CN117665290A - 用于肺癌检测的试剂盒及肺癌样本多色免疫荧光染色方法 - Google Patents
用于肺癌检测的试剂盒及肺癌样本多色免疫荧光染色方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117665290A CN117665290A CN202311673937.0A CN202311673937A CN117665290A CN 117665290 A CN117665290 A CN 117665290A CN 202311673937 A CN202311673937 A CN 202311673937A CN 117665290 A CN117665290 A CN 117665290A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- human
- monoclonal antibody
- rabbit anti
- antibody
- fluorescent dye
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 title claims abstract description 79
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 79
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 79
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 51
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims abstract description 20
- 101001011442 Homo sapiens Interferon regulatory factor 5 Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102100030131 Interferon regulatory factor 5 Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims abstract 5
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 claims abstract 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 101
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 claims description 5
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 3
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 claims description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 abstract description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 abstract description 4
- 102100026882 Alpha-synuclein Human genes 0.000 abstract 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 abstract 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 abstract 1
- -1 CD86 Proteins 0.000 abstract 1
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 abstract 1
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 abstract 1
- 101000652359 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 2 Proteins 0.000 abstract 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 abstract 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 abstract 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 27
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 24
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 22
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 22
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 15
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 10
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 description 8
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 8
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 8
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 7
- 239000011022 opal Substances 0.000 description 7
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 7
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 230000007711 cytoplasmic localization Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 6
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 5
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000043138 IRF family Human genes 0.000 description 2
- 108091054729 IRF family Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 206010017472 Fumbling Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 102100026655 Zinc finger protein castor homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000022120 response to tumor cell Effects 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012418 validation experiment Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本申请公开了一种用于肺癌检测的试剂盒及肺癌样本多色免疫荧光染色方法。本申请用于肺癌检测的试剂盒包括封闭试剂、一抗试剂、二抗试剂和荧光染料；其中，一抗试剂为第一抗体组合或者第二抗体组合；第一抗体组合由CD68、CD86、CD163、CD206、IRF5和panCK组成；第二抗体组合由CD3、CD8、PD1、FOXP3、LAG‑3和panCK组成。本申请的试剂盒，能在一张组织切片上同时表达六个抗体，检测更多的靶标蛋白质信息和共定位情况，不仅能提高染色效率、节约样本，还能避免手工染色带来的重复性低、时间长等问题。此外，本申请的试剂盒还能应用于全自动染片机，实现肺癌的自动化多色免疫荧光检测。
Description
技术领域
本申请涉及肺癌检测技术领域，特别是涉及一种用于肺癌检测的试剂盒及肺癌样本多色免疫荧光染色方法。
背景技术
肺癌(Lung cancer)是起源于肺部支气管粘膜或腺体的呼吸系统恶性肿瘤。肺癌的组织病理学分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌两大类；具有发病率和死亡率较高特点，严重威胁患者的生命健康和生活质量。肺癌的发病机制较为复杂，受环境、物理、化学及生物遗传等因素影响。早期肺癌患者临床症状较为隐匿，很难及时发现；临床确诊时大部分已经是肺癌晚期，并且已经发生转移。目前主要采取直接杀灭肿瘤组织来治疗，如手术、放疗和化疗等，对机体造成较大损伤。随着肺癌免疫治疗方法的研究，通过利用人体自身免疫系统来杀伤肿瘤细胞，开发癌症治疗中肿瘤标志物的研究已经成为重点。肿瘤标志物是肿瘤发生和增值过程中，肿瘤细胞合成、释放或机体应对肿瘤细胞反应进而产生的物质，从组织、血液和体液中均可以检测到，当超出正常检测阈值时，可以预示肿瘤的存在，开发不同肿瘤标志物，建立快速的检测方法，对于准确高效诊断肺癌和进行个体化治疗具有重大意义。
