CN111670364A - 用于将癌症患者分类到合适的癌症治疗组的系统和方法以及治疗癌症患者的组合物 - Google Patents
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Abstract
一种预测癌症患者对治疗反应的方法，所述方法包括：测量从癌症患者身上采集的白细胞样本中的至少一个免疫标记物的表达；基于所述至少一个免疫标记物相关预定值的表达，将患者样本分为(i)选择性内放射治疗(SIRT)的持续应答者(SR)或(ii)选择性内放射治疗(SIRT)的短暂/无应答者(TR/NR)，以及用SIRT或包含SIRT和免疫疗法的组合治疗SIRT的可持续应答者(SR)。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月30日提交的新加坡专利，申请号为10201709924T的专利的优先权，其内容通过引用并入本申请。
发明领域
本发明涉及用于将癌症患者分类到治疗组进行预测和对特定癌症治疗进行预测反应的系统和方法，特别涉及放射治疗，特别是选择性内放射治疗(selective internalradiation therapy,SIRT)单独或与包括免疫治疗在内的其他治疗相结合的治疗。
背景技术
下文中对技术背景的讨论的目的仅在于促进对本发明的理解。需要说明的是，该讨论并不代表或承认讨论中提及的内容是本发明优先权日时在任何司法管辖区已经发表、已知或属于技术人员公知常识的一部分。
2015年，癌症导致15.7％的人口死亡。这些死亡病例中很大一部分包括诊断晚、处于无法切除和/或肿瘤周围出现高度血管化肿块的癌症。在肝癌(HCC)中，肿瘤周围的高度血管化肿块主要通过现有动脉的新形成分支(如肝动脉)接受血液供应。一种常见的治疗高度血管化癌症的方法是栓塞新形成的分支。选择性内放射治疗(SIRT，又称放射性栓塞(RE))是一种在放射指导下经动脉导管将放射性包被微球直接注入高度血管化肿瘤的治疗方法。
这种精确的给药方式避免了非恶性器官的损伤，因为放射治疗只能通过向肿瘤供血的分支给药，而微球的辐射通过在一定范围内的放射破坏了肿瘤细胞，同时保留了健康组织。
肝细胞癌(HCC)是一种高度恶性的疾病，是全世界第二大癌症相关的死亡原因(Ferlay,et al.Int J Cancer 136,E359-386(2015))。肝癌最有效的治疗方法是肿瘤切除或肝移植，但仅限于疾病早期(Bruix，and Sherman，Hepatology(Baltimore，Md.)531020-1022(2011)。大多数局部晚期疾病患者采用局部治疗，如经动脉化疗栓塞或钇-90(Y90)放射性栓塞(RE)，也称为选择性内放射治疗(SIRT)(Raza，and Sood，World Journal ofGastroenterology:WJG 20，4115-4127(2014))。
肝脏通常作为免疫抑制的微环境维持。肝脏以这种方式进化的主要原因是来自动脉循环和肠道的血液进入肝脏后，在那里毒素和肠道衍生的微生物产物会被捕获和清除。为了防止应答持续的病原体暴露引起的异常免疫，肝脏具有独特的免疫调节系统。肝细胞对肝脏固有耐受性的贡献在于通过在缺乏共刺激的情况下启动初始T细胞，从而导致细胞毒性缺陷和克隆消除。这表明免疫治疗尤其是肝内T细胞启动在肝癌的治疗中是无效的。此外，肝脏处理毒素，因此通常对化疗药物不太敏感。
钇-90(Y90)-放射性栓塞(RE)可显著降低局部晚期肝细胞癌(HCC)的发病率，延缓疾病进展。尽管Y90-RE有效，但它引起持续治疗应答的免疫影响机制尚不清楚。Y90-RE已被证明能通过肿瘤缩小和延缓疾病进展来控制疾病(Kallini,et al.Advances in Therapy33,699-714(2016))。Y90同位素的半衰期约为64.2小时，但最大的临床反应，即肿瘤消退和血清甲胎蛋白(serum alfa-feto protein)减少，仅在治疗3-6个月后才出现(Salem,etal.Gastroenterology 138,52-64(2010))。导致这种延迟但持久的抗肿瘤作用的机制仍不清楚。
有必要了解谁将对治疗作出反应，以改善上述问题中的至少一个。
发明内容
本发明的目的是提供用于将癌症患者分类到治疗组进行预测并预测对特定癌症治疗反应的系统和方法，特别是放射治疗是否是适当的癌症治疗，特别涉及选择性内放射治疗法(SIRT)单独或与包括免疫疗法在内的其他疗法联合治疗。
因此，本发明一方面提供一种用于预测癌症患者治疗反应的体外方法，所述方法包括：测量从癌症患者身上采集的白细胞样本中的至少一个免疫标记物的表达；基于所述至少一个免疫标记物相关(in relation to)预定值的表达，将患者样本分为(i)选择性内放射治疗(SIRT)的持续应答者(SR)或(ii)选择性内放射治疗(SIRT)的短暂/无应答者(TR/NR)。
本发明另一方面提供一种用于预测癌症患者治疗反应的系统，所述系统包括：一种处理单元，用于获取取自癌症患者白细胞样本中免疫标记物表达谱的数据集；根据概率对所述数据集进行排序，所述概率为白细胞样本中多个细胞的免疫标记物表达与癌症患者相对应，所述癌症患者是指对选择性内放射治疗(SIRT)有反应或对SIRT无反应或仅有短暂反应的癌症患者；为从癌症患者中采集的样本分配一个概率分数，所述癌症患者(i)对SIRT有反应或(ii)对SIRT治疗无反应或仅有短暂反应，其中，所述样本的所述概率分数来自具有免疫标记物表达的多个细胞中的大多数，这些细胞对应于对SIRT有反应的癌症患者或对应于对SIRT没有反应或短暂反应的癌症患者。
本发明另一方面还提供一种包括选择性内放射治疗(SIRT)和免疫疗法的组合在制备用于被预测为SIRT持续应答者(SR)的患者的癌症治疗药物中的应用，最好是肝细胞癌。
本发明另一方还提供一种用于治疗被预测为选择性内放射治疗(SIRT)的持续应答者(SR)的癌症患者的治疗方法，所述方法包括向患者施用治疗性有效剂量的包含SIRT和免疫疗法的成分。
本发明另一方还提供一种包括选择性内放射治疗(SIRT)和免疫疗法的组合，用于被预测为SIRT的持续应答者(SR)的癌症患者的治疗。
本领域技术人员结合附图审阅下面发明披露的技术方案的具体实施例说明可以很明显地了解到本发明披露的技术方案的其它方面。
附图说明
现在，仅以示例的方式，参考附图来描述本发明的技术方案。
图1是预测肝细胞癌患者Y90放射性栓塞后持续反应的模型流程图。使用具有37个标记的单细胞细胞因子数据(CyTOF data)来获得作为应答者或非应答者的每个患者的最终预测类别状态。
图2是使用随机森林预测法(random forest prediction method)建立Y90-RE持续反应预测模型。A、基于随机森林预测模型，用树状图显示训练队列(training cohort)n＝22和检测队列(testing cohort)n＝8样本之间的距离。B、基于mtry(随机变量个数)和ntree(树个数)的精度曲线，采用随机森林预测法建立训练模型。最准确参数选自mtry＝10和ntree＝2000，准确率为76.8％。C、描述如何预测临床结果。D、随机森林预测法中的受试者操作特征(ROC)曲线，用于预测训练队列n＝22和验证/检测队列n＝8中Y90-RE后的持续反应。AUC＝曲线下面积。
图3是训练集模型和测试集模型在单细胞水平上的ROC曲线，采用随机森林预测模型的最终预测模型。训练集n＝22:AUC＝0.8461，准确程度＝0.7686；测试集n＝8:AUC＝0.6769，准确程度＝0.7082。AUC＝曲线下面积。
图4是Y90-RE持续应答预测模型显示由Y90-RE在肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)和PBMCs中诱导一系列的免疫应答。在Y90-RE治疗肿瘤的TILs中(在Y90-RE成功缩小后3-6个月内切除)，Y90-RE治疗后观察到表达CD8+的GB、自然杀伤(NK)细胞和NKT细胞的浸润增加，而在首次治疗对照肿瘤(treatment-
control tumors)组中观察到更多的TREG。Y90-RE诱导肿瘤微环境中趋化因子的上调可能与CD8+T细胞的募集和活化有关。另一方面在PBMCs中，在Y90-RE治疗后1个月和3个月，观察到TNF-α表达和颗粒酶B(GB)表达的免疫亚群以及抗原呈递细胞(APC)的免疫激活。
图5是从Y90治疗和首次治疗的肿瘤(treatment-naive tumors)里分离出的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的免疫特性。A、样本收集和分析管道。在Y90前和Y90-RE后不同时间点采集PBMCs(n＝31例患者)。TILs收集自Y90-RE后切除的HCC肿瘤(治疗后缩小)或首次治疗患者(treatment-naive patients)Ctl(n＝每组7例)。CyTOF用于分析Y90-RE后和首次治疗患者的肿瘤组织中PBMCs、TILs和NGS(n＝每组4例)。B、二维热图显示TILs富集节点免疫标记物的差异表达，TILs分离自Y90-RE后(左上角)或首次治疗(Ctl；右上角)的肝癌。Y90-RE后TILs中富集的免疫亚群为CD56+、自然杀伤(NK)细胞、CD8+CD56+NKT细胞、CD8+Tim3+T细胞和CD4+CD45RO+T细胞，而调节性T细胞、Treg细胞则富集于由Ctl的肝细胞癌分离的TILs(灰度编码线)。n＝每组7个。
图6是A、颗粒酶B(GB)和B、Tim-3在Y90-RE(Y90)和Ctl-HCC肿瘤上分离出的TILs的二维表达。图像是使用内部增强的ACCENSE软件生成的。
图7是显示来自Y90-RE(Y90)后或Ctl TILs(顶部面板)的CD8+T细胞上GB圈选(gating of GB)的典型图。来自Y90-RE后和Ctl TILs(底部面板)患者的GB+CD8+T细胞和Tim-3+CD8+T细胞的百分比。
图8是来自Y90-RE后(Y90)和Ctl-TILs的CD56+NK细胞、CD8+CD56+NKT细胞、GB+CD56+NK细胞和GB+CD8+CD56+NKT细胞的百分比。图形数据表示平均值±标准差，并通过未配对学生t-检验(unpaired Students’t-test)进行分析。*P<0.05和**P<0.01。
图9是来自于Y90-RE后或首次治疗肿瘤的TILs免疫特性。A、密度图显示代表性节点(representative nodes)的CXCR3和CD45RO表达，节点244代表Y90RE后肿瘤中在TILs中富集的CD4+群(CD4+population)。灰色图显示选定节点的表达特性(expressionprofiles)，黑色图显示所有节点的表达特性。灰线和黑线表示每个标记物的平均表达水平。B、图表显示了Y90-RE(Y90)后TILs中CXCR3+CD4+CD45RO+T细胞的百分比和首次治疗(Ctl)肿瘤的百分比。图表表示平均值±SDs，并通过未配对学生t-检验进行分析。*p<0.05。
图10是Y90RE后或首次治疗肿瘤的TILs的免疫特性。具有代表性的图显示了来自Y90RE(Y90)后和首次治疗(Ctl)的TILs的圈选前CD4+T细胞上Foxp3+CD152+Treg细胞的圈选。右图表显示了Treg细胞的百分比。数据显示平均值±标准差，采用未配对学生t-检验进行分析。*p<0.05。
图11是由Y90-RE诱导的CCL5和CXCL16的趋化途径。A、定量PCR分析Y90处理的(n＝8)与Ctl(n＝6)肿瘤组织中CCL5和CXCL16的RNA表达。B、CCL5和CXCL16的RNA表达与肿瘤浸润GB+CD8+活化T细胞(n＝14)百分率的相关性。图形数据表示平均值±标准偏差。P值和相关系数(r)用Pearson相关性检验(Pearson’s correlation test)计算。*P<0.05和**P<0.01。
图12是Y90-RE应答者与无应答者外周血单个核细胞(PBMCs)在Y90-RE治疗后1个月和3个月时的免疫特征。A、代表图显示CD8+Tim3+ T细胞的圈选(上部)以及圈选在这些CD8+Tim3+ T细胞上的TNF-α表达，所述圈选是基于Y90-RE之前(Pre)和一个月(1mo)之后分离出的PBMCs进行的。右图显示Y90-RE治疗前和治疗1-6个月后表达TNF-α的CD8+Tim-3+ T细胞在在持续应答者(SRs)或无应答者(NRs)和短暂应答者(TRs)中的百分比。B、代表图显示圈选TNF-α表达CD4+ T细胞，所述圈选是基于Y90治疗之前(Pre)和一个月(1mo)之后分离出的PBMCs进行的。右图显示了表达TNF-α的CD4+T细胞的百分比。C、代表图显示圈选CD14+HLA-DR+细胞，所述圈选是基于Y90治疗之前(Pre)和三个月(3mo)之后分离出的PBMCs进行的。右图显示Y90-RE治疗前和治疗1-6个月后SRs和NRs/TRs中CD14+HLADR+抗原呈递细胞的百分比。图形数据表示平均值±标准偏差。数据分析采用配对学生t-检验(pairedStudent’s t-test)(治疗前和治疗后1个月或3个月)或未配对学生t-检验(治疗后3个月的SRs与NRs/TRs)。*P<0.05。**P<0.01。D、密度图显示代表性节点CD14和HLA-DR的表达，节点293显示Y90RE后肿瘤中TILs中富集的APCs。红色点显示选定节点的表达特性，黑色显示所有节点的表达特性。红线和黑线表示每个标记物的平均表达水平。E、代表图显示从Y90 RE和三个月(3mo)后圈选GB+CD56+NK细胞。右图显示持续应答者(SRs)和无或短暂应答者(NRs/TRs)在Y90 RE治疗前和治疗后不同时间点的GB+CD56+NK细胞百分比。数据显示平均数±SDs，采用未配对学生t-检验进行分析。*p<0.05。
图13是Y90-RE的持续应答者(SRs)与无应答者(NRs)/短暂应答者(TRs)的不同免疫亚群。A图中显示了从SRs或NRs/TRs患者中分离出的PBMCs中CXCR6+或CCR5+CD8+T细胞和CXCR6+或CCR5+CD8+Tim-3 T细胞的百分比，这些样本分别在患者治疗前和Y90-RE治疗后不同时间点(1、3和6个月)采集。图形数据表示平均值±标准差，并通过未配对学生t-检验进行分析。*P<0.05和**P<0.01。B、分离出的PBMCs上PD-1和Tim-3的二维细胞图，这些样本采集于SRs或NRs/TRs患者治疗前和Y90-RE治疗后3个月。图像是用accente软件生成的。
图14是Y90-RE的持续应答者(SRs)与无应答者(NRs)/短暂应答者(TRs)的不同免疫亚群。A、图中显示了Y90-RE后不同时间点(1、3和6个月)SRs和NRs/TRs的免疫亚群百分比：PD-1+CD8+T细胞、Tim3+CD8+T细胞、PD-1+CD45RO+CD4+T细胞和Foxp3+CD152+Treg细胞。B、显示PD-1+CD8+T细胞和Tim3+CD8+T细胞百分比的代表图。C、显示PD1+CD4+T细胞百分比(在CD4+CD45RO+T细胞上预圈选)的代表图。D、显示Foxp3+CD152+Treg细胞百分比的代表图(在CD4+ T细胞上预圈选)。B-D、持续应答者(SRs)与无或短暂应答者(NRs/TRs)中Y90 RE前PBMCs中的免疫亚群。
图15是Y90-RE的持续应答者(SRs)与无应答者(NRs)/短暂应答者(TRs)的不同免疫亚群。A、PBMCs上的CXCR6和CCR5的二维细胞图，这些样本分别分离于SRs和NRs/TRs患者Y90-RE术前和术后3个月。B、CCR5+或CXCR6+CD8+T细胞百分比的代表图。免疫亚群来自于Y-90RE前持续应答者(SRs)与无或短暂应答者(NRs/TRs)中的PBMCs。
具体实施方式
下文中对技术背景的讨论的目的仅在于促进对本发明的理解。需要说明的是，该讨论并不代表或承认讨论中提及的内容是本发明优先权日时在任何司法管辖区已经发表、已知或属于技术人员公知常识的一部分。
在本文中，除非上下文要求不同的理解，术语“包括”或其的变型表明包括任何列举的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。
在本文中，除非上下文要求不同的理解，术语“包含”或其的变型表明包括任何列举的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。
如说明书和后续权利要求中的使用，单数形式的表达也包括复数，除非上下文另外明确指出。
本文分析了肝细胞癌切除术后的免疫功能，所述肝细胞癌经Y90-RE治疗后缩小。利用飞行时间质谱(CyTOF)对Y90-RE诱导的高维、深入的免疫表型关键抗肿瘤免疫应答进行了鉴定，这可能是临床反应的基础。对Y90治疗后患者肿瘤组织进行下一代测序(NGS)确定了多个免疫亚群的激活和诱导活化的CD8+T细胞募集的潜在途径。同时检测Y90-RE治疗前和治疗后不同时间点的患者外周血单个核细胞(PBMCs)的免疫特性，确定了关键免疫亚群，包括表达检查点受体PD-1和Tim-3的CD8+T细胞和CD4+T细胞，以及Y90-RE反应者的归巢受体CCR5和CXCR6。此外，利用治疗前PBMCs的免疫特性建立了一个预测模型，以确定Y90-RE的潜在持续应答者。
