CN112666358A - 一种使用外周血检测抗原免疫原性的方法 - Google Patents

Abstract

一种使用外周血检测抗原免疫原性的方法，包括：离心步骤，包括使用密度梯度离心管对外周血样本进行离心，分离得到外周血单个核细胞；多肽培养步骤，包括取部分外周血单个核细胞，培养过程中，分多次加入待测抗原多肽、培养基、细胞因子，培养得到被多肽刺激的外周血单个核细胞；树突状细胞培养步骤，包括取部分外周血单个核细胞，诱导培养，得到树突状细胞；检测步骤，将被多肽刺激的外周血单个核细胞与树突状细胞混合孵育，检测抗原多肽是否具有免疫原性。通过短时间离心后，进行多肽刺激培养外周血单个核细胞，可快速检测待测抗原的免疫原性，显著简化操作步骤，缩短检测时间，并且只需少量外周血，显著降低样本的获取难度。

Description

一种使用外周血检测抗原免疫原性的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种使用外周血检测抗原免疫原性的方法。

背景技术

关于新生抗原的免疫原性的检测，早期主要采用肿瘤浸润淋巴细胞(TumorInfiltrating Lymphocyte，TIL)来检测新生抗原的免疫原性。80年代科学家们发现手术切除的肿瘤组织中，大部分是肿瘤细胞，也有少部分淋巴细胞。科学家可以通过一些培养方法把这些肿瘤组织中的淋巴细胞扩增起来(Rosenberg et al.,2011)。这些淋巴细胞中有些是能够杀伤肿瘤细胞的新生抗原特异性T细胞。具体培养方法如下：首先，从进行手术的病人身上采集新鲜的肿瘤组织，马上将肿瘤组织运输到实验室，将手术切除的肿瘤组织(1-2mm³)分割成很多小块，每一块放在不同的培养孔中，待各孔的TIL长满后，筛选出含有新生抗原特异性T细胞的TIL，再大量扩增。如果能从TIL中找到新生抗原特异性T细胞，则证明新生抗原具有免疫原性。通过测序、生信分析和新生抗原预测算法，获知新生抗原序列，将它们的DNA序列(minigene)串联起来，形成串联小基因(TMG)，然后转录成RNA，再通过电转的方式导入抗原呈递细胞，将各个培养孔里的TIL分别与抗原呈递细胞共孵育做酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测，出现阳性结果则表明这个孔的TIL中含有新生抗原特异性T细胞，至于是哪条新生抗原，还需要将串联小基因中各每个新生抗原，分别合成多肽，负载至抗原呈递细胞，逐个进行ELISPOT检测。最后才能知道这一孔TIL中含有的新生抗原特异性T细胞识别的到底是哪条新生抗原，从而确定哪条新生抗原具有免疫原性。

研究者们发现在肿瘤患者的外周血中也存在新生抗原特异性T细胞，也就是说可以采用外周血样品来检查新生抗原的免疫原性。研究者们首先从PBMC中分选出CD8+及PD-1+双阳性细胞，扩大培养到一定数量，采用与上述类似的DNA序列串联的方式，将新生抗原DNA序列串联起来，形成TMG，然后转录成RNA，再通过电转的方式导入抗原呈递细胞，将导入了不同TMG的抗原呈递细胞分别与CD8+及PD-1+双阳性细胞共孵育做ELISPOT检测。可以找到ELISPOT阳性的TMG，至于是哪条新生抗原，还需要将TMG中各每个新生抗原，分别合成多肽，负载至抗原呈递细胞，逐个进行ELISPOT检测。最后才能知道哪条新生抗原具有免疫原性。操作过程繁琐，而且耗时较长。

发明内容

根据第一方面，一种实施例中提供一种使用外周血检测抗原免疫原性的方法，包括：

离心步骤，包括使用密度梯度离心管对外周血样本进行离心，分离得到外周血单个核细胞；

多肽培养步骤，包括取部分外周血单个核细胞，培养过程中，分多次加入待测抗原多肽、培养基、细胞因子，培养得到被多肽刺激的外周血单个核细胞；

树突状细胞培养步骤，包括取部分外周血单个核细胞，诱导培养，得到树突状细胞；

检测步骤，将被多肽刺激的外周血单个核细胞与树突状细胞混合孵育，检测抗原多肽是否具有免疫原性。

依据上述实施例的方法，通过短时间离心后，进行多肽刺激培养外周血单个核细胞，可快速检测待测抗原的免疫原性，显著简化操作步骤，缩短检测时间，并且只需少量外周血，显著降低样本的获取难度。