免疫染色技术包括：IHC(Immunohistochemistry)，ICC(Immunocytochemistry)和IF(Immunofluorescence)。其中IHC/IF检测是通过使用抗体和荧光检测来研究福尔马林固定及石蜡包埋(formalin fixation and paraffin embedding，FFPE)的样本中目标蛋白在固定细胞或组织中的定位、相对表达和激活状态。在肿瘤分子检测技术逐渐成熟的今天，相关研究与临床决策的信息基础也开始更加注重对于肿瘤微环境的覆盖。肿瘤微环境的复杂性要求单张组织样本切片产出多重信息，提高对于样本切片特别是珍贵样本的利用率。最近一种新的多标记免疫组织化学染色/免疫荧光染色(multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence,mIHC/IF)技术允许在单一组织切片上同时检测多个抗体，并对细胞组成、细胞功能和细胞-细胞相互作用进行全面研究。该技术克服了常规免疫组织化学IHC技术存在的诸多局限性，包括观察者间的变异性高，每张组织切片仅能标记一个标志物。目前，mIHC/mIF已在国内外研究中得到广泛应用，利用该技术实现对肿瘤免疫微环境(Tumorimmune microenvironment，TIME)下的特异性免疫细胞群的研究，有助于肺癌等患者临床预后判断及疗效预测，已经成为最具应用前景的技术。mIHC/mIF为开展高重复性、高效、高性价比的组织研究提供了高通量多重染色技术和标准化的定量分析。该技术在转化研究和临床实践中，尤其是肿瘤免疫治疗中极具应用价值。
但是，目前尚未有针对肺癌检测的全自动多色免疫荧光检测方案，不利于肺癌的早期诊断和准确的临床预后。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的用于肺癌检测的试剂盒以及肺癌样本多色免疫荧光染色方法。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的第一方面公开了一种用于肺癌检测的试剂盒，该试剂盒用于肺癌样本的多色免疫荧光检测，试剂盒包括封闭试剂、一抗试剂、二抗试剂和荧光染料；其中，一抗试剂为第一抗体组合或者第二抗体组合；第一抗体组合由鼠抗人CD68单克隆抗体、兔抗人CD86单克隆抗体、兔抗人CD163单克隆抗体、兔抗人CD206单克隆抗体、兔抗人IRF5单克隆抗体和兔抗人panCK单克隆抗体组成；第二抗体组合由兔抗人CD3单克隆抗体、兔抗人CD8单克隆抗体、兔抗人PD-1单克隆抗体、兔抗人FOXP3单克隆抗体、兔抗人LAG-3单克隆抗体和兔抗人panCK单克隆抗体组成。
需要说明的是，本申请的肺癌检测试剂盒，针对肺癌检测的使用需求，特别研发了适用于肺癌多色免疫荧光检测的抗体组合，即第一抗体组合和第二抗体组合；基于这两组抗体组合，本申请的试剂盒能够在一张组织切片上同时表达六个抗体，为病理医生提供更多的靶标蛋白质信息和共定位情况，在大大提高染色效率、节约样本的同时；有效的避免手工染色带来的重复性低、时间长等问题。此外，本申请的试剂盒还能够应用于全自动染片机，实现肺癌的自动化多色免疫荧光检测。
还需要说明的是，本申请的试剂盒中第一抗体组合和第二抗体组合的生物学意义不同，两者都是针对肺癌免疫微环境的检测，都能够直接用于肺癌检测。但是，第一抗体组合侧重于研究巨噬细胞，是通过巨噬细胞和肺癌标记物进行检测；第二抗体组合侧重于研究T细胞，通过T细胞和肺癌标记物进行检测。
本申请的一种实现方式中，二抗试剂包括HRP标记的抗鼠抗兔混合物。
本申请的一种实现方式中，封闭试剂为过氧化物酶封闭剂。
本申请的一种实现方式中，第一抗体组合和第二抗体组合中，各抗体分别对应不同的荧光染料。
本申请的一种实现方式中，第一抗体组合的鼠抗人CD68单克隆抗体配对荧光染料XTSA-480，兔抗人CD86单克隆抗体配对荧光染料XTSA-690，兔抗人CD163单克隆抗体配对荧光染料XTSA-620，兔抗人CD206单克隆抗体配对荧光染料XTSA-520，兔抗人IRF5单克隆抗体配对荧光染料XTSA-570，兔抗人panCK单克隆抗体配对荧光染料XTSA-780。
本申请的一种实现方式中，第二抗体组合的兔抗人CD3单克隆抗体配对荧光染料XTSA-520，兔抗人CD8单克隆抗体配对荧光染料XTSA-480，兔抗人PD-1单克隆抗体配对荧光染料XTSA-620，兔抗人FOXP3单克隆抗体配对荧光染料XTSA-570，兔抗人LAG-3单克隆抗体配对荧光染料XTSA-690，兔抗人panCK单克隆抗体配对荧光染料XTSA-780。
需要说明的是，以上具体配对荧光染料是本申请的一种实现方式中经过证实，在本申请的荧光染色顺序下，能够实现染色均一、不串色、染色效果好，能够实现肺癌六个靶标的多色免疫荧光检测的荧光染料配对方案。可以理解，在本申请的发明构思下，不排除还可以采用其他的荧光染料配对方案。
本申请的第二方面公开了本申请的试剂盒在制备肺癌检测或肺癌免疫治疗疗效评估的试剂中的应用。
需要说明的是，本申请的试剂盒能够对肺癌标记物和肺癌免疫微环境进行检测，为病理医生提供更多的靶标蛋白质信息和共定位情况，高效辅助医生和科研人员完成免疫组化多重标记后的各项免疫组化指标的分析，能够在更大规模更大范围内对免疫治疗疗效进行评估。
本申请的第三方面公开了一种肺癌样本多色免疫荧光染色方法，包括采用第一抗体组合或者第二抗体组合中的抗体依序对样本进行抗体孵育和荧光染色；第一抗体组合中各抗体的孵育和荧光染色顺序为，兔抗人CD206单克隆抗体、兔抗人IRF5单克隆抗体、兔抗人CD163单克隆抗体、鼠抗人CD68单克隆抗体、兔抗人CD86单克隆抗体、兔抗人panCK单克隆抗体；第一抗体组合中各抗体的孵育和荧光染色顺序为，兔抗人LAG-3单克隆抗体、兔抗人CD3单克隆抗体、兔抗人FOXP3单克隆抗体、兔抗人PD-1单克隆抗体、兔抗人CD8单克隆抗体、兔抗人panCK单克隆抗体。
