CN116087499A - 一种癌样本的染色方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

一种癌样本的染色方法及试剂盒，该方法包括：染色步骤，包括按照如下抗原组中的抗原顺序，使用对应的一抗依次对待测的样本进行孵育，使用染色剂对孵育后的样本进行染色，得到染色后的样本：Granzyme B、CD8、FOXP3、CD4、PD1、CD56。本发明提供的用于尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒及方法实现了自动化检测，对单张切片进行多重免疫荧光实验，可同时呈现六个抗原靶标的表达情况，显著提高单个样本的利用率，尤其是珍贵样本。

Description

一种癌样本的染色方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及荧光检测技术领域，具体涉及一种癌样本的染色方法及试剂盒。
背景技术
尿路上皮癌(Urothelial Carcinoma，UC)起源于尿路上皮的一种多源性的恶性肿瘤，包括肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌以及尿道癌，是最常见的泌尿系统肿瘤。其中尿路上皮癌可分为非肌层浸润性尿路上皮癌和肌层浸润性尿路上皮癌。而10％-15％的肌层浸润性尿路上皮癌患者在确诊时已出现转移。对于T3-T4和(或)N+Mo的高危患者5年生存率仅为25％-35％。
食管癌(Esophageal Carcinoma，EC)常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人。男多于女，发病年龄多在40岁以上。食管癌典型的症状为进行性咽下困难，先是难咽干的食物，继而是半流质食物，最后水和唾液也不能咽下。
宫颈癌(Cervical Cancer，CC)是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。近几十年宫颈细胞学筛查的普遍应用，使宫颈癌和癌前病变得以早期发现和治疗，宫颈癌的发病率和死亡率已有明显下降。生物标志物检测对癌症及疗效预测很有意义，但目前的检测方法和检测效率都有着局限性与不足，需要开发更有效的生物标志物，构建更高效的检测方法，同时实现标准化检测来节省人力、物力和财力，并提高检测准确性，以指导治疗。
免疫染色技术包括：IHC(Immunohistochemistry，免疫组织化学)、ICC(Immunocytochemistry，免疫细胞化学)和IF(Immunofluorescence，免疫荧光法)。其中IHC/IF检测是通过使用抗体和荧光检测来研究福尔马林固定及石蜡包埋(formalinfixation and paraffin embedding,FFPE)的样本中目标蛋白在固定细胞或组织中的定位、相对表达和激活状态。在肿瘤分子检测技术逐渐成熟的今天，相关研究与临床决策的信息基础也开始更加注重对于肿瘤微环境的覆盖。肿瘤微环境的复杂性要求单张组织样本切片产出多重信息，提高对于样本切片特别是珍贵样本的利用率。最近一种新的多标记免疫组织化学染色/免疫荧光染色(multiplex immunohistochemist ry/immunofluorescence,mIHC/IF)技术允许在单一组织切片上同时检测多个抗体，并对细胞组成、细胞功能和细胞-细胞相互作用进行全面研究。该技术克服了常规免疫组织化学IHC技术存在的诸多局限性，包括观察者间的变异性高，每张组织切片仅能标记一个标志物。目前，mIHC/mIF已在国内外研究中得到广泛应用，利用该技术实现对肿瘤免疫微环境(Tumor immunemicroenvironment,TIME)下的特异性免疫细胞群的研究，有助于肺癌等患者临床预后判断及疗效预测，已经成为最具应用前景的技术。mIHC/mIF为开展高重复性、高效、高性价比的组织研究提供了高通量多重染色技术和标准化的定量分析。该技术在转化研究和临床实践中，尤其是肿瘤免疫治疗中极具应用价值。
然而，对于尿路上皮癌、食管癌或宫颈癌样本，现有的方法还无法实现多重免疫荧光染色及检测。
发明内容
根据第一方面，在一实施例中，提供一种癌样本的染色方法，包括：
染色步骤，包括按照如下抗原组中的抗原顺序，使用对应的一抗依次对待测的样本进行孵育，使用染色剂对孵育后的样本进行染色，得到染色后的样本：
Granzyme B、CD8、FOXP3、CD4、PD1、CD56。
根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项所述的染色方法获得的样本或图像。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种图像分析方法，包括：对第二方面所述图像的目标区域的荧光表达数据进行生物标记物分析计算，得到样本的生物标记物数值。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种用于检测癌样本的试剂盒，包括如下抗体：
抗Granzyme B单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗FOXP3单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体、抗PD1单克隆抗体、抗CD56单克隆抗体。
依据上述实施例的一种癌样本的染色方法及试剂盒，本发明提供的用于尿路上皮癌、食管癌或宫颈癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒及方法实现了自动化检测，对单张切片进行多重免疫荧光实验，可同时呈现六个抗原靶标的表达情况，显著提高单个样本的利用率，尤其是珍贵样本。
