CN115066611A - 靶抗原的多重免疫荧光检测 - Google Patents

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Abstract

描述了一种生物样本的多光谱免疫荧光成像方法。所述方法允许使用直接标记的抗体荧光团缀合物同时直接检测七种或更多种靶抗原。所述方法使得能够在整个平面生物样本上同时多重检测和分析多种生物标志物，从而在免疫治疗和免疫诊断中提供独特的时空洞察力。

Description

靶抗原的多重免疫荧光检测
技术领域
本发明一般涉及生物样本中多种靶抗原的同时可视化，包括与其相关的方法和试剂。
背景技术
多光谱/高维成像对于生物医学研究和临床医学/病理学的从业者来说越来越重要。在组织样本中使多个特定分子可视化的能力为研究和临床医学应用提供了有力的工具。例如，这种能力允许确定不同细胞类型的空间排列，具有用于健康和疾病管理及治疗的应用。
在医学中，需要检测在组织样本中用作生物分子标志物或“生物标志物”的靶分子，特别是蛋白质，以帮助鉴定患者可能响应的疗法类型。在一个实例中，根据在特定组织中检测到的生物标志物，可以将该组织中出现癌症的患者分组，用于不同的疗法。在病理学中，还可能需要在推荐特定疗法之前对表达特定靶蛋白的细胞的数量进行定量。
目前使用的免疫组织化学技术通常将检测组织样本的任何一个组织切片中的单个靶蛋白。对于许多疾病(例如乳腺癌)，这意味着在推荐可以进行的最佳疗法之前，必须用不同的抗体标记几个组织切片。
目前采用的免疫荧光显微术(IFM)技术可以在样本的单个组织切片中同时检测多于一种分子。然而，目前的技术通常使用未缀合的一抗进行间接标记，随后使用缀合至不同荧光团(FP)的不同的二抗来标记一抗，每种荧光团具有不同的发射光谱。这种二次标记过程允许在同一组织切片中单独检测和定位由各种抗体标记的靶蛋白。
遗憾的是，虽然IFM曾用于生物医学研究和一些临床病理学环境中，但IFM通常仅限于检测两至三种，最多四种不同的颜色；即，检测两至三种不同的抗体标签和核染剂。这种限制是由于传统的荧光显微镜仅具有分离不同荧光团的某些发射光谱的能力。
目前，多光谱成像的使用已经提高了可以在单个组织切片中区分的荧光团的数量。例如，Opal染色平台可以在单个切片中标记多达9种不同的靶抗原。然而，在组织切片的多光谱、多重成像中存在与使用目前的IFM标记方案相关的重大缺点，包括完成方案所需的劳动强度和时长。
目前的多重标记技术是劳动密集型的。例如，Opal染色技术通常需要3-5天来完成多色染色。这些平台也很难迭代，这意味着开发新的多色染色方案经常将需要数月。就Opal而言，开发新的和/或改进的面板(panel)需要对IFM和感兴趣的特定标志物有相当多的了解。
因此，在研究和临床医学中都需要对来自单个组织样本的多种靶分子进行多重免疫荧光检测的新的和改进的方法。
本发明的目的是通过提供一种对来自单个组织样本的多种靶分子进行多重免疫荧光检测的方法，包括其中所用的试剂，至少以某种方式解决现有技术中的上述缺陷，和/或至少为公众提供一种有用的选择。
在本说明书中，引用了专利说明书、其他外部文献或其他信息来源，这通常是为了提供用于讨论本发明特征的上下文。除非另有明确说明，否则对此类外部文献的引用不应解释为承认此类文献或此类信息来源在任何管辖范围内是现有技术，或构成本领域公知常识的一部分。
发明内容
在一方面，本发明涉及一种组合物，其包含至少三种、四种、五种、六种或至少七种抗体-荧光团缀合物(Ab-FP)，其中每种FP具有不同的最大荧光激发和发射波长(Ex)。
在另一方面，本发明涉及一种生物样本的直接免疫荧光分析方法，其包括
a)用至少一种独特的Ab-FP缀合物在生物样本的平面样本中标记至少一种靶抗原，以及
b)使用多光谱扫描仪生成经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中图像包括至少两种颜色，其中至少一种颜色与至少一种独特的Ab-FP缀合物和至少一种靶抗原的特异性结合相关联，以及
c)从图像中确定包括至少一种靶抗原的生物标志物的存在或不存在。
在另一方面，本发明涉及一种平面生物样本的多光谱免疫荧光图像，该图像包括至少三种、优选四种、五种、六种、七种、优选至少八种颜色，其中至少三种、优选四种、五种、六种、优选七种颜色与至少三种、优选四种、五种、六种、优选七种Ab-FP和平面样本中包括的靶抗原的特异性结合相关联。
在另一方面，本发明涉及一种检测生物样本中的多种靶抗原的方法，其包括
a)用至少两种独特的Ab-FP缀合物同时标记生物样本的平面样本中的至少两种靶抗原，其中至少两种靶抗原存在于样本中的细胞上或细胞中，以及
b)使用多光谱扫描仪生成经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中图像包括至少三种颜色，其中至少两种颜色与每种独特的Ab-FP缀合物和靶抗原的特异性结合相关联，以及
c)从图像中确定至少两种靶抗原的存在或不存在，每种靶抗原用不同的独特的Ab-FP标记。
在另一方面，本发明涉及一种检测生物样本中的多种生物标志物的方法，其包括
a)用至少两种独特的Ab-FP缀合物同时标记生物样本的平面样本中的至少两种靶抗原，其中样本中的生物标志物包括每种靶抗原，以及
b)使用多光谱扫描仪生成经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中图像包括至少三种颜色，其中至少两种颜色与每种独特的Ab-FP缀合物和靶抗原的特异性结合相关联，以及
c)从图像中确定多种生物标志物的存在或不存在，每种生物标志物包括用不同的独特的Ab-FP标记的靶抗原。
在另一方面，本发明涉及一种检测生物样本中的多种不同细胞类型的方法，其包括
a)用至少两种独特的Ab-FP缀合物同时标记平面样本中的至少两种靶抗原，其中靶抗原存在于样本中的细胞上或细胞中，以及
b)使用多光谱扫描仪生成经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中图像包括至少三种颜色，其中至少两种颜色与每种独特的Ab-FP缀合物和不同细胞类型上的靶抗原的特异性结合相关联，以及
c)从图像中确定至少两种细胞类型的存在或不存在，每种细胞类型用不同的独特的Ab-FP标记。
在另一方面，本发明涉及一种鉴定生物样本中的多种细胞类型的丰度的方法，其包括：
a)用至少两种、优选三种、四种、五种、六种、优选至少七种独特的抗体-荧光团缀合物(Ab-FP)同时标记平面生物样本，其中每种Ab-FP特异性结合不同细胞上或不同细胞中的靶抗原，以及
b)通过同时分别检测来自每种Ab-FP的每种FP的荧光发射光谱来生成经标记的平面样本的多光谱图像，以及
c)基于检测到的荧光发射光谱，任选地根据合适的参考对照，确定平面样本中的多种不同细胞类型的丰度。
在另一方面，本发明涉及一种确定生物样本中的多种细胞类型的空间分布的方法，其包括
a)用至少两种独特的Ab-FP缀合物同时标记生物样本的平面样本中的至少两种靶抗原，其中至少两种靶抗原中的每一种存在于样本中的不同细胞类型上或不同细胞类型中，
b)使用多光谱扫描仪生成经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中图像包括至少三种颜色，其中至少两种颜色与每种独特的Ab-FP缀合物和靶抗原的特异性结合相关联，
c)基于每种Ab-FP和至少两种靶抗原的结合，从图像中鉴定至少两种不同的细胞类型，以及
d)从图像中确定生物样本中的多种细胞类型的空间分布。
在另一方面，本发明涉及一种从一组患者中鉴定患者亚组的方法，其包括：
a)用至少两种、优选三种、四种、五种、六种、优选七种独特的抗体-荧光团缀合物(Ab-FP)同时标记来自患者的平面生物样本中的至少三种、优选四种、五种、六种、优选七种不同的生物标志物，其中每种Ab-FP特异性结合生物标志物上的靶抗原，
b)通过同时分别检测每种Ab-FP中的每种FP的荧光发射光谱来生成经标记的平面样本部分的多光谱图像，
c)检测b)中生成的图像中每种生物标志物的存在或丰度，其中每种生物标志物在图像中鉴定为与独特的Ab-FP的特异性结合相关联的不同颜色，以及
d)基于与每种生物标志物特异性结合的每种Ab-FP的存在或丰度，从图像中确定患者处于亚组中。
在另一方面，本发明涉及一种制备抗体-荧光团缀合物(Ab-FP)的诊断面板的方法，其包括：
a)鉴定预先确定的疾病或病症的至少三种、优选四种、五种、六种、优选七种生物标志物，
b)获得每种经鉴定的生物标志物的独特的Ab-FP，每种Ab-FP包括特异性结合a)中鉴定的生物标志物中的一种、优选a)中鉴定的每种生物标志物上的靶抗原的抗体，每种Ab-FP具有最大荧光发射波长为约420nm至约850nm的荧光团(FP)，
c)用b)中的Ab-FP同时标记平面生物样本，其中标记包括将每种Ab-FP特异性结合至生物标志物，优选地其中每种Ab-FP分别结合不同的生物标志物，
d)获得每种FP的荧光发射光谱的多光谱图像，
e)在多光谱图像中鉴定每种生物标志物的存在或丰度，其中每种生物标志物在图像中鉴定为与不同Ab-FP和生物标志物上的靶抗原的特异性结合相关联的不同颜色，以及
f)选择独特的Ab-FP缀合物，其可以在e)中的图像中鉴定为一组Ab-FP，用于诊断a)中预先确定的疾病或病症。
在另一方面，本发明涉及一种鉴定用于生物样本的直接免疫荧光分析的替换抗体-荧光团(Ab-FP)缀合物的方法，其包括：
a)根据本文所述的方法，使用第一组至少两种至至少七种独特的Ab-FP缀合物来生成来自单个平面生物样本的第一多光谱免疫荧光图像，该第一多光谱免疫荧光图像包括多达八种不同的颜色，其中多达七种颜色各自与独特的Ab-FP缀合物相关联，
b)从第一组中选择Ab-FP缀合物中的至少一种，用于用替换Ab-FP替换，
c)鉴定用于替换Ab-FP的合适抗体
d)鉴定用于替换Ab-FP的合适荧光团
e)获得替换Ab-FP，
f)用替换Ab-FP替换b)中所选择的Ab-FP，以生成第二组至少两种至至少七种独特的Ab-FP缀合物，
g)根据本文所述的方法，使用第二组Ab-FP缀合物生成第二免疫荧光图像，以及
h)比较第一多光谱免疫荧光图像和第二多光谱免疫荧光图像，
其中当在h)中比较第一图像和第二图像时，区分多光谱图像中每种不同颜色的能力无差异，这证实了替换Ab-FP缀合物的鉴定。
在另一方面，本发明涉及一种用于确定至少一种细胞类型是否响应于候选药物的方法；该方法包括：
a)使用本文所述的多光谱免疫荧光检测方法确定包括至少一种细胞类型的平面生物样本中至少一种细胞类型的丰度或空间分布，以及
b)任选地与合适的对照相比，基于样本中至少一种细胞类型的丰度或空间分布确定至少一种细胞类型是否响应于候选药物。
在一个实施方案中，平面生物样本包括体外培养的细胞。在一个实施方案中，平面生物样本包括生物组织或其一部分。
在另一方面，本发明涉及一种用于预测患者对预先确定的疾病或病症的建议治疗的治疗应答的方法，该方法包括：
