CN103266086A

CN103266086A - 一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法

Info

Publication number: CN103266086A
Application number: CN2013102369745A
Authority: CN
Inventors: 陈玉强; 王勇军; 颜江华; 王生育
Original assignee: No174 Hospital Of Pla
Current assignee: No174 Hospital Of Pla
Priority date: 2013-06-15
Filing date: 2013-06-15
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2033-06-15
Also published as: CN103266086B

Abstract

一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法，涉及树突状细胞。胃癌细胞MGC-803总RNA的提取、鉴定；SOCS1拮抗剂pJAK2(1001－1013)多肽的合成；外周血单个核细胞的分离；单核细胞的获取；未成熟树突状细胞的体外诱导；RNA转染未成熟树突状细胞；pJAK2(1001－1013)多肽负载RNA转染的树突状细胞；未成熟树突状细胞的成熟诱导，即可产生成熟树突状细胞。可改善树突状细胞抗原递呈功能和特异性免疫应答水平，采用SOCS1拮抗剂pJAK2(1001－1013)多肽修饰胃癌细胞总RNA转染的树突状细胞。

Description

一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及树突状细胞，尤其是涉及一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法。

背景技术

树突状细胞（dendritic cells,DC）是目前已知体内抗原递呈能力最强、唯一能活化初始型T淋巴细胞的抗原递呈细胞。DC以主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex,MHC）-多肽复合物的形式递呈抗原，在天然免疫和获得性免疫中发挥着极其重要的作用，引起当前肿瘤免疫治疗的密切关注。

大量的研究表明，DC与肿瘤的发生发展及预后关系密切，肿瘤的发生可能与肿瘤浸润性DC或宿主DC功能缺陷有关，在此情况下，肿瘤患者体内的DC处于一种“无能状态”，无法有效地递呈肿瘤抗原，激活T细胞识别并杀伤肿瘤细胞。可能的原因是由于肿瘤分泌产生的可溶性免疫抑制因子和某些细胞因子抑制了DC的免疫监视和应答功能，从而发生免疫逃逸。此外，DC在活化过程中本身存在的负反馈调节机制也影响了DC免疫功能的发挥。研究发现，细胞因子信号抑制因子（Suppressor of cytokine signaling，SOCS）家族成员SOCS1在DC的免疫负反馈调节中起着重要作用。采用基因敲除或siRNA技术阻断或抑制SOCS1的表达和功能发挥能明显增强DC的抗原递呈功能和更好地诱发特异性抗肿瘤免疫应答。值得一提的是，SOCS1拮抗剂，即pJAK2(1001–1013)多肽（1.Waiboci LW,Ahmed CM,Mujtaba MG,Flowers LO,Martin JP,Haider MI,Johnson HM.Both the suppressor of cytokine signaling1(SOCS-1)kinase inhibitory region and SOCS-1mimetic bind to JAK2autophosphorylation site:implications for the development of a SOCS-1antagonist.J Immunol.2007,178:5058-5068），能增强免疫细胞的抗病毒能力和T细胞的免疫杀伤作用，间接证明了pJAK2(1001–1013)多肽能有效抑制SOCS1的负调节效应（2.Ahmed CM,Dabelic R,Martin JP,Jager LD,Haider SM,Johnson HM.Enhancement of antiviral immunity by small molecule antagonist of suppressor ofcytokine signaling.J Immunol.2010,185:1103-1113），故pJAK2(1001–1013)多肽有望在扭转DC功能缺陷或改善DC抗原递呈功能上发挥重要作用。目前，采用pJAK2(1001–1013)多肽修饰而获得有效递呈抗原的树突状细胞及其制备方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法，该方法可改善树突状细胞抗原递呈功能和特异性免疫应答水平，采用SOCS1拮抗剂，即pJAK2(1001–1013)多肽，修饰胃癌细胞总RNA转染的树突状细胞。

本发明包括如下步骤：

1）胃癌细胞MGC-803总RNA的提取、鉴定：采用

试剂从胃癌细胞MGC-803中提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度、琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA分子量大小；