在一实施例中，该试剂盒及染色方法降低了传统检测方法对组织样本的要求，穿刺样本也可以满足要求，同时避免了微小组织样本染色重复性差的问题。
附图说明
图1为一种实施例中的检测流程示意图；
图2为CD4染料配对的MIF及SNR结果；
图3为CD4抗体修复次数的MIF及SNR结果；
图4为CD8染料配对的MIF及SNR结果；
图5为CD8抗体修复次数的MIF及SNR结果；
图6为CD56抗体不同稀释比例的染色结果图；
图7为CD56染料配对的MIF及SNR结果；
图8为CD56抗体修复次数的MIF及SNR结果；
图9为FOXP3染料配对的MIF及SNR结果；
图10为FOXP3抗体修复次数的MIF及SNR结果；
图11为扁桃体样本的染色结果。
图12为Granzyme B染料配对的MIF及SNR结果；
图13为Granzyme B抗体修复次数的MIF及SNR结果；
图14为PD-1抗体的染色结果；
图15为扁桃体样本21R5148SLZB的mIF预实验-1的染色结果；
图16为扁桃体样本21R5148SLZD的mIF预实验-2的染色结果(20X)；
图17为尿路上皮癌样本22R6054SLZA的染色结果；
图18为尿路上皮癌样本22R1420SLZA的染色结果；
图19为尿路上皮癌样本22R6807SLZA的染色结果；
图20为尿路上皮癌样本22R5473SLZA的染色结果(20X)；
图21为尿路上皮癌样本22R3234SLZA的染色结果；
图22为尿路上皮癌样本22R5637SLZA的染色结果；
图23为食管癌样本22R4785SLZA的染色结果；
图24为食管癌样本22R5650SLZA的染色结果(20X)；
图25为食管癌样本22R8997SLZA的染色结果；
图26为食管癌样本22R9601SLZA的染色结果；
图27为宫颈癌样本22R1720SLZA的染色结果；
图28为宫颈癌样本22R7131SLZA的染色结果(10X)；
图29为宫颈癌样本22R4956SLZA的染色结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
术语解释
CD4：别名OKT4，辅助T细胞标志物。多数巨噬细胞、滤泡树状细胞、Langerhans细胞也阳性。在病理学中的应用为T细胞淋巴细胞的诊断和分类，信号定位在胞膜。CD4、CD4+T细胞，属于淋巴细胞分类中的辅助T细胞，直接反应机体免疫力功能的强弱，CD4+T细胞是HIV感染过程中的主要靶点。
CD8：是一种白细胞分化抗原，用以辅助T细胞受体(TCR)识别抗原并参与T细胞活化信号的转导。表达C D8的T细胞(CD8+T细胞)通常在活化后分化为细胞毒性T细胞，能够特异性地杀伤靶细胞，信号定位在胞膜。CD8，CD8+T细胞，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。
FOXP3：Treg的主要调节因子，Foxp3是控制Treg细胞发育和功能的关键转录因子之一。
CD56：别名Neural cell adhesion molecules、NCAM、leu19，是亲同种结合糖蛋白，在胚胎发育以及神经细胞的相互联系中发挥重要作用。主要表达于神经元、星形细胞、施万细胞、外周血中NK细胞、少数CD4+、CD8+T细胞及其肿瘤。常用于神经外胚层肿瘤、小细胞肺癌和NK细胞淋巴瘤的诊断及研究。在病理学中的应用：NK细胞淋巴瘤(鼻型)的诊断；神经母细胞瘤、神经内分泌肿瘤的诊断；多数浆细胞样树突细胞肿瘤(+)；PNET、神经鞘瘤、MPNST均阳性，信号定位在胞膜。
Granzyme B：细胞毒性T细胞和NK细胞的胞浆颗粒中含有丰富的蛋白酶，通过免疫突触进入靶细胞时激活caspase独立的焦变性。这种酶在细胞介导的免疫反应中对靶细胞裂解是必要的，它在Asp.之后裂开，似乎与负责细胞凋亡执行的半胱氨酸蛋白酶(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)的级联激活有关，裂解caspase-3、-7、-9和10，产生介导细胞凋亡的活性酶。信号定位在胞质颗粒，胞溶性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的胞浆颗粒。
PD1：别名programmed death-1、CD9a，为CD28家族受体成员之一。表达于生发中心相关辅助T细胞、C D8+T细胞。在病理中的应用：血管免疫母细胞淋巴瘤的诊断及鉴别诊断；原发性皮肤CD4阳性小/中多形性T细胞淋巴瘤、皮肤假T细胞淋巴瘤于其它皮肤T细胞淋巴瘤的鉴别诊断；PD-1阳性T细胞玫瑰花环一样围绕H D样细胞，可协助诊断结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。信号定位在胞质。
FoxP3是Treg细胞发育成熟和发挥功能的必要因素，是目前Treg细胞最敏感的标记；CD4是辅助T细胞标志物；CD8是一种白细胞分化抗原，用以辅助T细胞受体(TCR)识别抗原并参与T细胞活化信号的转导。
在一实施例中，本发明提供一种用于检测肿瘤组织中T细胞免疫检查点肿瘤清除作用的mIF Panel；同时进行抗体开发，最终确认目标marker为：CD4、CD8、FOXP3、PD-1、Granzyme B。
根据第一方面，在一实施例中，提供一种癌样本的染色方法，包括：
染色步骤，包括按照如下抗原组中的抗原顺序，使用对应的一抗依次对待测的样本进行孵育，使用染色剂对孵育后的样本进行染色，得到染色后的样本：
Granzyme B、CD8、FOXP3、CD4、PD1、CD56。样本可以是取自单独患有尿路上皮癌的受试者的样本，也可以是取自单独患有食管癌的受试者的样本，也可以是取自单独患有宫颈癌的受试者的样本，也可以是取自同时患有尿路上皮癌、食管癌、宫颈癌中至少两种或三种的受试者的样本。本发明可以同时对前述三个癌种的样本进行染色，也可以对其中的一个癌种或两个癌种样本进行染色，可同时呈现六个抗原靶标的表达情况，降低样本的需求量，提高样本利用率。