a)使用本文所述的多光谱免疫荧光检测方法确定来自患者的平面生物样本中至少一种细胞类型的丰度或空间分布，以及
b)任选地与合适的对照相比，基于样本中至少一种细胞类型的丰度或空间分布确定患者将或将不响应于建议治疗。
在另一方面，本发明涉及一种用于鉴定对候选药物的细胞应答的方法，其包括
a)使含有多种细胞的平面生物样本与候选药物接触，
b)使用本文所述的多光谱免疫荧光检测方法确定样本中至少一种细胞类型的丰度或空间分布，以及
c)任选地与合适的对照相比，从样本中至少一种细胞类型的丰度或空间分布确定存在对候选药物的细胞应答。
在另一方面，本发明涉及一种鉴定将受益于候选疗法的患者的方法，其包括：
a)用至少一种独特的Ab-FP缀合物、优选用1至12种独特的Ab-FP缀合物标记从受试者获得的平面生物样本，
b)使用多光谱扫描仪获得经标记的样本的至少一个数字荧光图像；
c)提取与Ab-FP缀合物相关联的至少一个发射光谱相关联的数据，
d)计算捕获至少一个发射光谱的数据分布的分布函数；
e)从分布函数导出患者的总分数；
f)相对于至少一个参考值评估总分数；基于总分数选择受试者作为指定疗法的候选者，以及
g)任选地用指定疗法治疗受试者。
在另一方面，本发明涉及一种检测生物样本中的多种生物标志物的方法，其包括
a)用至少两种独特的Ab-FP缀合物同时标记生物样本的平面样本中的至少七种靶抗原，其中样本中的生物标志物包括每种靶抗原，以及
b)使用多光谱扫描仪生成经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中图像包括至少八种颜色，其中至少七种颜色与每种独特的Ab-FP缀合物和靶抗原的特异性结合相关联，以及
c)从图像中确定多种生物标志物的存在或不存在，每种生物标志物包括用不同的独特的Ab-FP标记的靶抗原。
上文讨论的本发明的不同方面的各种实施方案也在下文本发明的详细描述中阐述，但本发明不限于此。
本发明的其他方面可以从以下仅作为示例并参照附图给出的描述中变得显而易见。
附图说明
现在将参照附图中的图来描述本发明。
图1－显示CD3表达的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像(灰度)
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的七种颜色(6种Ab-FP+DAPI)中的一种的去混合图像，其仅显示CD3+T细胞的分布。用抗CD3-AF532抗体缀合物标记的CD3+T细胞显示为亮的和/或灰色。
图2－显示CD21表达的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像(灰度)
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的七种颜色(6种Ab-FP+DAPI)中的一种的去混合图像，其仅显示CD21+B细胞和滤泡树突细胞的分布。用抗CD21-BB700抗体缀合物标记的CD21+B细胞和滤泡树突细胞显示为亮的和/或灰色。
图3－显示CD31表达的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像(灰度)
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织中同时检测到的七种颜色(6种Ab-FP+DAPI)中的一种的去混合图像，其仅显示CD31+血液和淋巴内皮细胞的分布。用抗CD31-BV480抗体缀合物标记的CD31+血液和淋巴内皮细胞显示为亮的和/或灰色。
图4－显示CD34表达的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像(灰度)
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的七种颜色(6种Ab-FP+DAPI)中的一种的去混合图像，其仅显示CD34+血液和淋巴内皮细胞的分布。用抗CD34-PE-CF594抗体缀合物标记的CD34+血液和淋巴内皮细胞显示为亮的和/或灰色。
图5－显示CD141表达的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像(灰度)
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的七种颜色(6种Ab-FP+DAPI)中的一种的去混合图像，其仅显示CD141+边缘网状细胞和树突细胞的分布。用抗CD141-BB515抗体缀合物标记的CD141+边缘网状细胞和树突细胞显示为亮的和/或灰色。
图6－显示Ki67表达的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像(灰度)
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的七种颜色(6种Ab-FP+DAPI)中的一种的去混合图像，其仅显示Ki67+细胞的分布。用抗Ki67-AF647抗体缀合物标记的Ki67+细胞显示为亮和/或灰色。
图7－仅显示核染剂DAPI的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像(灰度)
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的七种颜色(6种Ab-FP+DAPI)中的一种的去混合图像，其仅显示核染剂DAPI。
图8－Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的组合图像(灰度)。
图1至7中去混合图像的组合，其显示从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的所有七种颜色(6种Ab-FP+DAPI)。
图9－无DAPI的Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的组合图像(灰度)。
图1至6中去混合图像的组合，其显示从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的七种颜色(6种Ab-FP+DAPI)中的六种。DAPI未示出。
图10－Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的组合图像(颜色)。
图1至7中去混合图像的组合，其显示从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的所有七种颜色(6种Ab-FP+DAPI)。
图11－无DAPI的Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的组合图像(颜色)。
图1至6中去混合图像的组合，其显示从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的七种颜色(6种Ab-FP+DAPI)中的六种。DAPI未示出。
图12－Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织+DAPI的组合图像(灰度)。
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片种同时检测到的七种颜色(6种Ab-FP+DAPI)的组合去混合图像。分别如图1至6所示，图像显示T细胞、B细胞、FDC(滤泡树突细胞)、MRC(边缘网状细胞)、BEC(血液内皮细胞)、LEC(淋巴内皮细胞)和Ki67+细胞的分布。DAPI表示核染剂。
图13－无DAPI的Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的组合图像(灰度)。
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的七种颜色(6种Ab-FP+DAPI)中的六种的组合去混合图像。分别如图1至6所示，图像显示T细胞、B细胞、FDC(滤泡树突细胞)、MRC(边缘网状细胞)、BEC(血液内皮细胞)、LEC(淋巴内皮细胞)和Ki67+细胞的分布。DAPI未示出。
图14－仅显示DAPI的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像(灰度)。
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的八种颜色(7种Ab-FP+DAPI)中的一种的去混合图像，其仅显示核染剂DAPI。
图15－显示CD31表达的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像(灰度)。
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的八种颜色(7种Ab-FP+DAPI)中的一种的去混合图像，其仅显示CD31+血液和淋巴内皮细胞的分布。用抗CD31-BV480抗体缀合物标记的CD31+血液和淋巴内皮细胞显示为亮的和/或灰色。
图16－显示CD141表达的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像(灰度)。
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的八种颜色(7种Ab-FP+DAPI)中的一种的去混合图像，其仅显示CD141+边缘网状细胞和树突细胞的分布。用抗CD141-BB515抗体缀合物标记的CD141+边缘网状细胞和树突细胞显示为亮的和/或灰色。
图17－显示CD3表达的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像(灰度)。
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的八种颜色(7种Ab-FP+DAPI)中的一种的去混合图像，其仅显示CD3+T细胞的分布。用抗CD3-AF532抗体缀合物标记的CD3+T细胞显示为亮的和/或灰色。
图18－显示CD34表达的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像(灰度)。
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的八种颜色(7种Ab-FP+DAPI)中的一种的去混合图像，其仅显示CD34+血液和淋巴内皮细胞的分布。用抗CD34-PE-CF594抗体缀合物标记的CD34+血液和淋巴内皮细胞显示为亮的和/或灰色。
图19－显示Ki67表达的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像(灰度)。