附图说明

图1为实施例1的ELISPOT检测斑点数结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。

本文中，IL-2是指白细胞介素-2，是趋化因子家族的一种细胞因子。

本文中，IL-15是指白细胞介素-15，是趋化因子家族的一种细胞因子。

本文中，“μM”表示浓度μmol/L。

本文中，“外周血”是除骨髓之外的血液。

本文中，“自体血浆”是指与PBMC来自于同一患者的血浆。

本文中，“PHA”是指植物凝集素，英文名称为Phytohaemagglutinin。

现有的新生抗原免疫原性检测技术需要TIL，而TIL来源于新鲜肿瘤组织。如果病人不能做手术，则无法获取肿瘤组织和TIL；而大多数癌症晚期病人都不能做手术，因此获取TIL有困难。在某些肿瘤病人中，有研究者发现，TIL细胞中的细胞毒性T细胞处于耗竭状态。肿瘤的形成是一个长期的过程，在这一漫长的进程中，识别肿瘤细胞的效应T细胞产生之后，肿瘤抗原仍然存在，在肿瘤抗原的长期、反复刺激作用下，T细胞逐渐失去效应功能并最终变成耗竭型。通常，T细胞分泌IL-2的能力以及高增殖能力会在早期首先丧失，其次，分泌IFN-γ、TNF和趋化因子的量随后大幅下降。T细胞耗竭也伴随着抑制性受体(包括PD-1、LAG-3、2B4、CD160)的表达逐渐增加。最终，如果持续时间过长，特异性T细胞可能会丢失(“缺失”)。因此，从TIL中分离出来的T细胞很有可能是丧失了抗肿瘤功能的。也正是由于上述原因，TIL中的新生抗原特异性T细胞的种类比较少，甚至没有。

从肿瘤组织中培养新生抗原特异性T细胞的过程如下：首先，从进行手术的病人身上采集新鲜的肿瘤组织，马上将肿瘤组织运输到实验室，将手术切除的肿瘤组织分割成很多1-2mm³的小块，每一块放在不同的培养孔中，研究者们从病人的肿瘤组织中分离出TIL，这个过程需要一个月。再从TIL中找出新生抗原特异性T细胞，这个过程需要两个月。整个过程需要两到三个月。即使采集了新鲜肿瘤组织，从中分离培养了TIL，用ELISPOT检测新生抗原免疫原性时依然需要大量PBMC(外周血单个核细胞，Peripheral blood mononuclearcell，简称PBMC)来获得树突状细胞(DC)作为抗原呈递细胞。

由于外周血中TCR(T细胞受体，T cell receptor，简称TCR)库的多样性，所含的TCR非常丰富，任何人的外周血分离出来的PBMC中都含有他所拥有的全部TCR克隆。从理论上来说，如果患者体内存在新生抗原特异性T细胞，都可以从外周血中找到。可喜的是，科学家们的确在病人的外周血中也找到了新生抗原特异性T细胞，并且PBMC中的新生抗原特异性T细胞的种类相较TIL而言更多，因为远离肿瘤组织而不会陷入无能状态，所以从外周血中发现新生抗原特异性T细胞可能比从肿瘤组织中发现新生抗原特异性T细胞更容易。也就是说，用外周血样品来检测新生抗原的免疫原性更合适。

现有技术中，从外周血分离PBMC时，红细胞残留较多，不得不反复做梯度密度离心和洗涤，细胞数量损失较大，从而需要采集较多的外周血，无法用少量外周血完成实验。

不论采用TIL还是PBMC，现有的检测新生抗原免疫原性的传统的TMG的方法需要大量的肿瘤患者外周血(＞100mL)。并且实验流程复杂，周期较长，技术难度较高。即使用PBMC检测新生抗原的免疫原性，实验的周期比TIL的短一些，但是依然需要一个月以上。

鉴于现有技术存在的缺陷，在一些实施例中，本发明提供一种使用外周血检测抗原免疫原性的方法，包括：

离心步骤，包括使用密度梯度离心管对外周血样本进行离心，分离得到外周血单个核细胞；

多肽培养步骤，包括取部分外周血单个核细胞，培养过程中，分多次加入待测抗原多肽、培养基、细胞因子，培养得到被多肽刺激的外周血单个核细胞；

树突状细胞培养步骤，包括取部分外周血单个核细胞，诱导培养，得到树突状细胞；

检测步骤，将被多肽刺激的外周血单个核细胞与树突状细胞混合孵育，检测抗原多肽是否具有免疫原性。

在一些实施例中，所述外周血样本为肿瘤患者外周血。

在一些实施例中，所述肿瘤患者的癌症的类型不受限制，可以包括但不限于肝癌、肺癌、胃癌、结直肠癌等等。通常为肿瘤患者。肿瘤(tumour)是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物(neogrowth)，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物(neoplasm)。

