CN116008549A - 一种多重荧光免疫组化检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于用于癌症检测的免疫测定技术领域，涉及一种多重荧光免疫组化检测试剂盒及其应用。针对现有技术多重荧光免疫组化检测中，对同一张切片上的多种不同抗原同时标记时，干扰多，灵敏度低，批次间稳定性差技术问题，本申请提供一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，可对同一张组织切片上的多至8种不同抗原进行不同的荧光标记，同时结合不同平台的全光谱荧光成像系统以及光谱拆分成像软件，均可对多至9色(含细胞核)的组织切片进行成像。本申请还提供了一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，适用于多种癌症，可采用自动化染色仪器操作，批次间稳定性更强，更节约人力成本，对科研及临床帮助更大。

Description

一种多重荧光免疫组化检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于用于癌症检测的免疫测定技术领域，具体地，涉及一种多重荧光免疫组化检测试剂盒及其应用。

背景技术

免疫组织化学(IHC)是利用抗体特异性识别对应抗原的特性，通过酶标抗体识别抗原，并催化底物显色，最终将抗原在组织上特异性的标记出来的技术。该技术作为基础的免疫学技术之一，一直在生命科学领域被广泛使用。尤其是在医疗诊断方面，临床病理诊断，尤其是肿瘤等疾病的诊断，IHC方法因其可直接在组织上原位标记，且方法经典，操作简便，结果灵敏可靠，成为金标准，发挥着重要作用。但随着疾病的个性化诊疗需求的增加，尤其是近年来，肿瘤领域中靶向药物越来越多的应用于临床，诊断指标以及药物临床入组需筛选指标越来越多，而单张样本切片只能检测一个指标的IHC技术愈发显示出其局限性，如无法显示不同指标共定位、在多指标检测时需较多切片、不同切片存在组织异质性等。在IHC方法的基础上，采用枝杈TSA染料取代传统IHC中的DAB染料，通过多轮次染色，可对同一张组织切片上的多种不同抗原进行不同的荧光标记。

如中国专利申请公布号CN111830256A，发明名称为“一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒及使用方法”，公开的试剂盒包括试剂A、试剂B、稀释液、FITC试剂、Cy3试剂及Cy5试剂，该试剂盒采用TSA信号放大技术，其原理与普通的免疫组化类似，一抗与抗原结合后，孵育HRP标记的二抗，HRP催化加入体系的荧光素底物，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，使样品上稳定地共价结合荧光素，之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换第二种一抗进行第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记，并且每轮只孵育一种抗体，微波处理后洗去非共价结合的抗体，所以对所用抗体种属来源无限制。但是，该方案需采用分步染色，先催化Biotin-Tyramide链接上去，再用Strepavidin-染料，操作复杂，耗时长，不利于临床使用。

中国专利申请公布号CN109541217A，发明名称为“一种霍奇金淋巴瘤的多重免疫组化分析试剂盒及其使用方法和应用”，公开的试剂盒限定了单克隆抗体组包括CD3单克隆抗体、CD30单克隆抗体、CD68单克隆抗体、CD56单克隆抗体、LAG3单克隆抗体、PD1单克隆抗体和PDL1单克隆抗体中的两种以上、不超过六种。该方案仅能标记不超过六种免疫检查点，且仅适用于霍奇金淋巴瘤。现有技术中亟需一种适用于多种癌症，且精确度高的多重荧光免疫组化检测试剂盒。

发明内容

1、要解决的问题

针对现有技术多重荧光免疫组化检测中，对同一张切片上的多种不同抗原同时标记时，干扰多，灵敏度低，批次间稳定性差技术问题，本申请提供一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，可对同一张组织切片上的多至8种不同抗原进行不同的荧光标记，同时结合全光谱荧光成像系统以及光谱拆分成像软件，对多至9色(含细胞核)的组织切片进行成像。本申请还提供了一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，适用于多种癌症，可采用自动化染色仪器操作，批次间稳定性更强，更节约人力成本，对科研及临床帮助更大。

2、技术方案

为达到上述目的，提供的技术方案为：

本发明的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：抗原染液、细胞核染液、信号放大稀释液、HRP酶标二抗聚合物、抗荧光淬灭封片剂、缓冲液；