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的八种颜色(7种Ab-FP+DAPI)中的一种的去混合图像，其仅显示Ki67+细胞的分布。用抗Ki67-AF647抗体缀合物标记的Ki67+细胞显示为亮和/或灰色。
图20－显示CD21表达的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像(灰度)。
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的八种颜色(7种Ab-FP+DAPI)中的一种的去混合图像，其仅显示CD21+B细胞和滤泡树突细胞的分布。用抗CD21-BB700抗体缀合物标记的CD21+B细胞和滤泡树突细胞显示为亮的和/或灰色。
图21－显示CD11c表达的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像(灰度)。
从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的八种颜色(7种Ab-FP+DAPI)中的一种的去混合图像，其仅显示CD11c+细胞的分布。用抗CD11c-AF700抗体缀合物标记的CD11c+细胞显示为亮的和/或灰色。
图22－显示8种颜色组合的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的组合图像(灰度)。
图14至21中去混合图像的组合，其显示从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的所有八种颜色(7种Ab-FP+DAPI)。组合去混合图像显示了T细胞、B细胞、FDC(滤泡树突细胞)、MRC(边缘网状细胞)、BEC(血液内皮细胞)、LEC(淋巴内皮细胞)、CD11c+细胞和Ki67+细胞的分布。DAPI表示核染剂。
图23－显示7种颜色组合(DAPI未显示)的Ab-FP+DAPI标记的黑素瘤浸润淋巴结组织的组合图像(灰度)。
图14至21中去混合图像的组合，其显示从Ab-FP标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片中同时检测到的七种颜色(7种Ab-FP+DAPI，其中DAPI未显示)。组合去混合图像显示了T细胞、B细胞、FDC(滤泡树突细胞)、MRC(边缘网状细胞)、BEC(血液内皮细胞)、LEC(淋巴内皮细胞)、CD11c+细胞和Ki67+细胞的分布。
图24－显示CD163表达的黑素瘤浸润淋巴结组织切片的去混合图像。
用抗CD163 APC/Fire 750染色的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像，其显示CD163+细胞分布。用抗CD163-APC/Fire 750抗体缀合物标记的CD163+细胞显示为亮的和/或灰色。
图25－显示CD163表达的黑素瘤浸润淋巴结组织切片的去混合图像。
用抗CD163 APC/Fire 750染色的黑素瘤浸润淋巴结组织的去混合图像，其显示CD163+细胞分布。用抗CD163-APC/Fire 750抗体缀合物标记的CD163+细胞显示为亮的和/或灰色。
图26－显示CD19表达(有或无DAPI)的去混合图像(灰度)：AF647
2种颜色(CD19-AF647+DAPI)染色的FFPE扁桃体组织的去混合图像，其显示CD19+B细胞的分布(通过抗CD19 AF647抗体检测)，有(A)或无(B)DAPI。
用抗CD19-AF647抗体缀合物标记的CD19+B细胞显示为亮的和/或灰色。
图27－显示CD8表达(有或无DAPI)的去混合图像：AF647
2种颜色(CD8-AF647+DAPI)染色的FFPE扁桃体组织的去混合图像，其显示CD8+T细胞的分布(通过抗CD8 AF647抗体检测)，有(A)或无(B)DAPI。
用抗CD8 AF647抗体缀合物标记的CD8+T细胞显示为亮的和/或灰色。
图28－显示CD45RO表达(有或无DAPI)的去混合图像：AF488
2种颜色(CD45RO-AF488+DAPI)染色的FFPE扁桃体组织的去混合图像，其显示CD45RO+活化T细胞和记忆T细胞及一些B细胞的分布(通过抗CD45RO AF488抗体检测)，有(A)或无(B)DAPI。
用抗CD45RO AF488抗体缀合物标记的CD45RO+活化T细胞、记忆T细胞和一些B细胞显示为亮的和/或灰色。
图29－显示CD45RO表达(有或无DAPI)的去混合图像：AF594
2种颜色(CD45-AF594+DAPI)染色的FFPE扁桃体组织的去混合图像，其显示CD45RO+活化T细胞和记忆T细胞及一些B细胞的分布(通过抗CD45RO F594抗体检测)，有(A)或无(B)DAPI。
用抗CD45RO AF488抗体缀合物标记的CD45RO+活化T细胞、记忆T细胞和一些B细胞显示为亮的和/或灰色。
图30－显示CD45RO表达(有或无DAPI)的去混合图像：AF700
2种颜色(CD45-AF700+DAPI)染色的FFPE扁桃体组织的去混合图像，其显示CD45RO+活化T细胞和记忆T细胞及一些B细胞的分布(通过抗CD45RO AF700抗体检测)，有(A)或无(B)DAPI。
用抗CD45RO AF488抗体缀合物标记的CD45RO+活化T细胞、记忆T细胞和一些B细胞显示为亮的和/或灰色。
图31－显示CD45RO表达(有或无DAPI)的去混合图像：BV510
2种颜色(CD45-BV510+DAPI)染色的FFPE扁桃体组织的去混合图像，其显示CD45RO+活化T细胞和记忆T细胞及一些B细胞的分布(通过抗CD45RO BV510抗体检测)，有(A)或无(B)DAPI。
用抗CD45RO AF488抗体缀合物标记的CD45RO+活化T细胞、记忆T细胞和一些B细胞显示为亮的和/或灰色。
图32－显示CD45RO表达(有或无DAPI)的去混合图像：BV650
2种颜色(CD45-BV650+DAPI)染色的FFPE扁桃体组织的去混合图像，其显示CD45RO+活化T细胞和记忆T细胞及一些B细胞的分布(通过抗CD45RO BV650抗体检测)，有(A)或无(B)DAPI。
图33－显示CD45RO表达(有或无DAPI)的去混合图像：PE/Dazzle 594
2种颜色(CD45-PE/Dazzle 594+DAPI)染色的FFPE扁桃体组织的去混合图像，其显示CD45RO+活化T细胞和记忆T细胞及一些B细胞的分布(通过抗CD45RO PE/Dazzle 594抗体检测)，有(A)或无(B)DAPI。
用抗CD45RO AF488抗体缀合物标记的CD45RO+活化T细胞、记忆T细胞和一些B细胞显示为亮的和/或灰色。
图34－显示CD45RO表达(有或无DAPI)的去混合图像：APC/Fire 750
2种颜色(CD45-APC/Fire 750+DAPI)染色的FFPE扁桃体组织的去混合图像，其显示CD45RO+活化T细胞和记忆T细胞及一些B细胞的分布(通过抗CD45RO APC/Fire 750抗体检测)，有(A)或无(B)DAPI。
图35－显示CD19和CD45RO表达的去混合图像
3种颜色(2种Ab+DAPI)染色的FFPE扁桃体组织的组合去混合图像(A)，其显示CD19+B细胞(通过抗CD19-AF647抗体检测(B))，以及CD45RO+活化T细胞和记忆T细胞及一些B细胞(通过抗CD45RO AF488抗体检测(C))和DAPI(D)的分布。
图36－显示CD8和CD45RO表达的去混合图像
3种颜色(2种Ab+DAPI)染色的FFPE扁桃体组织的组合去混合图像(A)，其显示CD8+T细胞(通过抗CD8-AF647抗体检测(B))，以及CD45RO+活化T细胞和记忆T细胞及一些B细胞(通过抗CD45RO AF488抗体检测(C))和DAPI(D)的分布。
图1至36中的所有图像均使用Vectra Polaris多光谱获取。
发明详述
定义
除非另外指明，否则本文所用的所有技术和科学术语应理解为具有与本发明所属相关领域的普通技术人员所理解的相同含义。还认为可以使用本领域已知的标准免疫学、组织学、细胞生物学、分子生物学、药理学和生物化学方案和程序进行本发明的实践。
提供以下定义以更好地限定本发明，并作为本领域普通技术人员在实施本发明时的指导。
本文提及的所有专利和出版物，包括在这些专利和出版物中公开的所有序列均通过引用明确并入。
本文所用的术语“Ab-FP缀合物”(本文也缩写为Ab-FP)及其语法变体是指抗体-荧光团缀合物，其中缀合物中的抗体和荧光团通过至少一个共价键彼此直接连接。在一些实施方案中，Ab-FP缀合物包括具有一个或多个共价结合的FP的单个Ab部分。在一些实施方案中，Ab-FP包括共价结合至单个Ab的多个FP。Ab-FP缀合物中的抗体是直接结合至生物分子上天然存在的靶抗原的一抗。
当参照Ab-FP使用时，术语“独特的抗体-荧光团缀合物”(包括其语法变体和缩写)是指在含有“独特的抗体荧光团缀合物”的任何组合物中，“独特的抗体荧光团缀合物”中包括的抗体和荧光团不同于包含于组合物中或可以与组合物一起使用的任何其他Ab-FP中包括的任何其他抗体或荧光团。包含至少两种独特的Ab-FP的组合物是指两种Ab-FP中的每一种中的抗体和荧光团彼此不同。同样地，包含至少三种独特的Ab-FP的组合物是指三种Ab-FP中的每一种中的抗体和FP彼此不同。
本文所用的术语“最大荧光激发和发射波长(Ex/Em)”及其语法变体是指荧光团的最大激发(Ex)波长(nm)和该荧光团的最大发射(Em)波长。
本文所用的术语“荧光激发和发射光谱”及其语法变体是指给定荧光团的多个激发和发射波长，其与该给定荧光团不同并且使用本文所述的多光谱扫描仪检测。
本文所用的“多光谱扫描仪”及其语法变体是指能够在各种不同波长范围上收集数据的装置，例如在US 6399299或US 9006684中所述的，在此通过引用将其明确并入，包括其中公开的所有专利和出版物。
本文所用的关于Ab-FP的术语“标记的(labelled)”和“标记(labelling)”及其语法变体是指Ab-FP中包括的Ab已经在平面生物样本中在允许免疫荧光检测Ab-FP中包括的FP的条件下原位特异性结合至靶抗原。
术语“抗体”及其语法变体是指具有特定结构的免疫球蛋白分子，其与包括其同源抗原的分子特异性相互作用(结合)。在一些实施方案中，抗原是用于合成抗体的抗原。该抗原称为靶抗原。
短语“每种Ab彼此不同”是指每种Ab特异性结合不同的靶抗原。
如本文所用，术语“抗体”及其语法变体广泛地包括全长抗体，并且还可以包括某些抗原结合部分和/或其片段。还包括单克隆和多克隆抗体、多价和单价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体以及亲和力成熟的抗体及其抗原结合部分和/或片段。