需要说明的是，本申请的肺癌样本多色免疫荧光染色方法，实际上就是采用本申请的试剂盒进行肺癌样本的染色处理，因此，本申请肺癌样本多色免疫荧光染色方法中涉及的各抗体的配对荧光染料可以参考本申请的试剂盒，在此不累述。可以理解，本申请的肺癌样本多色免疫荧光染色方法，仅仅是对肺癌样本的染色处理，至于具体的检测还需要配合相应的染色仪器和分析系统；因此，本申请的肺癌样本多色免疫荧光染色方法仅仅是肺癌样本的处理方法，尚不涉及直接对肺癌样本的检测。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请用于肺癌检测的试剂盒，能在一张组织切片上同时表达六个抗体，检测更多的靶标蛋白质信息和共定位情况，不仅能提高染色效率、节约样本，还能避免手工染色带来的重复性低、时间长等问题。此外，本申请的试剂盒还能应用于全自动染片机，实现肺癌的自动化多色免疫荧光检测。
附图说明
图1是本申请实施例中Panel 1在扁桃体样本中染色结果；
图2是本申请实施例中Panel 1在肺癌样本中染色结果；
图3是本申请实施例中Panel 2在扁桃体样本中染色结果；
图4是本申请实施例中Panel 2在肺癌样本中染色结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本申请作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
基于现有的多色免疫荧光检测原理，本申请创造性的研发了适用于肺癌多色免疫荧光检测的试剂盒，并进一步研发了肺癌样本多色免疫荧光染色方法，即染料程序。
本申请通过多重免疫荧光技术(即多色免疫荧光检测技术)开发了一种用于肺癌检测的试剂盒，并利用图像识别系统(如inForm v2.3、HALO病理图像分析系统等)获得组织和细胞表型信息以及相应靶标的荧光强度信息等，对肺癌免疫微环境的TILs进行分析，验证了本申请试剂盒检测的准确性和精密度符合科研检测要求。例如本申请的一种实现方式中，获取来自于每一受试者的肺癌组织样本，制备成组织切片，对所述肺癌组织样本进行多重免疫组化染色处理(如Leica公司Bond RX自动化染色仪器)，再通过成像扫描仪器(如Akoya公司Vectra Polaris光谱型定量病理分析系统)获取相应的免疫组化显微全景图。
本申请解决了肺癌肿瘤免疫治疗疗效评估缺乏足够生物标志物，以及如何使肺癌肿瘤免疫微环境相关指标能够在更大规模更大范围内对免疫治疗疗效进行评估的技术问题；同时很好地解决在临床病理工作以及科学研究中通过多重免疫荧光技术进行肺癌肿瘤免疫微环境分析的需求，高效辅助医生和科研人员完成免疫组化多重标记后的各项免疫组化指标的分析。
本申请的试剂盒包括封闭试剂、一抗试剂、二抗试剂和荧光染料；其中，一抗试剂为第一抗体组合或者第二抗体组合；第一抗体组合由鼠抗人CD68单克隆抗体、兔抗人CD86单克隆抗体、兔抗人CD163单克隆抗体、兔抗人CD206单克隆抗体、兔抗人IRF5单克隆抗体和兔抗人panCK单克隆抗体组成；第二抗体组合由兔抗人CD3单克隆抗体、兔抗人CD8单克隆抗体、兔抗人PD-1单克隆抗体、兔抗人FOXP3单克隆抗体、兔抗人LAG-3单克隆抗体和兔抗人panCK单克隆抗体组成。
本申请的试剂盒通过性能验证实验，准确性和精密度均合格。样本通过病理学家对样本H&E染色结果判读，样本符合质控要求；第一抗体组合(以下简称Panel 1)染色结果判读亚细胞定位正确，Panel 1：细胞膜定位包括CD86、CD163、CD206、CD68，细胞质定位panCK；细胞核定位IRF5；第二抗体组合(以下简称Panel 2)染色结果判读亚细胞定位正确，Panel 2；细胞膜定位包括CD3、CD8、LAG-3、PD-1，细胞质定位panCK，细胞核定位FoxP3。本申请试剂盒进行多色免疫荧光检测，无明显的串色，染色均一；阴性对照预期染色效果：样本未出现明显阳性信号，满足验收标准。
本申请用于肺癌检测的试剂盒，与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本申请提供的用于肺癌样本的全自动多色免疫荧光检测的试剂盒，能够实现自动化检测，对单张切片进行多重免疫荧光实验，可同时呈现六个抗原靶标的表达情况，大大提高单张组织样本的利用率，尤其时珍贵样本；
(2)节约病人取材的样本，便于样本有足够的量做其他检测项目；
(3)自动化染色可以进行高通量测试，实现标准化操作，单次最多可同时检测30片病理切片，避免了手工操作时间长和误差大的弊端，为临床病理人员提供了简便高效的检测方法；
(4)本申请试剂盒能够实现标准化操作的自动化检测，并且已经通过性能验证，具有高准确性和高精密度；
(5)本申请的试剂盒检测方法降低了传统检测方法对组织样本的要求，穿刺样本也可以满足要求，同时避免了微小组织样本染色重复性差的问题。
实施例
一、用于肺癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒
本例用于肺癌检测的试剂盒包括封闭试剂、一抗试剂、二抗试剂和荧光染料；其中，一抗试剂为第一抗体组合或者第二抗体组合；第一抗体组合由鼠抗人CD68单克隆抗体(CD68)、兔抗人CD86单克隆抗体(CD86)、兔抗人CD163单克隆抗体(CD163)、兔抗人CD206单克隆抗体(CD206)、兔抗人IRF5单克隆抗体(IRF5)和兔抗人panCK单克隆抗体(panCK)组成；第二抗体组合由兔抗人CD3单克隆抗体(CD3)、兔抗人CD8单克隆抗体(CD8)、兔抗人PD-1单克隆抗体(PD1)、兔抗人FOXP3单克隆抗体(FOXP3)、兔抗人LAG-3单克隆抗体(LAG-3)和兔抗人panCK单克隆抗体组成(panCK)。其中，二抗试剂为HRP标记的抗鼠抗兔混合物，封闭试剂为过氧化物酶封闭剂。
本例使用的全自动多色免疫荧光检测主要物料如表1所示。
表1全自动多色免疫荧光检测试剂
本例用于肺癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒，开发程序如下：
在方法学开发实验中，对每个抗体进行优化。抗体包括：Panel 1(CD68,IRF5,CD86,CD206,CD163,panCK)，Panel 2(CD3,CD8,PD1,LAG-3,panCK,FOXP3)。方法学开发关键步骤如下：
(1)抗体验证实验：通过采用IHC实验，确认抗体是否可以用；并初步明确阳参样本；
(2)一抗浓度摸索实验：结合抗体说明书推荐的浓度，进行适当的浓度调整，设置3个浓度，开展IHC实验摸索一抗浓度。例如：抗体Anti-CD68(KP1)-Abcam，推荐抗体浓度为1:100，具体设置1:50、1:100、1:200开展IHC实验；
(3)抗体酸碱修复实验：结合抗体说明书推荐的修复条件，确认ER1或者ER2，基于常用条件95℃，20min开展IHC实验，根据实验结果进行调整。例如：将ER1调整为ER2；条件参数可调整为95℃，20min；95℃，40min；95℃，80min。
(4)抗体染料配对实验：Panel 1(CD68,IRF5,CD86,CD206,CD163,panCK)，Panel 2(CD3,CD8,PD1,LAG-3,panCK,FOXP3)均为六标七色mIF实验，计划使用480,520,570,620,690,780通道，结合抗体说明书以及相关参考文献推荐推荐配对通道，对不同抗体进行3-7个通道的抗体染料配对IF实验；对于实验结果进行荧光强度统计，并计算信噪比，确认该抗体较优配对通道。例如：抗体Anti-CD68(KP1)-Abcam，设置与480,520,570,620,650,690,780 7个不同通道进行IF配对实验，结果显示650、780、570通道信噪比较高，后续mIF实验条件优化中，优先这3个通道进行该抗体染料的配对。
(5)抗原修复次数实验：Panel 1(CD68,IRF5,CD86,CD206,CD163,panCK)，Panel 2(CD3,CD8,PD1,LAG-3,panCK,FOXP3)均为六标七色mIF实验，抗原修复7次，最后一次为DAPI染色；对不同抗体进行1-6次抗原修复后进行IF实验，选择1、3、5轮次进行修复实验；对于实验结果进行荧光强度统计，并计算信噪比，确认该抗体较优修复轮次。例如：抗体Anti-CD68(KP1)-Abcam，分别设置1、3、5轮次修复后孵一抗进行修复次数的IF实验，根据信噪比结果，后续mIF实验条件优化中，将该抗体安排在较优修复轮次中开展实验。
(6)mIF预实验：根据上述实验结果，归纳总结抗体特性，确定一抗浓度、酸碱修复条件，抗体配对染料和抗原修复轮次，初步明确mIF实验条件；根据实验结果优化mIF条件，直至达到无非特异性染色，光谱拆分无串染等效果。
利用Bond RX进行自动化染色，开展多次mIF条件优化，形成染色程序如表2和表3所示。
表2Panel 1实验参数
表3Panel 2实验参数
二、全自动染片机的应用及染色程序
将本例的试剂盒应用于肺癌组织，以扁桃体组织为阳参，实施多重免疫组化染色，使用的机器为BOND RX全自动染片机。
(1)取肺癌和扁桃体石蜡组织各一个，分别制备肺癌石蜡组织切片各1张(实验切片)，扁桃体石蜡组织切片2张(阴参和阳参切片)，厚度为3微米，贴好样本标签，放在切片盒中，于4℃冰箱中待用。
(2)打开电热鼓风干燥箱，提前预热电热鼓风干燥箱至65℃。将切片放入切片架中，将切片架放入电热鼓风干燥箱中，65℃，3h。肉眼观察组织表面的蜡融化彻底即可，填写实验记录表。
(3)试剂准备：从4℃冰箱中取出、一抗、二抗、染料、封闭液，需避光的试剂需用锡箔纸包裹试管，置于冰上，备用，放于离心机中短暂离心。
a.抗体配置：取出抗体储存液，放于离心机中短暂离心，备用。在滴定管(Titration Kit)中，用抗体稀释液按照表4和表5稀释比例配制工作液，用锡箔纸包裹试管，在管外标记染料名称，配制时间，配制人员。
表4Panel 1一抗工作液配制
表5Panel 2一抗工作液配制
| 序号 | 一抗 | 稀释体积比 | 工作液用量 |
| 1 | LAG-3 | 1:800 | 150μL/张 |
| 2 | CD3 | 1:500 | 150μL/张 |
| 3 | FOXP3 | 1:100 | 150μL/张 |
| 4 | PD1 | 1:400 | 150μL/张 |
| 5 | CD8 | 1:100 | 150μL/张 |
| 6 | panCK | 1:400 | 150μL/张 |
| 7 | 兔IgG | 1:250 | 150μL/张 |