因此，本发明的一方面提供了一种用于预测癌症患者治疗反应的体外方法，所述方法包括：测量从癌症患者身上采集的白细胞样本中的至少一个免疫标记物的表达；基于所述至少一个免疫标记物相关预定值的表达，将患者样本分为(i)选择性内放射治疗(SIRT)的持续应答者(SR)或(ii)选择性内放射治疗(SIRT)的短暂/无应答者(TR/NR)。
本文中使用的关于预测或预报的术语，无论是何种形式(‘prognoses’,‘prognosis’,‘prognosed’‘prognosticate’,‘prognosticated’,or‘prognosing’)均是指提供选择性内放射治疗(SIRT)后癌症可能结果的预测或预报。SIRT是介入放射治疗癌症的一种放射治疗方法。它通常是用于手术不能切除的癌症患者。该治疗方法包括将含有放射性物质的微小玻璃或树脂微球(最好是钇90同位素(Y-90))注入供应肿瘤血液的动脉。由于该疗法结合了放疗和栓塞，所以也被称为放射性栓塞。选择性内放射治疗(SIRT)后癌症患者可能结果的预测或预报，可以是对SIRT的持续应答者(SR)或一个短暂/无应答者(TR/NR)，在治疗周期的1个月、3个月、6个月或12个月或24个月。在各种实施例中，使用选择性内放射治疗(SIRT)后癌症的可能结果的预测或预报可根据实体瘤的反应评价标准(RECIST)1.1指南(Eisenhauer,et al.Eur J Cancer 45,228-247(2009).)。其中，持续应答者(SRs)被定义为Y90 RE后6个月(180天)内可能无进展性疾病(非PD)结局的患者；而无应答者(NRs)被定义为即使在3个月内也可能有进展性疾病(PD)结局的患者；或短暂应答者(TRs)被定义为可能在3个月时出现初始反应(非PD)，但在Y90 RE后6个月时进展(PD)的患者。
本文中所指的癌症患者是指被诊断为无法切除的癌症和/或高度血管化癌症的患者。在各种实施例中，癌症可以是以下不可切除和/或血管化程度高的癌症之一：肝细胞癌(HCC)；肝癌；结直肠癌；神经内分泌肿瘤；目前不符合肝移植资格的HCC患者；转移性肝癌；转移性结直肠癌；转移性神经内分泌肿瘤；一种肿瘤，在肿瘤或任何其他癌症周围形成一个高度血管化肿块，这种患者的预期寿命至少为3个月。
本文中使用的关于分类的术语，无论是何种形式，(‘classifying’,‘classified’,or‘classification’)，均是指根据特定的标准将患者群体分成亚群，或根据从患者身上采集的免疫标记物样本的特性将患者确定或安排到特定组的过程，或将患者分类为具有特定预后的过程，如选择性内放射治疗(SIRT)的持续应答者(SR)或SIRT的短暂/无应答者(TR/NR)。在各种实施例中，可将患者分类为不同的治疗方案组，例如单独使用SIRT治疗或SIRT结合免疫疗法治疗，由此将被分类为对选择性内放射治疗(SIRT)的持续应答者(SR)的患者可以单独使用SIRT或SIRT结合免疫疗法治疗。
在各种实施例中，通过使用飞行时间质谱(CyTOF)或下一代测序(NGS)、或定量聚合酶链反应(qPCR)或本领域已知的测量免疫标记的表达水平的任何其他方法，测量至少一个免疫标记的表达。
在各种实施例中，从PD-1(SEQ ID NO.9)、Tim-3(SEQ ID NO.21)、CXCR6(SEQ IDNO.12)或其组合、PD-1(SEQ ID NO.9)或Tim-3(SEQ ID NO.21)与CCR5(SEQ ID NO.34)的共表达中选择至少一个免疫标记。在各种实施例中，至少一种免疫标记物包括PD-1(SEQ IDNO.9)。在各种实施例中，至少一个免疫标记包括Tim-3(SEQ ID NO.21)。在各种实施例中，至少一种免疫标记物包括CXCR6(SEQ ID NO.12)。在各种实施例中，至少一个免疫标记包括PD-1(SEQ ID NO.9)与CCR5(SEQ ID NO.34)的共表达。在各种实施例中，至少一个免疫标记包括Tim-3(SEQ ID NO.21)与CCR5(SEQ ID NO.34)的共表达。在各种实施例中，至少一种免疫标记包括PD-1(SEQ ID NO.9)与CXCR6(SEQ ID NO.12)的共表达。在各种实施例中，至少一个免疫标记包括Tim-3(SEQ ID NO.21)与CXCR6(SEQ ID NO.12)的共表达。在各种实施例中，至少一个免疫标记是在CD8+T细胞或CD4 T细胞上的PD-1(SEQ ID NO.9)、Tim-3(SEQ IDNO.21)、CCR5(SEQ ID NO.34)或CXCR6(SEQ ID NO.12)共表达中的任何一个。
在各种实施例中，在测量至少一个免疫标记物表达之前，创建预测模型，包括：测量取自多个癌症患者样本中的多个免疫标记物的表达；
评估用(SIRI)治疗后3个月和/或6个月后癌症患者的临床反应，所述的临床反应选自(SR)和(TR/NR)；
确定每个免疫标记物与临床反应(SR)或临床反应(TR/NR)之间是否存在相关性；
逐一确定各免疫标记物对临床反应准确性有积极影响的概率；
基于所述积极影响临床反应准确性的所述免疫标记物数量，为每个样本分配一个概率分数；以及在从新来的癌症患者身上采集的白细胞样本中，为每个免疫标记分配相同的概率分数，将新来的患者分类为预测的SR或预测的TR/NR。
在各种实施例中，所述多个免疫标记物是表3中列出的两个或多个免疫标记物的任意组合，包括：CD14(SEQ ID NO.1)；CD3(SEQ ID NO.2)；CD19(SEQ ID NO.3)；CD45RO(SEQID NO.4)；HLA-DR(SEQ ID NO.5)；CD8(SEQ ID NO.6)；T-bet(SEQ ID NO.7)；CD28(SEQ IDNO.8)；PD-1(SEQ ID NO.9)；CD154(SEQ ID NO.10)；CD103(SEQ ID NO.11)；CXCR6(SEQ IDNO.12)；TNF-α(SEQ ID NO.13),CD25(SEQ ID NO.14)；CD27(SEQ ID NO.15)；CD152(SEQ IDNO.16)；PD-L1(SEQ ID NO.17)；CD244(SEQ ID NO.18)；IL-10(SEQ ID NO.19)；LAG-3(SEQID NO.20)；TIM-3(SEQ ID NO.21)；CCR7(SEQ ID NO.22)；CD56(SEQ ID NO.23)；CXCR3(SEQID NO.24)；GITR(SEQ ID NO.25)；FoxP3(SEQ ID NO.26)；KI67(SEQ ID NO.27)；CD80(SEQID NO.28)；IFN-γ(SEQ ID NO.29)；IL-17A(SEQ ID NO.30)；EOMES(SEQ ID NO.31)；Granzyme B(SEQ ID NO.32)；CD37(SEQ ID NO.33)；CCR5(SEQ ID NO.34)；CD4(SEQ IDNO.42)或CD69(SEQ ID NO.35)。
在各种实施例中，所述多个免疫标记物是表3中列出的三个或更多免疫标记物的任意组合；或表3中列出的四个或更多免疫标记物；或表3中列出的五个或更多免疫标记物；或表3中列出的六个或更多免疫标记物；或表3中列出的七个或更多免疫标记物；或表3中列出的八个或更多免疫标记物；或表3中列出的9个或更多免疫标记物；或表3中列出的10个或更多免疫标记物；或表3中列出的11个或更多免疫标记物；或表3中列出的12个或更多免疫标记物；或表3中列出的13个或更多免疫标记物；或表3中列出的14个或更多免疫标记物；或表3中列出的15个或更多免疫标记物；或表3中列出的16个或更多免疫标记物，包括：CD14；CD3；CD19；CD45RO；HLA-DR；CD8；T-bet；CD28；PD-1；CD4；CD154；CD103；CXCR6；CD25；CD27；CD152；PD-L1；CD244；IL-10,LAG-3；TIM-3；CCR7；CD56；CXCR3；GITR；FoxP3；KI67；CD80；IL-17A；EOMES；颗粒酶B；CD37；CCR5或CD69。在用SIRT治疗癌症患者之前，在多个癌症患者的样本中采集多个免疫标记物的表达。
在各种实施例中，所述多个癌症患者可以包括3到1000个患者,3到500个患者；3到200个患者；3到100个患者；3到90个患者；3到80个患者；3到70个患者；3到60个患者；3到50个患者；3到40个患者；3到30个患者；3到20个患者；3到10个患者,或任何数量超过2个的患者，其适合创建预测模型，所述模型至少与患者样本的分类一样准确，所述患者样本是基于与预定值相关的至少一个免疫标记物的表达来预测患者是否对上述(SIRT)治疗作出反应。
在各种实施例中，评估癌症患者对用(SIRT)治疗的临床反应是根据实体瘤的反应评价标准(RECIST)1.1指南。(Eisenhauer,et al.Eur J Cancer 45,228-247(2009))。其中持续应答者(SRs)被定义为Y90-RE后6个月(180天)无进展性疾病(非PD)可能结局的患者；而无应答者(NRs)被定义为即使在3个月时也可能导致稳定疾病(SD)的最低反应的患者，短暂反应者(TRs)是指Y90 RE后在3个月时有可能有初始反应，但在6个月时进展的患者。
在各种实施例中，确定每个免疫标记物与临床反应(SR)或临床反应(TR/NR)之间的相关性；使用机器学习算法(随机森林预测模型)确定每个免疫标记物对临床反应的准确性产生积极影响的概率，并根据对临床反应的准确性产生积极影响的免疫标记物的数量为每个样本分配概率得分。也可以使用其他类似的加权邻域方案(weighted neighbourhoodschemes)。在各种实施例中，随机森林包含从训练集构建的模型，数学上表示为：
{xi,yi}ni＝1 (1)
其中，x表示一种免疫标记物，y表示临床反应，i表示许多的细胞，n表示树的数量。
这使得通过观察点的“邻域”对新点“x'”做预测
该邻域由权重函数W形式化，数学上表示为：
这里，W(xi,x’)是第i个训练点相对于同一棵树中新点x'的非负权重。对于任何特殊的x'，对于点{\displaystyle x_{i}}xi的权重必须加1。权重函数列举如下：
在k-NN,权重为
如果xi是k点中的一个且靠近x',除此以外为0。
在一棵树中,
如果xi是是k点中的一个且在同样的树叶上作为x'，除此以外为0。
因为一个森林平均了具有单独的权重函数的一组m树的预测值：Wj,其预测为：
这表明，整个森林又是一个加权邻域方案，其权重是单棵树木的权重的平均值。x'的邻域被解释为在任何树j中共享相同叶子的点Xi。这样，x'的邻域以复杂的方式依赖于树的结构，从而依赖于训练集的结构。随机森林使用的邻域形状适应于每个特征的局部重要性，其中m表示随机变量的数量。在各种实施例中，n为10，m为2000。
在各种实施例中，确定每个免疫标记物积极影响临床反应准确性的概率是在细胞水平上的，所述细胞水平确定相对于单个细胞表达的免疫标记物是否对SIRT具有持续反应的概率。在各种实施例中，可以使用来自随机选择的每个癌症患者的具有多个免疫标记的约10000个单细胞的单细胞表达数据。在各种实施例中，单细胞表达数据被降低采样(downsampled)到约10000个单细胞，以提高单细胞水平的准确性。
在各种实施例中，基于积极影响临床反应准确性的免疫标记物的数量将概率分数分配给每个样本是在样本水平上，所述样本水平比较每个样本中的相邻细胞表达特征，并基于积极影响临床反应准确性的免疫标记物数量来对每个样本分配概率分数。在各种实施例中，对于每个样本，计算被分类为SR或NR的细胞的百分比，并对概率分数使用投票系统，其中≥50％作为SR将样本分类在SR组中，而<50％作为SR将其分类在NR组中(图2C)。投票系统的最后一步产生了非常精确的预测结果。单细胞训练模型和基于投票系统的样本，提供了比任何其他临床参数更高度精确的针对SIRT Y90 RE的反应预测。
在各种实施例中，单个新患者或多个新患者随后成为测试集。所述新患者可以是一个或多个或任何数量的新患者。在各种实施例中，新患者在取样时未经SIRT治疗。
在各种实施例中，所述方法还进一步包括将所述预测的SR或所述预测的TR/NR与基于与预定值相关的所述至少一个免疫标记物的表达的患者样本的分类进行比较，以预测患者是否对(SIRT)治疗作出反应。
将新患者的测试集与基于至少一个免疫标记物相对于预定值的表达对患者样本的分类进行比较，以预测患者是否对SIRT治疗有反应，可以检查预测的准确性，以确保新患者得到最合适的治疗，其中，预计对选择性内放射治疗(SIRT)有持续反应(SR)的患者将单独进行SIRT治疗或SIRT结合免疫治疗。类似地，被预测为短暂/无应答者(TR/NR)的患者将不接受SIRT治疗，而是接受TACE、索拉非尼或单独免疫治疗。
在各种实施例中，有更高概率积极影响临床反应准确性的免疫标记物包括至少一个免疫标记。
在各种实施例中，所述至少一个免疫标记物选自PD-1、Tim-3、CXCR6、或其组合、PD-1或Tim-3与CXCR6的共表达。在各种实施例中，所述至少一种免疫标记物包括PD-1。在各种实施例中，所述至少一种免疫标记物包括Tim-3。在各种实施例中，所述至少一种免疫标记物包括CXCR6。在各种实施例中，所述至少一种免疫标记包括PD-1与CCR5的共表达。在各种实施例中，所述至少一种免疫标记包括Tim-3与CCR5的共表达。在各种实施例中，所述至少一种免疫标记物包括PD-1与CXCR6的共表达。在各种实施例中，所述至少一种免疫标记物包括Tim-3与CXCR6的共表达。在各种实施例中，所述至少一种免疫标记物是CD8+T细胞上PD-1、Tim-3、CCR5或CXCR6共表达的任何一种。
在各种实施例中，所述白细胞样本包括肿瘤浸润白细胞样本。在各种其它实施例中，所述白细胞样本包括外周血单个核细胞(PBMC)样本。在各种实施例中，所述白细胞样本包括表达CD 8的T细胞。在各种实施例中，所述白细胞样本包括表达CD 4的T细胞。在各种实施例中，使用飞行时间质谱法(CyTOF)分析所述样品。
在各种实施例中，所述癌症是肝细胞癌。
在各种实施例中，从癌症患者中采集的白细胞样本，包括预测或分类为可持续应答者(SR)的癌症试验者，被确定为需要单独使用SIRT或SIRT与免疫疗法的组合治疗。
与其他疗法一样，SIRT和免疫疗法也有副作用，增加了任何治疗的成本。因此，首先预测癌症患者是否对SIRT有反应的优点是，只有对SIRT治疗有持续反应的癌症患者才会单独给予SIRT或SIRT附加免疫治疗。类似地，被预测为短暂/无应答者(TR/NR)的患者将不接受SIRT治疗，而是接受TACE、索拉非尼或单独免疫治疗。
本文中使用的术语“免疫治疗”是指，主动、被动或主动和被动免疫疗法的混合。主动免疫疗法指挥免疫系统攻击肿瘤细胞，可能涉及从血液或肿瘤中清除免疫细胞。对肿瘤有特异性的细胞被培养并回输到患者体内攻击肿瘤的地方；或者，免疫细胞可以通过基因工程改造来表达肿瘤特异性受体，然后培养并回输给患者。在各种实施例中，可能包括过继性T细胞治疗。被动免疫疗法增强现有的抗肿瘤反应，包括使用单克隆抗体、淋巴细胞或细胞因子。在各种实施例中，免疫治疗可包括抑制酪氨酸激酶的抗体；程序性细胞死亡1受体(PD-1)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)，也称为T细胞免疫球蛋白和含3的黏蛋白结构域(mucin-domain containing-3，Tim-3)；血管内皮生长因子(VEGF)；表皮生长因子受体(EGFR)；细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)或淋巴细胞活化基因3(Lag-3)。可从sunitinib、erlotinib、ipilimumab、nivolumab、pembrolizamab和bevacizumab中选择合适的抗体。在各种实施例中，免疫治疗可包括细胞因子或趋化因子，例如干扰素，例如TNF-α或白细胞介素类，例如IL-2。在各种实施例中，免疫疗法可包括上述任一免疫疗法的组合。
本发明另一方面提供一种用于预测癌症患者治疗反应的系统，所述系统包括：一种处理单元，用于获取来自癌症患者白细胞样本中免疫标记物表达特征的数据集；根据概率对所述数据集进行排序，所述概率为白细胞样本中多个细胞的免疫标记物表达与癌症患者相对应，所述癌症患者是指对选择性内放射治疗(SIRT)有反应或对SIRT无反应或仅有短暂反应的癌症患者；为从癌症患者中采集的样本分配一个概率分数，所述癌症患者(i)对SIRT有反应或(ii)对SIRT治疗无反应或仅有短暂反应，其中，所述样本的所述概率分数来自具有免疫标记物表达的多个细胞中的大多数，这些细胞对应于对SIRT有反应的癌症患者或对应于对SIRT没有反应或短暂反应的癌症患者。
