CN111690609A - 一种新生抗原免疫原性的测试方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新生抗原免疫原性的测试方法，通过将多条抗原多肽分为几组，利用单独负载、共同刺激的方式，显著降低了实验的操作复杂度，大幅简化了实验流程的同时，保证了实验结果的准确性，与常规单独负载、单独刺激的方式相比，可通过多条多肽共同刺激T细胞，测试时，只需检测一份T细胞中含有的不同新生抗原多肽特异性T细胞，测试过程得到了显著简化，提高了工作效率，同时降低了测试成本。

Description

一种新生抗原免疫原性的测试方法
技术领域
本发明属于细胞生物学及生物信息学技术领域，涉及一种免疫原性检测方法，具体地说涉及一种新生抗原免疫原性的测试方法。
背景技术
通常，验证新生抗原的免疫原性的方法是从肿瘤患者或健康志愿者的外周血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，并从PBMC中分选出T细胞，或者从肿瘤组织中分离瘤浸润淋巴细胞(TIL)，并分选出T细胞；从而对外周血来源的T细胞或TIL来源的T细胞，用酶联免疫斑点法(Elispot)验证新生抗原的免疫原性。对于外周血来源的T细胞，由于其中含有的新生抗原特异性T细胞的频率很低，甚至低于最敏感的实验方法的检测限，通常需要先采用预刺激的方式，即使用抗原呈递细胞(树突状细胞简称DC细胞)提呈一种新生抗原多肽，将其与T细胞共同孵育，刺激这种新生抗原特异性T细胞的增殖后方可进行各种检测，例如，制备新生抗原多肽四聚体，做四聚体流式分析，检测培养之后的T细胞中新生抗原特异性T细胞的比例。但是，四聚体制备费用高昂，而用于制备四聚体的人类白细胞抗原(HLA)单体种类很少，只有HLA A*0201，HLA A*1101，HLA A*3303等少数几种，即只能够制作HLA A*0201，HLAA*1101，HLA A*3303等少数几种HLA分子所提呈的新生抗原所对应四聚体。对于MHC II类新生抗原，目前还不能制备四聚体，也就是说，MHC II类新生抗原无法用四聚体流式的方法验证。另外，肿瘤患者的HLA分型千差万别，四聚体流式检测方法的应用范围很有限。
对于Elispot检测，在准备T细胞阶段，为了避免HLA分子提呈抗原多肽以及TCR对抗原的识别之间的竞争作用，常规做法是，分别用单条新生抗原负载到DC细胞上，与T细胞共孵育，刺激产生针对单条新生抗原的特异性T细胞(单独负载、单独刺激)，这种操作方法过程繁琐，工作量巨大，且所需T细胞数量众多，需采集大量PBMC，耗时耗力；或者通过一份DC细胞负载多条新生抗原多肽，然后与T细胞共孵育，刺激产生针对多条新生抗原的特异性T细胞(混合负载、混合刺激)。
针对TIL来源的T细胞，通常做法是，将算法预测的肿瘤突变位点构建成串联小基因(Tandem minigene，简称TMG)，然后通过电转的方式导入DC细胞，再与T细胞共孵育做四聚体流式或Elispot检测。这种方式需要大量的新鲜肿瘤组织，以用于TIL细胞的培养，但浸润肿瘤组织中的T细胞种类有限，与PBMC中的T细胞相比，种类单一。同时，因为电转过程中DC细胞会大量死亡，需要大量的DC细胞用于电转。这些都是应用过程中存在的限制条件。这个方法在实际操作上技术难度较大，较少被采用。
因此，亟需一种难度低、省时省力、成本低廉的新生抗原免疫原性的测试方法。
发明内容
为此，本发明正是要解决上述技术问题，从而提出一种简便经济、高效准确的新生抗原免疫原性的测试方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
本发明提供一种新生抗原免疫原性的测试方法，其包括如下步骤：
S1、分离获取外周血单个核细胞；
S2、从所述外周血单个核细胞中分离获取CD8阳性或CD4阳性T细胞；
S3、分选得到CD8阴性T细胞或CD4阴性T细胞，并分离得到单核细胞；
S4、将所述单核细胞诱导为DC细胞；
S5、将所述DC细胞分组，并使每组DC细胞负载一条抗原多肽，将负载有抗原多肽的DC细胞与阳性T细胞共培养；