在一些实施例中，所述外周血样本的体积≤10mL，优选为10mL。具体可以为5-10mL，包括但不限于5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL等等。

在一些实施例中，所述密度梯度离心管为SepMate 50(RUO)密度梯度离心管。

在一些实施例中，使用密度梯度离心管对外周血样本进行离心时，离心力为1000-1300×g，离心时间为20-30min。离心力包括但不限于1000×g、1100×g、1200×g、1300×g；离心时间包括但不限于20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min。

在一些实施例中，多肽培养步骤中，每隔1-2天进行半量换液，加入细胞因子和待测抗原多肽。通常是每个1天进行半量换液，如果培养基颜色没有变化，也可以每隔2天进行换液。

在一些实施例中，所述半量换液的具体方法如下：从培养体系中取出一半体积的原培养基，离心，去上清，加入同样体积的新鲜培养基，再将重悬细胞补加到原孔中。

在一些实施例中，多肽培养步骤中，所述培养基选自AIM-V培养基。

在一些实施例中，多肽培养步骤中，所述细胞因子包括但不限于IL-2、IL-15中的至少一种。

在一些实施例中，多肽培养步骤中，每种抗原多肽培养体系所需的外周血单个核细胞数量至少为10⁶。例如，每种抗原多肽培养体系所需的外周血单个核细胞数量可以为1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶等等，最低可降至1×10⁶，显著减少所需的外周血单个核细胞数量。

在一些实施例中，树突状细胞培养步骤中，用于培养树突状细胞的外周血单个核细胞数量至少为2.5×10⁶。例如，可以为2.5×10⁶、2.6×10⁶、2.7×10⁶、2.8×10⁶、2.9×10⁶、3.0×10⁶等等，显著少于现有技术培养树突状细胞所需的外周血单个核细胞数量。

在一些实施例中，多肽培养步骤中，在外周血单个核细胞培养的当天，加入培养基、待测抗原多肽。

在一些实施例中，在外周血单个核细胞培养的当天加入的培养基为含有10％(体积)FBS的AIM-V培养基。

在一些实施例中，在外周血单个核细胞培养的当天，每种抗原多肽培养体系中加入的培养基至少为0.5mL，可以为0.5mL、1mL等等。

在一些实施例中，在外周血单个核细胞培养的当天，每种抗原多肽培养体系中待测抗原多肽的终浓度为10μg/mL。

在一些实施例中，多肽培养步骤中，在外周血单个核细胞培养的第三天、第五天、第七天，均进行半量换液，加入培养基、细胞因子以及待测抗原多肽。

在一些实施例中，所述培养基为含有10％(体积)自体血浆的AIM-V培养基。

在一些实施例中，所述细胞因子包括IL-2、IL-15。

在一些实施例中，在外周血单个核细胞培养的第三天、第五天、第七天，加入细胞因子IL-2、IL-15后，每种抗原多肽培养体系中细胞因子IL-2、IL-15的浓度均为1ng/mL。

在一些实施例中，在外周血单个核细胞培养的第九天，收集细胞悬液，去除原始培养基后，加入新的含有10％(体积)自体血浆的AIM-V培养基重悬，过液培养，得到可用于检测检测步骤的细胞。