| 8 | 鼠IgG | 1:250 | 150μL/张 |
表4和表5中，稀释液为CST抗体稀释液/艾克发生物抗体稀释液，工作液有效期一般为14天；一抗工作液配置公式/μL：300+150*n(兔IgG：300+150*5*n；鼠IgG：300+150*1*n)。其中n为切片数量，300为Open container死仓体积。
b.染料配置：
①制备染料储存液，取出抗体及Opal染料，用锡箔纸包裹试管，放于离心机中短暂离心。分别往加入Opal 480、Opal 520、Opal 570、Opal 620、Opal 690、TSA-DIG染料管中加入75μL的DMSO溶液；将300μL的去离子水溶液加入Opal 780染料管中。将上述染料管上下混匀10次后，待试剂完全溶解，将染料管放于离心机中短暂离心。
②取出染料储存液，放于离心机中短暂离心，备用。在滴定管(Titration Kit)中，用稀释液按照表6稀释比例配制工作液，用锡箔纸包裹试管，在管外标记染料名称，配制时间，配制人员。
表6染料工作液配制
表6中，染料工作液配置公式/μL：300+150*n。其中n为切片数量，300为Opencontainer死仓体积。
c.二抗配制：使用移液器吸取二抗转至滴定管中(二抗试剂用量的计算公式：1618+150*7*n(μL)，其中n为切片数量，1618μL为30mL试剂盒死仓体积，150μL为每张切片用量)。
d.封闭液配制：使用移液器吸取封闭液转至滴定管中(封闭液用量的计算公式：1618+150*7*n(μL)，其中n为切片数量，1618μL为30mL试剂盒死仓体积，150μL为每张切片用量)。
(4)染色程序
a.检测样本及阳参样本的染色程序及其具体参数如表7和表8所示，表7为Panel 1检测样本及阳参样本的染色参数，表8为检测样本及阳参样本Panel 2的染色参数。
表7Panel 1mIF protocol参数设置
/>
表8Panel 2mIF protocol参数设置
/>
/>
b.阴参样本的染色程序及其具体参数如表9和表10所示，表9为Panel 1阴参样本的染色参数，表10为Panel 2阴参样本的染色参数。
表9Panel 1mIF protocol-negative control参数设置
/>
表10Panel 2mIF protocol-negative control参数设置
/>
(5)检测系统和装有抗体、染料的试剂架放入BOND RX仪器内，启动染色程序；
(6)右击玻片架直接开始染色，染色开始和结束时间会在玻片架下方显示，填写实验记录表；
(7)封片：
a.染色完成后，按下玻片架下方的“装/卸按钮”，解除玻片架的锁定状态，取出玻片架，并将一抗和二抗盒用封口膜或者盖子封好，放入4℃冰箱保存，TSA-DIG、Opal780以及DAPI染料直接倒入废液瓶，其他Opal染料在工作液有效期内可继续使用。
b.从玻片架上取出切片，去除通用玻片盖(Bond Universal Covertiles)。除组织外，使用无尘纸擦干切片上的水迹。
c.每张切片滴加抗荧光淬灭剂1-2滴进行封片，保证抗荧光淬灭剂完成覆盖组织且无气泡，同时需要避免抗荧光淬灭剂溢出。将切片放在存放板中保存，室温避光30min，待抗荧光淬灭剂凝固后，放在4℃冰箱中避光保存，留待扫描。
扫描切片：本例使用Vectra Polaris仪器，设置程序对切片进行全片扫描。扫描结束后，确保阳性对照与阴性对照样本出现预期染色效果。Panel 1的扫描结果如图1和图2所示，图1为在扁桃体样本中染色结果(20×)，图2为在肺癌样本中染色结果(20×)。图1和图2的结果显示，染色结果判读亚细胞定位正确，Panel 1：细胞膜定位包括CD86、CD163、CD206、CD68，细胞质定位panCK；细胞核定位IRF5。
Panel 2的Vectra Polaris全景扫描结果如图3和图4所示，图3为在扁桃体样本中染色结果(20×)，图4为在肺癌样本中染色结果(20×)。图3和图4的结果显示，染色结果判读亚细胞定位正确，Panel 2：细胞膜定位包括CD3、CD8、LAG-3、PD-1，细胞质定位panCK，细胞核定位FoxP3。
以上结果显示，Panel 1染色结果判读亚细胞定位正确(Panel 1：细胞膜定位包括CD86、CD163、CD206、CD68，细胞质定位panCK；细胞核定位IRF5)；Panel 2染色结果判读亚细胞定位正确(Panel 2；细胞膜定位包括CD3、CD8、LAG-3、PD-1，细胞质定位panCK，细胞核定位FoxP3)；无明显的串色，染色均一；阴性对照预期染色效果：样本未出现明显阳性信号，满足验收标准。以上结果说明，本例的Panel 1和Panel 2都能准确的检测肺癌样本。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
Claims (10)
1.一种用于肺癌检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于肺癌样本的多色免疫荧光检测，所述试剂盒包括封闭试剂、一抗试剂、二抗试剂和荧光染料；
所述一抗试剂为第一抗体组合或者第二抗体组合；
所述第一抗体组合由鼠抗人CD68单克隆抗体、兔抗人CD86单克隆抗体、兔抗人CD163单克隆抗体、兔抗人CD206单克隆抗体、兔抗人IRF5单克隆抗体和兔抗人panCK单克隆抗体组成；