S6、将多组DC细胞混合，并将混合后的DC细胞与CD8阳性T细胞或CD4阳性T细胞共培养，得到共培养细胞。
作为优选，所述步骤S6所述的：共培养过程中，每隔一天向所述共培养细胞中增加含细胞因子的培养基，共培养后，得到待测细胞。
作为优选，所述步骤S6中，DC细胞与T细胞的数量比为1:8。
作为优选，所述步骤S6中，所述共培养的时间为7-10日。
作为优选，所述细胞因子为IL-2、IL-7、IL-15中的至少一种。
作为优选，所述步骤S5中，所述DC细胞分组的数量为2*105/组，所述抗原多肽的浓度为25-50μg/ml，所述DC细胞与所述抗原多肽共同孵育2-4h后，即得负载有抗原多肽的DC细胞。
作为优选，所述步骤S2中，所述分离获取CD8阳性或CD4阳性T细胞是通过磁珠进行分选。
作为优选，所述步骤S3中，所述单核细胞通过贴壁法分离得到。
作为优选，所述步骤S6后还包括Elispot检测的步骤。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明所述的新生抗原免疫原性的测试方法，通过将多条抗原多肽分为几组，利用单独负载、共同刺激的方式，显著降低了实验的操作复杂度，大幅简化了实验流程的同时，保证了实验结果的准确性，与常规单独负载、单独刺激的方式相比，可通过多条多肽共同刺激T细胞，测试时，只需检测一份T细胞中含有的不同新生抗原多肽特异性T细胞，测试过程得到了显著简化，提高了工作效率，同时降低了测试成本。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是现有技术中第一种测试方法的流程图；
图2是现有技术中第二种测试方法的流程图；
图3是本发明实施例所述的测试方法的流程图；
图4是现有技术中第一种测试方法的Elispot测试结果；
图5是现有技术中第二种测试方法的Elispot测试结果；
图6是本发明实施例所述测试方法的Elispot测试结果；
图7是本发明实施例所述测试方法对TurNeo算法预测的新生抗原肽的免疫原性测试结果。
具体实施方式
实施例
本实施例提供一种新生抗原免疫原性的测试方法，如图1所示，所述方法包括如下步骤：
S1、从外周血中分离得到外周血单个核细胞(PBMC)，采用Ficoll paque plus单核细胞分离液试剂(品牌：GE healthcare；货号17-1440-02)从外周血中分离PBMC。
S2、用CD8磁珠(品牌：MILTENYI，货号：130-045-201)从PBMC中分选出CD8阳性T细胞或CD4阳性T细胞。
S3、分选得到CD8阴性T细胞或CD4阴性T细胞，经过步骤S2的分选，选出CD8阳性T细胞或CD4阳性T细胞后剩余即为CD8阴性T细胞或CD4阴性T细胞，然后通过贴壁法分离得到单核细胞。本实施例以CD8阳性T细胞为例，分选出的CD8阳性T细胞按照5*106/ml的浓度冻存。
S4、将单核细胞在细胞因子的诱导下，诱导成为DC细胞(树突状细胞)。
S5、将诱导得到的DC细胞按照2*105/组的数量分为5组，每组DC细胞负载一条抗原多肽，所述抗原多肽的浓度为25μg/ml。本实施例中，负载抗原多肽的具体方法为：将离心后的DC细胞用x-vivo(无血清培养基)重悬，重悬为2*105/0.4ml，然后分别置于0.6ml的EP管中，一条多肽加入到一管DC细胞中，每隔30min摇晃一次，孵育2-4h。之后再2000rpm的转速下离心10min，收集负载了单条多肽的DC细胞。
S6、将5组DC细胞混合，并将混合后的DC细胞与CD8阳性T细胞共培养，按照DC细胞与CD8阳性T细胞比例为1：8配比共培养7-10天，每隔一天，补加含IL-2,IL-7,IL-15细胞因子的培养基，最后得到共培养细胞。
在收取DC细胞的前一天下午，复苏CD8阳性T细胞：