在一些实施例中，树突状细胞培养步骤中，培养当天将外周血单个核细胞置于培养容器中贴壁培养。

在一些实施例中，树突状细胞培养步骤中，第二天，收集悬浮细胞，保留培养容器中剩余的贴壁细胞，向培养容器中加入培养基、细胞因子。

在一些实施例中，所述培养基为含有1％(体积)自体血浆的X-VIVO培养基。

在一些实施例中，所述细胞因子包括GM-CSF、IL-4。

在一些实施例中，所述培养基的加入量为1mL。

在一些实施例中，所述细胞因子GM-CSF、IL-4的加入量均为0.2μg。

在一些实施例中，树突状细胞培养步骤中，第五天，加入培养基、细胞因子。

在一些实施例中，所述培养基为含有1％(体积)自体血浆的X-VIVO培养基。

在一些实施例中，所述细胞因子包括GM-CSF、IL-4。

在一些实施例中，所述培养基的加入量为1mL。

在一些实施例中，所述细胞因子GM-CSF、IL-4的加入量均为0.2μg。

在一些实施例中，树突状细胞培养步骤中，第七天，对培养体系进行半量换液，加入培养基、细胞因子，然后培养至第十天，进入检测步骤。

在一些实施例中，所述培养基为含有2％(体积)自体血浆的X-VIVO培养基。

在一些实施例中，所述细胞因子包括GM-CSF、IL-4、IL-1β、TNF-α、IL-6、PGE2。

在一些实施例中，所述培养基的加入量为100μL。

在一些实施例中，所述GM-CSF的加入量为0.2μg、IL-4的加入量为0.2μg、IL-1β的加入量为0.04μg、TNF-α的加入量为0.08μg、IL-6的加入量为0.04μg、PGE2的加入量为2μg。

在一些实施例中，检测步骤中，检测方法为固相酶联免疫斑点检测法。

在一些实施例中，检测步骤中，根据待测组的斑点数与阴性对照组的斑点数之比，判断待测抗原多肽是否具有免疫原性。

在一些实施例中，检测步骤中，如果待测组的斑点数与阴性对照组的斑点数之比大于阈值，则待测抗原多肽具有免疫原性，否则，判断所述待测抗原多肽不具有免疫原性。

在一些实施例中，所述阈值为1.5。

在一些实施例中，检测步骤中，所述待测组为含有待测抗原多肽的培养基培养得到的细胞，所述细胞为外周血单个核细胞、树突状细胞混合孵育的细胞，所述外周血单个核细胞为多肽培养步骤培养得到的细胞，所述树突状细胞为树突状细胞培养步骤培养所得的细胞。

在一些实施例中，检测步骤中，所述阴性对照组为含有二甲基亚砜的培养基单独培养得到的细胞，所述细胞为外周血单个核细胞、树突状细胞混合孵育的细胞。

在一些实施例中，待测组中，待测抗原多肽在培养体系中的终浓度为10μg/mL。

在一些实施例中，阴性对照组中，二甲基亚砜与培养基的体积比为1:500。

在一些实施例中，检测步骤中，所述待测组、阴性对照组的培养基均为AIM-V培养基。

在一些实施例中，还可以设置阴性对照组，该对照组通常可以为含有二甲基亚砜的AIM-V培养基培养得到的细胞，所述细胞为外周血单个核细胞、树突状细胞混合孵育的细胞。

在一些实施例中，本发明提供一种使用少量外周血检测新生抗原免疫原性的方法，包括：采集肿瘤患者少量外周血(10mL)，采用分离管分离PBMC(30分钟完成分离)，加入新生抗原多肽(终浓度为10μg/mL)和细胞因子IL-2(终浓度为1ng/mL)、IL-15(终浓度为1ng/mL)，刺激培养10天，每隔一天换液，每次换液时都加入多肽和因子。培养9天之后，使外周血单个核细胞休息24小时，做ELISPOT检测，ELISPOT阳性的新生抗原具有免疫原性。

在一些实施例中，本发明具有如下优点中的至少一种：

1)外周血单个核细胞分离耗时短：采用stem cell公司的Sep Mate-50分离管，30分钟完成PBMC分离，PBMC纯度高，无红细胞污染。传统的ficoll分离PBMC的方法需要4个小时，肉眼可见红细胞污染，如果红细胞污染严重的话，还需要再次ficoll离心，需要额外增加2个小时。

2)PBMC用量少：验证一条患者新生抗原的免疫原性，需要的PBMC数量为10⁶，传统的方法验证一条新生抗原需要2×10⁷。

3)操作简便：将新生抗原多肽加入PBMC中进行刺激培养后进行ELISPOT检测，实验操作比较简便。传统做法都比较复杂。如前所述，如果采用TIL，从肿瘤细胞中分离培养TIL，合成TMG，再做ELISPOT检测是一个操作繁琐、技术要求高的过程。现有技术如果采用PBMC，需要从PBMC中分离出CD8+及PD-1+双阳性细胞,用滋养层细胞培养使其扩增。同时从PBMC中分离CD14+细胞。将CD14+细胞诱导成为成熟的DC细胞(树突状细胞，Dendritic Cell，简称DC)之后，通过电转导入新生抗原TMG，进行ELISPOT检测。完成全部操作难度也比较大。