所述处理单元可以是能够获得、排序和分配如本文所述的数据集的任何已知处理单元。
在各种实施例中，所述系统进一步还包括一个设备用于测量从癌症患者中采集的白细胞样本中免疫标记物的表达。
在各种实施例中，所述处理单元构成用于测量从癌症患者中采集的白细胞样本中免疫标记物表达的所述设备的一部分。
在各种实施例中，所述设备是一种细胞仪。在各种实施例中，所述细胞仪是适用于等离子体质谱和飞行时间质谱连用的流式细胞仪。在这种方法中，抗体与同位素纯元素结合，这些抗体用于标记普遍的和靶向的免疫标记物，如白细胞蛋白。细胞被雾化并通过氩等离子体，使金属结合的抗体电离。然后用飞行时间质谱仪分析金属信号。在各种其它实施例中，所述细胞仪可以是使用结合荧光团而不是同位素的流式细胞仪或本领域已知的任何其它细胞仪，以探测和/或测量白细胞中免疫标记物的表达。
在各种实施例中，所述设备是下一代测序器，例如热测序器、高序列基因组测序器(illumina)、大规模并行签名测序器(massively parallel signature sequencer)或本领域已知的用于探测和/或测量白细胞中免疫标记的mRNA表达的任何其他高通量测序设备或系统。在各种实施例中，所述设备是热循环器。在各种实施例中，所述热循环器可用于测量定量聚合酶链反应(qPCR)或实时qPCR(RT-qPCR)。在各种实施例中，所述设备是本领域已知的用于探测和/或测量白细胞中免疫标记物的mRNA表达的任何设备或系统。
本发明另一方面提供了一种组合，所述组合包括选择性内放射治疗(SIRT)和免疫疗法，用于被预测为SIRT持续应答者(SR)的患者的癌症治疗。
一个SIRT可包含含有放射性物质的微小玻璃或树脂微球。在各种实施例中，所述SIRT是钇90同位素(Y-90)。在各种实施例中，所述免疫治疗可包括过继性T细胞治疗。在各种实施例中，所述免疫治疗可包括经设计以对抗肿瘤抗原的T细胞。在各种实施例中，所述免疫治疗可包括抑制酪氨酸激酶的抗体；程序性细胞死亡1受体(PD-1)；甲型肝炎病毒细胞受体2(HAVCR2)，也称为T细胞免疫球蛋白和含-3的黏蛋白结构域(Tim-3)；血管内皮生长因子(VEGF)；表皮生长因子受体(EGFR)；细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)或淋巴细胞活化基因3(Lag-3)。可从sunitinib、erlotinib、ipilimumab、nivolumab、pembrolizamab和bevacizumab中选择合适的抗体。在各种实施例中，免疫治疗可包括细胞因子或趋化因子，例如干扰素，例如TNF-α或白细胞介素类，例如IL-2。在各种实施例中，免疫疗法可包括上述任一免疫疗法的组合。
在各种实施例中，免疫治疗可与钇90同位素(Y-90)一起包含在微球上。在各种其它实施例中，免疫治疗可与含钇90同位素(Y-90)的微球分开提供。
在各种实施例中，所述组合适合用于癌症治疗。在各种实施例中，所述癌症是肝细胞癌。
本发明另一方面提供一种包括选择性内放射治疗(SIRT)和免疫疗法的组合在制备用于被预测为SIRT持续应答者(SR)的患者的癌症治疗药物中的应用，最好是肝细胞癌，其中所述组合包含如上所述的SIRT和免疫疗法的。
本发明另一方面提供一种用于治疗被预测为选择性内放射治疗(SIRT)的持续应答者(SR)的癌症患者的治疗方法，所述方法包括向患者施用治疗性有效剂量的包含SIRT和免疫疗法的成分。其中包含SIRT和免疫疗法的成分如上所述。类似地，一种用于被预测为选择性内放射治疗(SIRT)的短暂/无应答者(TR/NR)的癌症患者的治疗方法，所述方法包括对患者施用其他疗法而不是SIRT，例如TACE或索拉非尼或免疫疗法。
在各种实施例中，所述癌症患者包括肝细胞癌患者。
在各种实施例中，免疫治疗可与SIRT一起施用。
在各种其它实施例中，免疫治疗可与SIRT分开施用。
举例说明
采用飞行时间质谱和下一代测序技术，分析Y90-RE治疗前和治疗后不同时间点肿瘤浸润白细胞(TILs)、肿瘤组织和外周血单个核细胞(PBMCs)的免疫状态(immunelandscapes)。
Y90-RE后分离出的TILs显示局部免疫激活的标志物，包括颗粒酶B(GB)的高表达和CD8+T细胞、CD56+NK细胞和CD8+CD56+NKT细胞的浸润。NGS证实在Y90-RE治疗的肿瘤中先天性和适应性免疫激活基因都上调。涉及CCL5和CXCL16的趋化通路与Y90-RE治疗肿瘤中活化的GB+CD8+T细胞的募集相关。当比较Y90-RE治疗前后的PBMCs时，观察到CD8+和CD4+T细胞上TNF-α的增加，以及Y90-RE后抗原提呈细胞百分比的增加，这意味着系统性免疫激活。高比例的PD-1+/Tim-3+CD8+T细胞共同表达归巢受体CCR5和CXCR6，预示Y90-RE应答者。根据治疗前外周血单个核细胞(PBMCs)的免疫特征，同时建立了预测模型来识别Y90-RE的持续应答者。
肿瘤和系统免疫状态(immune landscapes)的高维分析确定了可能解释Y90-RE持续反应的局部和系统免疫激活。确定了与阳性临床反应相关的潜在生物标记物，并建立了一个预测模型，以在治疗前识别持续反应者。
患者和样本处理
肿瘤组织和血液样本来自新加坡国家癌症中心和新加坡综合医院的41名HCC患者,这些患者之前用或者没有用Y90 RE治疗。其中，14例接受HCC手术切除，并从14例切除的HCC组织中经酶消化分离出肿瘤浸润性白细胞(TILs)(见表1)。
表1经Y90 RE治疗切除的HCC与首次治疗(treatment naive)的患者临床资料n＝12
脚注：n＝7Y90 RE后vs.n＝7首次治疗HCC肿瘤作为对照(Ctl)，并匹配有病毒状态、TNM级别、等级和性别。*进行切除术后Y90 RE的天数。+表示为CyTOF、NGS或qPCR实验采集的样本对。*从经Y90 RE治疗后HEP279和HEP285肿瘤中采集的两个肿瘤标本进行分析。
外周血单个核细胞(PBMCs)是从另一组31个患者(表2纳入了4例Y90 RE后切除的HCC患者，并对其TILs进行分析，纳入表1。)经过Y90 RE治疗前和治疗后不同时间点(1，3个月和6个月)分离的，根据制造商的说明，使用常规Ficoll(GE Healthcare，英国)分离方法。
表2 Y90RE治疗的HCC患者临床和样本采集信息
脚注：
■：用于飞行时间质谱的样本。
1个月(1mo),37到53天；3个月(3mo),75到146天；6个月(6mo)，157到233天。
RECIST 1.1标准：
CR，完全反应的特征是“所有靶病变消失”。
PR，部分反应定义为“靶病变直径之和减少30％”。
PD，进展性疾病被定义为“靶病变直径总和增加20％”。
SD，稳定性疾病被描述为“既没有足够的缩小来满足PR的要求，也没有足够的增加来满足PD的要求”(24)。
进展位置，靶向是指用Y90治疗的病变进展；无靶向是指未用Y90治疗的病变在肝(肝)内进展；对于肝外病变，如肺(远距离)。
反应级别：NR＝无应答者，3个月时已出现PD的患者；TR＝短暂应答者，患者在3个月时出现SD、PR或CR(无PD)，但在6个月时PD；SR＝持续应答者，6个月时为非PD的患者。
用于各种分析的样本在表1和表2中表明：
实体瘤的反应评价标准(RECIST)1.1指南(Eisenhauer,et al.Eur J Cancer 45,228-247(2009).)被用于评估肿瘤反应。持续应答者(SRs)被定义为Y90 RE治疗后6个月(180天)内无任何进展性疾病(无-PD)的患者；而无应答者(NRs)是即使在3个月内也没有最低的稳定性疾病(SD)反应；短暂应答者(TRs)是在Y90-RE后3个月有初始反应但在6个月有进展患者(表2)。这项研究得到了新加坡卫生服务中心机构审查委员会的批准，向所有患者提供了知情同意书。
飞行时间质谱(CyTOF)
利用37种金属结合抗体(表3)分析TILs和PBMCs，使用如前所述的CyTOF(Chew etal.Proc Natl Acad Sci U S A 114,E5900-E5909(2017))。简而言之，免疫细胞用顺铂活性染色(DVS Sciences,USA)和抗人CD45白细胞标记分别与金属镧系元素-89、115和172共轭-如前所述的三条形码系统染色(Lai,et al.Cytometry A 87,369-374(2015))。结合条形码免疫细胞，然后染色靶向表面标记的抗体。细胞用1.6％多聚甲醛固定，用100％甲醇渗透，使细胞内抗体染色。最后，在用Helios流式细胞仪(Fludigm,USA)分析之前，添加DNA插入器(DVS Sciences,USA)用于细胞可视化。
表3用于CyTOF染色的抗体
| 同位素 | 抗体 | 克隆 | 载体 |
| 89 | CD45(Barcode 1) | HI30 | Fluidigm |
| 112/114 | CD14 | TüK4 | Life technologies |
| 115 | CD45(Barcode 2) | HI30 | Biolegend |
| 139 | CD3 | UCHT1 | Biolegend |
| 141 | CD19 | HIB19 | Biolegend |
| 142 | CD45RO | UCHL1 | Biolegend |
| 143 | HLA-DR | L243 | Biolegend |
| 144 | CD8 | SK1 | Biolegend |
| 145 | T-bet | 4B10 | Biolegend |
| 146 | CD28 | CD28.2 | Biolegend |
| 147 | PD-1 | EH12.2H7 | Biolegend |
| 148 | CD4 | SK3 | Biolegend |
| 149 | CD154 | 24-31 | Biolegend |
| 150 | CD103 | B-Ly7 | Ebioscience |
| 151 | CXCR6 | K041E5 | Biolegend |
| 152 | TNF-α | Mab11 | Biolegend |
| 153 | CD25 | 2A3 | BD bioscience |
| 154 | CD27 | O323 | Biolegend |
| 155 | CD152 | BN13 | BD bioscience |
| 156 | PD-L1 | 29E.2A3 | Biolegend |
| 157 | CD244 | CL7 | Biolegend |
| 158 | IL-10 | JES3-9D7 | Biolegend |
| 159 | LAG-3 | 17B4 | Abcam |
| 160 | TIM-3 | F38-2E2 | Biolegend |
| 161 | CCR7 | G043H7 | Biolegend |
| 162 | CD56 | NCAM16.2 | BD bioscience |
| 163 | CXCR3 | G025H7 | Biolegend |
| 164 | GITR | 621 | Biolegend |
| 165 | FoxP3 | PCH101 | Ebioscience |
| 166 | Ki67 | 20Raj1 | Ebioscience |
| 167 | CD80 | 2D10 | Biolegend |
| 168 | INF-γ | B27 | Biolegend |
| 169 | IL-17A | BL168 | Biolegend |
| 170 | EOMES | 21Mags8 | Ebioscience |
| 171 | CD45RA | JS-83 | Ebioscience |
| 172 | CD45(Barcode 3) | HI30 | Biolegend |
| 173 | Granzyme B | CLB-GB11 | Abcam |
| 174 | CD137 | 4B4-1 | Biolegend |
| 175 | CCR5 | T21/8 | Biolegend |
| 176 | CD69 | FN50 | Biolegend |
| 191/193 | Ir嵌入剂 | Fluidigm |
Helios生成的输出文件按照制造商的说明(Finck,et al.Cytometry A 83,483-494(2013).)，使用EQTM四元素校准珠(Four Element Calibration Beads)(Cat#201078,Fluidigm)进行了规范化，并在FlowJo中通过布林圈选策略(Boolean Gating strategy)(version 10.2；FlowJo LLC,USA)手动解除条形码。每一个样本都减少(down-sampled)到10000个活的免疫细胞，在分析前为每组选择相同数量的样本，使用一个内部增强的基于非线性随机嵌入的细胞表达的自动分类(Automatic Classification of CellularExpression by Nonlinear Stochastic Embedding，ACCENSE)软件，基于Barnes-Hut-SNE非线性降维算法和k-means聚类算法的结合(Shekhar,et al.Proc Natl Acad Sci U S A111,202-207(2014))。同时生成二维t-分布随机邻域嵌入(t-Distributed StochasticNeighbour Embedding，t-SNE)图和密度图的细胞和节点视图，用于表达每个节点中的单个标记。通过配对或不配对的曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U Test)确定两组中显著富集的节点(P<0.05)。所有数据都是使用FlowJo独立验证的。基于所有重要节点绘制二维和三维热图，使用R脚本进行数据可视化。
下一代测序(NGS)
每个患者的肿瘤组织都随后保存在RNAlater储存溶液中(ThermoFisherScientific,USA)并在-80℃下储存，直到进一步处理。使用mirVana miRNA分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific)分离RNA，并使用SMART
v4 UltraTM低输入RNA测序试剂盒(Clontech,USA)生成cDNA，根据制造商规程操作。利用Nextera XT DNALibraryPrepKit(Illumina,USA)从扩增的cDNA中构建了Illumina-ready cDNA文库，并进行多重化(multiplexed)以进行2x 101bp测序。NGS是在新加坡基因组研究所的HiSeq高输出平台上进行的。
原始测序读取通过分层索引映射，以参考来自Ensembl基因组数据库的人类合集GRCh38.p7进行转录拼接对齐(HISTAT)。然后使用SAMtools对读取队列(Read alignments)进行排序，并使用高通量测序数据(HTSeq)提取原始基因计数。使用R package EdgeR工具对两组样本进行差异基因表达分析。将经验贝叶斯拟合F-检测(empirical Bayes quasi-likelihood F-test)用于广义线性模型管道(Generalised Linear Model pipeline)的基因统计分析(Lund,et al.Stat Appl Genet Mol Biol 11,(2012))。选择变化倍数(fold-change)>2和P<0.01的基因。这些数据随后用R-Script在热图上显示出来，并使用DAVID6.7功能注释工具(Functional Annotation Tool)，并基于P<0.01和benjamini<0.05选择标准，对Y90 RE后肿瘤中的富集基因进行生物功能分析。利用反应途径数据库(ReactomePathway Database)对富集基因进行其它的功能途径分析(Croft,etal.Nucleic Acids Res 39,D691-697(2011))。
定量聚合酶链反应(qPCR)
按上述方法从肿瘤组织中提取RNA，使用上标IV逆转录酶(Thermo FisherScientific,USA)进行cDNA转化，根据制造商的说明书操作。靶基因的引物序列见表4。使用
480 SYBR Green I Master(Roche,Switzerland)进行qPCR，并使用
480 SYBR Green I Master(Roche,Switzerland)进行qPCR操作，使用
480 II(Roche)收集数据。进行了技术性的三重测试，结果与GAPDH表达进行了标准化，以获得相对基因表达的平均值。
表4：靶基因的引物序列