所述第二抗体组合由兔抗人CD3单克隆抗体、兔抗人CD8单克隆抗体、兔抗人PD-1单克隆抗体、兔抗人FOXP3单克隆抗体、兔抗人LAG-3单克隆抗体和兔抗人panCK单克隆抗体组成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述二抗试剂包括HRP标记的抗鼠抗兔混合物。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述封闭试剂为过氧化物酶封闭剂。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述第一抗体组合和第二抗体组合中，各抗体分别对应不同的荧光染料。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述第一抗体组合中，鼠抗人CD68单克隆抗体配对荧光染料XTSA-480，兔抗人CD86单克隆抗体配对荧光染料XTSA-690，兔抗人CD163单克隆抗体配对荧光染料XTSA-620，兔抗人CD206单克隆抗体配对荧光染料XTSA-520，兔抗人IRF5单克隆抗体配对荧光染料XTSA-570，兔抗人panCK单克隆抗体配对荧光染料XTSA-780。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述第二抗体组合中，兔抗人CD3单克隆抗体配对荧光染料XTSA-520，兔抗人CD8单克隆抗体配对荧光染料XTSA-480，兔抗人PD-1单克隆抗体配对荧光染料XTSA-620，兔抗人FOXP3单克隆抗体配对荧光染料XTSA-570，兔抗人LAG-3单克隆抗体配对荧光染料XTSA-690，兔抗人panCK单克隆抗体配对荧光染料XTSA-780。
7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒在制备肺癌检测或肺癌免疫治疗疗效评估的试剂中的应用。
8.一种肺癌样本多色免疫荧光染色方法，其特征在于：包括采用第一抗体组合或者第二抗体组合中的抗体依序对样本进行抗体孵育和荧光染色；
所述第一抗体组合中各抗体的孵育和荧光染色顺序为，兔抗人CD206单克隆抗体、兔抗人IRF5单克隆抗体、兔抗人CD163单克隆抗体、鼠抗人CD68单克隆抗体、兔抗人CD86单克隆抗体、兔抗人panCK单克隆抗体；
所述第一抗体组合中各抗体的孵育和荧光染色顺序为，兔抗人LAG-3单克隆抗体、兔抗人CD3单克隆抗体、兔抗人FOXP3单克隆抗体、兔抗人PD-1单克隆抗体、兔抗人CD8单克隆抗体、兔抗人panCK单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的肺癌样本多色免疫荧光染色方法，其特征在于：所述第一抗体组合和第二抗体组合中，各抗体分别采用不同的荧光染料进行荧光染色。
10.根据权利要求9所述的肺癌样本多色免疫荧光染色方法，其特征在于：所述第一抗体组合中，鼠抗人CD68单克隆抗体配对荧光染料XTSA-480，兔抗人CD86单克隆抗体配对荧光染料XTSA-690，兔抗人CD163单克隆抗体配对荧光染料XTSA-620，兔抗人CD206单克隆抗体配对荧光染料XTSA-520，兔抗人IRF5单克隆抗体配对荧光染料XTSA-570，兔抗人panCK单克隆抗体配对荧光染料XTSA-780；
所述第二抗体组合中，兔抗人CD3单克隆抗体配对荧光染料XTSA-520，兔抗人CD8单克隆抗体配对荧光染料XTSA-480，兔抗人PD-1单克隆抗体配对荧光染料XTSA-620，兔抗人FOXP3单克隆抗体配对荧光染料XTSA-570，兔抗人LAG-3单克隆抗体配对荧光染料XTSA-690，兔抗人panCK单克隆抗体配对荧光染料XTSA-780。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311673937.0A CN117665290A (zh) | 2023-12-06 | 2023-12-06 | 用于肺癌检测的试剂盒及肺癌样本多色免疫荧光染色方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311673937.0A CN117665290A (zh) | 2023-12-06 | 2023-12-06 | 用于肺癌检测的试剂盒及肺癌样本多色免疫荧光染色方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117665290A true CN117665290A (zh) | 2024-03-08 |
Family
ID=90080387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311673937.0A Pending CN117665290A (zh) | 2023-12-06 | 2023-12-06 | 用于肺癌检测的试剂盒及肺癌样本多色免疫荧光染色方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117665290A (zh) |
-
2023