4)外周血相比新鲜肿瘤组织而言，更容易获取。

5)本发明中所采用的方法，所获得的的实验结果与传统方法是一致的。

实施例1

本实施例中，如无特别说明，FBS、自体血浆的百分比均为其在相应体系中的体积百分比。自体血浆是指与PBMC来自于同一患者的血浆。

本实施例提供一种用少量外周血检测新生抗原免疫原性的方法，具体方法如下：

1、用肝素钠抗凝管取肿瘤患者外周血两管，从采血到分离的时间不超过24小时。分离PBMC。

血液样本、DPBS(杜氏磷酸缓冲液，即Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)以及淋巴细胞分离液使用前恢复至18-20℃。如未注明离心的升降速，则默认为ACC 9、DEC9。

(1)通过中间小孔(insert)，用移液器或者1mL移液枪加入15mL Ficoll-Paque密度梯度分离液(其成分为聚蔗糖)，加完之后，Ficoll的液面位于insert上方。

(2)收集10mL外周血血样于50mL离心管中，按照体积比1：1加入PBS，混合均匀。将稀释后的样品沿着管壁加入SepMate 50(RUO)密度梯度离心管中，可以快速加入。通常不直接加到中间小孔(insert)。SepMate 50(RUO)密度梯度离心管(购自STEMCELLTechnologies，加拿大)能处理的最大样品体积为17mL。

(3)1200×g的离心力离心20min，RT(15-25℃)。

(4)离心后，用枪头或者巴氏管将血浆层取出(黄色的部分)，其中含有血小板。再将insert上方的白膜层取出(白色的部分)，即为PBMC，取出时不要拿枪头或者巴氏管对准小孔，取出15mL的白膜层，加入新的50mL离心管中。

(5)白膜层中加入15mL的PBS+2％FBS溶液，以300×g的离心力离心8min，离心后，去上清，加入20mL的PBS+2％FBS溶液；将白膜层再次以300×g的离心力离心8min，用2.5mL的AIM-V(+10％FBS)培养基重悬，稀释十倍后，计数结果为：1.25×10⁷个。

(6)分6个孔加入培养基，每个孔中加入0.2mL的细胞悬液和0.8mL AIM-V(+10％FBS)培养基，对于前五个孔，每个孔中单独加入一种多肽，使得每个孔中对应多肽的终浓度为10μg/mL；对于第六孔，加入五种多肽，使得培养孔中每种多肽的浓度为2μg/mL，五种多肽的总浓度为10μg/mL。

五种多肽序列如下：

WJS-1：HVKITDFGR(SEQ ID NO.1)；

WJS-2：EVVPTMTEK(SEQ ID NO.2)；

WJS-3：TVTAAEFRIYK(SEQ ID NO.3)；

WJS-4：GETVTAAEFR(SEQ ID NO.4)；

WJS-5：ETVTAAEFR(SEQ ID NO.5)。

最后取1.2mL的细胞悬液，其含有6×10⁶个PBMC，加入到24孔板内，分6个孔加入，每个孔中加0.2mL，每个孔中的细胞个数为10⁶个。

取0.5mL细胞悬液，其中含有2.5×10⁶个PBMC，将细胞悬液加入24孔板中的1个孔中，贴壁培养过夜，贴壁细胞将诱导成为树突状细胞(DC)。

2、第二天观察被多肽刺激的PBMC细胞。

对于用于培养DC细胞的PBMC，将孔中悬浮细胞收集起来(后续不再使用悬浮细胞)，用AIM-V(+10％FBS)培养基滴洗3次，进一步去除悬浮细胞，对于孔中剩余的贴壁细胞，先加入1mL的X-VIVO(+1％自体血浆)培养基，再配制1mL的X-VIVO(+1％自体血浆)培养基，并且加入细胞因子GM-CSF(100μg/mL)和IL-4(100μg/mL)各2μL，混匀后，将配制好的培养基加入到孔内，然后放到37℃、5％CO₂培养箱中。

细胞因子GM-CSF是指粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，拉丁名为Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor，简称GM-CSF。

IL-4是指白细胞介素4，主要由活化T细胞产生。

3、第三天观察被多肽刺激的PBMC细胞。半量换液同时加入细胞因子和多肽：取出0.5mL/孔培养基至15mL离心管中，以500×g的离心力离心7min，弃去上清，加入0.5mL的AIM-V(+10％自体血浆)培养基，再加入1μL的IL-2(初始浓度为1μg/mL)和1μL的IL-15(初始浓度为1μg/mL)，使得IL-2、IL-15在培养孔中的终浓度为1ng/mL，之后再加入跟第一天同样的多肽(10μg/mL)各2μL，混匀后加入到孔内；观察贴壁细胞。