| 靶基因 | SEQ ID NO. | 5'-3'方向的引物序列 |
| CCL5-Forward | 36 | ACACACTTGGCGGTTCTTTC |
| CCL5-Reverse | 37 | CCTGCTGCTTTGCCTACATT |
| CXCL16-Forward | 38 | CTACACGAGGTTCCAGCTCC |
| CXCL16-Reverse | 39 | CAATCCCCGAGTAAGCATGT |
| GAPDH-Forward | 40 | ACCACAGTCCATGCCATCAC |
| GAPDH-Reverse | 41 | TCCACCACCCTGTTGCTGTA |
预测模型算法
采用随机森林算法(Breiman，Machine Learning 45，5-32(2001))建立模型，预测Y90 RE的临床反应。来自随机选择的22名患者中，每个患者的单细胞CyTOF数据(10000个单细胞，37个标记物表达)被用于算法调整和训练，然后在一个独立的验证或测试队列中对8名患者进行测试(图1)。R中的Caret(K.M,Journal of Statistical Software 28,(2008))和Ranger(Wright,Journal of Statistical Software 77,(2017).))包用于基于两个参数的随机森林的调整和训练：mtry，每棵树中随机变量的数目；ntree，树的数目，以获得最佳精度(mtry＝10，ntree＝2000，最大精度为76.8％，用于调整模型-图2)。对于每个样本，计算被分类为SR或NR的细胞百分比，并将其用作概率得分的投票系统，其中≥50％作为SR分类样本到SR组，然而<50％作为SR分类样本到NR组。将结果与实际临床结果进行比较，并在受试者操作特性(ROC)曲线上绘制真、假阳性率。
单细胞水平的训练和测试数据的准确度分别为0.7686和0.7082(图3)，曲线下面积(AUC)值分别为0.846和0.677。对于训练数据，这意味着训练模型将随机选择的阳性R类单细胞数据排序高于随机选择的阴性NR类单细胞数据的可能性为84.6％，并且训练数据集中76.9％的单细胞数据被正确分类，作为对实际临床结果的参考。在所述测试数据集中，70.8％的单细胞数据被正确分类。然后使用简单的细胞水平概率得分来获得样本水平概率得分(图1，表5和表6)。对于训练或测试/验证队列中的每个样本，计算分类为SR类和NR类的细胞数。计算每个样本中被分类为SR类和NR类的单元格的百分比(图1，表5和表6)，并将其用作投票系统，作为整个样本水平上SR类和NR类的概率分数。在最后一步中，为了将样本分类为SR类，样本数据的正SR类概率得分必须等于或大于50％，否则样本将被分类为NR类。投票系统的最后一步产生了非常精确的预测结果，训练数据集的预测精度为0.955，测试数据集的预测精度为0.750。在ROC曲线下，训练和测试数据集的AUC值均为1(图2D)。这意味着，95.5％的训练集样本被正确分类，并且训练模型将随机选择的积极应答者SR类样本的排名高于随机选择的消极应答者NR类样本的概率为100％。这有一个明显的优势，即所有NR类别都很有可能使用包含SIRT和免疫疗法的相关组合进行治疗，即使在SR被预测为NR的情况下，仅使用SIRT治疗就足够了，包含SIRT和免疫疗法组合的联合治疗也应该仍然会引起反应。图2A显示了训练和测试/验证队列中样本之间距离的树状图。为单个标记使用中值表达式值。
表5：训练队列预测结果n＝22
表6：测试队列预测结果n＝8
单细胞训练模型和基于投票系统的样本，提供了比任何其他临床参数都高精确度的对SIRT Y90 RE反应的预测。
基于Y90前PBMCs免疫特征的持续反应的预测模型
根据外周血中免疫标记物表达的差异，将对Y90-RE有持续反应的患者从无反应或短暂反应的患者分离出来。接下来，利用随机森林建立预测模型，预测Y90前PBMCs(图2A)基于单细胞免疫特性的持续反应(来自10000个单细胞的CyTOF数据，有37个标记表达)。根据以下参数选择预测模型：mtry(随机变量数)和ntree(树数)，其最大精度提供了最佳精度(mtry＝10，ntree＝2000提供了最大精度76.8％，见图2B)。在训练队列(n＝22)中交叉验证该模型时，准确率高达95.5％，在测试队列(n＝8)中独立测试时，准确率为75.0％(图2D和表5、6)。综上所述，这种深入的免疫分型方法在局部和全身水平上证明了Y90-RE后免疫应答的性质。已经确定了潜在的系统生物标记物，用于分类和预测对Y90-RE有持续反应的HCC患者(图4)。
多元方差分析
为了考虑可能潜在影响临床结果或对Y90-RE反应的其他临床参数，进行多变量方差分析，以分析实际临床反应与本文所述的预测模型之间的关系以及可能影响结果/反应的其他临床参数。对于多变量方差分析(Manova-Xu and Cui.Bioinformatics 2008；24:1056-62)，基于Pillai-Bartlett痕迹统计(Muller and New.J Comput Graph Stat 1998；7:131-7)计算F值和P值。这些参数包括：分期、肿瘤多样性、肿瘤大小、门静脉癌栓(PVTT)、甲胎蛋白(AFP)水平、肝炎状况和Y90-RE治疗前后的治疗(pre or post therapy prior orafter Y90-RE)(表7)。
表7：Y90-RE-1治疗HCC患者的临床及标本采集信息
如表8所示，本文所述的预测模型在预测能力(p＝1.006e-07)上优于阶段(p＝0.0012)；或在肿瘤多样性(p＝0.014)或任何其他没有显著预测能力的参数。这表明，在Y90-RE前PBMC的免疫状态在预测Y90-RE持续应答方面，比其他临床参数更能作为一个更好的生物标志物。因此，本文所描述的预测模型是非常优越的。
表8：多变量方差分析(Manova)
F值＝根据F统计量计算的值
P值＝p<0.001***p<0.01**p<0.05*
统计分析
对于CyTOF数据，采用非参数配对或非配对曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney Utest)对两组间的差异节点进行识别。使用配对或未配对学生t-检验或曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney Utest)和Pearson相关检GraphPad Prism V.6.0f)来分析FlowJo和qPCR数据，如图所示。
Y90-RE治疗的一般反应
从分析肝癌患者切除的肿瘤组织和外周血单个核细胞获得的数据，有力地证明Y90-RE可诱导局部和系统免疫反应，包括T细胞、NK细胞和NKT细胞活化、抗原提呈和免疫细胞运动。对Y90-RE有持续反应的患者所特有的系统免疫亚群包括：表达衰竭标记物(PD-1和Tim-3)的CD8+T细胞和CD4+T细胞以及表达归巢受体(CCR5和CXCR6)的CD8+T细胞和CD8+Tim3+T细胞。还发现Y90-RE通过CCL5和CXCL16对活化的GB+CD8+T细胞的趋化途径。重要的是，目前的研究提供了一个基于Y90-RE前PBMCs免疫特征的持续临床反应预测模型。
TILs的深度免疫表型在肿瘤局部微环境中显示出明显的免疫激活，例如在Y90-RE后，活化或表达GB的CD8+T细胞、CD56+NK细胞和CD8+CD56+NKT细胞增加，TREG细胞减少。对肿瘤组织的NGS数据的分析也为增强的T细胞、NK细胞和NKT细胞活性提供了有力的证据。例如，在接受Y90-RE治疗的患者中，观察到CD28共刺激和CD28依赖的Vav1和Akt通路的诱导，这些通路以前被证明对T细胞的激活和增殖有积极的调节作用(Charvet,The Journal ofImmunology 177,5024-5031(2006))。CyTOF和NGS分析还发现，Y90-RE参与NK细胞和NKT细胞活化，从而增强了天然免疫应答。
Y90-RE激活局部免疫反应
设计了一个基于CyTOF和NGS的深入分析管道，以调查接受Y90-RE治疗前后HCC患者TILs、肿瘤组织和PBMCs的免疫表型(图5A)。为了了解局部免疫反应的性质，从Y90-RE治疗后的患者或首次治疗(treatment-naive)的患者(具有匹配的临床参数，作为对照，Ctl，表1)中分离TILs。使用CyTOF分析TILs(表3)，并确定Y90-RE后肿瘤与对照组(Ctl)肿瘤的差异表达节点/免疫亚群(图5B)。
观察到特异性CD56+NK细胞、CD8+CD56+NKT细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞亚群在从Y90-RE后肿瘤分离的TILs中富集(图5B)。Y90-RE后TILs中两种免疫标记物，颗粒酶B(GB)和Tim-3的表达高于对照组(Ctl)肿瘤(图6A和B)。事实上，在Y90-RE后的TILs中检测到更高百分比的GB+CD8+T细胞和Tim-3+CD8+T细胞，这已通过FlowJo手动圈选(manual gating)得到证实(图7)。在Y90-RE后的TILs中也观察到CD56+NK细胞和CD8+CD56+NKT细胞的总体富集，其表达显著高于对照组TILs的GB(图8)。此外，在Y90RE后的TILs中，观察到更高百分比的表达CXCR3的CD4+CD45RO+T细胞(图5B和图9)。相反，与Y90-RE后的TILs相比，对照组的TILs显示更高百分比的Foxp3+CD152+CD4+TREG细胞(图5B和图10)。综上所述，这些数据显示Y90-RE后肿瘤的免疫微环境被多个激活的免疫亚群浸润且免疫抑制作用较弱，与富含TREG细胞的对照组肿瘤相比。
Y90-RE治疗后肿瘤组织中诱导的免疫激活途径
对Y90-RE后HCC患者切除的肿瘤组织进行NGS，对比对照组未接受任何治疗的患者(表1)。总的来说，观察到多个差异表达基因，其中88％的高表达基因在Y90-RE后，相比对照组肿瘤。使用DAVID途径分析工具进行功能分析发现，这些富集的基因大多与先天或适应性免疫反应有关。相反，对照组肿瘤中富集的基因与免疫途径无关。
利用Reactome数据库(Reactome database)进一步分析这些Y90后再富集的基因，识别途径包括MHC II类分子的抗原提呈；T细胞激活途径，其与CD28共刺激和CD28依赖的Vav1和Akt途径相关。对比Y90-RE后于对照组的肿瘤，还检测到通过CD244和CD48上调NK细胞激活途径，以及LFA-1和ICAM-1结合的富集，这是肝脏NKT细胞发育和募集所需要的。综上所述，这些发现与CyTOF观察到的T-NK-和NKT-细胞在Y90-RE后肿瘤中的活化和募集的增强相辅相成。
Y90-RE诱导CD8+T细胞对肿瘤微环境的趋化作用
对Y90-RE后富集的基因的Reactome分析也表明，趋化活性增加涉及CXCL16和CCL5的上调(图11)。鉴于这一结果，推测Y90-RE可能诱导趋化途径。
对来自同一患者的肿瘤样本(表1)进行qPCR，以验证NGS结果，结果确实显示CCL5和CXCL16表达增加，这两种趋化因子分别与CCR5和CXCR6结合(图11A)。为了证实其对活化T细胞的趋化作用，CCL5和CXCL16的RNA表达与TILs中发现的免疫亚群相关，并证实CCL5和CXCL16与活化的GB+CD8+T细胞百分比呈正相关(图11B)。这些发现证明了Y90-RE不仅通过诱导肿瘤细胞死亡，而且在治疗后通过t细胞募集和激活，能够塑造HCC肿瘤的微环境。
Y90放射性栓塞诱导的早期和晚期免疫应答
为了捕获Y90 RE诱导的系统免疫应答，在Y90-RE前和后不同时间点(1、3和6个月)采集了31例HCC患者的外周血单个核细胞(PBMCs)(表2)。
所述31名接受Y90-RE治疗的患者被分为两组：持续应答者(SRs)和无应答或短暂应答者(NRs/TRs)(表2)。SRs是Y90 RE后6个月在任何部位(非PD)无进展性疾病的患者；NRs是甚至在3个月时没有显示稳定疾病(SD)的患者，TRs是在3个月时显示初始反应但在6个月进展的患者，并对SRs进行了特定的成对时间点CyTOF分析(图4)。免疫激活的最初迹象表现为Y90-RE后1个月CD8+Tim3+和CD4+T细胞TNF-α表达增加，特别是在SRs中(图12A和图12B)。值得注意的是，在治疗后1个月和3个月，在T细胞亚型中表达的TNF-α在SRs中显著高于NRs/TRs(图12A和图12B)。
在Y90-RE治疗后3个月和治疗前进行了同样的比较，治疗3个月后，特别在SRs中观察到明显较高比例的CD14+HLADR+抗原呈递细胞(APC)(图12C和图12D)。GB+CD56+NK细胞在3个月时也显著增强，但这种升高仅在Y90-RE后1个月的SRs中出现(图12E)。当将6个月时的PBMCs与除APCs外的Y90-RE前的PBMCs进行比较时，发现免疫细胞亚群的差异不太明显(图12C)。
Y90-RE治疗的反应预测
用CyTOF分析Y90-RE治疗前后的PBMCs，使我们能够捕捉治疗引起的系统免疫反应，并识别潜在的生物标志物来预测临床结果。首次在Y90-RE后1个月检测到的免疫反应是CD8+和CD4+T细胞上细胞因子TNF-α表达增加，随后在Y90-RE后3个月检测到APCs增加(图12)。Y90-RE前表达PD-1和Tim-3的系统性CD8+T细胞和CD4+CD45RO+T细胞百分率高，表明患者在治疗后继续引起持续反应，肿瘤进展时间延长≥6个月。同样的免疫亚群CD8+Tim-3+T细胞，也是Y90-RE后肿瘤TILs中富集的关键亚群之一(图7)。
Tim-3是免疫细胞衰竭的标志物，与包括HCC在内的多种癌症的进展有关(Li,etal.Hepatology 56,1342-1351(2012))。PD-1和Tim-3共表达可增强T细胞损伤，并与肿瘤的进展有关(Fourcade et al.J Exp Med 207,2175-2186(2010))。然而，Tim-3的表达也预示着先前T细胞的活化(Hastings et al.Eur J Immunol 39,2492-2501(2009))，事实上，CD8+T细胞上Tim-3和PD-1的共同表达可能表明先前对肿瘤抗原的免疫反应。另一个显示T细胞活性提高的指标是Y90-RE后患者TILs或PBMCs上的促炎性GB和TNF-α的共表达(图7和图12A)。同时靶向Tim-3和PD-1途径可以逆转T细胞衰竭，恢复小鼠肿瘤模型的抗肿瘤免疫反应(Sakuishi,et al.J Exp Med 207,2187-2194(2010))。根据这些数据，我们推测，Y90-RE序贯治疗加上针对PD-1/PD-L1或Tim-3通路的检查点抑制剂进行免疫治疗，特别是在持续应答者中，可能会增强HCC的临床反应。
Tim-3与归巢受体CCR5和CXCR6在CD8+T细胞上的共表达表明它们有向CCL5和CXCL16趋化因子归巢(home towards)的能力。数据表明，CCR5+CD8+和CXCR6+CD8+或CCR5+/CXCR6+Tim-3+CD8+T细胞是Y90-RE应答者的其他生物标记物(图13A)。
有趣的是，NGS和qPCR显示了Y90-RE后肿瘤微环境中CCL5和CXCL16的上调(图11)。这些结果表明，Y90-RE诱导的趋化因子表达是通过CCL5和CXCL16途径将细胞毒性的CD8+T细胞募集到肿瘤部位所必需的，并且这种效应导致Y90-RE的临床反应(图11B)。
深入的免疫表型分析和转录组分析显示，对Y90-RE有持续反应的HCC患者，其肿瘤微环境和外周血系统中均有较强的免疫激活。通过这种方法，免疫激活被捕获，再外周血中的预测性生物标记物被确定持续临床反应，可以指导HCC患者的治疗选择。
PD-1和Tim-3的更高表达识别并预测对Y90的持续反应
在Y90-RE治疗前和治疗后3个月，比较SRs和NRs/TRs的系统免疫功能。可以观察到CD4+T细胞和CD8+T细胞对SRs有清晰的特异性。PD-1和Tim-3在Y90-RE治疗前和治疗后3个月的SRs中均有更高的表达(图13B)。
经FlowJo手动圈选(manual gating)验证，同时在两个时间点，表达PD-1和Tim-3的CD8+T细胞在SRs中的百分比都更高(图14A和图14B)。还可以观察到，治疗前和治疗后3个月，SRs中PD-1+CD4+CD45RO+T细胞的百分比也更高(图13A和图14C)。值得注意的是，在Y90-RE后6个月，SRs中的Tim-3+CD8+T细胞保持更高(图14A)。
这种明显的衰竭标志物的更高表达可能表明治疗前和治疗后3或6个月时SRs特有的T细胞活化水平更高。这可能在一定程度上介导了随后对Y90-RE的持续反应。相反，Y90-RE前和Y90-RE后3个月NRs/TRs中富集的免疫亚群包括CD4+Foxp3+CD152+Treg(图14B和图14D)；不表达PD-1的CD4+CD45RO+T细胞和不表达PD-1或Tim-3的CD8+T细胞。
Y90-RE持续应答者T细胞表达特异性归巢受体