通过本文所述的Ab-FP中的抗体“特异性结合”或“特异性标记”(包括其语法变体)的“靶抗原”是优先结合至靶抗体的抗原，例如与非靶抗体具有小于25％、或小于10％、或小于1％或小于0.1％的交叉反应性。在一些实施方案中，靶抗原是蛋白质抗原。
本文所用的“靶抗原”是指样本中生物分子上的抗原，其直接由本文所述的Ab-FP的抗体部分结合，并且由此特异性标记。本文所用的靶抗原不是可以与二抗结合的一抗。根据本发明并且如本文所述，此类一抗明确排除在靶抗原之外。
通常，靶抗体对抗原或表位的结合亲和力(解离常数(Kd)值)不超过10-6或10-7M，优选小于约10-8M，更优选小于约10-9M、或10-10、或10-11或10-12M。可以使用表面等离子体共振来评估结合亲和力[参见，例如US 7531639或US 6818392，其各自通过引用并入本文]。
本文所用的术语“细胞类型”及其语法变体是指由一种或多种表达的靶抗原的共同存在所定义的一组细胞。本文所用的“细胞类型”可以是表达一种或多种靶抗原的任何大小的细胞组，例如细胞群体、细胞亚群体或更小的组。作为非限制性实例，细胞类型可以是本领域已知的免疫细胞群体，例如T细胞、B细胞或此类细胞的亚群体，例如不变的自然杀伤T细胞(iNKT)。
本文所用的术语“平面样本”和“平面生物样本”及其语法变体是指基本上平面的，即含有细胞或者生物分子复合物、细胞器、亚细胞结构或细胞碎片的任何组合的生物材料的二维样本(也称为“细胞材料”)。平面样本可以通过将含有细胞或细胞材料的三维样本切成切片并将切片安装至平面表面上来获得。平面样本也可以通过在平面表面上生长或沉积细胞或细胞材料，或通过将细胞或细胞材料吸附或吸收至平面表面来获得。在本发明的具体实施方案中，平面生物样本是组织切片。
术语“与Ab-FP的特异性结合相关联”的“颜色”及其语法变体是在荧光图像中表现的颜色，当Ab-FP在平面生物样本中原位特异性结合靶抗原时，该颜色与Ab-FP缀合物中的FP的荧光发射光谱直接相关。
术语“合适的对照图像”及其语法变体是本领域技术人员充分理解的，并且是指已经生成用作本领域技术人员将认识到的可接受的比较对照的图像。在一个非限制性实例中，合适的对照图像可以是未标记的组织切片的图像。在另一实例中，合适的对照图像可以是从监测疾病或病症进展的较早时间点，或从健康个体，或从疾病发作之前或医学治疗之后的个体中获得的组织切片的图像，但不限于此。据信，合适的对照图像的生成可以由技术人员参考相关领域并结合本发明所提供的方法和试剂来进行。
术语“生物标志物”及其语法变体在本文中如技术人员所理解的那样使用，并且包括包含靶抗原的生物分子，以及包括该生物分子的细胞或细胞结构或细胞亚结构。在一些实施方案中，生物分子是蛋白质、碳水化合物、脂质或其组合；例如，糖脂或糖蛋白，但不限于此。在一个实施方案中，生物分子是蛋白质。在一个实施方案中，生物分子是在细胞上或细胞中表达的蛋白质。
当描述性使用时，“生物标志物”是指已知与特定生物过程、特征、对象、状态、状况或功能相关和/或指示特定生物过程、特征、对象、状态、状况或功能的生物分子。在一个非限制性实例中，生物标志物指示细胞类型、细胞功能或细胞过程。在一些实施方案中，生物标志物是功能性标志物，例如在许多不同细胞中出现的细胞过程的标志物。在这种情况下，生物标志物的相对表达可以允许通过使用本文所述的Ab-FP进行生物标志物的充分标记以确定生物标志物的存在和/或丰度来区分不同的细胞类型、细胞结构和/或细胞亚结构。在一个实例中，生物标志物与疾病状态或疾病进展的状态相关联，但不限于此。
如本文所用，关于生物标志物及其语法变体的短语“已知与……相关联”是指生物标志物指示从中测量其的生物体的特征、分子、结构、状态或状况。在一些实例中，生物标志物的存在或不存在可以指示生物特征、分子、结构、状态或状况中的任一个或全部。在其他实例中，生物标志物的绝对或相对丰度可以指示生物特征、分子、结构、状态或状况中的任一个或全部。
术语“确定细胞类型的丰度”及其语法变体是指根据本文所述的方法，确定包括感兴趣的特定生物标志物的细胞的绝对数量。在一些实施方案中，确定丰度是指鉴定样本的多光谱免疫荧光图像中的细胞数量，该样本具有大于样本预先确定的自发荧光背景水平的荧光发射强度。
术语“确定细胞类型的相对丰度”及其语法变体是指再次根据本文所述的方法，从平面样本中存在的细胞类型的总群体中确定包括感兴趣的特定生物标志物的细胞的数量百分比。
“丰度”是指经标记的细胞的总数量。相对丰度是指给定细胞类型的经标记的细胞占该细胞类型总细胞的百分比。
术语“整个组织切片的多光谱成像”及其语法变体是指使用多光谱扫描仪扫描存在于载玻片或其他支撑切片的载体上用于标记和成像的组织样本的整个切片，并且由该扫描产生的图像包括存在于载玻片或载体上的组织切片的整体。
本文所用的术语“患者”可以与“受试者”互换使用，并且含义相同。患者或受试者是动物。优选地，动物是哺乳动物。优选地，哺乳动物包括人和非人哺乳动物，例如猫、狗、马、猪、牛、绵羊、鹿、小鼠、大鼠、灵长类(包括大猩猩、恒河猴和黑猩猩)、负鼠和其他家养农场或动物园动物，但不限于此。优选地，哺乳动物是人。当在本文中用于描述细胞类型、疾病或病症时，术语“预先确定的”及其语法变体是指细胞类型、疾病或病症是已知的，并且可以由技术人员鉴于本发明和本领域来选择。
本文所用的术语“临床相关水平”及其语法变体是指根据本文所述的方法检测到的生物标志物的存在和/或丰度被技术人员认为临床可行。
本文所用的用于描述生物标志物、细胞、细胞类型、细胞结构或亚结构的术语“高丰度”及其语法变体是指样本中生物标志物、细胞、细胞类型、细胞结构或亚结构的丰度或相对丰度被技术人员认为临床可行。
本文所用的术语“临床可行”及其语法变体是指根据本文所述的方法产生的多光谱免疫荧光图像中至少一种生物标志物的存在和/或丰度，其中检测到的生物标志物的存在和/或丰度为临床医生提供了需要治疗干预的清楚且令人信服的证据。
本文所用的术语“独特的颜色”及其语法变体是指特异性对应于从本文所述的Ab-FP中的特定FP发射的荧光能量的光谱的颜色。
本说明书和权利要求中所用的术语“包括(comprising)”是指“至少部分由……组成”；也就是说，当解释包括“包括(comprising)”的本说明书和权利要求中的陈述时，每个陈述中以该术语开头的特征都需要存在，但是也可以存在其他特征。如“包括(comprise、comprised)”等的相关术语以类似的方式解释。
本文所用的术语“基本上由……组成”是指指定材料或步骤，以及不实质影响发明要求保护的基本和新颖特征的那些。
本文所用的术语“由……组成”是指发明要求保护的指定材料或步骤，不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或组成部分。
对本文所公开的数值范围(例如1至10)的引用也意图包括该范围内的所有相关数值(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及该范围内的任何有理数范围(例如2至8、1.5至5.5以及3.1至4.7)，因此，本文明确公开的所有范围的所有子范围均明确公开。这些仅是具体意图的实例，所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合应被视为以类似方式在本申请中明确陈述。
具体实施方式
本文所述的发明技术的基础是发明人可以使用本文所述的多种Ab-FP缀合物在平面生物样本中同时标记多种靶抗原的确定。在一个实例中，经标记的样本是组织切片，然后可以使用多光谱扫描仪和合适的图像分析软件对其成像以生成多光谱图像，其中可以同时确定两种至十二种不同生物标志物的存在和/或丰度。
发明人意外地发现使用本文所述的Ab-FP缀合物可以进行多种生物标志物的特异性和同时标记。以这种方式，可以生成描绘多种颜色的多光谱图像，每种颜色与Ab-FP的特异性结合相关联，并且每种颜色提供了与特定生物标志物相关的具体信息。
根据本文所述的方法同时且快速标记和直接检测这种大量的生物标志物的能力为临床医生提供了强大的研究工具，其在生物标志物检测方面具有明显的、未预料到的和出乎意料的优点。此外，本文所述的方法可以由技术人员用于各种临床应用，包括疾病诊断、患者预后以及需要例如基于一种或多种靶抗原/生物标志物的存在和/或丰度在组织中区分多种细胞类型的其他应用。
生物标志物
本领域技术人员认识到，生物分子标志物或“生物标志物”是描述生物分子(在这种情况下为蛋白质)的领域术语，其存在可以认为指示特定细胞类型和/或特定生物事件或背景(例如疾病、细胞群体或组织)的诊断和/或预后。通过各种手段检测一种或多种“生物标志物”可以用于大量研究和临床目的。
例如，在本发明中，生物标志物可以是任何靶生物分子，优选蛋白质，其中根据本文所述的多光谱免疫荧光检测方法通过本文所述的Ab-FP与生物分子上包括的靶抗原的特异性结合来检测和可视化靶生物分子。靶抗原存在于生物分子上，生物分子本身将存在于细胞中或细胞上。以这种方式，生物标志物可以用于检测细胞、细胞类型、细胞结构或亚结构，但不限于此。在一个实施方案中，生物分子是蛋白质或包括其部分的抗原。
在一个示例性情况中，使用本文所述的Ab-FP缀合物标记CD21蛋白上的靶抗原，其中靶抗原存在于蛋白上，其中该蛋白存在于细胞上并用作成熟B细胞和滤泡树突细胞的几种生物标志物中的一种(但不限于此)。
将用于许多不同研究、诊断和预后目的的多种生物标志物的多光谱免疫荧光检测特别考虑作为本文所述方法的一部分。发明人认为，鉴于本发明，使用本文所述的本发明的方法的技术人员可以如下同时检测多种细胞或细胞类型的存在和丰度。
技术人员可以选择合适的至少三种、优选四种、五种、六种、优选至少七种抗体组，该抗体特异性结合至至少三种、优选四种、五种、六种、优选至少七种靶抗原，每种靶抗原分别包括在预先确定的生物标志物上。然后将所选择的抗体直接缀合至本文所述的FP中的一种，以形成本文所述的Ab-FP缀合物，用于生物标志物的同时多光谱成像。
以这种方式，技术人员可以采用本文所述的方法进行对各种细胞、细胞群体和组织的研究，以及进行许多不同疾病或病症的诊断和/或预后。在一些实施方案中，疾病或病症是免疫性疾病或病症。本文所述的方法还可以在临床上用于通过细胞的免疫群体和亚群体来鉴定患者群体和亚群体，并且用于监测药物和/或候选药物对靶抗原表达的影响，但不限于此。
作为非限制性实例，与临床环境中的鉴定相关的细胞的免疫群体包括包含调节性T细胞的CD4+T细胞、CD8+T细胞(细胞毒性)、B细胞(包括原始的
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活化的、记忆以及浆细胞)、单核细胞、树突细胞、巨噬细胞以及肿瘤细胞。
发明人认为，当与本领域可用的方法相比时，本文提供的方法和试剂的优点很多。
传统的基于显微镜的免疫荧光显微术(IFM)限于检测四种不同的标记，每种标记对应的颜色本身对应于标记中包括的不同荧光团的荧光发射光谱。使用核染剂(例如DAPI或HOECHST 33342)意味着熟练的从业者可以在单一视野内同时可视化多达三种蛋白质和核染剂(例如，通过快速交换滤镜组)。
