CN116539396B - 基于直标荧光与多重免疫荧光的多癌种染色方法 - Google Patents

基于直标荧光与多重免疫荧光的多癌种染色方法 Download PDF

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Abstract

一种多色免疫荧光染色方法及试剂盒，该方法包括：直标步骤，包括使用直标抗体对待测样本进行孵育，获得标记有直标抗体的样本；多重染色步骤，包括按照抗原组中的抗原顺序，使用对应的一抗依次对标记有直标抗体的样本进行孵育，使用染色剂对孵育后的样本进行染色，得到染色后的样本。本发明实现多6标mIF Pa nel的多色免疫荧光染色，能够在一张组织切片上同时表达六个抗体，在此基础上加1标、2标、3标进行开发，同时对9标10色mIF Panel进行了性能验证，本发明可以为病理医生提供更多的靶标蛋白质信息和共定位情况，可以大大提高染色效率，节约样本。

Description

基于直标荧光与多重免疫荧光的多癌种染色方法
技术领域
本发明涉及荧光检测技术领域，具体涉及一种基于直标荧光与多重免疫荧光的多癌种染色方法。
背景技术
免疫染色技术包括：IHC(Immunohistochemistry，免疫组织化学)、ICC(Immunocytochemistry，免疫细胞化学)和IF(Immunofluorescence，免疫荧光法)。其中IHC/IF检测是通过使用抗体和荧光检测来研究福尔马林固定及石蜡包埋(formalinfixation and paraffin embedding,FFPE)的样本中目标蛋白在固定细胞或组织中的定位、相对表达和激活状态。在肿瘤分子检测技术逐渐成熟的今天，相关研究与临床决策的信息基础也开始更加注重对于肿瘤微环境的覆盖。肿瘤微环境的复杂性要求单张组织样本切片产出多重信息，提高对于样本切片特别是珍贵样本的利用率。传统的IHC/IF检测最大的局限性是单次共染靶标数量较少(1-3个/片)，而精准治疗的肿瘤评估，需要对多个蛋白靶点进行检测，这就需要充足的组织学标本。而在大多数实际病例中，患者的活检样本无法满足除肿瘤病理组织学分型之外的额外检测，这导致错失了从患者样本中获得重要的诊断和预后信息的机会。此外，即使有足够的样本进行一系列连续的组织切片传统IHC/IF染色，在多细胞群的研究中对于蛋白之间的相关性也无法准确评估。因此，目前IHC/IF检测方法获取信息仍有很大局限性，无法说明复杂TIME(肿瘤免疫微环境)的全部情况。传统的IHC/IF的另一大限制是观察者之间的高变异性，缺少标准化操作，具有随机性；其结果判读主要通过人为定性或半定量，有一定的主观性，不同批次之间、人与人之间都会有误差。为减少主观性的影响，目前国际上存在共识，要求实验室具备经验丰富的病理学专家。此外，结合研究现状和技术需求，说明标准化、自动化是时代发展的必然，可以消除观察者间的差异，同时提高检测效率。
最近一种新的多标记免疫组织化学染色/免疫荧光染色(multipleximmunohistochemistry/immunofluorescenc e,mIHC/IF)技术能够实现在单张组织切片上标记多种生物标志物，同时通过后期分析获得关于细胞组成和空间排列的多通道信息，并对TIME进行高维分析。该技术配合定量分析软件，能够自动区分肿瘤和非肿瘤组织，客观地分析多个生物标志物以及细胞组成、功能状态和细胞-细胞相互作用，具有高重复性、高效率和高成本效益的优点。
而目前，市场上面提供的mIF(multiplex immunofluorescence，多重免疫荧光)服务大多为3标4色、4标5色、5标6色、6标7色Panel，对于多6标产品较少，主要技术瓶颈为荧光染料光谱的限制，靶标过多会增大光谱拆分的难度，较容易造成不同程度的串色问题，最终造成假阳性，非特异性显色，使得无法区分阳性细胞，造成开发失败，不得不重新换成较少靶标的Panel重新开发。
发明内容
根据第一方面，在一实施例中，提供一种多色免疫荧光染色方法，包括：
直标步骤，包括使用直标抗体对待测样本进行孵育，获得标记有直标抗体的样本；
多重染色步骤，包括按照抗原组中的抗原顺序，使用对应的一抗依次对标记有直标抗体的样本进行孵育，使用染色剂对孵育后的样本进行染色，得到染色后的样本。
根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项所述的染色方法获得的样本或图像。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种图像分析方法，包括：对第二方面所述图像的目标区域的荧光表达数据进行生物标记物分析计算，得到样本的生物标记物数值。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种用于检测癌样本的试剂盒，包括直标抗体以及用于多重标记的抗体。
依据上述实施例的一种多色免疫荧光染色方法及试剂盒，在多色免疫荧光染色基础上，加1标、2标、3标，本发明提供的mIF Panel可以为病理医生提供更多的靶标蛋白质信息和共定位情况，可以大大提高染色效率，节约样本。
在一实施例中，本发明实现多6标mIF Panel的多色免疫荧光染色，能够在一张组织切片上同时表达六个抗体，在此基础上加1标、2标、3标进行开发，同时对加3标的试剂盒，即9标10色mIF Panel进行了性能验证，本发明提供的mIF Panel可以为病理医生提供更多的靶标蛋白质信息和共定位情况，可以显著提高染色效率，节约样本。
附图说明
图1为实施例1中的检测流程示意图；
图2为直标Panel+IF实验流程构建结果图；
图3为直标Panel+IF实验直标抗体去除方法摸索曝光时间阈值确认图；
图4为1个直标抗体去除-2次修复效果图；
图5为1个直标抗体去除-1次修复效果图；
图6为3个直标抗体去除-4次修复效果图；
图7为3个直标抗体去除-3次修复肺癌样本1效果图；
图8为3个直标抗体去除-3次修复肺癌样本2效果图；
图9为3个直标抗体去除-3次修复胰腺癌样本1效果图；
图10为3个直标抗体去除-3次修复胰腺癌样本2效果图；
图11为肺癌样本中(直标Panel+mIF Panel)预实验染色结果(20X)；
图12为肺癌样本的直标Panel染色结果(20X)；
图13为肺癌样本的mIF Panel染色结果(20X)；
图14为肺癌样本中(直标Panel+mIF Panel)染色结果(20X)；
图15为肺癌样本中，单mIF Panel和直标Panel+mIF Panel检测的阳性细胞密度相关性分析结果；
图16为肺癌样本中，单mIF Panel和直标Panel+mIF Panel检测的阳性细胞比例相关性分析结果；
图17为肺癌样本中重复实验的染色结果(200X)；
图18为合并后免疫组化显微全景图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
CD3：别名OKT3，全T细胞标记，免疫球蛋白超家族成员，识别T细胞的常用抗体，由delt、epsilon、g amma、zeta等链组成的复合体。在病理中的应用为T细胞淋巴瘤的诊断，为T细胞最特异的抗体，信号定位在胞膜和胞浆。CD3，T细胞表面标记，主要功能是促进细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)和辅助T细胞(CD4+T细胞)的活化，并最终帮助形成获得性免疫反应。
CD4：别名OKT4，辅助T细胞标志物。多数巨噬细胞、滤泡树状细胞、Langerhans细胞也阳性。在病理学中的应用为T细胞淋巴细胞的诊断和分类，信号定位在胞膜。CD4，CD4+T细胞，属于淋巴细胞分类中的辅助T细胞，直接反应机体免疫力功能的强弱，CD4+T细胞是HIV感染过程中的主要靶点。
CD8：是一种白细胞分化抗原，用以辅助T细胞受体(TCR)识别抗原并参与T细胞活化信号的转导。表达C D8的T细胞(CD8+T细胞)通常在活化后分化为细胞毒性T细胞，能够特异性地杀伤靶细胞,信号定位在胞膜。C D8，CD8+T细胞，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。
FOXP3：Treg的主要调节因子，Foxp3是控制Treg细胞发育和功能的关键转录因子之一。Treg细胞的免疫抑制除了可以帮助机体避免自身免疫性疾病，在某些肿瘤中，它也可以使机体对肿瘤细胞产生抗原耐受，从而使肿瘤细胞逃脱机体的免疫杀伤作用。关于如何对Treg细胞进行检测分析，目前,公认的区分Treg细胞的表面标记物为：CD4+CD25+FoxP3+或CD4+CD25+CD127低表达。FoxP3是Treg细胞发育成熟和发挥功能的必要因素，是目前Treg细胞最敏感的标记，但检测FoxP3需要对细胞进行破膜，如后续实验需要上样细胞且细胞保持完整，可以CD4+CD25+CD127低表达作为Treg标志，CD127位于Treg细胞表面。
OX40：OX40(TNFRSF4,CD134)是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的一员，可调节T细胞活性和免疫应答。OX40蛋白包含四个半胱氨酸富集结构域、一个跨膜结构域和一个含有QEE基序的细胞浆尾区。OX40主要在激活的CD4+和CD8+T细胞中表达，而OX40配体(OX40L,TNFSF4,CD252)则主要在激活的抗原呈递细胞中表达。OX40结合OX40L会导致TNF受体相关因子(TRAF)的募集，从而形成TCR非依赖型信号转导复合体。该复合体的一个组分(PKCθ)可激活NF-κB通路。通过Akt进行OX40信号转导还会直接增强TCR信号转导。研究表明，OX40L-OX40通路与炎症和自身免疫疾病有关。其他研究表明，OX40激动剂会增强多种癌症类型中的抗肿瘤免疫。OX40与肿瘤在肿瘤微环境中，免疫激活可导致OX40表达。可增强效应T细胞的活化和增殖，并制Tregs，从而导致复杂的抗肿瘤免疫反应。肿瘤浸润性T细胞表达OX40，注射Anti-OX40抗体或OX40L.Fc融合蛋白能有效抑制荷瘤小鼠模型的肿瘤生长。目前，多种Anti-OX40抗体或OX40L.Fc融合蛋白正在用于针对转移性癌症的临床试验。为了增加抗OX40的效果，在适当的时间将OX40途径与其他可能互补的免疫途径结合，可能是更有效激活抗肿瘤免疫应答的关键策略，目前正有许多对不同的联合疗法的研究。
panCK：细胞角蛋白是由至少29种不同蛋白质组成的一组，是上皮细胞和绒毛细胞的特征。细胞角蛋白1、4、5、6和8是II型中性到碱性亚家族成员。单克隆抗细胞角蛋白是上皮细胞分化的特异性标记物，已广泛用于肿瘤的鉴定和分类。单克隆抗泛细胞角蛋白是一种广泛反应性试剂，可以识别存在于大多数人类上皮组织中的抗原表位。它有助于正常细胞、化生细胞和肿瘤细胞的分型。不同组分之间的协同作用导致染色扩增。这使得细胞的识别成为可能，否则这些细胞只能被少量染色。这种混合物有助于区分癌和非上皮性肿瘤，如肉瘤、淋巴瘤和神经肿瘤。它还有助于检测淋巴结、骨髓和其他组织的微转移，并确定低分化肿瘤的来源。细胞角蛋白有两种类型:酸性的I型细胞角蛋白和碱性或中性的II型细胞角蛋白。细胞角蛋白通常成对出现，包括1型细胞角蛋白和2型细胞角蛋白。通常II型细胞角蛋白比I型细胞角蛋白大8kD。信号定位在胞质。
OX40主要在激活的CD4+和CD8+T细胞中表达；FoxP3是Treg细胞发育成熟和发挥功能的必要因素，是目前Treg细胞最敏感的标记；CD4是辅助T细胞标志物；CD8是一种白细胞分化抗原，用以辅助T细胞受体(TCR)识别抗原并参与T细胞活化信号的转导；CD3是全T细胞标记，免疫球蛋白超家族成员，识别T细胞的常用抗体；panCK是上皮源性肿瘤标志物。
CD20：别名L26，是B细胞共同抗原，是一种跨膜蛋白，涉及B细胞活化。在病理学中的应用为B细胞淋巴瘤的诊断，细胞定位在胞膜。
CD45：别名leukocyte common antigen(LCA)，是白细胞共同抗原。在病理学中的应用为淋巴造血系统肿瘤的诊断和淋巴瘤白血病分型，信号定位在胞膜。
CD68：别名KP1、PGM1，KP1：分子量为110kDa的糖蛋白，与溶酶体颗粒有关。标记巨噬细胞、外周血的单核细胞、骨髓前体细胞和外周血粒细胞，主要用于标记巨噬细胞，组织细胞及其肿瘤，还可以与反应性淋巴结中的浆细胞性T细胞反应；不与粒细胞及其前体细胞反应。在病理中的应用：表达广泛，特异性差，主要用于组织细胞及其肿瘤的诊断。信号定位在胞浆。
目前亟待一种既可以避免串色，又可以在单张样本切片上面显示尽可能多的信息的方法及试剂盒。尤其在组织学标本稀少的情况下，本发明提供的多6标mIF Panel的全自动多色免疫荧光检测方法，可以作为新的检测方法选择，在临床上具有广阔的应用前景。
根据第一方面，在一实施例中，提供一种多色免疫荧光染色方法，包括：
直标步骤，包括使用直标抗体对待测样本进行孵育，获得标记有直标抗体的样本；
多重染色步骤，包括按照抗原组中的抗原顺序，使用对应的一抗依次对标记有直标抗体的样本进行孵育，使用染色剂对孵育后的样本进行染色，得到染色后的样本。
在一实施例中，直标步骤、多重染色步骤既可以手动进行，也可以使用自动化仪器进行，优选使用自动化仪器进行，可提高染色效率。
在一实施例中，直标步骤中，将所有直标抗体与待测样本混合，一次性孵育，不进行多次重复。
在一实施例中，直标步骤中，直标抗体标记的抗原包含如下抗原中的至少一种：CD45、CD20、CD68。
在一实施例中，直标步骤中，直标抗体标记的抗原包含如下抗原中的全部：CD45、CD20、CD68。该直标抗体也可用于乳腺癌等其他样本的直标，只要存在该类型的细胞，即可使用此处的直标抗体。
在一实施例中，直标步骤中，包括在直标抗体孵育结束后，对样本进行核染色，然后进入多重染色步骤。此处需要进行核染色，因为直标Panel染色后需要扫描，并且后续合并Panel是以核定位识别的，所以需要核染色。
在一实施例中，直标步骤中，核染色时，使用的核染色剂包括但不限于DAPI(即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，CAS登录号：47165-04-8)。
在一实施例中，直标步骤中，包括对待测样本依次进行抗原修复、封闭、直标抗体孵育、清洗表面抗体、核染色。
在一实施例中，多重染色步骤中，包括按照如下抗原组中的抗原顺序，使用对应的一抗依次对标记有直标抗体的样本进行孵育，使用染色剂对孵育后的样本进行染色，得到染色后的样本：
OX40、CD3、FOXP3、CD4、CD8、panCK。
在一实施例中，多重染色步骤中，使用的染色剂的种类数量与抗体的种类数量一致。
在一实施例中，多重染色步骤中，抗原对应的一抗与染色剂按如下顺序依次配对染色：
抗OX40单克隆抗体配对Opal 690，抗CD3单克隆抗体配对Opal 620，抗FOXP3单克隆抗体配对Opal570，抗CD4单克隆抗体配对Opal 520，抗CD8单克隆抗体配对Opal 480，抗panCK单克隆抗体配对Opal 780。
在一实施例中，多重染色步骤中，包括按照抗原顺序，重复进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色(即染料孵育)、去除抗体。每一轮对一种抗原进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色、去除抗体。
在一实施例中，多重染色步骤中，二抗孵育时使用的二抗标记有辣根过氧化物酶。
在一实施例中，多重染色步骤中，对前5种抗原完成染色后，使用封闭液对样本进行封闭，然后对第6种抗原依次进行一抗孵育、二抗孵育、信号放大染色、去除抗体、使用对应的染色剂进行染色、使用核染色剂进行染色，获得染色后的样本。
在一实施例中，多重染色步骤中，信号放大染色时，使用的染色剂包含Opal TSA-DIG染料。
在一实施例中，多重染色步骤中，所述核染色剂包括但不限于DAPI(即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，CAS登录号：47165-04-8)。
在一实施例中，多重染色步骤中，所述样本包括癌组织切片。
在一实施例中，直标染色步骤中，所述样本包含肺癌和/或胰腺癌样本。
在一实施例中，还包括成像步骤，包括对染色后的样本进行连续光谱成像，获得对应的染色图像。染色图像为中间结果，而非最终结果，因此，不属于疾病的诊断方法。
在一实施例中，还包括检测步骤，对染色图像进行检测。检测结果通常可以是生物标记物数值的分析结果，该结果仅仅是中间结果，而非最终结果，因此，不属于疾病的诊断方法。
根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项所述的染色方法获得的样本或图像。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种图像分析方法，包括：对第二方面所述图像的目标区域的荧光表达数据进行生物标记物分析计算，得到样本的生物标记物数值。
在一实施例中，所述生物标记物数值包括对应标记物的阳性表达率。
在一实施例中，所述生物标记物数值包括对应标记物的阳性表达密度。
在一实施例中，所述生物标记物数值包括空间距离。空间距离具体可以是基质区激活效应T细胞(Stroma：Total Activated Effector T Cell)到肿瘤区上皮细胞(Tumor：PanCK+Cell)在250微米范围内的空间距离。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种用于检测癌样本的试剂盒，包括直标抗体以及用于多重标记的抗体。
在一实施例中，所述直标抗体包含如下抗体中的至少一种：抗CD45单克隆抗体、抗CD20单克隆抗体、抗CD68单克隆抗体。
在一实施例中，所述直标抗体包含如下抗体中的全部：抗CD45单克隆抗体、抗CD20单克隆抗体、抗CD68单克隆抗体。
在一实施例中，所述用于多重标记的抗体包括如下抗体：
抗OX40单克隆抗体、抗CD3单克隆抗体、抗FOXP3单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗panCK单克隆抗体。
在一实施例中，还包括染色剂，用于多重染色的染色剂的种类数量与用于多重标记的抗体的种类数量一致。
在一实施例中，所述染色剂包括荧光染色剂(即荧光染料)。
在一实施例中，所述染色剂包括：
Opal 690、Opal 620、Opal 570、Opal 520、Opal 480、Opal 780。
在一实施例中，用于多重标记的抗体与染色剂的配对关系如下：
抗OX40单克隆抗体配对Opal 690，抗CD3单克隆抗体配对Opal 620，抗FOXP3单克隆抗体配对Opal570，抗CD4单克隆抗体配对Opal 520，抗CD8单克隆抗体配对Opal 480，抗panCK单克隆抗体配对Opal 780。
在一实施例中，还包括荧光染料Opal TSA-DIG。该染色剂用于信号放大染色。
在一实施例中，还包括核染色剂。核染色剂可用于直标抗体标记后的染色以及多重抗体标记后的染色。
在一实施例中，所述核染色剂包括但不限于DAPI。
在一实施例中，所述试剂盒还包含抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、封闭液、抗荧光淬灭剂中的至少一种。
在一实施例中，所述试剂盒还包含核染色剂。
在一实施例中，所述样本包括癌组织切片。
在一实施例中，所述样本包括但不限于肺癌和/或胰腺癌样本。
在一实施例中，本发明提供一种通过直标抗体检测与mIF结合的方法，并利用生信图片合并技术，实现多6标mIF Panel检测方法学优化，最终实现最多9标十色的mIF Panel检测方案，同时可应用于7标8色和8标9色的mIF Panel检测。便于观察靶标蛋白质的相互作用和共生定位，对组织样本的需求量显著降低；且该试剂盒能够应用于自动化染色机，显著提高准确度和可重复性，简便高效。
在一实施例中，本发明提供一种多6标mIF Panel的全自动多色免疫荧光检测方法及染色方法。本发明通过将直标染色方法和mIF染色方法相结合的形式，并利用图像识别系统(如inForm v2.3、HALO病理图像分析系统等)对原始结果进行数据合并，同时获得组织和细胞表型信息以及相应靶标的荧光强度信息等，对样本免疫微环境的肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes,TILs)进行分析，验证了该方法应用于试剂盒检测的准确性和精密度符合科研检测要求。
在一实施例中，本发明主要解决了肿瘤免疫治疗疗效评估缺乏足够生物标志物，以及如何使肿瘤免疫微环境相关指标能够在更大规模更大范围内对免疫治疗疗效进行评估的技术问题；同时很好地解决在临床病理工作以及科学研究中通过多重免疫荧光技术进行肿瘤免疫微环境分析的需求，高效辅助医生和科研人员完成免疫组化多重标记后的各项免疫组化指标的分析。
在一实施例中，本发明利用了一种前期设计的用于肺癌和胰腺癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒及染色方法，在此基础上进行多6标mIF Panel的全自动多色免疫荧光检测方法及染色方法的开发。该试剂盒能够在一张组织切片上同时表达六个抗体，我们在此基础上加1标、2标、3标进行开发，同时对加3标的试剂盒，即9标10色mIF Panel进行了性能验证，本发明提供的mIF Panel可以为病理医生提供更多的靶标蛋白质信息和共定位情况，可以大大提高染色效率，节约样本；同时可以避免手工染色带来的重复性低、时间长等问题；该试剂盒可以应用于全自动染片机，具有广泛的应用前景。
实施例1
图1为本实施例的检测流程示意图。
一、本实施例提供的多6标mIF Panel的全自动多色免疫荧光检测方法具体如下：
1.本实施例选用了肺癌和胰腺癌样本的全自动6标7色免疫荧光检测试剂盒，包括如下组分：过氧化物酶封闭剂、一抗试剂、二抗试剂、荧光染料；一抗试剂包括兔抗人CD3单克隆抗体、兔抗人CD4单克隆抗体、鼠抗人CD8单克隆抗体、兔抗人OX40单克隆抗体、兔抗人FOXP3单克隆抗体、兔抗人panCK单克隆抗体；二抗试剂包括HRP标记的抗鼠抗兔混合物；并选取了3个与该试剂盒不同的直标抗体：兔抗人CD68单克隆抗体、鼠抗人CD45单克隆抗体、鼠抗人CD20单克隆抗体，全自动多色免疫荧光检测涉及的关键物料如表1。
表1关键物料清单
2.获取来自于某一受试者的肺癌组织样本，制备成组织切片，对所述肺癌组织样本进行多重免疫组化染色处理(如Leica公司BOND RX自动化染色仪器)，再通过成像扫描仪器(如Akoya公司Vectra Polaris光谱型定量病理分析系统)获取相应的免疫组化显微全景图。
3.适用于全自动免疫组化染色机，染色程序包括如下步骤：
表2直标Panel染色程序
表3mIF Panel染色程序
/>
表4直标Panel阴参样本的程序
表5mIF Panel阴参样本的染色程序
本实施例通过性能验证实验，准确性和精密度均合格。样本通过病理学家对样本H&E染色结果判读，样本符合质控要求；染色结果判读亚细胞定位正确(细胞膜定位包括CD20、CD3、CD4、CD8、OX40，细胞质定位CD45、CD68、panCK，细胞核定位FOXP3)；利用斯皮尔曼相关系数R计算IHC和mIF的相关性。使用R描述相关性的强度：0.20-0.39，“弱”；0.40-0.59，“中等”；0.60-1.0，“强”。如图15与图16所示，使用单mIF Panel和直标Panel+mIF Panel检测CD3、CD4、CD8、OX40、FOXP3及panCK的6种蛋白的表达情况，斯皮尔曼相关系数R值均大于等于0.6，因此通过准确度验证；计算每个抗体的阳性细胞密度(阳性细胞计数/图像面积百分比)的C.V.值并计算平均值。当阳性细胞密度(Overall Density)大于100/mm2时，C.V.≤0.2，通过精密度评估；当阳性细胞密度小于100/mm2时，C.V.≤0.4，通过精密度评估。因C.V.均满足对应的条件，所以通过精密度验证。
二、该多6标mIF Panel的全自动多色免疫荧光结果分析方法如下：
1.获取来自于每一受试者的肺癌组织样本，制备成组织切片，每个样本获得2张连续切片，每张切片4-5微米厚，对所述肺癌组织样本进行多重免疫组化染色处理(如Leica公司的BOND RX自动化染色仪器)，第一张进行DIRECT染色，第二张进行TSA染色，再通过成像扫描仪器(如Akoya公司的Vectra Polaris光谱型定量病理分析系统)获取相应的免疫组化显微全景图。每个样本会产生2张TSA多重染色图片。
2.将每个样本的2张病理图像导入图像识别分析软件系统(HALO)进行2张图像之间的配准(image r egistration)，配准步骤使用两种图像的DAPI荧光信号，实现细胞与细胞之间的对齐与匹配。
3.进一步对配准完成的2张连续切片进行合并与叠加(fuse)，合并后的图片通道保留panel来源信息，分别为DIRECT|570、DIRECT|690、DIRECT|Opal 620、TSA|Opal 570、TSA|Opal 690、TSA|Op al 480、TSA|Opal 620、TSA|Opal 780以及TSA|Opal 520。
4.通过mIF的图像识别分析软件系统(如HALO等)对每一张免疫组化显微全景图进行分析区域圈选。圈选目标区域遵循以下几点规则：(1)在浸润性肿瘤以及其附近基质所组成的区域边界内进行选取；(2)排除浸润性肿瘤以及其附近基质外和癌旁正常组织；(3)排除肿瘤区域中具有自溶、原位癌、DAPI显色异常、碳化、褶皱、划痕、气泡、压迫伪影、坏死、透明化消退以及其他人为因素造成的异常区域；(4)调节图片荧光信号强度，去除背景信号，增强真阳性信号。
5.因两张图片为同一张组织切片，故细胞级别的DAPI荧光信号配准误差极小，从而组织区域级别的配准也不存在误差，故两个panel之间的细胞可进行细胞级别的共定位，以及区域识别(其中一张的区域可以用于另一张的区域识别)，最常见的用法是使用DIRECT中的PanCK marker对TSA的肿瘤以及基质区域进行识别与区分。根据表达marker对mIF病理图像的细胞使用classifier进行表型区域识别，设置如下：(1)新建class ifier，设置算法为Random Forest；(2)添加类别Tumor与Stroma；(3)选中不同表型并在图片上采集相应表型富集的区域，Tumor选择PanCK多阳性富集区域，Stroma选择PanCK阴性富集区域；(4)选择多个包含所有表型的视野实时浏览分类结果，若分类结果不理想则添加更多采集区域以训练分类器，直至分类结果符合病理生理学特征即可完成分类器调试；(5)保存classifier分析设置以便批量应用到其他图片。
6.在细胞核形态学识别(Nuclear Detection)的步骤中，设置参数如下(未提及参数设置为默认)：Analys is Settings选择Indica Labs HighPlex FL v4.1.3,NuclearContrast Threshold参数设置为0.5，Minimum Nuclea r Intensity参数设置为0.095，Maximum Image Brightness参数设置为1，Nuclear Segmentation Aggressiveness参数设置为0.9，Fill Nuclear Holes参数设置为False，Nuclear Size参数设置为11.3到571.7，Minimum Nucle ar Roundness参数设置为0，Number of Nuclear Dyes参数设置为2，Nuclear Dye 1参数设置为DIRECT|D API，Nuclear Dye 1Weight参数设置为1,NuclearDye 2参数设置为TSA|DAPI，Nuclear Dye 2Weight参数设置为1。基于以上参数对mIF病理图像的细胞核进行识别。
7.根据表达marker对mIF病理图像的细胞进行表型识别，设置参数如下(未提及参数设置为默认)：
a)Maximum Cytoplasm Radius参数设置为2.5；
b)Membrane Segmentation Agressiveness参数设置为0.9；
c)Cell Size参数设置为5到600；
d)Number of Membrane Dyes参数设置为0；
e)DIRECT|DAPI Nucleus Positive Threshold Weak参数设置为35；
f)CD68+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为18-20；
g)CD20+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为12；
h)CD45+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为20-25；
i)TSA|DAPI Nucleus Positive Threshold Weak参数设置为35；
j)FOXP3+Nucleus Positive Threshold Weak参数设置为20-25；
k)OX40+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为9.5-10；
l)CD8+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为12-15；
m)CD3+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为25；
n)PanCK+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为18-25；
o)CD4+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为38-45；
p)所有marker如未特殊提及，Nucleus Positive Threshold Weak、NucleusPositive Threshold Mod、Nu cleus Positive Threshold Strong、Cytoplasm PositiveThreshold Weak、Cytoplasm Positive Threshold Mod以及Cytoplasm PositiveThreshold Strong参数设置默认为255；
q)所有marker如未特殊提及，细胞核marker Nucleus％Completeness Threshold设置为50，其他mark er为0；细胞质marker Cytoplasm％Completeness Threshold参数设置默认为30，其他marker为0；
r)Advanced settings中Class List参数设置为Tumor|Stroma,Classifier参数设置为上一步保存的classi fier设置，Classifier Output Type设置为Mask。将各靶标荧光强度大于(e)至(0)中提及的cutoff值的细胞被判断为阳性细胞，获得相应的细胞表型的数据。
8.对每一受试者的mIF病理图像目标区域的荧光表达数据进行生物标记物分析计算，得到每一受试者的跨panel生物标记物定量性数值，其中，算法包括以下步骤：
a)肿瘤浸润淋巴细胞识别，跨panel计算肿瘤区域基质区各多阳标志物在肿瘤区的阳性表达率以及阳性表达密度(细胞数量/mm2)。
b)空间距离分析。
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，但这些实施例只是用于说明本发明，而不是来限制本发明的范围。本发明检测样本为肺癌和扁桃体样本，但并不局限于此。
一、一种用于肺癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒
该实施例提供了一种用于肺癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒，开发程序如下：
在方法学开发实验中，对每个抗体进行优化。抗体包括：直标抗体CD20、CD45、CD68和一抗CD3、CD4、CD8、OX40、FOXP3、panCK。关键步骤如下：
(1)抗体验证实验：通过采用IHC实验，确认抗体是否可以用；并初步明确阳参样本；
(2)直标抗体浓度、修复、孵育温度和时间等条件摸索实验：结合抗体说明书推荐的浓度，进行适当的浓度调整，设置2-3个浓度，开展IHC实验摸索一抗浓度。例如：抗体Anti-CD68(KP1)-Abcam，推荐抗体浓度为1：100(体积比，下同)，设置1：50、1：100、1：200开展IHC实验；
(3)直标Panel实验：根据直标抗体实验结果，归纳总结抗体特性，确定一抗浓度、酸碱修复条件，抗体配对染料和抗原修复轮次，初步明确直标Panel实验条件；根据实验结果优化直标Panel条件，直至达到无非特异性染色，光谱拆分无串染等效果；
(4)直标抗体清除实验：通过增加洗脱和修复步骤，设置1-4次修复，进行直标抗体清除测试。各个修复次数清除后，均进行玻片扫描，判断残存情况，确保对后续mIF Panel无影响；
(5)mIF Panel实验：使用已经开发的试剂盒mIF Panel(CD3、CD4、CD8、OX40、FOXP3、panCK)进行直标Panel+六标七色mIF，进行多六标探索实验；
(6)直标Panel+mIF Panel预实验：根据上述实验结果，归纳总结实验条件，初步明确直标Panel+mIF Pa nel实验条件；并探索TBST去除盖玻片时间和注意事项，安排实验；根据实验结果优化条件，直至达到无非特异性染色，光谱拆分无串染等效果。
1.预实验条件：预实验-1(单个直标+IF)
直标抗体筛选
表6
预实验1：1直标+IF
表7
直标实验结束后，封片拍照；后TBST去除玻片；正常IF，没有增加额外修复次数。
预实验1结果(扁桃体样本22R1167SLZA)：
从图2可见，直标-CD45在IF实验后，荧光强度变弱，但仍有残留，更换修复条件：增加修复次数、更换修复方法。图2中，左上角荧光图中，左下角的信息为Standard、DAPI、Opal620、Sample AF、2mm。右上角荧光图中，左下角的信息为Standard、DAPI、Opal 480、Opal620、Sample AF、2mm。左下角荧光图中，左下角的信息为Standard、DAPI、Opal 620、SampleAF、50μm。右下角荧光图中，左下角的信息为Standard、DAPI、Opal 480、Opal 620、SampleAF、50μm。
从图3可见，直标-CD45在IF实验后，荧光强度变弱，但仍有残留；高压修复2min后，100ms扫描可以看到弱阳性信号，会影响mIF；后续可以增加修复次数或降低抗体浓度。图3中，从左往右，左侧第一列上下图的荧光通道为Opal 620，右侧三列上下图的荧光通道均为Opal 480、Opal 620。上侧4个图的标尺均为2mm，下侧4个图的标尺均为50μm。
从图4可见，直标-CD45在IF实验后，观察CD45清除情况；可见荧光强度变弱，但仍有残留；IF实验相当于1次修复去除实验，后续可以增加修复次数或降低抗体浓度，来避免对后续mIF造成串色，出现非特异性染色。图4中，所有图的荧光通道均为Opal 480、Opal620，上侧2个图的标尺均为2mm，下侧3个图的标尺均为50μm。
2.预实验条件：预实验-2(单个直标+2次修复)
表8
染色顺序 抗体 酸碱修复 一抗浓度 一抗孵育时间/温度 染料
1 厂家试剂盒-CD45 ER2,95℃，20min 1:40 室温/60min /
2 / ER2,100℃，20min+20min / / /
直标实验结束后，封片拍照；后TBST去除玻片；后高温修复2次。
从图5可见，直标-CD45在2次碱修复实验后，100ms扫描可以无阳性信号，不会影响mIF；后续可以尝试其他通道探索。所有图的荧光通道均为Opal 620，上侧3个图的标尺均为2mm，下侧3个图的标尺均为50μm。
3.预实验条件：预实验-3(3个直标+4次修复)
表9
直标实验结束后，封片拍照；后TBST去除玻片；后高温修复4次数。
实验结果如图6所示，直标3+高温修复4次，经拆分无阳性信号，初步确定直标去除方法学方案；后续可进行直标+mIF实验。图6中，第一行4个图的通道信息为DAPI MSI、Cy3、Cy5 MSI、Texas Red，标尺为2mm。第二行4个图的通道信息为DAPI MSI、Cy3、Cy5 MSI、TexasRed，标尺为50μm。第三行4个图的通道信息为DAPI、Opal 570、Opal 620、Opal 690，标尺为2mm。
直标+mIF程序建立
1.实验条件：3个直标+mIF
3直标实验参数：
表10
mIF实验参数：
表11
/>
3.实验条件：3个直标+mIF，样本挑选
肺癌样本22R2897SLZA(评分4.5)。评分为生信分析评估，评分规则如下：根据染色以及marker表达、质控等因素先给出分数，最后对于整体面积较小的组织再减1分；总分5分。
表12
染料 曝光时间/ms
480 6.43
520 24.02
570 45
620 16.08
690 57.08
780 36.89
DAPI 5
染色结果如图7所示，可见，样本整体染色效果较好，且曝光时间在100 ms以内，可有效避免直标抗体染色对后续mIF染色的影响。
肺癌样本22R3184SLZA(评分4)，以及肺癌样本22R7458SLZA。
表13
染料 曝光时间/ms
480 6
520 29.89
570 55.89
620 27.09
690 51.07
780 36.89
DAPI 5.5
DAPI 5
染色结果如图8所示，可见，样本整体染色效果较好，且曝光时间在100 ms以内，可有效避免直标抗体染色对后续mIF染色的影响。
胰腺癌样本2201595FZZA-2204204FZZA(评分5)。
表14
染料 曝光时间/ms
480 9
520 28.9
570 44.42
620 17.09
690 42.04
780 40.66
DAPI 5
染色结果如图9所示，可见，样本整体染色效果较好，且曝光时间在100ms以内，可有效避免直标抗体染色对后续mIF染色的影响。
胰腺癌样本2106501FZZA-2104370FZZA(评分4.5)-2102542FZZA。
表15
染料 曝光时间/ms
480 9
520 28.9
570 44.1
620 17.09
690 60
780 40.66
DAPI 3.5
染色结果如图10所示，可见，样本整体染色效果较好，且曝光时间在100ms以内，可有效避免直标抗体染色对后续mIF染色的影响。
实验条件1：3个直标+mIF，肺癌样本22R2897SLZA
染色结果如图11所示，可见，直标Panel阳性细胞标记准确(细胞膜定位包括CD20，细胞质定位CD45、CD68)；mIF Panel各通道显色正常，阳性细胞标记准确(细胞膜定位包括CD3、CD4、CD8、OX40，细胞质定位panCK，细胞核定位FOXP3)；未受到直标Panel显色影响，无非特异性染色；整体拆分效果较好，合并图合格，可以进行性能验证实验。
性能验证-实验条件：直标+mIF Panel。
利用Bond RX进行自动化染色，染色程序如表16、17：
表16直标Panel实验参数
第一轮染色时，三种抗体混合配制。
扫描图片，获得一份高清图像22R1167SLZA-1和一份100ms、150ms曝光时间图22R1167SLZA-1-100ms，然后取出盖玻片进行修复洗脱直标抗体，以及进行mIF实验。
修复洗脱直标抗体实验条件：酸碱修复，具体为ER2，100℃，20min*2次。后一轮修复时，中间进行2次洗涤。
表17mIF Panel实验参数
第三轮mIF结束后，扫描，获得图像22R1167SLZA-1-mIF。
直标+mIF：用同一张性的扁桃体样本，第二轮修复程序和第三轮mIF实验程序合并，增加2次洗涤。
二、试剂盒在全自动染片机中的应用及染色程序。步骤如下：
将试剂盒应用于肺癌组织，以扁桃体组织为阳参，实施多重免疫组化染色，使用的机器为BOND RX全自动染片机。
(1)取肺癌和扁桃体石蜡组织各一个，分别制备肺癌石蜡组织切片1张(实验切片)，扁桃体石蜡组织切片2张(阴参和阳参切片)，厚度为3微米，贴好样本标签，放在切片盒中，于4℃冰箱中待用；
(2)打开电热鼓风干燥箱，提前预热电热鼓风干燥箱至65℃。将切片放入切片架中，将切片架放入电热鼓风干燥箱中，65℃，3h。肉眼观察组织表面的蜡融化彻底即可，填写实验记录表。
(3)试剂准备：从4℃冰箱中取出、一抗、二抗、染料、封闭液，需避光的试剂需用锡箔纸包裹试管，置于冰上，备用，放于离心机中短暂离心。
a.抗体配制：取出抗体储存液，放于离心机中短暂离心，备用。在滴定管(Titration Kit)中，用抗体稀释液按照下表的稀释比例配制工作液，用锡箔纸包裹试管，在管外标记染料名称，配制时间，配制人员。
表18一抗工作液配制
b.染料配制：
①制备染料储存液，取出抗体及Opal染料，用锡箔纸包裹试管，放于离心机中短暂离心。分别往Opal 480、Opal 520、Opal 570、Opal 620、Opal 690、TSA-DIG染料管中加入75μL的DMSO溶液；将300μL的去离子水溶液加入Opal 780染料管中。将上述染料管上下混匀10次后，待试剂完全溶解，将染料管放于离心机中短暂离心。
②取出染料储存液，放于离心机中短暂离心，备用。在滴定管(Titration Kit)中，用稀释液按照下表的稀释比例配制工作液，用锡箔纸包裹试管，在管外标记染料名称，配制时间，配制人员。
表19染料工作液配制
c.二抗配制：使用移液器吸取二抗转至滴定管中(二抗试剂用量的计算公式如下：1618+150*7*n(μL)，其中n为切片数量，1618μL为30mL试剂盒死仓体积，150μL为每张切片用量)。
d.封闭液配制：使用移液器吸取封闭液转至滴定管中(封闭液用量的计算公式如下：1618+150*7*n(μL)，其中n为切片数量，1618μL为30mL试剂盒死仓体积，150μL为每张切片用量)。
(4)设置染色程序：
a.检测样本及阳参样本程序设置：点击“程序设置”，具体参数见表20、表21。
表20直标Panel染色程序
表21mIF Panel染色程序
b.阴参样本程序设置：点击“程序设置”，具体参数见表22、表23。
表22直标Panel染色程序
/>
表23mIF Panel阴参样本染色程序
(5)检测系统和装有抗体的试剂架放入BOND RX仪器内，启动直标Panel染色程序。
(6)右击玻片架直接开始染色，染色开始和结束时间会在玻片架下方显示，填写实验记录表；
(7)封片：
a.染色完成后，按下玻片架下方的“装/卸按钮”，解除玻片架的锁定状态，取出玻片架，并将一抗和二抗盒用封口膜或者盖子封好，放入4℃冰箱保存。
b.从玻片架上取出切片，去除通用玻片盖(Bond Universal Covertiles)。除组织外，使用无尘纸擦干切片上的水迹。
c.每张切片滴加抗荧光淬灭剂1-2滴进行封片，保证抗荧光淬灭剂完成覆盖组织且无气泡，同时需要避免抗荧光淬灭剂溢出。将切片放在存放板中保存，室温避光30min，待抗荧光淬灭剂凝固后，放在4℃冰箱中避光保存，留待扫描。
(8)扫描切片：使用Vectra Polaris仪器，设置程序对切片进行全片扫描。扫描结束后，确保阳性对照与阴性对照样本出现预期染色效果。图12所示为肺癌样本的直标Panel染色结果(20X)，可见，阳性对照预期染色效果：样本出现阳性信号(细胞膜定位包括CD20，细胞质定位CD45、CD68)。阴性对照预期染色效果：样本未出现明显阳性信号。图12中，各个图左下角的荧光通道信息均为：DAPI、Opal 570、Opal 620、Opal 690。
(9)检测系统和装有抗体、染料的试剂架放入BOND RX仪器内，启动mIF Panel染色程序。
(10)右击玻片架直接开始染色，染色开始和结束时间会在玻片架下方显示，填写实验记录表。
(11)封片：
a.染色完成后，按下玻片架下方的“装/卸按钮”，解除玻片架的锁定状态，取出玻片架，并将一抗和二抗盒用封口膜或者盖子封好，放入4℃冰箱保存，TSA-DIG、Opal780以及DAPI染料直接倒入废液瓶，其他Opal染料在工作液有效期内可继续使用。
b.从玻片架上取出切片，去除通用玻片盖(Bond Universal Covertiles)。除组织外，使用无尘纸擦干切片上的水迹。
c.每张切片滴加抗荧光淬灭剂1-2滴进行封片，保证抗荧光淬灭剂完成覆盖组织且无气泡，同时需要避免抗荧光淬灭剂溢出。将切片放在存放板中保存，室温避光30min，待抗荧光淬灭剂凝固后，放在4℃冰箱中避光保存，留待扫描。
(8)扫描切片：使用Vectra Polaris仪器，设置程序对切片进行全片扫描。扫描结束后，确保阳性对照与阴性对照样本出现预期染色效果。图13为肺癌样本的mIF Panel染色结果(20X)，可见，阳性对照预期染色效果：样本出现阳性信号(细胞膜定位包括CD3、CD4、CD8、OX40，细胞质定位panCK，细胞核定位FOXP3)。阴性对照预期染色效果：样本未出现明显阳性信号。
(9)数据分析：将数据上传至共享文件夹，路径是指定项目文件夹。后根据分析需求进行数据处理。使用HALO对图像进行分析处理，合并图像，以及统计学分析。图14为肺癌样本的(直标Panel+mIF Panel)染色结果(20X)，可见，阳性对照预期染色效果：样本出现阳性信号(细胞膜定位包括CD20、CD3、CD4、CD8、OX40，细胞质定位CD45、CD68、panCK，细胞核定位FOXP3)。
三、试剂盒在肺癌组织中应用的性能验证实验和结果。具体实验如下：
(1)样本：
a.为了评估多色免疫荧光结果的准确性(Accuracy)，检测来自LC的3个FFPE样本，每个样本选择3张连续切片进行性能验证，其中1张用于panel的mIF、1张用于直标+mIFPanel、1张用于H&E。每次实验取正常人扁桃体组织连续切片2张用于对照实验，其中1张用于阳参对照实验，1张用于IgG同型对照，所有的标本从国内组织芯片服务公司取得。
b.为了评估多色免疫荧光结果精密度(Precision)，检测3个LC样本，每个样本6张连续切片，其中：每个样本5张用于重复性实验，1张切片用于H&E染色。每次实验取正常人扁桃体组织连续切片2张用于对照实验，其中1张用于阳参对照实验，1张用于IgG同型对照，所有的标本从国内组织芯片服务公司取得。
(2)HE质控：依据病理医生反馈的HE阅片结果，对切片进行HE染色结果判读，HE染色结果判读标准如下表。
表24HE质控标准
五项参数均在参考范围内才判定为该等级样本，若有一项不符则判定为下一等级样本。风险样本可以尝试上机操作，但最终结果可能差于合格样本。
(3)准确性分析：
a.检测至少3个样本来评估准确性。
b.mIF Panel单个抗体作为直标Panel+mIF Panel合并染色图像的单个抗体的参考。
c.结果分析中，使用Vectra Polaris扫描仪扫描直标Panel或mIF Panel染色。对3个样本进行全扫描和数字成像分析。通过成像HALO软件(或同等软件)分析mIF的扫描图像，然后将单个直标Panel+mIF Panel中抗体(CD3、CD4、CD8、OX40、FOXP3、panCK)的每个抗体染色的细胞密度和比例与单个mIF Panel中抗体(CD3、CD4、CD8、OX40、FOXP3、panCK)的细胞密度和比例进行比较(每个样本选择至少5个感兴趣的区域(Region of Interest，ROI)进行分析)。
d.每张幻灯片的染色结果将显示为每个标记物的每平方毫米中阳性细胞计数和总细胞中阳性细胞的百分比。对IHC或染色片同一标记的结果进行排名。①将直标Panel或mIF Panel的图像加载到HALO；②计算每个抗体染色的阳性细胞的密度，用公式表示为：阳性细胞计数/图像面积。③随机选取至少5个ROI，对每个R OI中的单个mIF的阳性细胞密度进行排名，然后计算每个抗体的斯皮尔曼相关系数Rs。
e.利用斯皮尔曼相关系数Rs检测单单mIF Panel和直标Panel+mIF Panel的相关性。使用Rs描述相关性的强度：0.20-0.39，“弱”；0.40-0.59，“中等”；0.60-1.0，“强”。准确性研究只有在Rs值大于等于0.6时才通过验证。只有通过使用至少15个ROI的数据，当Rs值在0.6到1.0之间时，准确性评估才通过验证。
(4)精密度分析：
a.为了精确评估，3个肿瘤的FFPE样本将至少分三个批次进行重复性实验，每次实验每个患者取3张切片用于抗体panel检测。且每次实验均选取1张切片用于阳参对照检测和1张切片用于同型对照检测。
b.评估测定精度的三个批次由至少两名不同的人员在至少两天进行，以涵盖尽可能多的变量。
c.通过Vectra Polaris或同等方法对染色后的切片进行扫描。每个样本中的9张切片都将进行全片扫描和数字成像分析。HALO或同等软件分析图像，然后将一批次的染色结果与其他批次的染色结果进行比较。①将每批的一个样本的mIF的图像加载到HALO。②每个抗体染色的阳性细胞的密度和百分比，用公式表示：阳性细胞计数/图像面积和总细胞中的阳性细胞百分比。③计算每个抗体染色的C.V.值。
d.计算每个抗体的阳性细胞密度和比例(阳性细胞计数/图像面积百分比)，得到C.V.值。只有当C.V.≤0.2时，精密度评估才会被视为通过；如果C.V.>0.2，将维持机器稳定，控制实验室环境条件，确保更稳定的实验条件，再次重复实验，然后使用重复实验的数据计算C.V.值；因任何原因导致切片无法产出有效结果，该切片扫描结果需排除在计算之外。除此之外，还重复包括此样本在内批次的评估，并在重复实验结果中重新计算C.V.值。
(5)验证结果：
a.样本符合质控要求：病理学家对样本H&E染色结果判读，如下表。
表25样本H&E质控结果
b.染色结果：在满足质控要求的肺癌样本中，利用Bond RX进行自动化染色，使用Vectra Polaris全景扫描。染色结果判读亚细胞定位正确(细胞膜定位包括CD20、CD3、CD4、CD8、OX40，细胞质定位CD45、CD68、panCK，细胞核定位FOXP3)。染色准确性分析：肺癌各3个肿瘤FFPE样本，每个样本取1张切片用于mIF检测。使用HALO对图像进行分析处理，以及统计学分析(图15～16)。依据的数据源：肺癌样本单m IF Panel和直标Panel+mIF Panel检测的阳性细胞密度以及阳性细胞比例。
图15为肺癌样本中，单mIF Panel和直标Panel+mIF Panel检测的阳性细胞密度相关性分析结果。
图16为肺癌样本中，单mIF Panel和直标Panel+mIF Panel检测的阳性细胞比例相关性分析结果。
c.相关性分析：利用斯皮尔曼相关系数R计算IHC和mIF的相关性。使用R描述相关性的强度：0.20-0.39，“弱”；0.40-0.59，“中等”；0.60-1.0，“强”。如图15与图16所示，使用单mIF Panel和直标Panel+mIF Pa nel检测CD3、CD4、CD8、OX40、FOXP3及panCK的6种蛋白的表达情况，斯皮尔曼相关系数R值均大于等于0.6，因此通过准确度验证。
d.精密度分析：肺癌3个肿瘤的FFPE样本将分3个批次进行重复性实验，第一批次实验每个患者取3张切片用于检测，第二、三批次实验每个患者取1张切片用于检测。且每次实验均需1张切片用于阳参对照检测和1张切片用于同型对照检测。使用HALO对图像进行分析处理，以及统计学分析(图15)。计算每个抗体的阳性细胞密度(阳性细胞计数/图像面积百分比)的C.V.值并计算平均值。当阳性细胞密度(Overall Density)大于100/mm2时，C.V.≤0.2通过精密度评估；当阳性细胞密度小于100/mm2时，C.V.≤0.4通过精密度评估。因C.V.均满足对应的条件，所以通过精密度验证。
图17为肺癌样本中重复实验的染色结果(200X；行为不同marker，列为不同样本；行1-11分别为全通道图、DAPI、CD68、CD20、CD45、FOXP3、OX40、CD8、CD3、panCK以及CD4)。
表26肺癌样本中直标Panel+mIF Panel检测的精密度验证结果
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e.验证结论：样本通过病理学家对样本H&E染色结果判读，样本符合质控要求；染色结果判读亚细胞定位正确(细胞膜定位包括CD20、CD3、CD4、CD8、OX40，细胞质定位CD45、CD68、panCK，细胞核定位F OXP3)；准确度验证结果显示阳性细胞密度以及比例相关性系数均大于0.6，满足验收标准。精密度验证结果显示，当阳性细胞密度(Overall Density)大于100/mm2时，C.V.平均值分布约为0.136至0.212；当阳性细胞密度小于100/mm2时，C.V.平均值分布约为0.140至0.312，满足验收标准。性能验证通过验收，可用于检测肺癌样本。
四、该试剂盒应用实验结果分析方法和结果。具体如下：
1.本实施例中使用的样本是在本实验室检测的临床肺癌病人的手术组织切片样本，共3个FFPE样本，每个样本获得3张连续切片，2张用于mIF、1张用于H&E。使用Bond RX自动化染色仪完成对该患者肿瘤组织样本的mIF染色Panel DIRECT(DAPI、CD68、CD20以及CD45)和Panel TSA(DAPI、FOXP3、OX40、CD8、CD3、PanCK以及CD4)，并经过VECTRA POLARIS系统进行全片扫描获取免疫组化显微全景图。获取来自于每一受试者的肺癌组织样本，制备成组织切片，每张切片4-5微米厚，对所述肺癌组织样本进行多重免疫组化染色处理(Leica公司Bond RX自动化染色仪器)，第一张进行DIRECT染色，第二张进行TSA染色，再通过成像扫描仪器(Akoya公司Vectra Polaris光谱型定量病理分析系统)获取相应的免疫组化显微全景图。每个样本会产生2张TSA多重染色图片。将全景图片导入HALO软件中。图18为合并后免疫组化显微全景图，各Panel说明如下：Panel 1(DAPI蓝色，CD68黄色，CD20红色以及CD45橙色)，Panel 2(DAPI蓝色，FOXP3黄色，OX40红色，CD8青色，CD3橙色，PanCK白色，CD4绿色)。
2.进行2张图像之间的配准(image registration)，配准步骤使用两种图像的DAPI信号，实现细胞与细胞之间的对齐与匹配。
3.进一步对配准完成的2张连续切片进行合并与叠加(fuse)，合并后的图片通道保留panel来源信息，分别为DIRECT|Opal 570、DIRECT|Opal 620、DIRECT|Opal 780、DIRECT|Opal 520、TSA|Opal 570、TSA|Opal 690、TSA|Opal 480、TSA|Opal 620、TSA|Opal780以及TSA|Opal 520(见图12)。
4.通过mIF的图像识别分析软件系统(如HALO、QuPath等，本实施例具体为HALO)对每一张免疫组化显微全景图进行分析区域圈选。圈选目标区域遵循以下规则：(1)应在浸润性肿瘤以及其附近基质所组成的区域边界内进行选取；(2)应排除浸润性肿瘤以及其附近基质外和癌旁正常组织；(3)排除肿瘤区域中具有自溶、原位癌、DAPI显色异常、碳化、褶皱、划痕、气泡、压迫伪影、坏死、透明化消退以及其他人为因素造成的异常区域；(4)调节图片荧光信号强度，去除背景信号，增强真阳性信号。
5.根据表达marker对mIF病理图像的细胞使用classifier进行表型区域识别，设置如下：(1)新建clas sifier，设置算法为Random Forest；(2)添加类别Tumor与Stroma；(3)选中不同表型并在图片上采集相应表型富集的区域，Tumor选择PanCK多阳性富集区域，Stroma选择PanCK阴性富集区域；(4)选择多个包含所有表型的视野实时浏览分类结果，若分类结果不理想则添加更多采集区域以训练分类器，直至分类结果符合病理生理学特征即可完成分类器调试；(5)保存classifier分析设置以便批量应用到其他图片。
表27荧光靶标标志物阳性细胞识别参数
6.在细胞核形态学识别(Nuclear Detection)的步骤中，设置参数如下(未提及参数设置为默认)：Analys is Settings选择Indica Labs HighPlex FL v4.1.3,NuclearContrast Threshold参数设置为0.5，Minimum Nuclea r Intensity参数设置为0.095，Maximum Image Brightness参数设置为1，Nuclear Segmentation Aggressiveness参数设置为0.9，Fill Nuclear Holes参数设置为False，Nuclear Size参数设置为11.3到571.7，Minimum Nucle ar Roundness参数设置为0，Number of Nuclear Dyes参数设置为2，Nuclear Dye 1参数设置为DIRECT|D API，Nuclear Dye 1Weight参数设置为1,NuclearDye 2参数设置为TSA|DAPI，Nuclear Dye 2Weight参数设置为1。基于以上参数对mIF病理图像的细胞核进行识别。
7.根据表达marker对mIF病理图像的细胞进行表型识别，设置参数如下(未提及参数设置为默认)：
7.1Maximum Cytoplasm Radius参数设置为2.5；
7.2Membrane Segmentation Agressiveness参数设置为0.9；
7.3Cell Size参数设置为5到600；
7.4Number of Membrane Dyes参数设置为0；
7.5DIRECT|DAPI Nucleus Positive Threshold Weak参数设置为35；
7.6CD68+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为18-20；
7.7CD20+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为12；
7.8CD45+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为20-25；
7.9TSA|DAPI Nucleus Positive Threshold Weak参数设置为35；
7.10FOXP3+Nucleus Positive Threshold Weak参数设置为20-25；
7.11OX40+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为9.5-10；
7.12CD8+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为12-15；
7.13CD3+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为25；
7.14PanCK+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为18-25；
7.15CD4+Cytoplasm Positive Threshold Weak参数设置为38-45；
7.16所有marker如未特殊提及，Nucleus Positive Threshold Weak、NucleusPositive Threshold Mod、Nucleus Positive Threshold Strong、Cytoplasm PositiveThreshold Weak、Cytoplasm Positive Threshold Mod以及Cytoplasm PositiveThreshold Strong参数设置默认为255；
7.17所有marker如未特殊提及，细胞核marker Nucleus％CompletenessThreshold设置为50，其他marker为0；细胞质marker Cytoplasm％CompletenessThreshold参数设置默认为30，其他marker为0；
7.18advanced settings中Class List参数设置为Tumor|Stroma,Classifier参数设置为上一步保存的c lassifier设置，Classifier Output Type设置为Mask。各靶标荧光强度大于7.5至7.15中提及的cutoff值的细胞被判断为阳性细胞，获得相应的细胞表型的数据。
表28细胞与区域识别数值
/>
8.对每一受试者的mIF病理图像目标区域的荧光表达数据进行生物标记物分析计算，得到每一受试者的跨panel生物标记物定量性数值，其中，算法包括以下步骤：
8.1具体marker肿瘤浸润淋巴细胞识别，跨panel计算肿瘤区域基质区各多阳标志物在肿瘤区的阳性表达率以及阳性表达密度(细胞数量/mm2)。
表29荧光靶标标志物阳性表达率以及密度
/>
/>
/>
8.2对基质区激活效应T细胞(Stroma：Total Activated Effector T Cell)到肿瘤区上皮细胞(Tumor：Pa nCK+Cell)在250微米范围内各项空间距离指标进行分析、计算(详见表30)，具体如下：
8.2.1％Unique Tumor:PanCK+Cell：该指标表示基质区激活效应T细胞到肿瘤区域PanCK阳性细胞250微米范围内的肿瘤区域PanCK阳性细胞占总肿瘤区域PanCK阳性细胞比例，两种细胞越近占比越高，衡量两种细胞在一定距离范围内的远近程度，可直接用于样本间横向对比。
8.2.2Unique Stroma:Total Activated Effector T Cell Cells：该指标表示基质区激活效应T细胞到肿瘤区域PanCK阳性细胞250微米范围内的基质区激活效应T细胞绝对数，两种细胞越近数值越高，衡量两种细胞在一定距离范围内的远近程度，不可直接用于样本间横向对比。
8.2.3％Stroma:Total Activated Effector T Cell within 250μm of Tumor:PanCK+Cell：该指标表示基质区激活效应T细胞到肿瘤区域PanCK阳性细胞250微米范围内的基质区激活效应T细胞占总基质区激活效应T细胞总数比例，两种细胞越近占比越高，衡量两种细胞在一定距离范围内的远近程度，可直接用于样本间横向对比。
8.2.4Paired Up Stroma:Total Activated Effector T Cell Cells：该指标表示基质区激活效应T细胞到肿瘤区域PanCK阳性细胞250微米范围内形成的所有细胞配对数，两种细胞越近形成配对数越多，衡量两种细胞在一定距离范围内的远近程度，不可直接用于样本间横向对比。
8.2.5Average Number of Stroma:Total Activated Effector T Cell pairswithin 250μm of Tumor:Pan CK+Cell：该指标表示基质区激活效应T细胞到肿瘤区域PanCK阳性细胞250微米范围内平均有多少细胞配对，两种细胞越近配对数越高，衡量两种细胞在一定距离范围内的远近程度，可直接用于样本间横向对比。
8.2.6Average Number of Stroma:Total Activated Effector T Cell within250μm of Tumor:PanCK+Cell：该指标表示肿瘤区域PanCK阳性细胞250微米范围内平均有多少个基质区激活效应T细胞，两种细胞越近数值越高，衡量两种细胞在一定距离范围内的远近程度，可直接用于样本间横向对比。
8.2.7Average Distance Stroma:Total Activated Effector T Cell within250μm of Tumor:PanCK+Ce ll：该指标表示基质区激活效应T细胞到肿瘤区域PanCK阳性细胞250微米范围内的平均细胞间距离，两种细胞越近数值越低，衡量两种细胞在一定距离范围内的远近程度，可直接用于样本间横向对比。
8.2.8Stroma:Total Activated Effector T Cell within XXXμm of Tumor:PanCK+Cell％：该指标表示基质区激活效应T细胞到肿瘤区域PanCK阳性细胞250微米范围内的不同距离区间内基质区激活效应T细胞占比，衡量两种细胞在不同距离区间的分布情况，可直接用于样本间横向对比。
表30空间距离信息
/>
技术效果
在一实施例中，本发明提供的用于肺癌和/或胰腺癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒及方法实现了自动化检测，对单张切片进行多重免疫荧光实验，可同时呈现六个抗原靶标的表达情况，显著提高单张组织样本的利用率，尤其是珍贵样本。
在一实施例中，节约病人取材的样本，便于样本有足够的量做其他检测项目。
在一实施例中，自动化染色可以进行高通量测试，实现标准化操作，单次最多可同时检测30片病理切片，避免了手工操作时间长和误差大的弊端，为临床病理人员提供了简便高效的检测方法。
在一实施例中，该试剂盒实现标准化操作的自动化检测，已经通过性能验证，具有高准确性和高精密度。
在一实施例中，该试剂盒检测方法降低了传统检测方法对组织样本的要求，穿刺样本也可以满足要求，同时避免了微小组织样本染色重复性差的问题。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (14)

1.一种多色免疫荧光染色方法，其特征在于，包括：
直标步骤，包括使用直标抗体对待测样本进行孵育，获得标记有直标抗体的样本，直标抗体标记的抗原包含如下抗原中的全部：CD45、CD20、CD68；
多重染色步骤，包括按照抗原组中的抗原顺序，使用对应的一抗依次对标记有直标抗体的样本进行孵育，使用染色剂对孵育后的样本进行染色，得到染色后的样本；
多重染色步骤中，包括按照如下抗原组中的抗原顺序，使用对应的一抗依次对标记有直标抗体的样本进行孵育，使用染色剂对孵育后的样本进行染色，得到染色后的样本：
OX40、CD3、FOXP3、CD4、CD8、panCK；
多重染色步骤中，使用的染色剂的种类数量与抗体的种类数量一致，抗原对应的一抗与染色剂按如下顺序依次配对染色：
抗OX40单克隆抗体配对Opal 690，抗CD3单克隆抗体配对Opal 620，抗FOXP3单克隆抗体配对Opal 570，抗CD4单克隆抗体配对Opal 520，抗CD8单克隆抗体配对Opal 480，抗panCK单克隆抗体配对Opal 780。
2.如权利要求1所述的多色免疫荧光染色方法，其特征在于，直标步骤中，包括在直标抗体孵育结束后，对样本进行核染色，然后进入多重染色步骤。
3.如权利要求1所述的多色免疫荧光染色方法，其特征在于，多重染色步骤中，包括按照抗原顺序，重复进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色、去除抗体。
4.如权利要求3所述的染色方法，其特征在于，多重染色步骤中，二抗孵育时使用的二抗标记有辣根过氧化物酶。
5.如权利要求3所述的染色方法，其特征在于，多重染色步骤中，对前5种抗原完成染色后，使用封闭液对样本进行封闭，然后对第6种抗原依次进行一抗孵育、二抗孵育、信号放大染色、去除抗体、使用对应的染色剂进行染色、使用核染色剂进行染色，获得染色后的样本。
6.如权利要求1所述的染色方法，其特征在于，多重染色步骤中，所述样本包括癌组织切片。
7.如权利要求1所述的染色方法，其特征在于，直标染色步骤中，所述样本包含肺癌和/或胰腺癌样本。
8.采用如权利要求1～7任意一项所述染色方法获得的样本。
9.一种用于检测癌样本的试剂盒，其特征在于，包括直标抗体、用于多重标记的抗体和染色剂；
所述直标抗体包含如下抗体中的全部：抗CD45单克隆抗体、抗CD20单克隆抗体、抗CD68单克隆抗体；
所述用于多重标记的抗体包括如下抗体：
抗OX40单克隆抗体、抗CD3单克隆抗体、抗FOXP3单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗panCK单克隆抗体；
所述染色剂包括：
Opal 690、Opal 620、Opal 570、Opal 520、Opal 480、Opal 780；
用于多重标记的抗体与染色剂的配对关系如下：
抗OX40单克隆抗体配对Opal 690，抗CD3单克隆抗体配对Opal 620，抗FOXP3单克隆抗体配对Opal 570，抗CD4单克隆抗体配对Opal 520，抗CD8单克隆抗体配对Opal 480，抗panCK单克隆抗体配对Opal 780。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光染料Opal TSA-DIG。
11.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、封闭液中的至少一种。
12.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含核染色剂。
13.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述样本包括癌组织切片。
14.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述样本包含肺癌和/或胰腺癌样本。
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