当将Y90-RE前和Y90-RE后3个月的SRs与NRs/TRs比较时，可以观察到趋化因子受体表达的明显差异，即CCR5和CXCR6(图15A)。所有样本的FlowJo手动圈选(manual gating)证实，同时在这两个时间点，SRs中CCR5+CD8+T细胞和CXCR6+CD8+T细胞的百分比显著更高(图13A和图15B)。有趣的是，在富集的SRs的Tim-3+CD8+T细胞亚群中，CCR5和CXCR6的表达也显著更高(图14A和图14B)。表达CCR5和CXCR6的CD8+ T细胞的更高百分比也与先前的结果一致，该结果显示活化的CD8+ T细胞在Y90-RE时进入肿瘤微环境(图11B)。此外，在Y90-RE后1个月观察到CD8+T细胞和CD8+Tim-3+ T细胞上CCR5和CXCR6的百分比下降，这进一步表明激活的T细胞在Y90-RE后募集到肿瘤部位(图13A)。
本领域技术人员可以领会到，上述技术特征的变化和组合，并不是可选方案或替代方案，可以被组合起来形成更多属于本发明保护范围的实施例。
序列表
<110> 新加坡保健服务集团有限公司（Singapore Health Services Pte. Ltd.）
<120> 用于将癌症患者分类到合适的癌症治疗组的系统和方法以及治疗癌症患者的组合物
<130> 2018.P01322
<150> SG10201709924T
<151> 2017-11-30
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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cccagcccct cacaccactc gggagaggga catcctacgg tcccaaggtc aggagggcag 1740
ggctggggtt gactcaggcc cctcccagct gtggccacct gggtgttggg agggcagaag 1800
tgcaggcacc tagggccccc catgtgccca ccctgggagc tctccttgga acccattcct 1860
gaaattattt aaaggggttg gccgggctcc caccagggcc tgggtgggaa ggtacaggcg 1920
ttcccccggg gcctagtacc cccgccgtgg cctatccact cctcacatcc acacactgca 1980
cccccactcc tggggcaggg ccaccagcat ccaggcggcc agcaggcacc tgagtggctg 2040
ggacaaggga tcccccttcc ctgtggttct attatattat aattataatt aaatatgaga 2100
gcatgctaag gaaaa 2115
<210> 10
<211> 1834
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
actttgacag tcttctcatg ctgcctctgc caccttctct gccagaagat accatttcaa 60
ctttaacaca gcatgatcga aacatacaac caaacttctc cccgatctgc ggccactgga 120
ctgcccatca gcatgaaaat ttttatgtat ttacttactg tttttcttat cacccagatg 180
attgggtcag cactttttgc tgtgtatctt catagaaggt tggacaagat agaagatgaa 240
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gatataatgt taaacaaaga ggagacgaag aaagaaaaca gctttgaaat gcaaaaaggt 420
gatcagaatc ctcaaattgc ggcacatgtc ataagtgagg ccagcagtaa aacaacatct 480
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tattgtatct acctgcagtc tccattgttt ccagagtgaa cttgtaatta tcttgttatt 1800
tattttttga ataataaaga cctcttaaca ttaa 1834
<210> 11
<211> 3878
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
ccgcctcctg gcctcctggc tgaggggaag ctgagtgggc cacggcccat gtgtcgcact 60
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ccaaaagtgt ctgtgcattg tgcaaaaagt aaacttagga aacatttggt attaaataaa 3840
tttacacttt tctttgcagt aaaaaaaaaa aaaaaaaa 3878
<210> 12
<211> 1953
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
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<210> 13
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
cagacgctcc ctcagcaagg acagcagagg accagctaag agggagagaa gcaactacag 60
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agccctggcc tccaccccca ccccgccgac catccaaggg agagtgagac ctggcagcca 1080
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<210> 16
<211> 1923
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
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gttttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920
aaa 1923
<210> 17
<211> 907
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
ggcgcaacgc tgagcagctg gcgcgtcccg cgcggcccca gttctgcgca gcttcccgag 60
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aataaca 907
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<210> 19
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
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<210> 20
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<212> DNA
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ggaacttact aaaaattttt ttttactgtt aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2448
<210> 22
<211> 2207
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
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ttacccacac acagataaag ttttcccttg aggaaacaac agctttaaaa gaaaaagaaa 2160
aaaaaagtct ttggtaaatg gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2207
<210> 23
<211> 5977
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
tgtctctctt acctccttga tgttcggcac tatttgtggc cggcgtggtg gaaggacaca 60
gtgaggttct cacccccgcc ccccgctcct cgctcccatc ccagttccat caaaacgaac 120
ccgggccagc gcaaggatct ccgagttgcg agtgtgctga ggctgggact gtcactcatt 180
ctccgatcag cgcgtgaacg cagctcggct gccgctggca ggaaacaatt ctgcaaaaat 240
aatcatactc agcctggcaa ttgtctgccc ctaggtctgt cgctcagccg ccgtccacac 300
tcgctgcagg ggggggggca cagaatttac cgcggcaaga acatccctcc cagccagcag 360
attacaatgc tgcaaactaa ggatctcatc tggactttgt ttttcctggg aactgcagtt 420
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ggagaaaagc tcaccccaaa ccagcagcgg atctcagtgg tgtggaatga tgattcctcc 600
tccaccctca ccatctataa cgccaacatc gacgacgccg gcatttacaa gtgtgtggtt 660
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tgtgatgtgg tcagctccct cccaccaacc atcatctgga aacacaaagg ccgagatgtc 840
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ggcttcccag agcccaccat gagctggaca aaggatgggg aacagataga gcaagaggaa 1140
gacgatgaga agtacatctt cagcgacgat agttcccagc tgaccatcaa aaaggtggat 1200
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accatccacc tcaaagtctt tgcaaaaccc aaaatcacat atgtagagaa ccagactgcc 1320
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ctcaatggca aagggctggg tgagatcagc gcggcctccg agttcaagac gcagccagtc 2160
caaggggaac ccagtgcacc taagctcgaa gggcagatgg gagaggatgg aaactctatt 2220
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tgtggcctgt tcatgtgcat tgcggtcaac ctgtgtggaa aagccgggcc cggggccaag 2640
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gtggaggttc gaacggagga ggagaggacc ccaaaccatg atggagggaa acacacagag 2760
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acacagacaa aggagaacga gagcaaagca tgatgggtga agagaaccga gcaaagatca 2940
aaataaaaag tgacacagca gcttcaccag agcatttcca acaccacaga cacacacacg 3000
cacgcacaca cacaaacaca catgcacaca cacacatctc atttctctag tgtcttttgc 3060
ctttaaaaaa aactaaacag ataaaacatg ggaatctcct ttttgtaggt ttatagaaag 3120
ggtccctttg ttgcacactc acttgtaaga aaatgagaca aaaaggttaa acccacagcc 3180
aaactaggac actccgttcc ctgaaaccgt taaaaaatca aacaaaagga ccccaaatta 3240
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gattggcaca gaccagtttc agagaaatac tttcaggcac taagactaat cgaatgaaca 3360
aagtccacag tttattttta tactttcagt caagtttgaa ctctgtaaaa cctcataaat 3420
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gctgaattca attcccacgt agactcttat tttataggac gaatgccaaa ttgcagcttc 3540
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tctttctttc tttctgccaa ctttgttttc cagtgtttac aaggtgacaa atgtttgact 3660
ttggttgtgt ttaaatgtcc gtgtaaaata gctgcctttt attttttaag gtaacaaata 3720
ccacctagag gtaggtagga tcatcccacg cttgctttag cacaggacaa ctttacaaaa 3780
catgattgtt tacagctgct cttcccctct tttctgatct gcagtttttg cctgggtccc 3840
actcaggtga aaatccatct cattctggaa tggttttgct tttgaatttt tggttatttt 3900
tgtgtttctt tgggggttag accactttct gattagccgc cacctgcctg catctgtgaa 3960
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atgaagcaga gaagattgta tagttggggc tggtcttggt gaacacacat tattacccca 4080
cacatcccct ttgtgtagaa agccaaataa aatctataca taccatttcc ttttgagccc 4140
agaatctaga tttgagcgga agagcatgtg tgcttcaggg aattagtgtc tttttttgga 4200
aatctgttga agtaaagtaa catcggcctt ctgttcactt aggcagcatt tatagaaaca 4260
aaagaagaaa gaaacaacct actgtctgga gtcataacac aactttcctg gattggaaac 4320
caagtggggg aaaaaataca gaaactttaa gggggatggg agggggggga gaagggaaaa 4380
gccagccctt tgtatagaaa ttttgctttt ttttccctca ttctacttta gaactgcaag 4440