该染色方法获得是的染色的样本，属于中间结果，而非最终结果，因此，不属于疾病的诊断方法。
在一实施例中，染色步骤中，使用的染色剂的种类数量与抗体的种类数量一致。
在一实施例中，染色步骤中，抗原对应的一抗与染色剂按如下方式依次配对染色：
抗Granzyme B单克隆抗体配对Opal 690，抗CD8单克隆抗体配对Opal 480，抗FOXP3单克隆抗体配对Opal 570，抗CD4单克隆抗体配对Opal 520，抗PD1单克隆抗体配对Opal 620，抗CD56单克隆抗体配对Op al 780。
在一实施例中，染色步骤中，包括按照抗原顺序，重复进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色(即染料孵育)、去除抗体。每一轮对一种抗原进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色、去除抗体。
在一实施例中，染色步骤中，二抗孵育时使用的二抗标记有辣根过氧化物酶。
在一实施例中，染色步骤中，对前5种抗原完成染色后，使用封闭液对样本进行封闭，然后对第6种抗原依次进行一抗孵育、二抗孵育、信号放大染色、去除抗体、使用对应的染色剂进行染色、使用核染色剂进行染色，获得染色后的样本。
在一实施例中，染色步骤中，信号放大染色时，使用的染色剂包含Opal TSA-DIG染料。
在一实施例中，染色步骤中，所述核染色剂包括但不限于DAPI(即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，CAS登录号：47165-04-8)。
在一实施例中，染色步骤中，所述样本包括癌组织切片。
在一实施例中，染色步骤中，所述样本为尿路上皮癌、食管癌、宫颈癌样本中的至少一种。
在一实施例中，还包括成像步骤，包括对染色后的样本进行连续光谱成像，获得对应的染色图像。染色图像为中间结果，而非最终结果，因此，不属于疾病的诊断方法。
在一实施例中，还包括检测步骤，对染色图像检测。检测结果通常可以是生物标记物数值的分析结果，该结果仅仅是中间结果，而非最终结果，因此，不属于疾病的诊断方法。
根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项所述的染色方法获得的样本或图像。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种图像分析方法，包括：对第二方面所述图像的目标区域的荧光表达数据进行生物标记物分析计算，得到样本的生物标记物数值。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种用于检测癌样本的试剂盒，包括如下抗体：
抗Granzyme B单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗FOXP3单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体、抗PD1单克隆抗体、抗CD56单克隆抗体。
在一实施例中，还包括染色剂，染色剂的种类数量与抗体的种类数量一致。
在一实施例中，所述染色剂包括荧光染色剂。
在一实施例中，所述染色剂包括：
Opal 690、Opal 480、Opal 570、Opal 520、Opal 620、Opal 780。
在一实施例中，抗体与染色剂的配对关系如下：
抗Granzyme B单克隆抗体配对Opal 690，抗CD8单克隆抗体配对Opal 480，抗FOXP3单克隆抗体配对Opal 570，抗CD4单克隆抗体配对Opal 520，抗PD1单克隆抗体配对Opal 620，抗CD56单克隆抗体配对Op al 780。
在一实施例中，还包括荧光染料Opal TSA-DIG。
在一实施例中，所述试剂盒还包含抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、封闭液、抗荧光淬灭剂中的至少一种。
在一实施例中，所述样本包括癌组织切片。
在一实施例中，所述样本为尿路上皮癌、食管癌、宫颈癌样本中的至少一种。
在一实施例中，提供一种用于尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌样本的多重免疫荧光试剂盒及染色方法。本发明提供的试剂盒包括如下组分：过氧化物酶封闭剂、一抗试剂、二抗试剂、荧光染料；一抗试剂包括兔抗人Gr anzyme B单克隆抗体、兔抗人CD4单克隆抗体、鼠抗人CD8单克隆抗体、兔抗人PD1单克隆抗体、兔抗人F OXP3单克隆抗体、兔抗人CD56单克隆抗体；二抗试剂包括HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗鼠抗兔混合物。该试剂盒能够在一张组织样本切片上同时呈现六个抗原靶标的表达情况，便于观察靶标蛋白质的相互作用和共生定位，对组织样本的需求量显著降低；且该试剂盒能够应用于自动化染色机，显著提高准确度和可重复性，简便高效。
针对现有技术存在的问题，在一实施例中，本发明提供一种针对尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒及染色方法。本发明基于多重免疫荧光技术开发了一种检测试剂盒，并利用图像识别系统(如inForm v2.3、HALO病理图像分析系统等)获得组织和细胞表型信息以及相应靶标的荧光强度信息等，对尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌免疫微环境的TILs(肿瘤浸润性淋巴细胞)进行分析，已应用于超60例样本的检测和分析。本发明主要解决了肿瘤免疫治疗疗效评估缺乏足够生物标志物，以及如何使肿瘤免疫微环境相关指标能够在更大规模更大范围内对免疫治疗疗效进行评估的技术问题；同时很好地解决在临床病理工作以及科学研究中通过多重免疫荧光技术进行肿瘤免疫微环境分析的需求，高效辅助医生和科研人员完成免疫组化多重标记后的各项免疫组化指标的分析。