4、第五天观察被多肽刺激的PBMC细胞。半量换液同时加入细胞因子和多肽：取出1mL/孔培养基至15mL离心管中，以500×g的离心力离心7min，弃去上清，加入1mL的AIM-V(+10％自体血浆)培养基，再加入1μL的IL-2(初始浓度为1μg/mL)和1μL的IL-15(初始浓度为1μg/mL)，之后再加入跟第一天同样的多肽(10μg/mL)各2μL，混匀后加入到孔内。

观察贴壁细胞，配制1mL的X-VIVO(+1％自体血浆)培养基，并且加入GM-CSF(100μg/mL)和IL-4(100μg/mL)各2μL，混匀后，将配制好的培养基加入到孔内。

5、第七天观察被多肽刺激的PBMC细胞。半量换液同时加入细胞因子和多肽：取出0.5mL/孔培养基至15mL离心管中，以500×g的离心力离心7min，弃去上清，加入0.5mL的AIM-V(+10％自体血浆)培养基，再加入1μL的IL-2(初始浓度为1μg/mL)和1μL的IL-15(初始浓度为1μg/mL)，之后再加入跟第一天同样的多肽(10μg/mL)各2μL，混匀后加入到孔内。

观察贴壁细胞，补液加入6种成熟因子，具体如下：向100μL的X-VIVO(+2％自体血浆)培养基中加入6种成熟因子：GM-CSF(100μg/mL)+IL4(100μg/mL)+IL-1β(20μg/mL)+TNF-α(40μg/mL)+IL-6(20μg/mL)+PGE2(1mg/mL)各2μL，混匀后，加入到孔内。

6、第九天收集被多肽刺激的PBMC细胞：先用1mL枪头吹打孔内培养基，收集细胞悬液到15mL离心管中，每次加入1mL的AIM-V(+10％自体血浆)培养基，吹洗2遍，收集细胞悬液到一起，以300×g的离心力离心10min，去上清，加入1mL的AIM-V(+10％自体血浆)培养基重悬，置于六孔板中休息过夜。

7、第十天将DC与休息之后的PBMC细胞铺在ELISPOT孔板中共孵育过夜。PBMC为5×10^4/孔，DC为10^3/孔。

(1)收集成熟DC：先用1mL枪头吹打孔内培养基，收集细胞悬液到15mL离心管中，每次加入1mL的X-VIVO(+2％自体血浆)培养基，吹洗2遍，收集所有细胞悬液到一起，以300×g的离心力离心10min，弃去上清，加入1mL的X-VIVO(+2％自体血浆)培养基，重悬。之后，再次刮洗孔板，把孔板边缘的贴壁细胞尽量收集到一起，以400×g的离心力离心5min，弃去上清，加入100μL的自体血浆，重悬。将以上DC细胞混合均匀，计数。

(2)观察休息过夜的PBMC细胞，没有产生细胞团，有少量的杂质。

(3)配制多肽、PHA(Phytohaemagglutinin，即植物凝集素)和DMSO(二甲基亚砜)溶液：

多肽溶液的配制方法如下：

各取1mg WJS-1至WJS-5号多肽粉末，加入到0.1mL的DMSO中，配置得到10mg/mL的多肽溶液。各取2μL WJS-1至WJS-5号多肽(每种多肽的初始浓度为10mg/mL)，加入到1mL的AIM-V培养基中，得到五种多肽稀释液，每种稀释液中，对应多肽的浓度独立地为20μg/mL；

PHA溶液的配制方法如下：

取10μL的PHA，加入到500μL的AIM-V培养基中。

DMSO溶液的配制方法如下：

取1μL的DMSO，加入到500μL的AIM-V培养基中。

(4)用无菌PBS洗涤ELISPOT板4次，200μL/孔。

(5)加入AIM-V培养基，200μL/孔，37℃，5％的CO₂孵箱中封闭30分钟后弃去培养基。

(6)收集休息过夜后的经过了多肽预刺激的PBMC细胞

先用1mL枪头吹打孔内培养基，将培养基移至50mL离心管中，每孔再加入1mL的AIM-V(+10％自体血浆)培养基，吹洗一遍，收集所有细胞悬液到一起，以300×g的离心力离心10min，弃去上清，加入2mL的AIM-V培养基重悬、混匀，计数：1×10^7个；取1mL细胞悬液，再加入9mL的AIM-V培养基至10mL体积，稀释至5×10^5个/mL。