2）SOCS1拮抗剂pJAK2(1001－1013)多肽的合成；

3）外周血单个核细胞（PBMC）的分离；

4）单核细胞（Monocyte）的获取：采用“人CD14⁺单核细胞分离试剂盒”从步骤3）分离得到的PBMC中分选出单核细胞；

5）未成熟树突状细胞（iDC）的体外诱导：将步骤4）获取的单核细胞在RPMI-1640培养基中经细胞因子GM-CSF和IL-4诱导培养后即产生未成熟树突状细胞（iDC）；

6）RNA转染未成熟树突状细胞；

7）pJAK2(1001－1013)多肽负载RNA转染的树突状细胞：pJAK2(1001–1013)多肽与经RNA电穿孔转染的iDC孵育4h进行负载；

8）未成熟树突状细胞（iDC）的成熟诱导：将步骤6）和7）经RNA转染和SOCS1拮抗剂pJAK2(1001-1013)多肽负载后的iDC采用LPS和TNF-α诱导后，即可产生成熟树突状细胞（mDC）。

在步骤2）中，所述pJAK2(1001–1013)多肽可由上海吉尔生化公司合成。

在步骤3）中，所述外周血单个核细胞（PBMC）的分离可采用密度梯度离心法从健康志愿者外周血中分离PBMC。

在步骤4）中，所述分选，可参照试剂盒的操作说明。

在步骤5）中，所述细胞因子GM-CSF的使用终浓度可为1000U/ml，所述IL-4的使用终浓度可为800U/ml；所述诱导培养的时间可为5d。

在步骤6）中，所述RNA转染未成熟树突状细胞可采用电穿孔的方式进行RNA转染；所述采用电穿孔的方式进行RNA转染的条件可为：RNA转染浓度为5.0μg RNA/2×10⁵DC，电压300V、电容150μF、电阻99Ω、脉冲时间为5～6s。

在步骤7）中，所述iDC孵育的时间可为4h。在步骤8）中，所述SOCS1拮抗剂pJAK2(1001-1013)多肽负载后的iDC的使用终浓度可为30μM；所述LPS的使用终浓度可为1.0μg/ml，TNF-α的使用终浓度可为50ng/ml；所述诱导的时间可为24h。

所制得的成熟树突状细胞（mDC）可进行以下功能鉴定：

通过倒置显微镜观察成熟树突状细胞（mDC）的形态、流式细胞仪鉴定mDC表型、混合淋巴细胞反应检测mDC的免疫刺激能力、ELISA测定mDC分泌细胞因子的能力、ELISPOT测定mDC诱导产生特异性细胞毒T淋巴细胞（CTLs）的水平、LDH释放法检测mDC诱导的CTLs对靶细胞的特异性细胞毒作用。

本发明采用“人CD14⁺单核细胞分离试剂盒”从外周血单个核细胞（peripheral bloodmononuclear cell,PBMC）中分选出高纯度的单核细胞（Monocyte），然后单核细胞经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）和白介素-4（interleukin-4,IL-4）诱导分化至第5天获得未成熟树突状细胞（immature dendritic cells,iDC），胃癌细胞总RNA以电穿孔的方式转染iDC，随即加入SOCS1拮抗剂pJAK2(1001-1013)多肽，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中孵育4h，然后加入脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）继续培养24h，即获得成熟树突状细胞（mature dendritic cells,mDC）。此时收获的mDC通过细胞形态学、表面标志分子、混合淋巴细胞反应强度、细胞因子分泌能力、特异性细胞毒T淋巴细胞（CTLs）诱导水平、对靶细胞的特异性细胞毒作用等进行功能鉴定。

本发明的有益效果是，提供了一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞及其制备方法，为开发更具免疫功能的树突状细胞疫苗用于治疗肿瘤性疾病提供参考。

附图说明

图1为倒置显微镜下观察到的成熟树突状细胞（mDC）的典型细胞形态（400×）。

图2为pJAK2(1001-1013)多肽修饰的mDC增强诱导产生的特异性CTLs对靶细胞的细胞毒作用。在图2中，横坐标为效应细胞(CTLs)∶靶细胞(MGC-803)；纵坐标为细胞毒作用(%)；标记