临床病理学中的IFM通常仅用于生成单色图像，例如用于检测肾脏等器官中的抗体沉积。相反，当需要可视化生物标志物时，临床病理学家通常将使用酶免疫组织化学(IHC)。尽管两种甚至三种颜色的方法可以用于免疫组织化学染色，但绝大多数临床病理学实验室仅使用单一颜色，通常的可视化是基于辣根过氧化物酶标记的二抗的结合。通常手动进行细胞的定量。手动可视化可能是困难的并且容易出现不准确和错误，在许多情况下都依赖于解释，例如在可视化癌细胞时。技术人员必须依赖于细胞的大小和形状来鉴定癌细胞，然后计数多少已鉴定的细胞被标记。已知该过程充满不准确性。
目前采用的多重IFM方法通常允许同时鉴定多达四种蛋白质。传统的多重IFM方法(用福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织)通常以二至四种颜色进行，原因如下：1)不同同种型(如果来自相同的宿主动物)和宿主物种中的一抗的可用性有限，2)可以通过常规IF显微镜滤镜很好分离的荧光团的可用性有限。
目前使用多光谱成像的应用已经增加了可以可视化的颜色数量，以及可以分析的视野。具体地，可以使用多光谱扫描来生成包括多种颜色的多光谱图像，每种颜色对应于不同荧光团的荧光发射光谱。整个样本的不同发射光谱的多光谱可视化可以在单次扫描中完成。
然而，目前用于多光谱成像的组织切片的多重标记的方法存在许多公认的缺点，包括制备用于多重成像的样本所需的时间长、缺乏再现性以及费用高。
例如，某些迭代标记方案可以提供大量不同的颜色(>40种颜色)；例如，CODEX系统(https://www.akoyabio.com/codextm/technology)。CODEX系统是基于IFM的平台，其使用采用寡核苷酸缀合的Ab的迭代标记方案，每个抗体结合循环加入3次，随后重复剥离和重新结合抗体，以产生多重标记的样本。目前仅存在有限数量的寡核苷酸缀合的抗体可用。这些抗体是特化的昂贵的标记抗体，而不是现成的FP缀合的抗体。CODEX可以配备有多光谱扫描仪，但是使用CODEX的多光谱成像限于三种颜色。由于迭代标记过程，现有标记方案的修改以及用于该平台的新方案和标记面板的生产是缓慢的。
在CODEX中，允许这种成像的组织样本的生成不是通过用本文所述的多种Ab-FP同时标记组织切片来完成。相反，该技术需要上文提到的冗长的染色和剥离方案，并且经由寡核苷酸标签采用二次荧光标记。
相比之下，本文所述的方法对于临床医生而言在使等效的染色方案能够在短短2小时内进行并在几天内迭代方面是明显有利的。本文所述的方法中采用的多光谱扫描的速度有利于这些优点。在一些实施方案中，生成样本的多光谱荧光图像在少于10min、少于20min、优选少于30min内完成。
目前可用的多重免疫荧光成像方法的实例包括MACSimaTM(Miltenyi Biotec)和Chip-cytometry Zellscanner one(Zellkraftwerk)。然而，这些技术中的每一种都具有本文所讨论的若干缺点。
MACSima和Zellscanner也需要迭代标记。MACSima系统一次只允许三种抗体。MACSima系统配备有常规荧光显微镜，并且不允许对整个组织切片进行多光谱成像。
Zellscanner系统(http://www.zellkraftwerk.com/products)允许每个循环加入多达5种特异性荧光团缀合的Ab(BUV395、BUV421、FITC、PE、PerCP)并重复标记循环。然而，Zellscanner仅限于使用这5种荧光团，因为仪器是专门为这些荧光团单独设计的。Zellscanner配备有常规荧光显微镜，并且不能进行多光谱扫描。该系统的另一个主要缺点是，待检查的组织切片必须装载到要由仪器检查的特殊芯片上。该要求使得Zellscanner难以用于已经冰冻或石蜡包埋的组织样本。
再一次，由于迭代标记过程，现有标记方案的修改以及用于MACSima和Zellscanner平台的新方案和标记面板的生产是缓慢的。
福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织的Ab-FP标记
使用传统的多重IF方法(即用针对靶标的一抗和结合一抗的荧光团缀合的二抗的间接IF)的FFPE组织的抗体标记主要以二至四种颜色进行，这是由于1)不同同种型(如果来自相同的宿主动物)和宿主物种中的一抗的可用性有限，2)可以通过常规IF显微镜滤镜很好分离的荧光团的可用性有限。
使用传统的多重IFM方法将FFPE组织IF染色成二至四种颜色通常需要一天半至两天。
新的Opal IHC技术允许对FFPE组织进行多达七至九种颜色的多重IF染色(前提是能够进行多光谱成像的显微镜是可用的)。然而，Opal染色需要最少三至四天来完成整个染色循环。此外，开发和优化七色Opal染色面板可能需要六至八周(更多信息请参见该网页：https://www.akoyabio.com/product-support/opal-multiplex-immunohistochemistry#Opal-FAQ)，并且使用者需要对IHC技术有相当多的了解和经验来设计和开发Opal染色面板。此外，Opal平台与冰冻组织切片不兼容。
因此，因为使用Opal多重IHC技术的多重染色是缓慢的，由于大量步骤而在技术上是困难的，并且仅可以与有限数量的染色试剂一起使用，所以该技术没有广泛地用于临床诊断和研究实验室中。
在提供本文所述的方法和试剂时，发明人通过在同时标记和检测生物标志物的方法中使用本文所述的直接缀合的Ab-FP缀合物直接标记靶抗原而克服了上述许多缺点。
本文所述的方法不是夹心测定法，并且不包括用特异性结合靶抗原的一抗初次标记靶抗原，随后用抗体-荧光团缀合物二次标记一抗，然后通过荧光发射检测荧光团。相反，所述方法需要本文所述的Ab-FP，其中Ab-FP的抗体部分是特异性结合靶抗原的一抗，FP部分直接连接至一抗。本领域技术人员理解，遵循本文所述的方法提供了通过本文所述的Ab-FP直接检测靶抗原的优点，而不需要如本领域已知的夹心测定法中采用的二次标记。
本发明提供的主要优点是使用直接缀合至荧光团的抗体(即，直接缀合的抗体)以快速允许整个载玻片/切片的多光谱检测和成像。在一些实施方案中，优点还包括使用多种直接缀合的抗体以快速且同时地允许整个载玻片/切片的多光谱检测和成像。在一个非限制性实例中，这使用Vectra Polaris来完成。
发明人认为，他们首先向技术人员提供快速生成新的诊断测试的能力，该测试在单一图像中可视化所有临床相关的细胞标志物，使得能够定量不同细胞中的相对表达。例如，遵循本文所述的方法，包括至少三种、多达十二种靶抗原的平面生物样本的多重荧光图像可以在少于15分钟内生成。通过这些手段，发明人提供了令人惊讶和有效的技术解决方案，其将在细胞和组织研究以及临床医学中快速开辟新的机会。本文所提供的鉴定细胞和/或细胞群体和/或在几小时内进行这种诊断测试的能力提供了优于现有技术的清楚且独特的优点，并且在许多领域中为技术人员提供了提高研究和诊断病理学应用的效率和准确性的手段。
发明人进一步认为，技术人员容易理解，本文所述的方法和试剂提供了非显而易见的技术方案，其使得能够开发本文所述的生物医学研究和医学中的新应用。本文所述的方法和试剂还使得能够开发可以用于加速为患者选择最佳治疗方案的快速诊断法。例如，在一些实施方案中，技术人员可以通过选择合适的多种生物标志物(例如参考(Hofman，2019)、(Sood，2006)和(Majtahed，2011)，这些公开内容通过引用他们的整体全部明确并入本文)，将本文所公开的方法用于癌症(包括肺癌、乳腺癌和结肠直肠癌)的分子和免疫分析以及疾病管理。
因此，在一方面，本发明涉及一种组合物，其包含至少三种、四种、五种、六种或至少七种抗体-荧光团缀合物(Ab-FP)，其中每种FP具有不同的荧光激发和发射光谱(Ex)。
在一个实施方案中，每种Ab彼此不同。
在一个实施方案中，组合物包含至少八种、九种、十种、十一种或十二种Ab-FP。在一个实施方案中，组合物包含六种、七种或八种Ab-FP。
在一个实施方案中，组合物基本上由至少三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种Ab-FP组成。在一个实施方案中，组合物基本上由至少三种至至少七种Ab-FP组成。在一个实施方案中，组合物基本上由至少六种、七种或八种Ab-FP组成。
在一个实施方案中，组合物基本上由至少六种Ab-FP组成。在一个实施方案中，组合物基本上由至少七种Ab-FP组成。在一个实施方案中，组合物基本上由至少八种Ab-FP组成。
在一个实施方案中，组合物基本上由六种Ab-FP组成。在一个实施方案中，组合物基本上由七种Ab-FP组成。在一个实施方案中，组合物基本上由八种Ab-FP组成。
在一个实施方案中，组合物中的每种Ab-FP是独特的Ab-FP。
在一个实施方案中，每种FP的最大激发和发射波长(Ex/Em)选自由348/395、404/448、405/421、405/510、405/570、405/603、405/646、405/711、407/421、415/500、436/478nm、490/515nm、494/520nm、495/519nm、485/693nm、496/578、532/554nm、566/610nm、590/620nm、650/660nm、650/668nm、652/704、696/719nm、753/785nm、754/787nm、755/775nm和759/775nm组成的组。
在一个实施方案中，FP中的至少一种、两种或三种的最大荧光发射波长(Em)为约710nm至约850nm。在一个实施方案中，FP中的至少一种、两种或三种的Em为约753nm至约759nm，优选753nm、754nm、755nm或759nm。在一个实施方案中，FP中的一种的Em为754nm。
在一个实施方案中，FP选自由Ex/Em为348/395的BrilliantTM Ultraviolet 395(BUV395)、Ex/Em为436/478nm的BrilliantTM Violet 480(BV480)、Ex/Em为405/421的Brilliant Violet 421TM、Ex/Em为407/421的BrilliantTM Violet 421(BV421)、Ex/Em为405/510的BrilliantTM Violet 510(BV510)、Ex/Em为405/570的Brilliant Violet 570TM、Ex/Em为405/603的Brilliant Violet 605TM、Ex/Em为405/646的Brilliant Violet 650TM、Ex/Em为405/711的Brilliant Violet 711TM、Ex/Em为404/448的BD HorizonTM V450、Ex/Em为415/500的BD HorizonTM V500、Ex/Em为490/515nm的BrilliantTM Blue 515(BB515)、Ex/Em为494/520nm的异硫氰酸荧光素(FITC)、Ex/Em为495/519nm的Alexa Fluor 488(AF488)、Ex/Em为532/554nm的Alexa Fluor 532(AF532)、Ex/Em为496/578的R-藻红蛋白(PE)、Ex/Em为590/620nm的Alexa Fluor 594(AF594)、Ex/Em为566/610nm的PE-Dazzle 594(PE594)或PE-CF594(CF594)、Ex/Em为650/668nm的Alexa Fluor 647(AF647)、Ex/Em为650/660nm的别藻蓝蛋白(APC)、Ex/Em为485/693nm的BD HorizonTM 700(BB700)、Ex/Em为696/719nm的Alexa Fluor 700(AF700)、Ex/Em为753/785nm的APC/Alexa Fluor 750、Ex/Em为754/787nm的APC/Fire 750、Ex/Em为652/704的APC-R700、Ex/Em为755/775nm的APC-Cy7以及Ex/Em为759/775nm的AF750组成的组。