准备14ml AIM-V培养基+10％自体血浆，在37℃下预热，将细胞置于42℃水浴中融化到有一个小冰核时取出。打开冻存管，先用酒精棉球擦拭瓶口处，用1ml移液枪将细胞吸出至15ml的离心管中，然后用1ml移液枪吸取预热好的培养基，先洗一次冻存管，再将枪头伸入到离心管底，缓慢加入培养基，此过程大约30s，然后重复此步骤，用大约10s将1ml培养基加入到离心管中，最后将7ml培养基在30s内加入细胞中，在500g的转速下离心处理7min。用10ml移液管去除上清，剩下1ml用1ml移液枪轻轻吸走。用手轻拍离心管底部，使细胞沉淀分散开，用2ml配好的培养基重悬，取10ul稀释后计数。用AIM-V+10％自体血浆+IL7(10ng/ml)重悬T细胞，然后在24孔板中培养过夜。CD8阳性T细胞休息时，铺板密度小一点，减少细胞成团概率，细胞数量为4-5*105/cm2。如果CD8阳性T休息过夜后出现成团的细胞，在培养基中加入十分之一的DNase I(1mg/ml)，在37℃下孵育10min，团块就可以散开成单细胞。按照如上的操作步骤，复苏后可以收获90％以上的CD8阳性T细胞。
将复苏后的CD8阳性T细胞与DC细胞共同培养：
共培养第一天，按照1:8的比例，将2*105个DC细胞与1.6*106个CD8阳性T细胞混合均匀，铺在24孔板中。用AIM-V+10％自体血清+30ng/mlIL-21培养基培养细胞。之后每隔一天，半量换液。培养基为AIM-V+10％自体血清+10ng/mlIL-2+5ng/mlIL-7+1ng/ml IL-15。
S7、Elispot测试：
所述Elispot测试的原理为：抗原呈递细胞提呈的抗原肽，如果能被T细胞表面的TCR识别，进而激活T细胞分泌IFN-γ，被Elispot板中提前包被的IFN-γ抗体抓住，显色后在孔板上形成斑点。一个斑点代表一个分泌IFN-γ的T细胞。证明抗原肽能刺激T细胞产生免疫应答，具有免疫原性。反之，则不能形成斑点，也就是说，抗原肽没有免疫原性。
测试方法为：准备T细胞，将多肽刺激物和T细胞加入Elispot孔板中，共孵育24小时，显色后在孔底的膜上形成斑点。
测试时，现有技术中，单独负载、单独刺激的方式(方式一)按照表1-5所列的方式进行铺板：
表1
T1+DC+#1 T1+DC+#1 T1+DC+#1 DC+#1
T1+DC+neg T1+DC+neg T1+DC+neg DC+neg
T1+DC T1+DC T1+DC DC
T1 T1 T1 DC
T1+PHA T1+PHA T1+PHA DC
表2
T2+DC+#2 T2+DC+#2 T2+DC+#2 DC+#2
T2+DC+neg T2+DC+neg T2+DC+neg DC+neg
T2+DC T2+DC T2+DC DC
T2 T2 T2 DC
T2+PHA T2+PHA T2+PHA DC
表3
T3+DC+#3 T3+DC+#3 T3+DC+#3 DC+#3 T3+#3
T3+DC+neg T3+DC+neg T3+DC+neg DC+neg T3+neg
T3+DC T3+DC T3+DC DC T3
T3+PHA T3+PHA T3+PHA DC T3
表4
T4+DC+#4 T4+DC+#4 T4+DC+#4 DC+#4 T4+#4
T4+DC+neg T4+DC+neg T4+DC+neg DC+neg T4+neg
T4+DC T4+DC T4+DC DC T4
T4+PHA T4+PHA T4+PHA DC T4
表5
T5+DC+#5 T5+DC+#5 T5+DC+#5 DC+#5 T5+#5
T5+DC+neg T5+DC+neg T5+DC+neg DC+neg T5+neg
T5+DC T5+DC T5+DC DC T5
T5+PHA T5+PHA T5+PHA DC T5
混合负载、混合刺激(方式二)、单独负载、混合刺激(方式三)的铺板方式如表6所示：
表6
T+DC+#1 T+DC+#1 T+DC+#1 DC+#1
T+DC+#2 T+DC+#2 T+DC+#2 DC+#2
T+DC+#3 T+DC+#3 T+DC+#3 DC+#3
T+DC+#4 T+DC+#4 T+DC+#4 DC+#4
T+DC+#5 T+DC+#5 T+DC+#5 DC+#5