所述抗原染液包括TSA480、TSA520、TSA540、TSA570、TSA620、TSA650、TSA700、TSA770。

进一步的，所述HRP酶标二抗聚合物为鼠兔通用聚合物HRP酶标二抗。

进一步的，所述细胞核染液为DAPI染液；所述缓冲液为TBST缓冲液。

优选的，所述信号放大稀释液为0.3％H₂O₂，抗荧光淬灭封片剂为可选普通商用抗荧光淬灭封片剂。

进一步的，还包括二甲苯溶液、乙醇溶液和中性福尔马林溶液。

优选的，还包括抗原修复液，所述抗原修复液为pH值为6.0的0.01M柠檬酸钠修复液或pH值为9的Tris-EDTA溶液(0.05M Tris，0.001M EDTA)。

进一步的，所述乙醇溶液包含3个浓度梯度，质量分数分别为70％、95％和100％；所述中性福尔马林溶液的质量分数为10％。

一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，使用所述多重荧光免疫组化检测试剂盒；将所述多重荧光免疫组化检测试剂盒应用于癌症的检测中。

优选的，所述癌症为肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、黑色素瘤等。

进一步的，包括如下步骤：脱蜡水合；微波抗原修复；封闭；一抗孵育；二抗孵育；用所述抗原染液荧光染色；重复一抗孵育、二抗孵育和荧光染色，重复次数≤7次；细胞核染色；封片。

优选的，所述微波抗原修复步骤中，将脱蜡水合后的载玻片置于修复杯中，用抗原修复液浸没，将修复杯置于微波炉内高火煮沸，低火维持15min，注意补液，防止蒸发过度导致干片，取出室温自然冷却至室温。

优选的，所述封闭步骤中，去除载玻片上残存洗液，用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加封闭液，覆盖样本区域，室温保湿，震荡10min。

进一步的，所述一抗孵育步骤中，用缓冲液浸洗载玻片，重复1次；所述二抗孵育步骤中，滴加所述HRP酶标二抗聚合物孵育，用缓冲液浸洗载玻片，重复1次；所述荧光染色步骤中，滴加所述抗原染液孵育，用缓冲液浸洗载玻片，重复3次，微波修复，灭菌水洗片1次，缓冲液浸片后封闭。

优选的，所述一抗孵育步骤中，去除载玻片上的封闭，用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域，室温保湿震荡孵育1h，需针对不同抗体做优化调整，缓冲液每次浸洗载玻片的时间为3min。

优选的，所述二抗孵育步骤中，去除载玻片上残存的洗液，直接滴加HRP酶标二抗聚合物，浸没样本区域，室温保湿孵育10min，缓冲液每次浸洗载玻片的时间为3min。

优选的，所述荧光染色步骤中，去除载玻片上残存的洗液，用移液器在载玻片上滴加抗原染液浸没样本区域，室温保湿震荡孵育10min，缓冲液每次浸洗载玻片的时间为3min，微波修复，室温自然冷却至室温，灭菌水洗载玻片1次，缓冲液每次浸洗载玻片的时间为2min，单染结束，封片观察或追加后续染色，从步骤3封闭开始后续染色，每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用缓冲液覆盖样品，防止干片。

进一步的，所述细胞核染色步骤中，滴加所述细胞核染液孵育，用缓冲液浸洗载玻片，重复3次。

优选的，所述细胞核染色步骤中，室温孵育5min，缓冲液每次浸洗载玻片的时间为2min，然后滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡，长期保存请用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。阅片：对染色后的载玻片在荧光显微镜下观察并分析。

进一步的，所述脱蜡水合步骤中，用所述二甲苯浸载玻片，重复3次；乙醇浸载玻片：梯度次序为100wt％、95wt％和70wt％；灭菌水洗载玻片，重复3次；10wt％中性福尔马林浸载玻片，灭菌水洗载玻片，重复3次。

脱蜡水合的目的是使组织恢复到固定后的状态，暴露抗原以便与一抗结合。本申请的脱蜡水合参数脱蜡水合彻底，完全脱去切片上的蜡，不会引起染色不均匀、不产生非特异性背景着色等问题。

优选的，二甲苯浸载玻片，每次的时间为10min；乙醇浸载玻片，每次的时间为2min；中性福尔马林浸片10min，灭菌水洗载玻片每次的时间为1min。

3、有益效果

采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：

(1)本发明的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，包括抗原染液、细胞核染液、信号放大稀释液、HRP酶标二抗聚合物、抗荧光淬灭封片剂、缓冲液，所述抗原染液包括TSA480、TSA520、TSA540、TSA570、TSA620、TSA650、TSA700、TSA770。采用聚合物HRP二抗，以及枝杈TSA染料，信号放大作用更强，灵敏度更高，依托光谱拆分功能的成像系统，可更精准的对组织进行高通量成像，干扰少，成像精度高。