- 2023-12-06 CN CN202311673937.0A patent/CN117665290A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11070750B2 (en) | Digitally enhanced microscopy for multiplexed histology | |
| CN110337588B (zh) | 用于定量免疫组织化学的方法和系统 | |
| US20060041385A1 (en) | Method of quantitating proteins and genes in cells using a combination of immunohistochemistry and in situ hybridization | |
| Parker et al. | Comparison of molecular methods and BRAF immunohistochemistry (VE1 clone) for the detection of BRAF V600E mutation in papillary thyroid carcinoma: a meta-analysis | |
| Umemura et al. | Immunohistochemical evaluation for hormone receptors in breast cancer: a practically useful evaluation system and handling protocol | |
| WO2012078138A1 (en) | Cell array quality control device for pathological analysis | |
| Harms et al. | Multiplex immunohistochemistry and immunofluorescence: a practical update for pathologists | |
| Singh-Bains et al. | Preparation, construction and high-throughput automated analysis of human brain tissue microarrays for neurodegenerative disease drug development | |
| CN108603879A (zh) | 样品多重循环和原位成像的方法 | |
| CN111363789B (zh) | 一种同时检测蛋白质和rna的试剂盒和方法 | |
| CN117665290A (zh) | 用于肺癌检测的试剂盒及肺癌样本多色免疫荧光染色方法 | |
| CN116087499B (zh) | 一种癌样本的染色方法及试剂盒 | |
| CN116086919B (zh) | 一种肺癌和/或胰腺癌样本的染色方法及试剂盒 | |
| CN116106537A (zh) | 一种乳腺癌样本的染色方法及试剂盒 | |
| US20240043904A1 (en) | Morphological marker staining | |
| CN116539396B (zh) | 基于直标荧光与多重免疫荧光的多癌种染色方法 | |
| Bui et al. | Modern Techniques in Cytopathology | |
| US20060246536A1 (en) | Xenograft tissue control for histology | |
| US10379015B2 (en) | Method for labeling concentration density differentials of an analyte in a biological sample | |
| US20220018778A1 (en) | Processing and imaging tissue samples | |
| Zhang et al. | Comparison of Her-2/Neu Gene Amplification or Expression between IHC and FISH in BC | |
| CN117147844A (zh) | 肿瘤细胞亚群及其作为结直肠癌诊断标志物的应用 | |
| Yigzaw et al. | Review of Immunohistochemistry Techniques: Applications, Current Status, and Future Perspectives | |
| CN116008549A (zh) | 一种多重荧光免疫组化检测试剂盒及其应用 | |
| Tubbs et al. | Gold-and Silver-Facilitated Metallographic In Situ Hybridization Procedures for Detection of HER2 Gene Amplification |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |