清培养基，避免了血清的应用，使用无血清培养基可以避免因采用含血清培养带来的异源成份导致的可能的免疫排斥反应，从而大大降低临床应用存在的安全风险。
(2)本发明使用IL-1alpha，LPS以及cholesterol可以促进DC快速成熟，LPS可以与细胞表面的TLR4结合，在单核细胞表面markerCD14复合物介导下促进DC细胞的成熟，IL-1alpha以及cholesterol与各自细胞表面受体结合并将DC细胞成熟时间缩短至3天，有效提高了临床治疗效率。
(3)本发明通过多种热休克蛋白及肿瘤新抗原应用可以促进树突状细胞特异性抗原提呈，从而大大提高肿瘤治疗效果。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1和图2均为本发明第一实施例培养DC细胞成熟度流式分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。本发明中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
正如前文所述，传统的DC细胞培养方法存在：1.含血清培养，具有异源成份，临床应用存在安全风险。2.培养时间较长，前后长达7-8天，可能对病情造成延误。3.特异性不强，造成治疗效果低下等方面的不足。为此，本发明提出了一种加速树突状细胞成熟的体外培养方法。现根据具体实施方式对本发明进一步说明。
第一实施例
1、一种加速树突状细胞成熟的体外培养方法，包括如下步骤：
(1)取4x108 PBMC细胞，平均为2份，分别用50ml 1640培养液重悬于2个T-175培养瓶中，将两个培养瓶置于37℃、5％(体积浓度)CO2培养箱中。
(2)孵育2小时后将两个培养瓶取出，然后轻晃培养瓶，吸出悬浮细胞，加入DC无血清培养基100ml，GM-CSF试剂(浓度500U/ml)+Il-4试剂(浓度10ng/ml)、cholesterol试剂(20ul)，继续置于37℃、5％(体积浓度)CO2的培养箱中进行培养。
(3)培养至第三天时加入LPS(浓度10ug/ml)，IL-1alpha(浓度20ng/ml)，继续培养至第四天时收获成熟DC细胞。
第二实施例
1、一种加速树突状细胞成熟的体外培养方法，包括如下步骤：
(1)取4x108 PBMC细胞，平均为2份，分别用50ml 1640培养液重悬于2个T-175培养瓶中，将两个培养瓶置于37℃、5％(体积浓度)CO2培养箱中。
(2)孵育1小时后将两个培养瓶取出，然后轻晃培养瓶，吸出悬浮细胞，加入DC无血清培养基100ml，GM-CSF试剂(浓度500U/ml)+Il-4试剂(浓度10ng/ml)、cholesterol试剂(20ul)，继续置于37℃、5％(体积浓度)CO2的培养箱中进行培养。
(3)培养至第三天时加入LPS(浓度10ug/ml)，IL-1alpha(浓度20ng/ml)，继续培养至第四天时收获成熟DC细胞。
细胞是否成熟有一个很重要的指标是CD83的marker是否高表达，图1和2表明：本发明第一实施例培养的树突状细胞的CD83表达达到了90％以上，其中图2显示细胞的成熟度达到了91.12％，意味着培养的细胞里有91.3％的细胞都是表达CD83这个指表，表明这些细胞都已经成熟。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种加速树突状细胞成熟的体外培养方法，其特征在于：包括步骤：
(1)将PBMC细胞用1640培养液重悬于培养容器中，然后将该培养容器至于恒温、并提供气体碳源的培养箱中培养；
(2)培养至预定时间后晃动培养容器，弃去悬浮细胞，然后加入DC无血清培养基、GM-CSF试剂、Il-4试剂、cholesterol试剂，继续在所述培养箱中培养；
(3)培养至第三天时加入LPS，IL-1alpha，继续培养至得到成熟DC细胞，即得。
2.根据权利要求1所述的加速树突状细胞成熟的体外培养方法，其特征在于：步骤(1)中，所述培养箱的温度保持37℃恒温，并以体积浓度为5％的二氧化碳为碳源。
3.根据权利要求1所述的加速树突状细胞成熟的体外培养方法，其特征在于：步骤(2)中，所述预定时间为1～2h。
4.根据权利要求1所述的加速树突状细胞成熟的体外培养方法，其特征在于：步骤(2)中，所述GM-CSF试剂在培养容器中的浓度为300-800U/ml，所述Il-4试剂在培养容器中的浓度为10-30ng/ml，所述cholesterol试剂在培养容器中的浓度为0.2-0.5ul/ml。
5.根据权利要求1-4任一项所述的加速树突状细胞成熟的体外培养方法，其特征在于：步骤(3)中，所述LPS在培养容器中的浓度为10-30ug/ml。
6.根据权利要求5所述的加速树突状细胞成熟的体外培养方法，其特征在于：步骤(3)中，所述IL-1alpha在培养容器中的浓度为20-50ng/ml。
7.根据权利要求1-4任一项所述的加速树突状细胞成熟的体外培养方法，其特征在于：步骤(3)中，至少继续培养至第四天时采集成熟DC细胞。
8.权利要求1-7任一项所述的加速树突状细胞成熟的体外培养方法在用于肿瘤治疗的药物制备中的应用。
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