T+DC+neg T+DC+neg T+DC+neg DC+neg
T+DC T+DC T+DC DC
T T T DC
T+PHA T+PHA T+PHA DC
表1-6中，#1-#5分别为5种不同的HLAA*0201抗原肽，具体的蛋白质序列如表7所示；T1-T5为5组DC细胞共同培养的CD8阳性T细胞。
表7
#1 肿瘤新生抗原(neoantigen) AVGSYVYSV
#2 肿瘤新生抗原(neoantigen) NLNCCSVPV
#3 巨细胞病毒(CMV) NLVPMVATV
#4 EB病毒(EBV) GLCTLVAML
#5 Melon A EAAGIGILTV
Elispot测试的具体过程为：
(1)用无菌PBS洗涤Elispot板5次，所述Elispot板板孔容积为200μl/孔。
(2)向Elispot板中加入1640+10％FBS培养基，200μl/孔，在37℃、5％的CO2孵箱中封闭30分钟后弃去培养基。也可以采用用做Elispot重悬细胞所使用的培养基(含10％血清)封闭Elispot板。
(3)负载有多肽的DC细胞和T细胞计数后，用AIM-V重悬。按照5×104T细胞/孔和5×103DC细胞/孔的密度铺板。培养体积为100uL T细胞/孔，50uL DC细胞/孔。Elispot的细胞培养基不要加血清。
(4)将Elispot培养板放入37℃、5％CO2的培养箱中，培养24h，培养时不可移动培养板。
(5)培养24h后弃去细胞，用PBS洗板5次，200μl/孔，将孔内PBS甩干。
(6)用0.22μM滤器过滤含0.5％FBS的PBS，稀释一抗(200×)，100μl/孔，37℃下处理2小时。
(7)用PBS洗板5次，200μl/孔。将孔内PBS甩干。
(8)加入100μl/孔底物显色液(显色液使用前需用0.22μM滤器过滤)，直至斑点出现(一般在2-10min斑点会出现，这个时间可以进行跟踪观察，斑点数量不再变化时终止反应)。
(9)迅速将板底拆开，用自来水反复洗板正反面。
(10)板底干后计数(计数前一定保证板子干燥，否则会影响实验结果的判读)。板子内的PVDF膜彻底干了之后，颜色会变成白色。
(11)在AID Elispot Reader上应用预设好的count setting进行全自动斑点图像采集和计数，输出每孔斑点图像和斑点数，保存每孔斑点详细信息。
(12)分泌IFN-γ的抗原特异性细胞频率计算根据每孔起始细胞数量及分泌斑点数。试验判断阳性的标准：SFC(样品)/SFC(阴性对照)>2。
抗原免疫原性的测定结果：若多肽的Elispot结果为阳性，则判断该抗原多肽具有免疫原性。
实施例1
本实施例提供了一种新生抗原免疫原性的测试方法，对上述#1-#5五条抗原多肽的免疫原性测定过程具体如下：
S1、从100ml外周血中，通过ficoll分离得到，1.2*108PBMC。
S2、通过CD8磁珠分选，从PBMC中得到2.4*107CD8阳性T细胞，用10％FBS+90％DMSO按照5*106/ml的密度将CD8阳性T细胞冻存起来。待DC细胞成熟时，再复苏使用。
S3、分选出CD8阳性T细胞后，剩余即得CD8阴性T细胞，将CD8阴性T细胞铺到6孔板中，单核细胞会贴壁，移走悬浮细胞。
S4、培养DC细胞，向贴壁分离出的单核细胞中加入细胞因子，诱导成DC细胞，培养7天后，得到成熟的DC细胞，收集所述成熟的DC细胞。
S5、将DC细胞分组，并使DC细胞以不同的方式负载抗原多肽，并与CD8阳性T细胞共培养，刺激产生抗原特异性T细胞。本实施例中，不同的方式负载抗原多肽包括：每组DC细胞负载一条抗原多肽(方式一)，每组DC细胞负载多条抗原多肽(方式二)。
DC细胞负载抗原多肽的过程为：
将多肽用相应溶剂溶解，配置成浓度为1mg/ml溶液。将收集到的成熟DC细胞用不含血清的培养基X-VIVO重悬成3*105/ml的细胞悬液，1ml/管分装到1.5ml EP管中，加入表8所示的多肽。
表8
Figure BDA0002561410870000101
加入多肽后，充分混匀，在培养箱放置4h，剩余成熟DC细胞冻存。