在一个实施方案中，荧光团选自由BV480、BB515、AF532、PE-CF594、AF647以及AF700或BB700组成的组。
在一个实施方案中，荧光团选自由BV480、BB515、AF532、PE-CF594、AF647、AF700以及BB700组成的组。
在一个实施方案中，荧光团选自由AF647、AF488、AF594、AF700、BV510、BV650、PE/Dazzle 594以及APC/Fire 750组成的组。
在一个实施方案中，Ab-FP中的Ab选自由抗CD31、CD141、CD144、CD3、CD34、CD163、CD11c、CD14、CD16、CD68Foxp3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD45RO、CD45RA、CD38、PD-1、PDL1、PDL2、CD68、Ki-67、Sox10、S100、PRAME、MART1以及抗CD21抗体组成的组。
在一个实施方案中，Ab-FP中的Ab选自由CD19、CD8和CD45RO组成的组。
在一个实施方案中，Ab-FP中的Ab包括选自由抗雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、her2以及抗细胞角蛋白抗体组成的组的一种或多种Ab。
在一个实施方案中，Ab-FP中的Ab包括一种或多种抗错配修复蛋白抗体或抗突变型错配修复蛋白抗体。
在一个实施方案中，Ab-FP中的Ab包括选自由抗b-raf(V600E突变)、MLH1、MSH2、MSH6以及抗PMS2抗体组成的组的一种或多种抗体。
在一个实施方案中，Ab-FP中的Ab选自由抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki-67、CD11c以及抗CD21抗体组成的组。
在一个实施方案中，组合物包含以下抗体中的至少三种，优选四种、五种或优选所有六种：抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki-67和抗CD21抗体。
在一个实施方案中，组合物包含以下抗体中的三种，优选四种、五种或优选所有六种：抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki-67和抗CD21抗体。
在一个实施方案中，组合物包含以下抗体中的至少一种，优选至少两种：抗CD19、CD8和抗CD45RO抗体。
在一个实施方案中，组合物包含以下抗体中的一种，优选两种：抗CD19，CD8和抗CD45RO抗体。
在一个实施方案中，组合物包含以下Ab-FP中的至少三种，优选四种、五种或优选所有六种：CD31-BV480；CD141-BB515；CD3-AF532；CD34-PE-CF594；Ki67-AF647和CD21-BB700。
在一个实施方案中，组合物包含以下Ab-FP中的三种，优选四种、五种或优选所有六种：CD31-BV480；CD141-BB515；CD3-AF532；CD34-PE-CF594；Ki67-AF647和CD21-BB700。
在一个实施方案中，组合物包含以下抗体中的至少三种，优选四种、五种、六种或优选所有七种：抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki-67、CD11c和抗CD21抗体。
在一个实施方案中，组合物包含以下抗体中的三种，优选四种、五种、六种或优选所有七种：抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki-67、CD11c和抗CD21抗体。
在一个实施方案中，组合物包含以下Ab-FP中的至少三种，优选四种、五种、六种或优选所有七种：CD31-BV480；CD141-BB515；CD3-AF532；CD34-PE-CF594；Ki67-AF647、CD11c-AF700和CD21-BB700。
在一个实施方案中，组合物包含以下Ab-FP中的三种，优选四种、五种、六种或优选所有七种：CD31-BV480；CD141-BB515；CD3-AF532；CD34-PE-CF594；Ki67-AF647、CD11c-AF700和CD21-BB700。
在一个实施方案中，组合物包含以下Ab-FP中的至少一种，优选至少两种：CD19-AF647；CD8-AF647；CD45RO-AF488；CD45RO-AF594；CD45RO-AF700；CD45RO-BV510；CD45RO-BV650；CD45RO-PE/Dazzle 594和CD45RO-APC/Fire 750。
在一个实施方案中，组合物包含以下Ab-FP中的一种，优选两种：CD19-AF647；CD8-AF647；CD45RO-AF488；CD45RO-AF594；CD45RO-AF700；CD45RO-BV510；CD45RO-BV650；CD45RO-PE/Dazzle 594和CD45RO-APC/Fire 750。
在一个实施方案中，每种Ab特异性结合靶抗原。在一个实施方案中，每种Ab特异性结合不同的靶抗原。在一个实施方案中，每种靶抗原是蛋白质或细胞类型的生物标志物。在一个实施方案中，每种靶抗原是不同蛋白质或不同细胞类型的生物标志物。
在一个实施方案中，每种靶抗原是细胞表面受体或细胞内抗原的生物标志物。在一个实施方案中，细胞内抗原是核抗原。
在一个实施方案中，每种靶抗原是T细胞、B细胞、巨噬细胞、单核细胞或树突细胞抗原。
在一个实施方案中，每种靶抗原是选自由CD3、CD4、CD8、FoxP3、CD25、CD137、CD38、CD69、PD-1、CTLA-4、CD45RO、CD45RA以及Ki67抗原组成的组的T细胞抗原。
在一个实施方案中，每种靶抗原是选自由CD19、CD20、CD21、BCL-6、BLIMP1、Ki67以及CD138抗原组成的组的B细胞抗原。
在一个实施方案中，每种靶抗原是选自由CD14、CD16、CD68和CD163抗原组成的组的巨噬细胞或单核细胞抗原。
在一个实施方案中，每种靶抗原是树突细胞抗原，即CD1c或CLEC9a抗原。
在一个实施方案中，靶抗原是与疾病或病症相关联的生物标志物。
在一个实施方案中，生物标志物是疾病或病症的诊断。
在一个实施方案中，生物标志物是疾病或病症的预后。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症，优选乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌或黑素瘤。在一个实施方案中，疾病或病症是免疫性疾病或病症。
在另一方面，本发明涉及一种生物样本的直接免疫荧光分析方法，其包括
a)用至少一种独特的Ab-FP缀合物在平面生物样本中标记至少一种靶抗原，以及
b)使用多光谱扫描仪生成经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中图像包括至少两种颜色，其中至少一种颜色与至少一种独特的Ab-FP缀合物和至少一种靶抗原的特异性结合相关联，以及
c)从图像中确定包括至少一种靶抗原的至少一种生物标志物的存在或不存在。
在一个实施方案中，a)中的标记包括用至少两种、优选至少三种、四种、五种、六种、优选至少七种独特的Ab-FP缀合物同时标记至少两种、优选至少三种、四种、五种、六种、优选至少七种不同的靶抗原。
在一个实施方案中，a)中的标记包括用两种、优选三种、四种、五种、六种、优选七种独特的Ab-FP缀合物同时标记两种、优选三种、四种、五种、六种、优选七种不同的靶抗原。
在一个实施方案中，b)中的一种颜色与核染剂的荧光发射光谱相关联。在一个实施方案中，核染剂是DAPI或Hoechst 33342。
在一个实施方案中，b)中的多光谱图像包括至少三种、优选至少四种、五种、六种、优选七种不同的颜色，其中每种不同的颜色与Ab-FP和靶抗原的特异性结合相关联。
在一个实施方案中，b)中的多光谱图像包括三种、优选至少四种、五种、六种、优选七种不同的颜色，其中每种不同的颜色与Ab-FP和靶抗原的特异性结合相关联。
在一个实施方案中，b)中的生成多光谱图像包括使用多光谱扫描仪分别检测至少两种、优选三种、四种、五种、六种、优选七种不同的荧光光谱，其中每种检测到的光谱对应于与靶抗原特异性结合的Ab-FP。
在一个实施方案中，b)中的生成多光谱图像包括使用多光谱扫描仪分别检测两种、优选三种、四种、五种、六种、优选七种不同的荧光光谱，其中每种检测到的光谱对应于与靶抗原特异性结合的Ab-FP。
在一个实施方案中，平面生物样本是组织切片。在一个实施方案中，组织切片是冰冻或福尔马林固定的组织切片。在一个实施方案中，组织切片是冰冻组织切片。在一个实施方案中，组织切片是福尔马林固定的石蜡包埋组织切片。
在一个实施方案中，组织切片来自哺乳动物，优选人。
在一个实施方案中，组织切片来自肝、肺、乳腺、结肠、扁桃体或淋巴结。在一个实施方案中，组织切片来自具有或疑似具有至少一种癌细胞的组织的活检。在一个实施方案中，组织活检来自肝、肺、乳腺、结肠或淋巴结。在一个实施方案中，组织活检是癌症活检。在一个实施方案中，组织活检是肿瘤活检。
在一个实施方案中，至少一种靶抗原是生物分子的生物标志物。在一个实施方案中，生物分子是或包括蛋白质、碳水化合物或脂质或其抗原性部分。在一个实施方案中，生物分子是蛋白质或其抗原性部分。在一个实施方案中，蛋白质在细胞、细胞结构或细胞亚结构中或细胞、细胞结构或细胞亚结构上表达。
在一个实施方案中，至少一种靶抗原是细胞、细胞类型、细胞结构或细胞亚结构的生物标志物。在一个实施方案中，生物标志物的存在定义了细胞类型。在一个实施方案中，一种或多种生物标志物的存在定义了细胞类型。