在一实施例中，本发明提供了一种用于尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒及染色方法。该试剂盒能够在一张组织切片上同时表达六个抗体，此试剂盒可以为病理医生提供更多的靶标蛋白质信息和共定位情况，可以显著提高染色效率节约样本；同时可以避免手工染色带来的重复性低、时间长等问题；该试剂盒可以应用于全自动染片机，具有广泛的应用前景。
实施例1
本实施例提供了一种用于尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒，包括如下组分：过氧化物酶封闭剂、一抗试剂、二抗试剂、荧光染料；一抗试剂包括兔抗人Granzyme B单克隆抗体、兔抗人CD4单克隆抗体、鼠抗人CD8单克隆抗体、兔抗人PD1单克隆抗体、兔抗人FOXP3单克隆抗体、兔抗人CD56单克隆抗体；二抗试剂包括HRP标记的抗鼠抗兔混合物。全自动多色免疫荧光检测涉及的关键物料如表1。
表1关键物料清单
Figure BDA0004085884790000051
Figure BDA0004085884790000061
获取来自于每一受试者的尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌组织样本，制备成组织切片，对所述尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌组织样本进行多重免疫组化染色处理(如Leica公司Bond RX自动化染色仪器)，再通过成像扫描仪器(如Akoya公司Vectra Polaris光谱型定量病理分析系统)获取相应的免疫组化显微全景图。
适用于全自动免疫组化染色机，染色程序见下表。
表2mIF染色程序
Figure BDA0004085884790000062
Figure BDA0004085884790000071
表3 mIF阴参样本染色程序
Figure BDA0004085884790000072
Figure BDA0004085884790000081
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步描述，本发明检测样本为尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌样本，但并不局限于此，仅开发期间以尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌样本为开发对象，并选用尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌样本进行了检测实验。
如图1所示为检测流程示意图，具体步骤如下：
一、制备用于尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒
该实施例提供了一种用于尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒，开发程序如下：
本实施例中，对每个抗体进行优化。抗体包括：CD4、CD8、CD56、PD1、FOXP3、Granzyme B。
前期进行了抗体测试，以及实验条件的摸索，包括抗体特性初步验证、抗体浓度摸索、抗体染料配对、抗体修复次数摸索、mIF实验预实验等环节，最终确定了具体的抗体和实验条件。
mIF条件的确定包括：共染色、通道的选择，染色轮次选择、整体染色效果。
关键步骤如下：
(1)抗体验证实验：采用IHC实验，确认抗体是否可以用；并初步明确阳参样本；
(2)一抗浓度摸索实验：结合抗体说明书推荐的浓度，进行适当的浓度调整，设置2-3个浓度，开展IHC实验摸索一抗浓度。例如：抗体Anti-CD68(KP1)-Abcam，推荐抗体浓度为1：100，可以设置1：50、1：100、1：200开展IHC实验；
(3)抗体酸碱修复实验：结合抗体说明书推荐的修复条件，确认ER1或者ER2，基于常用条件95℃、20min，开展IHC实验，根据实验结果进行调整。例如：将ER1调整为ER2；条件参数可调整为95℃，20min；95℃，40min；95℃，80min。
(4)抗体染料配对实验：Panel(CD4、CD8、CD56、PD1、FOXP3、Granzyme B)为六标七色mIF实验，计划使用480、520、570、620、690、780通道，结合抗体说明书以及相关参考文献推荐推荐配对通道，对不同抗体进行3-7个通道的抗体染料配对IF实验；对于实验结果进行荧光强度统计，并计算信噪比，确认该抗体较优配对通道。例如：抗体Anti-CD68(KP1)-Abcam，设置与480,520,570,620,650,690,780 7个不同通道进行IF配对实验，结果显示650、780、570通道信噪比较高，后续mIF实验条件优化中，优先选择这3个通道进行该抗体染料的配对。
(5)抗原修复次数实验：Panel(CD4、CD8、CD56、PD1、FOXP3、Granzyme B)为六标七色mIF实验，抗原修复7次，最后一次为DAPI染色；对不同抗体进行1-6次抗原修复后进行IF实验，选择1、3、5轮次进行修复实验；对于实验结果进行荧光强度统计，并计算信噪比，确认该抗体较优修复轮次。例如：抗体Anti-C D68(KP1)-Abcam，分别设置1、3、5轮次修复后孵一抗进行修复次数的IF实验，根据信噪比结果，后续mIF实验条件优化中，将该抗体安排在较优修复轮次中开展实验。