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caggaaacaa aaatcactca aacggaatcg aagcctttta acaaagaaaa tgaaatacag 4620
atgatgatga tgatgatgaa gatgatgcta agtaaacaga aatcagtact ccgcatgcgc 4680
tcctctccta aggtacaaag cagcaagagg ttagggtggc aaggctgcct ctgggtccat 4740
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tatgttaaga gatcaaagct tataattttc ttttttaatt tttgaaggag ggatcaactc 5520
cagtttccaa tgtctatgtg tctatgtgtg tatgtgccat acatatgtat tcacatgaag 5580
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cctgcagggc tgtggtgtat atagtgcagc tttggaggtg gaactctatt ttcacacttt 5700
tctatggagc cttccgagtc ccaggttttc acttgaggct gtctgtctgg atggcggttt 5760
tcagacctcc attaacatcc ctacccagca ttctgtactt cgggggcctt ctctcttgtt 5820
ataaaacttt ttaccaagtg aaacatcgat accacctttg tttccattct cactggtgta 5880
aatactgagt actaactgag aattttgact ttgcattctg tcggaatact tgtgttcaat 5940
aaaaattgaa agaaaaaagc taaaaaaaaa aaaaaaa 5977
<210> 24
<211> 1914
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 24
ccaaccacaa gcaccaaagc agaggggcag gcagcacacc acccagcagc cagagcacca 60
gcccagccat ggtccttgag gggtccctgg gccgatggga tcacgcagaa gaatgcgaga 120
gaagcagcct ttgagaaggg aagtcactat cccagagccc aggctgagcg gatggagttg 180
aggaagtacg gccctggaag actggcgggg acagttatag gaggagctgc tcagagtaaa 240
tcacagacta aatcagactc aatcacaaaa gagttcctgc caggccttta cacagcccct 300
tcctccccgt tcccgccctc acaggtgagt gaccaccaag tgctaaatga cgccgaggtt 360
gccgccctcc tggagaactt cagctcttcc tatgactatg gagaaaacga gagtgactcg 420
tgctgtacct ccccgccctg cccacaggac ttcagcctga acttcgaccg ggccttcctg 480
ccagccctct acagcctcct ctttctgctg gggctgctgg gcaacggcgc ggtggcagcc 540
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cgcctcaacg ccacccactg ccaatacaac ttcccacagg tgggccgcac ggctctgcgg 960
gtgctgcagc tggtggctgg ctttctgctg cccctgctgg tcatggccta ctgctatgcc 1020
cacatcctgg ccgtgctgct ggtttccagg ggccagcggc gcctgcgggc catgcggctg 1080
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ggctgcccca accagagagg gctccagagg cagccatcgt cttcccgccg ggattcatcc 1380
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tttgctcttt tatttttatg tctaaaatcc tgcttaaaac ttttcaataa acaagatcgt 1860
caggaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1914
<210> 25
<211> 1193
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
gtctacaccc cctcctcaca cgcacttcac ctgggtcggg attctcaggt catgaacggt 60
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<210> 26
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 26
gcacacactc atcgaaaaaa atttggatta ttagaagaga gaggtctgcg gcttccacac 60
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cacccaccac cgccactggg gtcttctccc tcaaggcccg gcctggcctc ccacctggga 540
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catcatccga caagggctcc tgctgcatcg tagctgctgg cagccaaggc cctgtcgtcc 960
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<211> 12507
<212> DNA
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gctgaaatgt tcaagacccc agtgaaggag caaccgcagt tgacaagcac atgtcacatc 2520
gctatttcaa attcagagaa tttgcttgga aaacagtttc aaggaactga ttcaggagaa 2580
gaacctctgc tccccacctc agagagtttt ggaggaaatg tgttcttcag tgcacagaat 2640
gcagcaaaac agccatctga taaatgctct gcaagccctc ccttaagacg gcagtgtatt 2700
agagaaaatg gaaacgtagc aaaaacgccc aggaacacct acaaaatgac ttctctggag 2760
acaaaaactt cagatactga gacagagcct tcaaaaacag tatccactgc aaacaggtca 2820
ggaaggtcta cagagttcag gaatatacag aagctacctg tggaaagtaa gagtgaagaa 2880
acaaatacag aaattgttga gtgcatccta aaaagaggtc agaaggcaac actactacaa 2940
caaaggagag aaggagagat gaaggaaata gaaagacctt ttgagacata taaggaaaat 3000
attgaattaa aagaaaacga tgaaaagatg aaagcaatga agagatcaag aacttggggg 3060
cagaaatgtg caccaatgtc tgacctgaca gacctcaaga gcttgcctga tacagaactc 3120
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aagagtgaga aaggcaaaat cactaaaatg ccctgccagt cattacaacc agaaccaata 3240
aacaccccaa cacacacaaa acaacagttg aaggcatccc tggggaaagt aggtgtgaaa 3300
gaagagctcc tagcagtcgg caagttcaca cggacgtcag gggagaccac gcacacgcac 3360
agagagccag caggagatgg caagagcatc agaacgttta aggagtctcc aaagcagatc 3420
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gaggaatcaa tgactgatga gaaaactacc aaaatagcct gcaaatctcc accaccagaa 3600
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tcagacccag tggacacccc aacaagcaca aagcaacgac ccaagagaag tatcaggaaa 4020
gcagatgtag agggagaact cttagcgtgc aggaatctaa tgccatcagc aggcaaagcc 4080
atgcacacgc ctaaaccatc agtaggtgaa gagaaagaca tcatcatatt tgtgggaact 4140
ccagtgcaga aactggacct gacagagaac ttaaccggca gcaagagacg gccacaaact 4200
cctaaggaag aggcccaggc tctggaagac ctgactggct ttaaagagct cttccagacc 4260
cctggtcata ctgaagaagc agtggctgct ggcaaaacta ctaaaatgcc ctgcgaatct 4320
tctccaccag aatcagcaga caccccaaca agcacaagaa ggcagcccaa gacacctttg 4380
gagaaaaggg acgtacagaa ggagctctca gccctgaaga agctcacaca gacatcaggg 4440
gaaaccacac acacagataa agtaccagga ggtgaggata aaagcatcaa cgcgtttagg 4500
gaaactgcaa aacagaaact ggacccagca gcaagtgtaa ctggtagcaa gaggcaccca 4560
aaaactaagg aaaaggccca acccctagaa gacctggctg gcttgaaaga gctcttccag 4620
acaccagtat gcactgacaa gcccacgact cacgagaaaa ctaccaaaat agcctgcaga 4680
tcacaaccag acccagtgga cacaccaaca agctccaagc cacagtccaa gagaagtctc 4740
aggaaagtgg acgtagaaga agaattcttc gcactcagga aacgaacacc atcagcaggc 4800
aaagccatgc acacacccaa accagcagta agtggtgaga aaaacatcta cgcatttatg 4860
ggaactccag tgcagaaact ggacctgaca gagaacttaa ctggcagcaa gagacggcta 4920
caaactccta aggaaaaggc ccaggctcta gaagacctgg ctggctttaa agagctcttc 4980
cagacacgag gtcacactga ggaatcaatg actaacgata aaactgccaa agtagcctgc 5040
aaatcttcac aaccagaccc agacaaaaac ccagcaagct ccaagcgacg gctcaagaca 5100
tccctgggga aagtgggcgt gaaagaagag ctcctagcag ttggcaagct cacacagaca 5160
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cagctgagaa ctcctaaggg aaagtctgaa gtccctgaag acctggccgg cttcatcgag 5340
ctcttccaga caccaagtca cactaaggaa tcaatgacta acgaaaaaac taccaaagta 5400
tcctacagag cttcacagcc agacctagtg gacaccccaa caagctccaa gccacagccc 5460
aagagaagtc tcaggaaagc agacactgaa gaagaatttt tagcatttag gaaacaaacg 5520
ccatcagcag gcaaagccat gcacacaccc aaaccagcag taggtgaaga gaaagacatc 5580
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aatagacggc tacaaactcg taaggaaaag gcccaggctc tagaagaact gactggcttc 5700
agagagcttt tccagacacc atgcactgat aaccccacga ctgatgagaa aactaccaaa 5760
aaaatactct gcaaatctcc gcaatcagac ccagcggaca ccccaacaaa cacaaagcaa 5820
cggcccaaga gaagcctcaa gaaagcagac gtagaggaag aatttttagc attcaggaaa 5880
ctaacaccat cagcaggcaa agccatgcac acgcctaaag cagcagtagg tgaagagaaa 5940
gacatcaaca catttgtggg gactccagtg gagaaactgg acctgctagg aaatttacct 6000
ggcagcaaga gacggccaca aactcctaaa gaaaaggcca aggctctaga agatctggct 6060
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ggcaagctca cacagacgtc agggaagacc acacagacac acagagagac agcaggagat 6300
ggaaagagca tcaaagcgtt taaggaatct gcaaagcaga tgctggaccc agcaaactat 6360
ggaactggga tggagaggtg gccaagaaca cctaaggaag aggcccaatc actagaagac 6420
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aaaactacca aaatagcctg caaatctcca caaccagacc cagtggacac cccagcaagc 7260
acaaagcaac ggcccaagag aaacctcagg aaagcagacg tagaggaaga atttttagca 7320
ctcaggaaac gaacaccatc agcaggcaaa gccatggaca caccaaaacc agcagtaagt 7380
gatgagaaaa atatcaacac atttgtggaa actccagtgc agaaactgga cctgctagga 7440
aatttacctg gcagcaagag acagccacag actcctaagg aaaaggctga ggctctagag 7500
gacctggttg gcttcaaaga actcttccag acaccaggtc acactgagga atcaatgact 7560