(7)铺板：

独立肽组：每个孔中加入一种多肽，按照100μL/孔加入对应的多肽；混合肽组：按照20μL/孔，将五种多肽加入同一孔中，混合肽组主要起到验证作用；之后在PHA对照孔(即阳性对照孔)和DMSO对照孔(即阴性对照孔)中加入PHA和DMSO溶液，均按100μL/孔加入。后期阳性对照孔中产生较多的斑点。

再加入PBMC细胞：用排枪，一行(6个孔)按从上往下的顺序，100μL/孔，悬空加入。

再加入DC：将DC细胞悬液放在6孔板内：用排枪，按照3个/行，50μL/孔，悬空加入到孔内。

(8)24小时后弃去细胞。用PBS洗板4次，200μL/孔，将孔内PBS用力甩干。

(9)用0.22μM滤器过滤含0.5％FBS的PBS，稀释一抗(200×)6mL(30μL一抗)，按照100μL/孔加入一抗，37℃放置两小时。加好一抗后，轻拍板架，排出气泡。

(10)用PBS洗板4次，200μL/孔。将孔内PBS用力甩干。

(11)按照100μL/孔加入底物显色液6mL(底物显色液使用前需用0.22μM滤器过滤，底物显色液为ELISPOT试剂盒自带的显色液)，直至斑点出现(一般在2-10min斑点会出现，这个时间可以进行跟踪观察，斑点数量不再变化时终止反应)。

(12)用PBS洗板4次，200μL/孔，或者用自然水小心缓慢地冲洗2-3遍(水柱不直接对准孔内)，将孔内PBS用力甩干，放到阴凉、避光晾干。

(13)板底干了之后读板计数(计数前一定保证板子干燥，否则会影响实验结果的判读)。

(15)在AID EliSpot Reader上应用预设好的计数设置(count setting)进行全自动斑点图像采集和计数，输出每孔斑点图像和斑点数，保存每孔斑点详细信息。

ELISPOT结果：

计数结果如图1所示，图1中，纵坐标为倍数变化(fold change)，横坐标为组别，其中，mix表示混合肽组，如果实验孔斑点数/阴性对照孔斑点数大于1.5倍，判断为ELISPOT阳性，所以#1、#2、#3、#5号新生抗原为ELISPOT阳性，即这四条新生抗原多肽具有免疫原性。

可见，本实施例用了10mL肿瘤患者外周血，分离得到了1.25×10^7PBMC，取5×10^6个PBMC，用于各个多肽独立预刺激；取2.5×10^6个PBMC，用于培养DC，总共用了7.5×10^6个PBMC(混合肽组只是起到验证作用)，检测了5条新生抗原多肽的免疫原性，其中有四条为阳性。本实施例采血量少(<20mL)，实验方法简便易操作，整个流程的时间周期短(一般只需要11天)，将DC培养与PBMC预刺激并行，检测费用低，只需少量常用的细胞因子，ELISPOT四条板条，就可以完成所有实验。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳裕康医学检验实验室；深圳裕泰抗原科技有限公司

<120> 一种使用外周血检测抗原免疫原性的方法

<130> 20I31131

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Arg

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Glu Val Val Pro Thr Met Thr Glu Lys

1 5

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Thr Val Thr Ala Ala Glu Phe Arg Ile Tyr Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gly Glu Thr Val Thr Ala Ala Glu Phe Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Glu Thr Val Thr Ala Ala Glu Phe Arg

1 5

Claims (10)

1.一种使用外周血检测抗原免疫原性的方法，其特征在于，包括：

离心步骤，包括使用密度梯度离心管对外周血样本进行离心，分离得到外周血单个核细胞；

多肽培养步骤，包括取部分外周血单个核细胞，培养过程中，分多次加入待测抗原多肽、培养基、细胞因子，培养得到被多肽刺激的外周血单个核细胞；

树突状细胞培养步骤，包括取部分外周血单个核细胞，诱导培养，得到树突状细胞；

检测步骤，将被多肽刺激的外周血单个核细胞与树突状细胞混合孵育，检测抗原多肽是否具有免疫原性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外周血样本为肿瘤患者外周血。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外周血样本的体积≤10mL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述密度梯度离心管为SepMate 50密度梯度离心管。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用密度梯度离心管对外周血样本进行离心时，离心力为1000-1300×g，离心时间为20-30min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，多肽培养步骤中，每隔1-2天进行半量换液，加入细胞因子和待测抗原多肽。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，多肽培养步骤中，所述培养基选自AIM-V培养基；