(6)mIF预实验：根据上述实验结果，归纳总结抗体特性，确定一抗浓度、酸碱修复条件，抗体配对染料和抗原修复轮次，初步明确mIF实验条件；根据实验结果优化mIF条件，直至达到无非特异性染色，光谱拆分无串染等效果。
A、各抗体的筛选过程如下：
1.CD4抗体浓度：重组Anti-CD4抗体[EPR6855](ab133616)-Abcam，稀释比例分别为1：500、1：1000、1：2000(体积比，下同)。
CD4染料配对：MIF及SNR结果如下表及图2所示。
表4
Figure BDA0004085884790000091
CD4抗体修复次数：MIF及SNR结果如下表及图3所示。
表5
抗体 570曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
CD4 1次:226.17、3次:24.47、5次：25.71 3次>5次 3次>5次 3
2.CD8抗体浓度：
CD8 Monoclonal Antibody(4B11)(MA1-80231)-Thermo Fisher Scientific，稀释比为1:50、1：100、1：200重组Anti-CD8 alpha抗体[EP1150Y](ab93278)-Abcam，稀释比为1：2000、1：4000、1：8000。
CD8染料配对：MIF及SNR结果如下表及图4所示。
表6
Figure BDA0004085884790000092
CD8抗体修复次数：MIF及SNR结果如下表及图5所示。
表7
抗体 570曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
CD8 1次:4.23、3次:5.54、5次：3.3 5次>3次>1次 5次>3次>1次 3、5
3.CD56抗体浓度：抗体为Anti-NCAM1/CD56[CAL53](ab237708)-Abcam。
21R4111SLZA样本的染色结果如图6所示，推荐稀释比例为1:1000(30min)。
抗体染料配对：21R4111SLZA样本。染色结果以及MIF、SNR结果如下表及图7所示，左侧右上角荧光图左下角的信息为Standard、DAPI、Opal 480、Sample AF、50μm。左侧左下角荧光图的通道为620，左侧右下角荧光图的通道为690。
表8
抗体 曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
CD56 480:6.07、620:94.82、690:17.63 480>690>620 620>690>480 690
抗体修复次数：21R4111SLZA样本。染色结果以及MIF、SNR结果如下表及图8所示，各荧光图左下角的信息为Standard、DAPI、Opal 570、Sample AF、50μm。
表9
抗体 570曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
CD56 1次、3次、5次：58.72 5次>3次>1次 5次>3次>1次 都可以
4.FOXP3抗体浓度：
抗体为FoxP3(D6O8R)Rabbit mAb(12653S)-Cell Signaling Technology，稀释比例为1:800。
Anti-FOXP3 antibody[EPR22102-37](ab215206)-Abcam，稀释比例为1：25、1：50、1：250。
FOXP3染料配对：MIF、SNR结果如下表及图9所示。
表10
抗体 曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
FoxP3 480:5.01、570、690:54.57 480>670>690 480>570>690 480、570
FOXP3抗体修复次数：MIF、SNR结果如下表及图10所示。
表11
抗体 570曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
FoxP3 1次:70.8、3次:69.8、5次:69.8 5次>3次>1次 3次>5次>1次 3>5
5.Granzyme B抗体浓度：扁桃体样本
染色结果如图11所示，推荐稀释比例为1:3000。
Granzyme B染料配对：扁桃体样本。染色结果以及MIF、SNR结果如下表及图12所示。
表12
抗体 曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
Granzyme B 480:8、570:65.79、690:20.12 570>690>480 480>690>570 480>690
Granzyme B修复次数：扁桃体样本(690nm)。染色结果以及MIF、SNR结果如下表及图13所示，左侧各荧光图左下角的信息为Standard、DAPI、Opal 690、Sample AF、50μm。
表13
抗体 曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
Granzyme B 15 1>5>3 1>5>3 都可以：1>5>3
6.PD-1抗体浓度：
抗体：Anti-PD1 antibody[EPR4877(2)](ab137132)-Abcam，稀释比为1：500。染色结果如图14所示。
B、mIF预实验
利用Bond RX进行自动化染色，开展多次mIF条件优化。
1.mIF预实验条件：预实验-1
表14
Figure BDA0004085884790000101
Figure BDA0004085884790000111
mIF预实验结果：扁桃体样本21R5148SLZB的染色结果如图15所示。
结果：该扁桃体样本FoxP3表达量低，无阳性细胞；其他抗体染色正常，无串染和非特异染色等情况；