gatgacaaaa tcacagaagt atcctgtaaa tctccacagc cagagtcatt caaaacctca 7620
agaagctcca agcaaaggct caagataccc ctggtgaaag tggacatgaa agaagagccc 7680
ctagcagtca gcaagctcac acggacatca ggggagacta cgcaaacaca cacagagcca 7740
acaggagata gtaagagcat caaagcgttt aaggagtctc caaagcagat cctggaccca 7800
gcagcaagtg taactggtag caggaggcag ctgagaactc gtaaggaaaa ggcccgtgct 7860
ctagaagacc tggttgactt caaagagctc ttctcagcac caggtcacac tgaagagtca 7920
atgactattg acaaaaacac aaaaattccc tgcaaatctc ccccaccaga actaacagac 7980
actgccacga gcacaaagag atgccccaag acacgtccca ggaaagaagt aaaagaggag 8040
ctctcagcag ttgagaggct cacgcaaaca tcagggcaaa gcacacacac acacaaagaa 8100
ccagcaagcg gtgatgaggg catcaaagta ttgaagcaac gtgcaaagaa gaaaccaaac 8160
ccagtagaag aggaacccag caggagaagg ccaagagcac ctaaggaaaa ggcccaaccc 8220
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ctgactgctg gcaaagccac taaaataccc tgcgaatctc ccccactaga agtggtagac 8340
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acaagctcaa agagacggcc caggacacgt gcccagaaag tagaagtgaa ggaggagctg 8760
ttagcagttg gcaagctcac acaaacctca ggggagacca cgcacaccga caaagagccg 8820
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gaagatgtaa ttggcagcag gagacagcca agagcaccta aggaaaaggc ccaacccctg 8940
gaagatctgg ccagcttcca agagctctct caaacaccag gccacactga ggaactggca 9000
aatggtgctg ctgatagctt tacaagcgct ccaaagcaaa cacctgacag tggaaaacct 9060
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agcaccagag accctgtaaa atcacaaagc aaaagcaaca cttccctgcc cccactgccc 9180
ttcaagaggg gaggtggcaa agatggaagc gtcacgggaa ccaagaggct gcgctgcatg 9240
ccagcaccag aggaaattgt ggaggagctg ccagccagca agaagcagag ggttgctccc 9300
agggcaagag gcaaatcatc cgaacccgtg gtcatcatga agagaagttt gaggacttct 9360
gcaaaaagaa ttgaacctgc ggaagagctg aacagcaacg acatgaaaac caacaaagag 9420
gaacacaaat tacaagactc ggtccctgaa aataagggaa tatccctgcg ctccagacgc 9480
caaaataaga ctgaggcaga acagcaaata actgaggtct ttgtattagc agaaagaata 9540
gaaataaaca gaaatgaaaa gaagcccatg aagacctccc cagagatgga cattcagaat 9600
ccagatgatg gagcccggaa acccatacct agagacaaag tcactgagaa caaaaggtgc 9660
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atttgacaga aaaatcgaac tgggaaaaat ataataaagt tagttttgtg ataagttcta 10020
gtgcagtttt tgtcataaat tacaagtgaa ttctgtaagt aaggctgtca gtctgcttaa 10080
gggaagaaaa ctttggattt gctgggtctg aatcggcttc ataaactcca ctgggagcac 10140
tgctgggctc ctggactgag aatagttgaa caccgggggc tttgtgaagg agtctgggcc 10200
aaggtttgcc ctcagctttg cagaatgaag ccttgaggtc tgtcaccacc cacagccacc 10260
ctacagcagc cttaactgtg acacttgcca cactgtgtcg tcgtttgttt gcctatgtcc 10320
tccagggcac ggtggcagga acaactatcc tcgtctgtcc caacactgag caggcactcg 10380
gtaaacacga atgaatggat gagcgcacgg atgaatggag cttacaagat ctgtctttcc 10440
aatggccggg ggcatttggt ccccaaatta aggctattgg acatctgcac aggacagtcc 10500
tatttttgat gtcctttcct ttctgaaaat aaagttttgt gctttggaga atgactcgtg 10560
agcacatctt tagggaccaa gagtgacttt ctgtaaggag tgactcgtgg cttgccttgg 10620
tctcttggga atacttttct aactagggtt gctctcacct gagacattct ccacccgcgg 10680
aatctcaggg tcccaggctg tgggccatca cgacctcaaa ctggctccta atctccagct 10740
ttcctgtcat tgaaagcttc ggaagtttac tggctctgct cccgcctgtt ttctttctga 10800
ctctatctgg cagcccgatg ccacccagta caggaagtga caccagtact ctgtaaagca 10860
tcatcatcct tggagagact gagcactcag caccttcagc cacgatttca ggatcgcttc 10920
cttgtgagcc gctgcctccg aaatctcctt tgaagcccag acatctttct ccagcttcag 10980
acttgtagat ataactcgtt catcttcatt tactttccac tttgccccct gtcctctctg 11040
tgttccccaa atcagagaat agcccgccat cccccaggtc acctgtctgg attcctcccc 11100
attcacccac cttgccaggt gcaggtgagg atggtgcacc agacagggta gctgtccccc 11160
aaaatgtgcc ctgtgcgggc agtgccctgt ctccacgttt gtttccccag tgtctggcgg 11220
ggagccaggt gacatcataa atacttgctg aatgaatgca gaaatcagcg gtactgactt 11280
gtactatatt ggctgccatg atagggttct cacagcgtca tccatgatcg taagggagaa 11340
tgacattctg cttgagggag ggaatagaaa ggggcaggga ggggacatct gagggcttca 11400
cagggctgca aagggtacag ggattgcacc agggcagaac aggggagggt gttcaaggaa 11460
gagtggctct tagcagaggc actttggaag gtgtgaggca taaatgcttc cttctacgta 11520
ggccaacctc aaaactttca gtaggaatgt tgctatgatc aagttgttct aacactttag 11580
acttagtagt aattatgaac ctcacataga aaaatttcat ccagccatat gcctgtggag 11640
tggaatattc tgtttagtag aaaaatcctt tagagttcag ctctaaccag aaatcttgct 11700
gaagtatgtc agcacctttt ctcaccctgg taagtacagt atttcaagag cacgctaagg 11760
gtggttttca ttttacaggg ctgttgatga tgggttaaaa atgttcattt aagggctacc 11820
cccgtgttta atagatgaac accacttcta cacaaccctc cttggtactg ggggagggag 11880
agatctgaca aatactgccc attcccctag gctgactgga tttgagaaca aatacccacc 11940
catttccacc atggtatggt aacttctctg agcttcagtt tccaagtgaa tttccatgta 12000
ataggacatt cccattaaat acaagctgtt tttacttttt cgcctcccag ggcctgtggg 12060
atctggtccc ccagcctctc ttgggctttc ttacactaac tctgtaccta ccatctcctg 12120
cctcccttag gcaggcacct ccaaccacca cacactccct gctgttttcc ctgcctggaa 12180
ctttccctcc tgccccacca agatcatttc atccagtcct gagctcagct taagggaggc 12240
ttcttgcctg tgggttccct cacccccatg cctgtcctcc aggctggggc aggttcttag 12300
tttgcctgga attgttctgt acctctttgt agcacgtagt gttgtggaaa ctaagccact 12360
aattgagttt ctggctcccc tcctggggtt gtaagttttg ttcattcatg agggccgact 12420
gcatttcctg gttactctat cccagtgacc agccacagga gatgtccaat aaagtatgtg 12480
atgaaatggt cttaaaaaaa aaaaaaa 12507
<210> 28
<211> 2757
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 28
gacaagtact gagtgaactc aaaccctctg taaagtaaca gaagttagaa ggggaaatgt 60
cgcctctctg aagattaccc aaagaaaaag tgatttgtca ttgctttata gactgtaaga 120
agagaacatc tcagaagtgg agtcttaccc tgaaatcaaa ggatttaaag aaaaagtgga 180
atttttcttc agcaagctgt gaaactaaat ccacaacctt tggagaccca ggaacaccct 240
ccaatctctg tgtgttttgt aaacatcact ggagggtctt ctacgtgagc aattggattg 300
tcatcagccc tgcctgtttt gcacctggga agtgccctgg tcttacttgg gtccaaattg 360
ttggctttca cttttgaccc taagcatctg aagccatggg ccacacacgg aggcagggaa 420
catcaccatc caagtgtcca tacctcaatt tctttcagct cttggtgctg gctggtcttt 480
ctcacttctg ttcaggtgtt atccacgtga ccaaggaagt gaaagaagtg gcaacgctgt 540
cctgtggtca caatgtttct gttgaagagc tggcacaaac tcgcatctac tggcaaaagg 600
agaagaaaat ggtgctgact atgatgtctg gggacatgaa tatatggccc gagtacaaga 660
accggaccat ctttgatatc actaataacc tctccattgt gatcctggct ctgcgcccat 720
ctgacgaggg cacatacgag tgtgttgttc tgaagtatga aaaagacgct ttcaagcggg 780
aacacctggc tgaagtgacg ttatcagtca aagctgactt ccctacacct agtatatctg 840
actttgaaat tccaacttct aatattagaa ggataatttg ctcaacctct ggaggttttc 900
cagagcctca cctctcctgg ttggaaaatg gagaagaatt aaatgccatc aacacaacag 960
tttcccaaga tcctgaaact gagctctatg ctgttagcag caaactggat ttcaatatga 1020
caaccaacca cagcttcatg tgtctcatca agtatggaca tttaagagtg aatcagacct 1080
tcaactggaa tacaaccaag caagagcatt ttcctgataa cctgctccca tcctgggcca 1140
ttaccttaat ctcagtaaat ggaatttttg tgatatgctg cctgacctac tgctttgccc 1200
caagatgcag agagagaagg aggaatgaga gattgagaag ggaaagtgta cgccctgtat 1260
aacagtgtcc gcagaagcaa ggggctgaaa agatctgaag gtcccacctc catttgcaat 1320
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ttccctttat cagtttgact gtggcctgtt aactggtata tacatatata tgtcaggcaa 1680
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ctaatgtcag agtagaagat tttatgctgc tgtttacaaa agcccaatgt aatgcatagg 1800
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caaatgtcta aggtagtaac tttccatagg gcctccttag atccctaaga tggctttttc 2220
tccttggtat ttctgggtct ttctgacatc agcagagaac tggaaagaca tagccaactg 2280
ctgttcatgt tactcatgac tcctttctct aaaactgcct tccacaattc actagaccag 2340