S5、复苏CD8阳性T细胞，得到2.1*107CD8阳性T细胞；将负载了多肽的DC细胞在400gx10m离心后，用AIM-V培养基重悬DC细胞，计数。六组DC细胞，每组取2*105，分别与1.6*106CD8阳性T细胞共培养。然后将第一到第五组DC细胞，每组取4*104，混合在一起，共2*105，与1.6*106CD8阳性T细胞共培养(方式三)。其中，#1DC细胞刺激的CD8阳性T细胞命名为T1，以此类推。
用AIM-V+10％自体血清+30ng/mlIL-21培养基培养T细胞。之后每隔一天，半量换液。培养基为AIM-V+10％自体血清+10ng/mlIL-2+5ng/mlIL-7。
S51、分部对上述方式一-三得到的共培养细胞做Elispot检测：
首先，复苏DC细胞，并按照下表9负载多肽：
表9
DC编号 加入多肽 体积(ul)
#1 AVGSYVYSV 1
#2 NLNCCSVPV 1
#3 NLVPMVATV 1
#4 GLCTLVAML 1
#5 EAAGIGILTV 1
Neg ctl SLYNTVATL 1
空载 无 0
测试结果如图4-6所示，从图中可看出，第一种方式(单独负载、单独刺激)与第三种方式(单独负载、混合刺激)所得到的测试结果较为一致，#2，#3，#4，#5多肽刺激T细胞产生的斑点数是实验对照孔斑点数的2倍以上，判断为Elispot阳性。即这两种方式验证#2，#3，#4，#5多肽具有免疫原性，验证结果一模一样。而第二种方式(混合负载、混合刺激)得出的实验结果为：#3，#4，#5多肽刺激T细胞产生的斑点数是实验对照孔斑点数的2倍以上，这三条多肽判断为Elispot阳性，#2多肽判断为Elispot阴性，实际为Elispot阳性。混合负载混合刺激的方式，存在假阴性结果。单独负载单独刺激所需的T细胞的数量是另外两种方式的5倍，T细胞培养及Elispot检测的工作量与另外两种方式比较翻了5倍。综合评估，单独负载混合刺激的方式是最简便高效且准确的实验方法。
进一步地，用方式三(单独负载、混合刺激)的方式验证5条用TurNeo算法预测的新生抗原肽的免疫原性，采用的多肽序列如表10所示：
表10
#6 neoantigen RAARFRICK
#7 neoantigen CVIHNFWISK
#8 neoantigen VIHNFWISK
#9 neoantigen AVVSVFRFLK
#10 neoantigen VVSVFRFLK
测试结果如图7所示：单独负载混合刺激得出的实验结果是：#7，#8，#9新生抗原多肽刺激T细胞产生的斑点数是实验对照孔斑点数的2倍以上，判断为Elispot阳性，由此得出结论，这三条新生抗原具有免疫原性，该方法效率和检测灵敏度高。
本实施例所述的方法，通过将多条抗原多肽分为几组，使每份DC细胞负载一条新生抗原多肽，然后再将负载了不同抗原多肽的DC细胞与T细胞共同培养，刺激抗原特异性细胞增殖，另外，基于识别某些抗原肽特别是新生抗原肽的TCR频率很低的问题，采取了预刺激的方式，提高低频抗原特异性TCR的频率。以利于检测到这种抗原肽的免疫原性。与常规Elispot的测试方法(在PBMC中直接加入多肽刺激物，利用PBMC中少量的B细胞或者巨噬细胞提呈抗原肽)相比，测试过程做了改良，用抗原呈递能力最强的DC细胞作为抗原呈递细胞，提高了Elispot检测灵敏度。与传统的方式一和方式二相比，本实施例所述的方式三具有与方式一相当的测试准确性，不存在假阴性的情况，并且简便经济，可以大大提高工作效率。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳裕泰抗原科技有限公司
<120> 一种新生抗原免疫原性的测试方法
<130> 20200617
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 1
Ala Val Gly Ser Tyr Val Tyr Ser Val
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 2