方案设计：更换扁桃体阳参样本，再次测试该条件。
2.mIF预实验条件：预实验-2
表15
Figure BDA0004085884790000112
mIF预实验结果：扁桃体样本21R5148SLZD的染色结果如图16所示。
结果：该扁桃体样本各抗体染色正常，无串染和非特异染色等情况；方法学开发完成。
方案设计：更换癌种样本(尿路上皮癌、食管癌、卵巢癌)，验证该条件在预期测试的癌种样本的染色情况；并且结合癌种样本表达量情况，可适当调整弱表达和强荧光通道的结合，优化实验参数。
目前仅收集到5例尿路上皮癌样本，先做HE，初步判断2例可用于mIF条件验证实验。
3.mIF条件：尿路上皮癌样本验证实验
表16
Figure BDA0004085884790000113
Figure BDA0004085884790000121
mIF结果：尿路上皮癌样本22R6054SLZA的染色结果如图17所示。
结果：该尿路上皮癌样本CD56和FoxP3表达量低，几乎无阳性细胞；其他抗体染色正常，无串染和非特异染色等情况。
方案设计：更换尿路上皮癌样本，验证mIF条件。
4.mIF条件：尿路上皮癌样本验证实验
表17
Figure BDA0004085884790000122
mIF结果：尿路上皮癌样本22R1420SLZA的染色结果如图18所示。
结果：该尿路上皮癌样本CD56和FoxP3表达量低，几乎无阳性细胞；Granzyme B与CD8存在共染现象；其他抗体染色正常，无串染和非特异染色等情况。
方案设计：更换尿路上皮癌样本，验证mIF条件。
5.mIF条件：尿路上皮癌样本验证实验
表18
Figure BDA0004085884790000123
Figure BDA0004085884790000131
mIF结果：尿路上皮癌样本22R6807SLZA的染色结果如图19所示。
结果：该尿路上皮癌样本CD56和FoxP3表达量低，但全片存在阳性细胞；其他抗体染色正常，无串染和非特异染色等情况。
mIF结果：尿路上皮癌样本22R5473SLZA的染色结果如图20所示。
结果：该尿路上皮癌样本各Marker均染色，无串染和非特异染色等情况；方法学开发完成。
mIF结果：尿路上皮癌样本22R3234SLZA的染色结果如图21所示。
结果：该尿路上皮癌样本CD56和FoxP3表达量低；其他抗体染色正常，无串染和非特异染色等情况。
mIF结果：尿路上皮癌样本22R5637SLZA的染色结果如图22所示。
结果：该尿路上皮癌样本各Marker均染色，无串染和非特异染色等情况；方法学开发完成。
6.mIF条件：食管癌样本验证实验
表19
Figure BDA0004085884790000132
mIF结果：食管癌样本22R4785SLZA的染色结果如图23所示。
结果：该食管癌样本各Marker均染色，无串染和非特异染色等情况；方法学开发完成。
mIF结果：食管癌样本22R5650SLZA的染色结果如图24所示。
结果：该食管癌样本各Marker均染色，无串染和非特异染色等情况；方法学开发完成。
mIF结果：食管癌样本22R8997SLZA的染色结果如图25所示。
结果：该食管癌样本各Marker均染色，无串染和非特异染色等情况；方法学开发完成。
mIF结果：食管癌样本22R9601SLZA的染色结果如图26所示。
结果：该食管癌样本各Marker均染色，无串染和非特异染色等情况；方法学开发完成。
7.mIF条件：宫颈癌样本验证实验
表20
Figure BDA0004085884790000141
mIF结果：宫颈癌样本22R1720SLZA的染色结果如图27所示。
结果：该宫颈癌样本FoxP3、CD56和FoxP3表达量低；其他抗体染色正常，无串染和非特异染色等情况。
mIF结果：宫颈癌样本22R7131SLZA的染色结果如图28所示。
结果：该宫颈癌样本各Marker均染色，无串染和非特异染色等情况；方法学开发完成。
mIF结果：宫颈癌样本22R4956SLZA的染色结果如图29所示。
结果：该宫颈癌样本FoxP3、CD56和FoxP3表达量低；其他抗体染色正常，无串染和非特异染色等情况。
二、试剂盒在全自动染片机中的应用及染色程序。
扁桃体样本21R5148SLZD、尿路上皮癌样本22R5473SLZA、食管癌样本22R5650SLZA、宫颈癌样本22R7131SLZA的具体染色步骤如下：
将试剂盒应用于尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌组织，以扁桃体组织为阳参，实施多重免疫组化染色，使用的机器为BOND RX全自动染片机。
(1)取尿路上皮癌、食管癌、宫颈癌和扁桃体石蜡组织样本各一个，分别制备尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌石蜡组织切片各1张(实验切片)，扁桃体石蜡组织切片2张(阴参和阳参切片)，厚度为3微米，贴好样本标签，放在切片盒中，于4℃冰箱中待用；
(2)打开电热鼓风干燥箱，提前预热电热鼓风干燥箱至65℃。将切片放入切片架中，将切片架放入电热鼓风干燥箱中，65℃，3h。肉眼观察组织表面的蜡融化彻底即可，填写实验记录表。
(3)试剂准备：从4℃冰箱中取出一抗、二抗、染料、封闭液，需避光的试剂用锡箔纸包裹试管，置于冰上，备用，放于离心机中短暂离心。
a.抗体配制：取出抗体储存液，放于离心机中短暂离心，备用。在滴定管(Titration Kit)中，用抗体稀释液按照下表稀释比例配制工作液，用锡箔纸包裹试管，在管外标记染料名称，配制时间，配制人员。
表21一抗工作液配制
Figure BDA0004085884790000151
b.染料配制：