和/或，多肽培养步骤中，所述细胞因子包括IL-2、IL-15；

和/或，多肽培养步骤中，每种抗原多肽培养体系所需的外周血单个核细胞数量至少为10⁶；

和/或，树突状细胞培养步骤中，用于培养树突状细胞的外周血单个核细胞数量至少为2.5×10⁶。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，多肽培养步骤中，在外周血单个核细胞培养的当天，加入培养基、待测抗原多肽；

和/或，在外周血单个核细胞培养的当天加入的培养基为含有10％(体积)FBS的AIM-V培养基；

和/或，在外周血单个核细胞培养的当天，每种抗原多肽培养体系中加入的培养基至少为0.5mL；

和/或，在外周血单个核细胞培养的当天，每种抗原多肽培养体系中待测抗原多肽的终浓度为10μg/mL；

和/或，多肽培养步骤中，在外周血单个核细胞培养的第三天、第五天、第七天，均进行半量换液，加入培养基、细胞因子以及待测抗原多肽；

和/或，多肽培养步骤中，在外周血单个核细胞培养的第三天、第五天、第七天，加入的培养基为含有10％(体积)自体血浆的AIM-V培养基；

和/或，多肽培养步骤中，在外周血单个核细胞培养的第三天、第五天、第七天，加入的细胞因子包括IL-2、IL-15；

和/或，在外周血单个核细胞培养的第三天、第五天、第七天，加入细胞因子IL-2、IL-15后，每种抗原多肽培养体系中细胞因子IL-2、IL-15的浓度均为1ng/mL；

和/或，多肽培养步骤中，在外周血单个核细胞培养的第九天，收集细胞悬液，去除原始培养基后，加入新的含有10％(体积)自体血浆的AIM-V培养基重悬，过液培养，得到可用于检测检测步骤的细胞。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，树突状细胞培养步骤中，培养当天将外周血单个核细胞置于培养容器中贴壁培养；

和/或，树突状细胞培养步骤中，第二天，收集悬浮细胞，保留培养容器中剩余的贴壁细胞，向培养容器中加入培养基、细胞因子；

和/或，所述培养基为含有1％(体积)自体血浆的X-VIVO培养基；

和/或，所述细胞因子包括GM-CSF、IL-4；

和/或，树突状细胞培养步骤中，第五天，加入培养基、细胞因子；

和/或，所述培养基为含有1％(体积)自体血浆的X-VIVO培养基；

和/或，所述细胞因子包括GM-CSF、IL-4；

和/或，树突状细胞培养步骤中，第七天，对培养体系进行半量换液，加入培养基、细胞因子，然后培养至第十天，进入检测步骤；

和/或，所述培养基为含有2％(体积)自体血浆的X-VIVO培养基；

和/或，所述细胞因子包括GM-CSF、IL-4、IL-1β、TNF-α、IL-6、PGE2。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测步骤中，检测方法为固相酶联免疫斑点检测法；

和/或，检测步骤中，根据待测组的斑点数与阴性对照组的斑点数之比，判断待测抗原多肽是否具有免疫原性；

和/或，检测步骤中，如果待测组的斑点数与阴性对照组的斑点数之比大于阈值，则待测抗原多肽具有免疫原性，否则，判断所述待测抗原多肽不具有免疫原性；

和/或，所述阈值为1.5；

和/或，检测步骤中，所述待测组为含有待测抗原多肽的培养基培养得到的细胞，所述细胞为外周血单个核细胞、树突状细胞混合孵育的细胞，所述外周血单个核细胞为多肽培养步骤培养得到的细胞，所述树突状细胞为树突状细胞培养步骤培养所得的细胞；

和/或，检测步骤中，所述阴性对照组为含有二甲基亚砜的培养基单独培养得到的细胞，所述细胞为外周血单个核细胞、树突状细胞混合孵育的细胞；

和/或，所述待测组中，待测抗原多肽在培养体系中的终浓度为10μg/mL；

和/或，所述阴性对照组中，二甲基亚砜与培养基的体积比为1:500；

和/或，检测步骤中，所述待测组、阴性对照组的培养基均为AIM-V培养基。

Images