为pJAK2(1001-1013)负载+RNA转染的mDC，△为RNA转染的mDC，■为mDC。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。

下面实施例中未注明具体条件的实验方法遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。

实施例1：胃癌细胞MGC-803总RNA的提取、鉴定

1.1胃癌总RNA提取

（1）将长满底壁约90%胃癌细胞MGC-803的培养皿置于冰上，吸去培养液；

（2）直接加入1ml

试剂，反复吹打；

（3）将细胞裂解液转移至新的1.5ml Eppendorf管中，室温放置5min；

（4）加入0.2ml氯仿，剧烈混匀15s；

（5）室温放置2～3min；

（6）12,000rpm离心，4℃，15min；

（7）见上层水相，中间混合相，下层酚相。吸取水相，转至新的Eppendorf管中，约0.5ml；

（8）加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min；

（9）12,000rpm离心，4℃，10min；

（10）吸去液体可见白色沉淀，加入75%乙醇1ml，剧烈混匀；

（11）9000rpm离心，4℃，10min；

（12）吸去液体，真空干燥5min；

（13）溶于DEPC处理水中，约25μl，60℃，10min。

1.2胃癌细胞总RNA的鉴定

（1）胃癌总RNA纯度检测及含量计算：取少量提取的RNA，经紫外线扫描，吸收峰位于波长260nm处。用紫外线分光计测定OD₂₆₀和OD₂₈₀值，RNA纯度=OD₂₆₀/OD₂₈₀。根据公式RNA浓度（μg/ml）=OD₂₆₀值×40μg/ml×稀释倍数，计算RNA浓度，RNA总量（μg）=RNA浓度（μg/ml）×总体积（ml）。

（2）胃癌总RNA分子量大小鉴定：

①制备1.2%琼脂糖胶：用DEPC水制备1.2%琼脂糖胶30ml，微波炉加热沸腾，见琼脂糖溶解，室温冷却至60℃，加入3ml10×MOPS，1.6ml去离子甲酰胺，制胶，放置梳子；

②胶凝固后，加1×MOPS电泳缓冲液；

③加样，取10μg提取的RNA样本，加等体积上样缓冲液，共10μl，60℃，5min，加入溴化乙锭，离心；

④走胶：由负极走向正极，1～5V/cm；

⑤当溴酚蓝走至胶边缘后，紫外灯下观察RNA条带情况并照相。

实施例2：SOCS1拮抗剂pJAK2(1001-1013)多肽的合成

pJAK2(1001–1013)多肽的氨基酸序列为¹⁰⁰¹LPQDKEYYKVKE¹⁰¹³，其中下划线Y为磷酸化的酪氨酸。多肽由上海吉尔生化公司合成，纯度为98.0%以上。为防止多肽在体外操作过程中的降解，同时确保能高效进入DC，多肽合成时在N端加了一个亲脂基团（棕榈酰基-赖氨酸）。

实施例3：外周血单个核细胞（PBMC）的分离

新鲜采集健康志愿者抗凝外周血（20U肝素钠/ml全血）50ml，用37℃PBS稀释1倍，沿管壁缓缓倒入盛有已回温的Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液的离心管中（血∶分离液=1∶1），使界面清晰。梯度离心（室温，800g，20min），取中间白膜细胞层，置入50ml离心管中，用不含钙镁的PBS悬浮细胞，离心（800g，10min），清洗细胞2次，再次离心（1200rpm，10min），待血小板洗尽后即获得PBMC。