①制备染料储存液，取出抗体及Opal染料，用锡箔纸包裹试管，放于离心机中短暂离心。分别往加入Opa l 480、Opal 520、Opal 570、Opal 620、Opal 690、TSA-DIG染料管中加入75μL的DMSO溶液；将300μL的去离子水溶液加入Opal 780染料管中。将上述染料管上下混匀10次后，待试剂完全溶解，将染料管放于离心机中短暂离心。
②取出染料储存液，放于离心机中短暂离心，备用。在滴定管(Titration Kit)中，用稀释液按照下表的稀释比例配制工作液，用锡箔纸包裹试管，在管外标记染料名称、配制时间、配制人员。
表22染料工作液
Figure BDA0004085884790000152
c.二抗配制：使用移液器吸取二抗转至滴定管中(二抗试剂用量的计算公式：1618+150*7*n(μL)，其中n为切片数量，1618μL为30mL试剂盒死仓体积，150μL为每张切片用量)。
d.封闭液配制：使用移液器吸取封闭液转至滴定管中(封闭液用量的计算公式：1618+150*7*n(μL)，其中n为切片数量，1618μL为30mL试剂盒死仓体积，150μL为每张切片用量)。
(4)设置染色程序：
a.检测样本及阳参样本程序设置：点击“程序设置”，具体参数见下表。
表23mIF程序
Figure BDA0004085884790000161
b.阴参样本程序设置：点击“程序设置”，具体参数见下表。
表24 mIF阴参样本染色程序
Figure BDA0004085884790000162
Figure BDA0004085884790000171
(5)检测系统和装有抗体、染料的试剂架放入BOND RX仪器内，启动染色程序：
(6)右击玻片架直接开始染色，染色开始和结束时间会在玻片架下方显示，填写实验记录表。
(7)封片：
a.染色完成后，按下玻片架下方的“装/卸按钮”，解除玻片架的锁定状态，取出玻片架，并将一抗和二抗盒用封口膜或者盖子封好，放入4℃冰箱保存，TSA-DIG、Opal780以及DAPI染料直接倒入废液瓶，其他Opal染料在工作液有效期内可继续使用。
b.从玻片架上取出切片，去除通用玻片盖(Bond Universal Covertiles)。除组织外，使用无尘纸擦干切片上的水迹。
c.每张切片滴加抗荧光淬灭剂1-2滴进行封片，保证抗荧光淬灭剂完成覆盖组织且无气泡，同时需要避免抗荧光淬灭剂溢出。将切片放在存放板中保存，室温避光30min，待抗荧光淬灭剂凝固后，放在4℃冰箱中避光保存，留待扫描。
(8)扫描切片：使用Vectra Polaris仪器，设置程序对切片进行全片扫描。扫描结束后，确保阳性对照与阴性对照样本出现预期染色效果。图16为试剂盒在扁桃体样本中的染色结果(20X)，阳性对照预期染色效果：样本出现阳性信号(细胞膜定位包括细胞膜定位包括CD4、CD8、CD56，细胞质定位包括PD1、Granzyme B，细胞核定位FoxP3，无明显的串色，染色均一)。阴性对照预期染色效果：样本未出现明显阳性信号。可见，该扁桃体样本各抗体染色正常，无串染和非特异染色等情况。
图20为试剂盒在尿路上皮癌样本中的染色结果(20X)，可见，该尿路上皮癌样本各Marker均染色，无串染和非特异染色等情况。
图24为试剂盒在食管癌样本中的染色结果(20X)，可见，该食管癌样本各Marker均染色，无串染和非特异染色等情况。
图28为试剂盒在宫颈癌样本中染色结果(10X)，可见，该宫颈癌样本各Marker均染色，无串染和非特异染色等情况。
数据分析：将数据上传至共享文件夹，路径是指定项目文件夹。然后根据分析需求进行数据处理。
三、试剂盒在尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌组织中应用的实验结果。具体实验如下：
(1)样本：
检测来自尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌的各20个FFPE样本各2片，1张用于panel的mIF、1张用于H&E。每次实验取正常人扁桃体组织连续切片2张用于对照实验，其中1张用于阳参对照实验，1张用于IgG同型对照，所有的标本从国内组织芯片服务公司取得。
(2)HE质控：依据病理医生反馈的HE阅片结果，对切片进行HE染色结果判读，HE染色结果判读标准如表6。
表25 HE质控标准
Figure BDA0004085884790000181
*注：四项参数需均在参考范围内才能判定为该等级样本，若有一项不符则判定为下一等级样本。风险样本通常不上机，也可以尝试上机操作，但最终结果可能差于合格样本。
(3)结果分析：
使用Vectra Polaris扫描仪扫描mIF染色。对60个样本进行全扫描和数字成像分析，通过成像HALO软件(或同等软件)分析mIF的扫描图像，然后统计单个mIF中抗体(CD4、CD8、CD56、PD1、FOXP3、Granzy me B)染色的细胞阳性细胞数。
(4)结论：
a.样本基本符合质控要求，无不合格样本：病理学家对样本H&E染色结果判读，结果如下表。其中，B级为风险样本，实验前已经通单样本再次确认，上机。
表26样本H&E质控结果
Figure BDA0004085884790000182
Figure BDA0004085884790000191
b.染色结果：在满足质控要求的尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌样本中，利用BondRX进行自动化染色，使用Vectra Polaris全景扫描。染色结果判读亚细胞定位正确(细胞膜定位包括CD4、CD8、CD56，细胞质定位包括PD1、Granzyme B，细胞核定位FOXP3)。使用HALO，对图像进行分析处理，依据的数据源：尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌样本mIF检测的阳性细胞数，满足分析需求。结果通过验收，实验条件稳定可靠，可用于检测尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌样本。