在一个实施方案中，生物标志物的丰度定义了细胞类型。在一个实施方案中，一种或多种生物标志物的丰度定义了细胞类型。在一个实施方案中，生物标志物的相对丰度定义了细胞类型。在一个实施方案中，一种或多种生物标志物的相对丰度定义了细胞类型。
在一个实施方案中，生物分子是细胞表面受体或细胞内抗原的生物标志物。在一个实施方案中，细胞内抗原是核抗原。
在一个实施方案中，至少一种靶抗原是T细胞、B细胞、巨噬细胞、单核细胞或树突细胞的生物标志物。
在一个实施方案中，至少一种靶抗原选自由抗雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、her2以及抗细胞角蛋白抗原组成的组。
在一个实施方案中，至少一种靶抗原是错配修复蛋白或突变型错配修复蛋白抗原。
在一个实施方案中，至少一种靶抗原选自由b-raf(V600E突变)、MLH1、MSH2、MSH6以及PMS2抗原组成的组。
在一个实施方案中，Ab-FP中的Ab选自由抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki-67、CD11c以及抗CD21抗体组成的组。
在一个实施方案中，至少一种靶抗原是选自由CD3、CD4、CD8、FoxP3、CD25、CD137、CD38、CD69、PD-1、CTLA-4、CD45RO、CD45RA以及Ki67抗原组成的组的T细胞抗原。
在一个实施方案中，至少一种靶抗原是选自由CD19、CD20、CD21、BCL-6、BLIMP1、Ki-67以及CD138B细胞抗原组成的组的B细胞抗原。
在一个实施方案中，每种靶抗原是选自由CD14、CD16、CD68以及CD163抗原组成的组的巨噬细胞或单核细胞抗原。
在一个实施方案中，至少一种靶抗原是树突细胞抗原CD1c或CLEC9a抗原。
在一个实施方案中，至少一种靶抗原是与疾病或病症相关联的生物标志物。在一个实施方案中，生物标志物是疾病或病症的诊断或部分诊断。在一个实施方案中，生物标志物是疾病或病症的预后或部分预后。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症，优选乳腺癌、肺癌或结肠直肠癌或黑素瘤。
在一个实施方案中，生物标志物区分或部分区分患者群体。
在一个实施方案中，生物标志物区分或部分区分响应于特定疗法的患者和不响应的患者。
在一个实施方案中，生物标志物区分或部分区分更可能响应于特定疗法的患者和不太可能响应的患者。
在一个实施方案中，疗法是免疫疗法。在一个实施方案中，疗法是癌症疗法。
在一个实施方案中，Ab-FP中的Ab选自由抗CD31、CD141、CD3、CD34、CD163、CD11c、CD14、CD16、Foxp3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD38、CD45RO、CD45RA、PD-1、PDL1、PDL2、CD68、CD14、Ki-67、Sox10、S100、PRAME、MART1以及抗CD21抗体组成的组。
在一个实施方案中，Ab-FP中的Ab包括选自由抗雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、her2以及抗细胞角蛋白抗体组成的组的一种或多种抗体。
在一个实施方案中，Ab-FP中的Ab包括一种或多种抗错配修复蛋白或突变型错配修复蛋白抗体。
在一个实施方案中，Ab-FP中的Ab包括选自由抗b-raf(V600E突变)、MLH1、MSH2、MSH6以及抗PMS2抗体组成的组的一种或多种抗体。
在一个实施方案中，Ab-FP中的Ab选自由抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki-67、CD11c以及抗CD21抗体组成的组。
在一个实施方案中，Ab-FP中的Ab选自由CD19、CD8和CD45RO组成的组。
在一个实施方案中，a)中的标记包括用两种至七种独特的Ab-FP、优选用六种独特的Ab-FP、优选用七种独特的Ab-FP同时标记。
在一个实施方案中，a)中的标记进一步包括用至少两种Ab-FP、优选用至少三种、四种、五种或六种另外的独特的Ab-FP同时标记。
在一个实施方案中，a)中的标记包括用以下抗体中的至少两种、优选三种、四种、五种、六种或优选所有七种来标记：抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki67、CD11c和抗CD21抗体。
在一个实施方案中，a)中的标记包括用以下抗体中的两种、优选三种、四种、五种、六种或优选所有七种来标记：抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki67、CD11c和抗CD21抗体。
在一个实施方案中，a)中的标记包括具有以下Ab-FP中的至少两种、优选三种、四种、五种、六种或优选所有七种来标记：CD31-BV480；CD141-BB515；CD3-AF532；CD34-PE-CF594；Ki67-AF647；CD11c-AF700和CD21-BB700。
在一个实施方案中，a)中的标记包括用以下Ab-FP中的两种、优选三种、四种、五种、六种或优选所有七种来标记：CD31-BV480；CD141-BB515；CD3-AF532；CD34-PE-CF594；Ki67-AF647；CD11c-AF700和CD21-BB700。
在一个实施方案中，a)中的标记包括用以下抗体中的至少一种、优选至少两种来标记：抗CD19、CD8和抗CD45RO抗体。
在一个实施方案中，a)中的标记包括用以下抗体中的一种、优选两种来标记：抗CD19、CD8和抗CD45RO抗体。
在一个实施方案中，a)中的标记包括用以下Ab-FP中的至少一种、优选至少两种来标记：CD19-AF647；CD8-AF647；CD45RO-AF488；CD45RO-AF594；CD45RO-AF700；CD45RO-BV510；CD45RO-BV650；CD45RO-PE/Dazzle594和CD45RO-APC/Fire 750。
在一个实施方案中，a)中的标记包括用以下Ab-FP中的一种、优选两种来标记：CD19-AF647；CD8-AF647；CD45RO-AF488；CD45RO-AF594；CD45RO-AF700；CD45RO-BV510；CD45RO-BV650；CD45RO-PE/Dazzle 594和CD45RO-APC/Fire 750。
在一个实施方案中，a)中的标记进一步包括用不同的Ab-FP替换一种Ab-FP。在一个实施方案中，替换Ab-FP包括相同的Ab以及Ex/Em为约753nm至约759nm、优选753nm、754nm、755nm或759nm的FP。
在一个实施方案中，a)中的标记进一步包括用另外的Ab-FP标记另外的靶抗原，该另外的Ab-FP包括Ex/Em为约753nm至约759nm、优选753nm、754nm、755nm或759nm的FP。
在一个实施方案中，另外的Ab-FP包括抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki-67、CD11c或抗CD21 Ab。在一个实施方案中，另外的Ab不包括抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki-67、CD11c或抗CD21 Ab。
在一个实施方案中，c)中的确定是检测至少两种、优选至少三种、四种、五种、六种、优选至少七种不同生物标志物的存在。
在一个实施方案中，c)中的确定是检测两种、优选至少三种、四种、五种、六种、优选至少七种不同生物标志物的存在。
在一个实施方案中，c)中的确定包括确定至少两种、优选至少三种、四种、五种、六种、优选至少七种不同生物标志物的丰度。在一个实施方案中，确定丰度是确定每种不同生物标志物的相对丰度。
在一个实施方案中，c)中的确定包括确定两种、优选至少三种、四种、五种、六种、优选至少七种不同生物标志物的丰度。在一个实施方案中，确定丰度是确定每种不同生物标志物的相对丰度。
在一个实施方案中，在c)中确定的确定丰度包括确定图像中一种或多种经标记的生物标志物的细胞的数量。
在一个实施方案中，确定相对丰度包括在c)中确定图像中预先确定的细胞类型的细胞百分比，其包括图像中可观察到的该细胞类型的细胞总数内的一种或多种经标记的生物标志物。在一个实施方案中，通过一种或多种生物标志物的存在确定该细胞类型的细胞。在一个实施方案中，通过形态学标准确定该细胞类型的细胞。在一个实施方案中，通过一种或多种生物标志物的存在和形态学标准的组合确定该细胞类型的细胞。
在一个实施方案中，b)中的生成图像包括从图像中减去对应于背景自发荧光的荧光发射光谱。
在一个实施方案中，在c)中确定的一种或多种生物标志物在患有预先确定的疾病或病症的个体中是高丰度的。在一个实施方案中，在c)中确定的一种或多种生物标志物在具有预先确定的疾病或病症的个体中是相对高丰度的。
在一个实施方案中，预先确定的疾病或病症是已知的疾病或病症。
在一个实施方案中，预先确定的疾病或病症是目前检测方法可用但临床上不适用的疾病或病症。
在一个实施方案中，预先确定的细胞类型是已知与疾病或病症相关联的细胞类型。
在一个实施方案中，c)中的确定包括检测免疫系统细胞上或细胞中的一种或多种生物标志物。
在一个实施方案中，c)中的确定包括检测一种或多种定义的细胞类型、优选免疫细胞类型的生物标志物。
在一个实施方案中，c)中的确定包括确定一种或多种生物标志物以高丰度或相对高丰度存在于免疫系统的细胞中或细胞上。
在一个实施方案中，免疫系统的细胞选自由T细胞、B细胞、巨噬细胞、单核细胞和树突细胞组成的组。
在一个实施方案中，c)中的确定包括检测至少一种肿瘤细胞上或至少一种肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物。
在一个实施方案中，c)中的确定包括检测临床相关水平的一种或多种生物标志物。
在一个实施方案中，c)中的确定包括确定一种或多种生物标志物以高丰度或相对高丰度存在于来自患有预先确定的疾病或病症的受试者的样本中。在一个实施方案中，预先确定的疾病或病症是免疫性疾病或病症。在一个实施方案中，预先确定的疾病或病症是癌症，优选肺癌、乳腺癌或结肠直肠癌和/或黑素瘤。
在一个实施方案中，一种或多种生物标志物以相对高丰度存在于来自疑似患有预先确定的疾病或病症的个体的样本中。在一个实施方案中，预先确定的疾病或病症是免疫性疾病或病症。
在一个实施方案中，b)中的多光谱图像是通过对来自由多光谱扫描仪捕获的图像中的每个像素的荧光强度数据进行计算机图像分析而生成的。
在一个实施方案中，多光谱扫描仪是Vectra Polaris。
在一个实施方案中，使用InForm细胞分析软件或Halo软件(PerkinElmer)对由多光谱扫描仪生成的数据进行图像分析，以生成b)中的图像。