aagtggacgc aacttaagct gggataatca cattatcatc tgaaaatctg gagttgaaca 2400
gcaaaagaag acaacatttc tcaaatgcac atctcatggc agctaagcca catggctggg 2460
atttaaagcc tttagagcca gcccatggct ttagctacct cactatgctg cttcacaaac 2520
cttgctcctg tgtaaaacta tattctcagt gtagggcaga gaggtctaac accaacataa 2580
ggtactagca gtgtttcccg tattgacagg aatacttaac tcaataattc ttttcttttc 2640
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<210> 29
<211> 1240
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
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agttcacaac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1240
<210> 30
<211> 1859
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 30
gcaggcacaa actcatccat ccccagttga ttggaagaaa caacgatgac tcctgggaag 60
acctcattgg tgtcactgct actgctgctg agcctggagg ccatagtgaa ggcaggaatc 120
acaatcccac gaaatccagg atgcccaaat tctgaggaca agaacttccc ccggactgtg 180
atggtcaacc tgaacatcca taaccggaat accaatacca atcccaaaag gtcctcagat 240
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<210> 31
<211> 3674
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
aagtttccaa gtggtcaact tgaccgatgc tttggcaatt gaaaaagggc agaaaggcgc 60
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<210> 32
<211> 984
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
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<210> 33
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
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<210> 34
<211> 3451
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 34
cttcagatag attatatctg gagtgaagaa tcctgccacc tatgtatctg gcatagtctc 60
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atcatcaaga atcttaagat agaagactca gatacttaca tctgtgaagt ggaggaccag 600
aaggaggagg tgcaattgct agtgttcgga ttgactgcca actctgacac ccacctgctt 660
caggggcaga gcctgaccct gaccttggag agcccccctg gtagtagccc ctcagtgcaa 720
tgtaggagtc caaggggtaa aaacatacag ggggggaaga ccctctccgt gtctcagctg 780
gagctccagg atagtggcac ctggacatgc actgtcttgc agaaccagaa gaaggtggag 840
ttcaaaatag acatcgtggt gctagctttc cagaaggcct ccagcatagt ctataagaaa 900
gagggggaac aggtggagtt ctccttccca ctcgccttta cagttgaaaa gctgacgggc 960
agtggcgagc tgtggtggca ggcggagagg gcttcctcct ccaagtcttg gatcaccttt 1020
gacctgaaga acaaggaagt gtctgtaaaa cgggttaccc aggaccctaa gctccagatg 1080
ggcaagaagc tcccgctcca cctcaccctg ccccaggcct tgcctcagta tgctggctct 1140
ggaaacctca ccctggccct tgaagcgaaa acaggaaagt tgcatcagga agtgaacctg 1200
gtggtgatga gagccactca gctccagaaa aatttgacct gtgaggtgtg gggacccacc 1260
tcccctaagc tgatgctgag tttgaaactg gagaacaagg aggcaaaggt ctcgaagcgg 1320
gagaaggcgg tgtgggtgct gaaccctgag gcggggatgt ggcagtgtct gctgagtgac 1380
tcgggacagg tcctgctgga atccaacatc aaggttctgc ccacatggtc caccccggtg 1440
cagccaatgg ccctgattgt gctggggggc gtcgccggcc tcctgctttt cattgggcta 1500
ggcatcttct tctgtgtcag gtgccggcac cgaaggcgcc aagcagagcg gatgtctcag 1560
atcaagagac tcctcagtga gaagaagacc tgccagtgtc ctcaccggtt tcagaagaca 1620
tgtagcccca tttgaggcac gaggccaggc agatcccact tgcagcctcc ccaggtgtct 1680
gccccgcgtt tcctgcctgc ggaccagatg aatgtagcag atcccaggcc tctggcctcc 1740
tgttcgcctc ctctacaatt tgccattgtt tctcctgggt taggccccgg cttcactggt 1800
tgagtgttgc tctctagttt ccagaggctt aatcacaccg tcctccacgc catttccttt 1860
tccttcaagc ctagcccttc tctcattatt tctctctgac cctctcccca ctgctcattt 1920
ggatcccagg ggagtgttca gggccagccc tggctggcat ggagggtgag gctgggtgtc 1980
tggaagcatg gagcatggga ctgttctttt acaagacagg accctgggac cacagagggc 2040
aggaacttgc acaaaatcac acagccaagc cagtcaagga tggatgcaga tccagaggtt 2100
tctggcagcc agtacctcct gccccatgct gcccgcttct caccctatgt gggtgggacc 2160
acagactcac atcctgacct tgcacaaaca gcccctctgg acacagcccc atgtacacgg 2220
cctcaaggga tgtctcacat cctctgtcta tttgagactt agaaaaatcc tacaaggctg 2280
gcagtgacag aactaagatg atcatctcca gtttatagac cagaaccaga gctcagagag 2340
gctagatgat tgattaccaa gtgccggact agcaagtgct ggagtcggga ctaacccagg 2400
tcccttgtcc caagttccac tgctgcctct tgaatgcagg gacaaatgcc acacggctct 2460
caccagtggc tagtggtggg tactcaatgt gtacttttgg gttcacagaa gcacagcacc 2520
catgggaagg gtccatctca gagaatttac gagcagggat gaaggcctcc ctgtctaaaa 2580
tccctccttc atcccccgct ggtggcagaa tctgttacca gaggacaaag cctttggctc 2640
ttctaatcag agcgcaagct gggagcacag gcactgcagg agagaatgcc cagtgaccag 2700
tcactgaccc tgtgcagaac ctcctggaag cgagctttgc tgggagaggg ggtagctagc 2760
ctgagaggga accctctaag ggacctcaaa ggtgattgtg ccaggctctg cgcctgcccc 2820
acaccctccc ttaccctcct ccagaccatt caggacacag ggaaatcagg gttacaaatc 2880
ttcttgatcc acttctctca ggatcccctc tcttcctacc cttcctcacc acttccctca 2940
gtcccaactc cttttcccta tttccttctc ctcctgtctt taaagcctgc ctcttccagg 3000
aagacccccc tattgctgct ggggctcccc atttgcttac tttgcatttg tgcccactct 3060
ccacccctgc tcccctgagc tgaaataaaa atacaataaa cttactataa agatgcaaaa 3120
aaaaaaaaaa aaaa 3134
Claims (24)
1.一种用于预测癌症患者治疗反应的体外方法，其特征在于，所述方法包括：
测量从癌症患者身上采集的白细胞样本中的至少一个免疫标记物的表达；
基于所述至少一个免疫标记物相关预定值的表达，将患者样本分为(i)选择性内放射治疗(SIRT)的持续应答者(SR)或(ii)选择性内放射治疗(SIRT)的短暂/无应答者(TR/NR)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在测量所述至少一个免疫标记物的表达之前，创建预测模型，包括：
测量取自多个癌症患者样本中的多个免疫标记物的表达；
评估用(SIRI)治疗后3个月和/或6个月后癌症患者的临床反应，所述的临床反应选自(SR)和(TR/NR)；
确定每个免疫标记物与临床反应(SR)或临床反应(TR/NR)之间是否存在相关性；
逐一确定各免疫标记物对临床反应准确性有积极影响的概率；
基于所述积极影响临床反应准确性的所述免疫标记物数量，为每个样本分配一个概率分数；以及在从新来的癌症患者身上采集的白细胞样本中，为每个免疫标记分配相同的概率分数，将新来的患者分类为预测的SR或预测的TR/NR。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步包括将所述预测的SR或所述预测的TR/NR与基于与预定值相关的所述至少一个免疫标记物的表达的患者样本的分类进行比较，以预测患者是否对(SIRT)治疗作出反应。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述多个免疫标记物是选自包括CD14、CD3、CD19、CD45RO、HLA-DR、CD8、T-bet、CD28、PD-1、CD4、CD154、CD103、CXCR6、TNF-α、CD25、CD27、CD152、PD-L1、CD244、IL-10、LAG-3、TIM-3、CCR7、CD56、CXCR3、GITR、FoxP3、KI67、CD80、IFN-γ、IL-17A、EOMES、颗粒酶B、CD37、CCR5或CD69的两个或多个免疫标记物的任意组合。
5.如权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，分配到较高概率分数的所述免疫标记物包括至少一个免疫标记。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一个免疫标记物选自PD-1或Tim-3与CCR5的共表达；或PD-1、Tim-3、CXCR6或其组合的表达。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述白细胞样本包括肿瘤浸润白细胞样本。
8.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述白细胞样本包括外周血单个核细胞(PBMC)样本。
9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述样品通过飞行时间(CyTOF)质谱法分析。
10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述白细胞样本包括表达CD8的T细胞。
11.如权利要求1-10任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症是肝细胞癌。
12.如权利要求1-11任一项所述的方法，其特征在于，从分类为(ii)SR的癌症患者中采集的白细胞样本来确定为需要用SIRT治疗或SIRT与免疫疗法的组合治疗。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述SIRT为Y90-RE。
14.一种用于预测癌症患者治疗反应的系统，其特征在于，所述系统包括：一种处理单元，用于获取取自癌症患者白细胞样本中免疫标记物表达谱的数据集；根据概率对所述数据集进行排序，所述概率为白细胞样本中多个细胞的免疫标记物表达与癌症患者相对应，所述癌症患者是指对选择性内放射治疗(SIRT)有反应或对SIRT无反应或仅有短暂反应的癌症患者；为从癌症患者中采集的样本分配一个概率分数，所述癌症患者(i)对SIRT有反应或(ii)对SIRT治疗无反应或仅有短暂反应，其中，所述样本的所述概率分数来自具有免疫标记物表达的多个细胞中的大多数，这些细胞对应于对SIRT有反应的癌症患者或对应于对SIRT没有反应或短暂反应的癌症患者。
15.如权利要求14所述的系统，其特征在于，进一步还包括一个设备用于测量从癌症患者中采集的白细胞样本中免疫标记物的表达。
16.如权利要求15所述的系统，其特征在于，所述设备是一个细胞仪。
17.如权利要求15所述的系统，其特征在于，所述设备是下一代测序器或热循环器。
18.一种包括选择性内放射治疗(SIRT)和免疫疗法的组合在制备用于被预测为SIRT持续应答者(SR)的患者的癌症治疗药物中的应用。
19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述SIRT为Y90-RE。
20.如权利要求18或19所述的应用，其特征在于，所述癌症是肝细胞癌。
21.一种用于治疗被预测为选择性内放射治疗(SIRT)的持续应答者(SR)的癌症患者的治疗方法，其特征在于，包括向患者施用治疗性有效剂量的包含SIRT和免疫疗法的成分。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述SIRT为Y90-RE。
23.如权利要求21或22所述的方法，其特征在于，所述癌症是肝细胞癌。
24.一种包括选择性内放射治疗(SIRT)和免疫疗法的组合，其特征在于，用于被预测为SIRT的持续应答者(SR)的癌症患者的治疗。
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