Asn Leu Asn Cys Cys Ser Val Pro Val
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 3
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 4
Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 5
Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5 10
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 6
Arg Ala Ala Arg Phe Arg Ile Cys Lys
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 7
Cys Val Ile His Asn Phe Trp Ile Ser Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 8
Val Ile His Asn Phe Trp Ile Ser Lys
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 9
Ala Val Val Ser Val Phe Arg Phe Leu Lys
1 5 10
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 10
Val Val Ser Val Phe Arg Phe Leu Lys
1 5

Claims (9)

1.一种新生抗原免疫原性的测试方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、分离获取外周血单个核细胞；
S2、从所述外周血单个核细胞中分离获取CD8阳性或CD4阳性T细胞；
S3、分选得到CD8阴性T细胞或CD4阴性T细胞，并分离得到单核细胞；
S4、将所述单核细胞诱导为DC细胞；
S5、将所述DC细胞分组，并使每组DC细胞负载一条抗原多肽，将负载有抗原多肽的DC细胞与阳性T细胞共培养；
S6、将多组DC细胞混合，并将混合后的DC细胞与CD8阳性T细胞或CD4阳性T细胞共培养，得到共培养细胞。
2.根据权利要求1所述的新生抗原免疫原性的测试方法，其特征在于，所述步骤S6所述的：共培养过程中，每隔一天向所述共培养细胞中增加含细胞因子的培养基，共培养后，得到待测细胞。
3.根据权利要求2所述的新生抗原免疫原性的测试方法，其特征在于，所述步骤S6中，DC细胞与T细胞的数量比为1:8。
4.根据权利要求3所述的新生抗原免疫原性的测试方法，其特征在于，所述步骤S6中，所述共培养的时间为7-10日。
5.根据权利要求4所述的新生抗原免疫原性的测试方法，其特征在于，所述细胞因子为IL-2、IL-7、IL-15中的至少一种。
6.根据权利要求1-5任一项所述的新生抗原免疫原性的测试方法，其特征在于，所述步骤S5中，所述DC细胞分组的数量为2*105/组，所述抗原多肽的浓度为25-50μg/ml，所述DC细胞与所述抗原多肽共同孵育2-4h后，即得负载有抗原多肽的DC细胞。
7.根据权利要求6所述的新生抗原免疫原性的测试方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述分离获取CD8阳性或CD4阳性T细胞是通过磁珠进行分选。
8.根据权利要求7所述的新生抗原免疫原性的测试方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述单核细胞通过贴壁法分离得到。
9.根据权利要求8所述的新生抗原免疫原性的测试方法，其特征在于，所述步骤S6后还包括Elispot检测的步骤。
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