(2)本发明的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒素的应用，使用所述多重荧光免疫组化检测试剂盒，将所述多重荧光免疫组化检测试剂盒应用于癌症的检测中。可对同一张组织切片上的多至8种不同抗原进行不同的荧光标记，同时结合全光谱荧光成像系统以及光谱拆分成像软件，对多至9色(含细胞核)的组织切片进行成像，并以组织流式技术分析平台对染色后的病理组织进行包括阳性率、细胞间护作、空间定位、细胞亚群间相互作用等在内的多种维度精确分析，为包括肿瘤在内的多种临床疾病的精确诊断提供更多可能。

附图说明

图1为实施例4中多重荧光免疫组化染色结果图；

图2为实施例5中多重荧光免疫组化染色结果图。

具体实施方式

为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。

实施例1

本实施例的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，所述试剂盒包括以下组份：

表1多重荧光免疫组化检测试剂盒的组份

本实施例中，其中，组份1的抗原染液包括TSA480、TSA520、TSA540、TSA570、TSA620、TSA650、TSA700、TSA770共8种，需在染色前用信号放大稀释液来进行稀释，50～300倍均可，通常为100倍。

组份2的细胞核染液为DAPI，在使用前用TBS进行稀释，50～300倍均可，通常为100倍。

组份4的HRP酶标二抗聚合物，为即用型工作液，直接滴加覆盖组织即可。

组份6的缓冲液，1×TBST，pH值为7.4。

本实施例的试剂盒，可对同一张切片上的多至8种不同抗原同时标记，适用范围广。采用聚合物HRP二抗，以及枝杈TSA染料，信号放大作用更强，灵敏度更高，依托光谱拆分功能的成像系统，可更精准的对组织进行高通量成像，干扰少，成像精度高，通过组织流式分析，可更多维度的对成像结果进行分析，有更准确的临床参考和诊断价值。

实施例2

本实施例的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，基本同实施例1，不同的是，组份的种类。

表2多重荧光免疫组化检测试剂盒的组份

本实施例的试剂盒，相较于实施例1，组份中包括二甲苯溶液、乙醇溶液和中性福尔马林溶液，适用于脱蜡水合步骤，无需额外配置，操作更加便捷。

实施例3

本实施例的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，基本同实施例1，不同的是，组份的种类和含量。

表3多重荧光免疫组化检测试剂盒的组份

本实施例的试剂盒，相较于实施例2，组份中的乙醇溶液份3个梯度，且包括抗原修复液，操作更加便捷，在实际使用中，可做到即拆即用。

实施例4

本实施例的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，使用实施例3的试剂盒，包括如下步骤：

1.材料

1.1.试剂

抗原染液，购自爱必信，皓赛拓华。

细胞核染液，购自爱必信。

信号放大稀释液，购自皓赛拓华，货号FFBN45。

HRP酶标二抗聚合物，购自爱必信。

缓冲液，购自爱必信。

抗原修复液，购自爱必信。

1.2主要仪器设备和耗材

Akoya Polaris全光谱成像平台；或TissueFAXS Spectra全光谱成像平台；分析平台：HALO病理分析平台，或TissueFAXS Spectra系统自带分析平台；自动染色平台LeicaBond Rx。

2.一抗溶液和二抗溶液的制备

一抗溶液按赛信通-Cell Signaling Technology说明书进行稀释，具体如下：

3.步骤

3.1.脱蜡水合

a)新鲜二甲苯浸片10min，重复3次。

b)梯度乙醇浸片：100％5min，95％5min，70％2min。

c)灭菌水洗片1min，重复3次。

d)10wt％中性福尔马林浸片10min，灭菌水洗片1min，重复3次。

3.2.微波修复抗原

a)将脱蜡水合后的玻片置于修复杯中，用抗原修复液1*工作液浸没。

b)将修复杯置于微波炉内高火煮沸。

c)低火维持15min(注意补液，防止蒸发过度导致干片)。

d)取出室温自然冷却至室温。

3.3.封闭

a)去除玻片上残存洗液。

b)用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加封闭液，覆盖样本区域。

c)室温保湿，震荡10min。

3.4.一抗孵育

a)去除玻片上的封闭。

b)用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域。

c)室温保湿震荡孵育1h(需针对不同抗体做优化调整)。

d)用TBST缓冲液浸洗玻片3min，重复1次。

3.5.二抗孵育

a)去除玻片上残存的洗液。

b)直接滴加HRP二抗工作液溶液，浸没样本区域。

c)室温保湿孵育10min。

d)用TBST缓冲液浸洗玻片3min，重复1次。

3.6.荧光染色放大信号

a)去除玻片上残存的洗液。

b)用移液器在玻片上滴加染料工作液100μL浸没样本区域。

c)室温保湿震荡孵育10min。

d)TBST缓冲液浸洗玻片，室温浸片3min，重复3次。

e)微波修复，室温自然冷却至室温。

f)灭菌水洗片1次，TBST缓冲液浸片2min。

g)单染结束，封片观察或追加后续染色(建议：从封闭步骤开始后续染色)。每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用TBST覆盖样品，防止干片。

3.7.染核及封片滴加DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育5min。用TBST浸洗玻片3次，每次2min。然后滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡，长期保存请用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。

3.8.阅片，对染色后的组织片在荧光显微镜下观察并分析

本实施例应用于肝癌症的检测中，标志物和染料如表4所示，结果如图1所示。

表4标志物和染料汇总

实施例5

本实施例的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，基本同实施例4，不同的是，用于甲状腺癌症的检测。

标志物和染料如表5所示，结果如图2所示。

表5标志物和染料汇总

本实施例可知，本申请的方案，同样适用于6种标志物和细胞核，共7色的检测。

实施例6

本实施例的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，基本同实施例4，不同的是，用于肺癌的检测。

标志物和染料如表6所示。

表6标志物和染料汇总

本实施例可知，在肺癌中，可以通过九色来对肿瘤T细胞亚群分化浸润情况，免疫检查点，肿瘤细胞分布等进行染色成像及分析。

综上所述，由实施例可以看出本申请可对同一张切片上的多至8种不同抗原同时标记；采用聚合物HRP二抗，以及枝杈TSA染料，信号放大作用更强，灵敏度更高；可采用自动化染色仪器操作，批次间稳定性更强，更节约人力成本；依托光谱拆分功能的成像系统，可更精准的对组织进行高通量成像，干扰少，成像精度高；通过组织流式分析，可更多维度的对成像结果进行分析，对科研及临床帮助更大。

以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下组分：抗原染液、细胞核染液、信号放大稀释液、HRP酶标二抗聚合物、抗荧光淬灭封片剂、缓冲液；

所述抗原染液包括TSA480、TSA520、TSA540、TSA570、TSA620、TSA650、TSA700、TSA770。

2.根据权利要求1所述的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，其特征在于：所述HRP酶标二抗聚合物为鼠兔通用聚合物HRP酶标二抗。

3.根据权利要求1所述的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，其特征在于：所述细胞核染液为DAPI染液；所述缓冲液为TBST缓冲液。

4.根据权利要求1-3任一项所述的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，其特征在于：还包括二甲苯溶液、乙醇溶液和中性福尔马林溶液。

5.根据权利要求4所述的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒，其特征在于：所述乙醇溶液包含3个浓度梯度，质量分数分别为70％、95％和100％；所述中性福尔马林溶液的质量分数为10％。

6.一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，其特征在于：使用权利要求1-5任一项所述多重荧光免疫组化检测试剂盒；将所述多重荧光免疫组化检测试剂盒应用于癌症的检测中。

7.根据权利要求6所述一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，其特征在于：包括如下步骤：脱蜡水合；微波抗原修复；封闭；一抗孵育；二抗孵育；用所述抗原染液荧光染色；重复一抗孵育、二抗孵育和荧光染色，重复次数≤7次；细胞核染色；封片。

8.根据权利要求7所述的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，其特征在于：

所述一抗孵育步骤中，用缓冲液浸洗载玻片，重复1次；所述二抗孵育步骤中，滴加所述HRP酶标二抗聚合物孵育，用缓冲液浸洗载玻片，重复1次；所述荧光染色步骤中，滴加所述抗原染液孵育，用缓冲液浸洗载玻片，重复3次，微波修复，灭菌水洗片1次，缓冲液浸片后封闭。

9.根据权利要求8所述的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，其特征在于：所述细胞核染色步骤中，滴加所述细胞核染液孵育，用缓冲液浸洗载玻片，重复3次。

10.根据权利要求7-9任一项所述的一种多重荧光免疫组化检测试剂盒的应用，其特征在于：所述脱蜡水合步骤中，用所述二甲苯浸载玻片，重复3次；乙醇浸载玻片：梯度次序为100wt％、95wt％和70wt％；灭菌水洗载玻片，重复3次；10wt％中性福尔马林浸载玻片，灭菌水洗载玻片，重复3次。

Images