实施例4：单核细胞（Monocyte）的获取

采用“人CD14⁺单核细胞分离试剂盒”从上述PBMC中分选出高纯度的单核细胞，详细分选步骤参照试剂盒的操作说明。

实施例5：未成熟树突状细胞（iDC）的体外诱导

纯化的CD14⁺单核细胞以1.0×10⁶/ml的浓度接种于6孔板中（3ml/孔），用无血清RPMI-1640培养液于37℃、含5%CO₂的细胞培养箱中培养1h，然后吸掉培养液，用冰冷的PBS漂洗贴壁的单核细胞，然后加入含10%FCS的RPMI-1640培养液，每孔加入终浓度为1000U/ml的rhGM-CSF和800U/ml的rhIL-4，置于37℃、含5%CO₂的细胞培养箱中进行DC的诱导培养，每隔2天进行半量换液，并相应补足细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4，培养5天后即产生未成熟树突状细胞（iDC），收获iDC用于后续的实验。

实施例6：RNA转染未成熟树突状细胞

采用电穿孔的方式使RNA瞬时有效进入DC，使用浓度为5.0μg RNA/2×10⁵DC，电穿孔转染的条件为：电压300V、电容150μF、电阻99Ω、脉冲时间为5～6s。

实施例7：pJAK2(1001-1013)多肽负载RNA转染的树突状细胞

iDC经RNA电穿孔转染后立即置于冰上10min，然后转入含新鲜培养液的6孔板中，随即按照实验分组加入pJAK2(1001-1013)多肽（终浓度为30μM），孵育4h。

实施例8：未成熟树突状细胞（iDC）的成熟诱导

上述经RNA转染和pJAK2(1001-1013)多肽负载后的iDC采用LPS（终浓度为1.0μg/mL）和TNF-α（终浓度为50ng/mL）诱导24h，即可产生成熟树突状细胞（mDC）。

实施例9：成熟树突状细胞（mDC）的功能鉴定

9.1DC形态学观察：操作步骤不再赘述，mDC的典型细胞形态见图1。

9.2DC表型鉴定：取上述iDC和mDC用单克隆抗体直接免疫荧光法染色，流式细胞仪检测DC表面标记分子HLA-DR、CD83和CD86。收集约5×10⁵个细胞，先用PBS洗涤，1000rpm离心5min弃上清。加入50μl PBS，轻轻吹打，制成细胞悬液。按说明书分别加入PE标记的HLA-DR、CD83和CD86荧光抗体，同时采用各种单抗的相应同种IgG（同型对照）作为阴性对照。于室温避光孵育30min后离心，PBS洗涤2次，1000rpm离心5min，重悬细胞。流式细胞仪分析DC的表型，并应用Cell-Quest软件进行分析。结果显示，pJAK2(1001-1013)多肽修饰后的mDC细胞表面标志分子表达率上调。

9.3混合淋巴细胞反应（MLR）：上述mDC用丝裂霉素C（MMC，25μg/10⁶mDCs）于37°C水浴中孵育30min后用RPMI-1640充分洗涤后作为刺激细胞（Stimulator，S），来自PBMC的同种异体T细胞用人CD3⁺分离试剂盒纯化获取作为靶细胞（Target cell，T），分别按S∶T=1∶4、1∶20、1∶100和1∶500的比例混合后，加入到96孔细胞培养板中，总体积为200μl/孔。于37℃含5%CO₂的细胞培养箱中孵育5天后，加入1.0μCi氚标记的胸腺嘧啶核苷（³H-TdR）继续培养16h，用多头细胞收集器将每孔培养物分别吸收于直径24mm的原型玻璃纤维纸上，抽气过滤并用蒸馏水充分洗涤。将滤纸片放80℃烘干约1h后分别浸于脂溶性闪烁液（每杯5ml）中。置于液体闪烁计数器上测定每个样品的每min脉冲数（cpm）值。MLR结果以液闪仪记录的cpm值表示。结果显示，pJAK2(1001-1013)多肽增强RNA转染后的mDC刺激同种异体T细胞增殖的能力。

9.4ELISA：上述iDC和mDC培养上清用于检测IL-12的分泌水平，具体操作步骤按照eBioscience公司提供的“Human IL-12p70High Sensitivity ELISA Kit”试剂盒上的说明进行。结果显示，pJAK2(1001-1013)多肽进一步刺激mDC分泌细胞因子IL-12。

9.5ELISPOT：DC诱导Th0分化为Th1的能力通过ELISPOT检测分泌IFN-γ的细胞数量来确定。具体操作步骤按照R&D Systems公司的“Human IFN-γELISPOT Kit”试剂盒上的说明进行。结果显示，pJAK2(1001-1013)多肽修饰的mDC增加能分泌IFN-γ的Th1细胞数量的产生。

9.6DC诱导特异性CTLs的产生及对靶细胞的细胞毒作用：将上述经MMC处理过各组mDC分别与自体T细胞以1∶10的比例混合，同时加入终浓度为10ng/mL的IL-7共培养7天，于第3天加入IL-2（终浓度为50U/ml），以后每隔3天半量换液一次，并维持相同IL-2浓度。每周按相同程序刺激T细胞一次，3～4次后即为特异性CTLs。将上述CTLs作为效应细胞（effector cell，E），胃癌细胞MGC-803作为靶细胞（Target cell，T），按效/靶比（E∶T）=10∶1、20∶1和40∶1的比例混匀两种细胞后加入96孔培养板中，同时设单一靶细胞及单一效应细胞组，每组各设3个复孔，总体积为200μl/孔。然后按照Promega公司的“CytoTox

Non-Radioactive Cytotoxicity Assay”试剂盒说明书的操作步骤，检测各组细胞的LDH释放水平。特异性CTLs对靶细胞MGC-803的细胞毒性可用以下公式计算得出：CTLs细胞毒性（%）=（实验测定孔OD值－效应细胞自发释放孔OD值－靶细胞自发释放孔OD值）/（靶细胞最大释放孔OD值－靶细胞自发释放孔OD值）×100%。结果显示，pJAK2(1001-1013)多肽提高mDC诱导产生的特异性CTLs对靶细胞的细胞毒作用，数据详见图2。

Claims

1.一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1）胃癌细胞MGC-803总RNA的提取、鉴定：采用

2）SOCS1拮抗剂pJAK2(1001－1013)多肽的合成；

3）外周血单个核细胞的分离；

4）单核细胞的获取：采用人CD14⁺单核细胞分离试剂盒从步骤3）分离得到的PBMC中分选出单核细胞；

5）未成熟树突状细胞的体外诱导：将步骤4）获取的单核细胞在RPMI-1640培养基中经细胞因子GM-CSF和IL-4诱导培养后即产生未成熟树突状细胞；

6）RNA转染未成熟树突状细胞；

8）未成熟树突状细胞的成熟诱导：将步骤6）和7）经RNA转染和SOCS1拮抗剂pJAK2(1001－1013)多肽负载后的iDC采用LPS和TNF-α诱导后，即可产生成熟树突状细胞。

2.如权利要求1所述一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤3）中，所述外周血单个核细胞的分离采用密度梯度离心法从健康志愿者外周血中分离PBMC。

3.如权利要求1所述一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤4）中，所述分选参照试剂盒的操作说明。

4.如权利要求1所述一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤5）中，所述细胞因子GM-CSF的使用终浓度为1000U/ml，所述IL-4的使用终浓度为800U/ml。

5.如权利要求1所述一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤5）中，所述诱导培养的时间为5d。

6.如权利要求1所述一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤6）中，所述RNA转染未成熟树突状细胞采用电穿孔的方式进行RNA转染。

7.如权利要求6所述一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法，其特征在于所述采用电穿孔的方式进行RNA转染的条件为：RNA转染浓度为5.0μg RNA/2×10⁵DC，电压300V、电容150μF、电阻99Ω、脉冲时间为5～6s。

8.如权利要求1所述一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤7）中，所述iDC孵育的时间为4h。

9.如权利要求1所述一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤8）中，所述SOCS1拮抗剂pJAK2(1001-1013)多肽负载后的iDC的使用终浓度为30μM；所述LPS的使用终浓度可为1.0μg/ml，TNF-α的使用终浓度可为50ng/ml。

10.如权利要求1所述一种有效递呈胃癌抗原的树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤8）中，所述诱导的时间为24h。