本发明已应用于超60例样本检测，样本通过病理学家对样本H&E染色结果判读，样本符合质控要求；染色结果判读亚细胞定位正确(CD4、CD8、CD56信号定位在细胞膜，PD1、Granzyme B信号定位在细胞质，F OXP3信号定位在细胞核)；无串色和非特异性染色现象，多色免疫荧光效果较好。
在一实施例中，本发明提供了一种用于尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒，包括如下组分：过氧化物酶封闭剂、一抗试剂、二抗试剂、荧光染料；一抗试剂包括兔抗人Granzyme B单克隆抗体、兔抗人CD4单克隆抗体、鼠抗人CD8单克隆抗体、兔抗人PD1单克隆抗体、兔抗人FOXP3单克隆抗体、兔抗人CD56单克隆抗体；二抗试剂包括HRP标记的抗鼠抗兔混合物。
在一实施例中，本发明提供的用于尿路上皮癌、食管癌和宫颈癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒及方法实现了自动化检测，对单张切片进行多重免疫荧光实验，可同时呈现六个抗原靶标的表达情况，显著提高单张组织样本的利用率，尤其是珍贵样本。
在一实施例中，节约病人取材的样本，便于样本有足够的量做其他检测项目；
在一实施例中，自动化染色可以进行高通量测试，实现标准化操作，单次最多可同时检测30片病理切片，避免了手工操作时间长和误差大的弊端，为临床病理人员提供了简便高效的检测方法。
在一实施例中，该试剂盒实现标准化操作的自动化检测，已经通过性能验证，具有高准确性和高精密度。
在一实施例中，该试剂盒及染色方法降低了传统检测方法对组织样本的要求，穿刺样本也可以满足要求，同时避免了微小组织样本染色重复性差的问题。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (10)

1.一种癌样本的染色方法，其特征在于，包括：
染色步骤，包括按照如下抗原组中的抗原顺序，使用对应的一抗依次对待测的样本进行孵育，使用染色剂对孵育后的样本进行染色，得到染色后的样本：
Granzyme B、CD8、FOXP3、CD4、PD1、CD56。
2.如权利要求1所述的染色方法，其特征在于，染色步骤中，使用的染色剂的种类数量与抗体的种类数量一致；
可选地，染色步骤中，抗原对应的一抗与染色剂按如下方式依次配对染色：
抗Granzyme B单克隆抗体配对Opal 690，抗CD8单克隆抗体配对Opal 480，抗FOXP3单克隆抗体配对Opal 570，抗CD4单克隆抗体配对Opal 520，抗PD1单克隆抗体配对Opal 620，抗CD56单克隆抗体配对Op al 780。
3.如权利要求1所述的染色方法，其特征在于，染色步骤中，包括按照抗原顺序，重复进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色、去除抗体；
可选地，染色步骤中，二抗孵育时使用的二抗标记有辣根过氧化物酶。
4.如权利要求1所述的染色方法，其特征在于，染色步骤中，对前5种抗原完成染色后，使用封闭液对样本进行封闭，然后对第6种抗原依次进行一抗孵育、二抗孵育、信号放大染色、去除抗体、使用对应的染色剂进行染色、使用核染色剂进行染色，获得染色后的样本；
可选地，信号放大染色时，使用的染色剂包含Opal TSA-DIG染料；
可选地，所述核染色剂包括DAPI。
5.如权利要求1所述的染色方法，其特征在于，染色步骤中，所述样本包括癌组织切片；
可选地，染色步骤中，所述样本为尿路上皮癌、食管癌、宫颈癌样本中的至少一种。
6.如权利要求1所述的染色方法，其特征在于，还包括成像步骤，包括对染色后的样本进行连续光谱成像，获得对应的染色图像。
7.采用如权利要求1～6任意一项所述染色方法获得的样本或图像。
8.一种图像分析方法，其特征在于，包括：对权利要求7所述图像的目标区域的荧光表达数据进行生物标记物分析计算，得到样本的生物标记物数值。
9.一种用于检测癌样本的试剂盒，其特征在于，包括如下抗体：
抗Granzyme B单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗FOXP3单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体、抗PD1单克隆抗体、抗CD56单克隆抗体。
10.如如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括染色剂，染色剂的种类数量与抗体的种类数量一致；
在一实施例中，还包括染色剂，染色剂的种类数量与抗体的种类数量一致；
可选地，所述染色剂包括荧光染色剂；
可选地，所述染色剂包括：
Opal 690、Opal 480、Opal 570、Opal 520、Opal 620、Opal 780；
可选地，抗体与染色剂的配对关系如下：
抗Granzyme B单克隆抗体配对Opal 690，抗CD8单克隆抗体配对Opal 480，抗FOXP3单克隆抗体配对Opal 570，抗CD4单克隆抗体配对Opal 520，抗PD1单克隆抗体配对Opal 620，抗CD56单克隆抗体配对Op al 780；
可选地，还包括荧光染料Opal TSA-DIG；
可选地，所述试剂盒还包含抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、封闭液、抗荧光淬灭剂中的至少一种；
可选地，所述样本包括癌组织切片；
可选地，所述样本为尿路上皮癌、食管癌、宫颈癌样本中的至少一种。
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