在一个实施方案中，b)中生成的图像包括至少两种独特的颜色，优选至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种，优选十二种独特的颜色，其中每种颜色与不同的FP荧光发射光谱相关联。
在一个实施方案中，b)中生成的图像包括两种独特的颜色，优选三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种，优选地十二种独特的颜色，其中每种颜色与不同的FP荧光发射光谱相关联。
在一个实施方案中，b)中生成的图像包括至少四种，优选地至少五种、六种、七种或八种独特的颜色，其中每种颜色与不同的FP荧光发射光谱相关联。
在一个实施方案中，b)中生成的图像包括四种，优选地五种、六种、七种或八种独特的颜色，其中每种颜色与不同的FP荧光发射光谱相关联。
在一个实施方案中，b)中生成的图像包括至少六种、七种或八种独特的颜色，其中每种颜色与不同的FP荧光发射光谱相关联。
在一个实施方案中，b)中生成的图像包括六种、七种或八种独特的颜色，其中每种颜色与不同的FP荧光发射光谱相关联。
在一个实施方案中，b)中生成的图像包括六种独特的颜色，其中每种颜色与不同的FP荧光发射光谱相关联。
在一个实施方案中，b)中生成的图像包括七种独特的颜色，其中每种颜色与不同的FP荧光发射光谱相关联。
在一个实施方案中，b)中生成的图像包括八种独特的颜色，其中每种颜色与不同的FP荧光发射光谱相关联。
在一个实施方案中，至少一种、两种或三种独特的颜色具体对应的FP发射光谱为约710nm和约850nm。在一个实施方案中，至少一种独特的颜色具体对应的FP最大发射波长为约753nm至约759nm，优选753nm、754nm、755nm或759nm。
在一个实施方案中，一种、两种或三种独特的颜色具体对应的FP发射光谱为约710nm和约850nm。在一个实施方案中，一种独特的颜色具体对应的FP最大发射波长为约753nm至约759nm，优选753nm、754nm、755nm或759nm。
在另一方面，本发明涉及一种平面生物样本的多光谱免疫荧光图像，该图像包括至少三种、优选四种、五种、六种、七种、优选至少八种颜色，其中至少三种、优选四种、五种、六种、优选七种颜色与至少三种、优选四种、五种、六种、优选七种Ab-FP和平面样本中包括的靶抗原的特异性结合相关联。
在一个实施方案中，平面生物样本的多光谱免疫荧光图像包括三种、优选四种、五种、六种、七种、优选八种颜色，其中三种、优选四种、五种、六种、优选七种颜色与三种优选四种、五种、六种、优选七种Ab-FP和平面样本中包括的靶抗原的特异性结合相关联。
在一个实施方案中，根据本文所述的方法生成多光谱图像。
在一个实施方案中，根据本文所述的方法，多光谱图像是通过对来自由多光谱扫描仪捕获的图像中的每个像素中的荧光强度数据进行计算机图像分析而生成的。
在一个实施方案中，多光谱扫描仪是Vectra Polaris。
在一个实施方案中，平面生物样本是组织切片。在一个实施方案中，组织切片是冰冻或福尔马林固定的组织切片。在一个实施方案中，组织切片是冰冻组织切片。在一个实施方案中，组织切片是福尔马林固定的石蜡包埋组织切片。
作为涉及多光谱免疫荧光图像的本发明该方面的实施方案，具体考虑的是本文中本发明的先前方面中阐述的所有实施方案，特别是并且不限于涉及抗体、荧光团、Ab-FP、靶抗原、生物标志物、组织、细胞、细胞类型、细胞结构和亚结构、标记以及多光谱成像的实施方案，但不限于此。
在另一方面，本发明涉及一种检测生物样本中的多种靶抗原的方法，其包括
a)用至少两种独特的Ab-FP缀合物同时标记生物样本的平面样本中的至少两种靶抗原，其中至少两种靶抗原存在于样本中的细胞上或细胞中，以及
b)使用多光谱扫描仪生成经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中图像包括至少三种颜色，其中至少两种颜色与每种独特的Ab-FP缀合物和靶抗原的特异性结合相关联，以及
c)从图像中确定至少两种靶抗原的存在或不存在，每种靶抗原用不同的独特的Ab-FP标记。
在一个实施方案中，靶抗原彼此不同。
在一个实施方案中，至少两种靶抗原存在于样本中的不同细胞类型上或不同细胞类型中。
在一个实施方案中，b)中的一种颜色与核染剂的荧光发射光谱相关联。在一个实施方案中，核染剂是DAPI或Hoechst 33342。
在一个实施方案中，a)中的标记包括用至少两种、优选至少三种、四种、五种、六种、优选至少七种独特的Ab-FP缀合物同时标记至少两种、优选至少三种、四种、五种、六种、优选至少七种不同的靶抗原。
在一个实施方案中，a)中的标记包括用两种、优选三种、四种、五种、六种、优选七种独特的Ab-FP缀合物同时标记两种、优选三种、四种、五种、六种、优选七种不同的靶抗原。
在一个实施方案中，b)中的多光谱图像包括至少三种、优选至少四种、五种、六种、七种、优选八种不同的颜色，其中至少两种、优选三种、四种、五种、六种、优选七种不同的颜色与Ab-FP和靶抗原的特异性结合相关联。
在一个实施方案中，b)中的多光谱图像包括三种、优选四种、五种、六种、七种、优选八种不同的颜色，其中两种、优选三种、四种、五种、六种、优选七种不同的颜色与Ab-FP和靶抗原的特异性结合相关联。
在一个实施方案中，b)中的生成多光谱图像包括使用多光谱扫描仪分别检测至少两种、优选三种、四种、五种、六种、优选七种不同的荧光光谱，每种检测到的光谱对应于与靶抗原特异性结合的Ab-FP。
在一个实施方案中，b)中的生成多光谱图像包括使用多光谱扫描仪分别检测两种、优选三种、四种、五种、六种、优选七种不同的荧光光谱，每种检测到的光谱对应于与靶抗原特异性结合的Ab-FP。
在一个实施方案中，a)中的标记包括用至少三种Ab-FP、优选用至少四种、五种、六种、七种、八种、九种、十一种、十一种或优选至少十二种独特的Ab-FP同时标记。
在一个实施方案中，a)中的标记包括用三种Ab-FP、优选用四种、五种、六种、七种、八种、九种、十一种、十一种或优选至少十二种独特的Ab-FP同时标记。
在一个实施方案中，a)中的标记包括用三种至七种独特的Ab-FP、优选六种独特的Ab-FP、优选七种独特的Ab-FP同时标记。在一个实施方案中，平面生物样本是组织切片。在一个实施方案中，组织切片是冰冻或福尔马林固定的组织切片。在一个实施方案中，组织切片是冰冻组织切片。在一个实施方案中，组织切片是福尔马林固定的石蜡包埋组织切片。
作为检测多种靶抗原的方法的本发明该方面的实施方案，本文具体考虑的是本文阐述的涉及本文阐述的本发明的先前方面的所有实施方案，包括但不限于抗体、荧光团、Ab-FP、靶抗原、生物标志物、组织、细胞类型、标记、多光谱成像以及多光谱图像分析。
在另一方面，本发明涉及一种检测生物样本中的多种生物标志物的方法，其包括
a)用至少两种独特的Ab-FP缀合物同时标记生物样本的平面样本中的至少两种靶抗原，其中样本中的生物标志物包括每种靶抗原，以及
b)使用多光谱扫描仪生成经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中图像包括至少三种颜色，其中至少两种颜色与每种独特的Ab-FP缀合物和靶抗原的特异性结合相关联，以及
c)从图像中确定多种生物标志物的存在或不存在，每种生物标志物包括用不同的独特的Ab-FP标记的靶抗原。
在一个实施方案中，c)中的确定包括基于用独特的Ab-FP标记细胞类型来确定细胞类型的存在或丰度。
作为检测多种生物标志物的方法的本发明该方面的实施方案，本文具体考虑的是本文阐述的涉及本文阐述的本发明的先前方面的所有实施方案，包括但不限于抗体、荧光团、Ab-FP、靶抗原、生物标志物、组织、细胞类型，以及检测多种靶抗原的方法，包括标记、多光谱成像和多光谱图像分析，但不限于此。
在另一方面，本发明涉及一种检测生物样本中的多种不同细胞类型的方法，其包括
a)用至少两种独特的Ab-FP缀合物同时标记平面样本中的至少两种靶抗原，其中靶抗原存在于样本中的细胞上或细胞中，以及
b)使用多光谱扫描仪生成经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中图像包括至少三种颜色，其中至少两种颜色与每种独特的Ab-FP缀合物和不同细胞类型上的靶抗原的特异性结合相关联，以及
c)从图像中确定至少两种细胞类型的存在或不存在，每种细胞类型用不同的独特的Ab-FP标记。
在一个实施方案中，细胞类型通过至少一种、优选两种、三种、四种、五种、六种或至少七种不同生物标志物的存在来定义。
在一个实施方案中，细胞类型通过一种、优选两种、三种、四种、五种、六种或至少七种不同生物标志物的存在来定义。
作为检测生物样本中多种不同细胞类型的方法的本发明该方面的实施方案，本文具体考虑的是本文阐述的涉及本发明的先前方面的所有实施方案，包括但不限于抗体、荧光团、Ab-FP、靶抗原、生物标志物、组织、细胞类型，以及检测靶抗原、生物标志物和细胞类型的方法，包括标记、多光谱成像和多光谱图像分析，但不限于此。
在另一方面，本发明涉及一种鉴定生物样本中的多种细胞类型的丰度的方法，其包括：
a)用至少两种、优选三种、四种、五种、六种、优选至少七种独特的抗体-荧光团缀合物(Ab-FP)同时标记平面生物样本，其中每种Ab-FP特异性结合不同细胞上或不同细胞中的靶抗原，以及
b)通过同时分别检测来自每种Ab-FP的每种FP的荧光发射光谱来生成经标记的平面样本的多光谱图像，以及
c)基于检测到的荧光发射光谱，任选地根据合适的参考对照，确定样本中多种不同细胞类型的丰度。
在一个实施方案中，c)中的确定包括从b)中生成的图像中减去对应于背景自发荧光的荧光发射光谱。
在一个实施方案中，丰度是相对丰度。
在一个实施方案中，相对丰度是确定为一种细胞类型的总细胞群体中的细胞百分比。
在一个实施方案中，使用多光谱扫描仪、优选Vectra Polaris来完成同时检测。
作为鉴定生物样本中的多种不同细胞类型的丰度的方法的本发明该方面的实施方案，本文具体考虑的是本文阐述的涉及本文阐述的本发明的先前方面的所有实施方案，包括但不限于抗体、荧光团、Ab-FP、靶抗原、生物标志物、组织、细胞类型，以及检测多种靶抗原、生物标志物和细胞类型的方法，包括标记、多光谱成像和多光谱图像分析，但不限于此。
在另一方面，本发明涉及一种确定生物样本中的多种细胞类型的空间分布的方法，其包括
a)用至少两种独特的Ab-FP缀合物同时标记生物样本的平面样本中的至少两种靶抗原，其中至少两种靶抗原中的每一种存在于样本中的不同细胞类型上或不同细胞类型中，
b)使用多光谱扫描仪生成经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中图像包括至少三种颜色，其中至少两种颜色与每种独特的Ab-FP缀合物和靶抗原的特异性结合相关联，
c)基于每种Ab-FP和至少两种靶抗原的结合，从图像中鉴定至少两种不同的细胞类型，以及
d)从图像中确定生物样本中的多种细胞类型的空间分布。
在一个实施方案中，d)中的确定包括确定b)中生成的图像中的至少一种经标记的细胞类型在图像中的一种或多种不同经标记的细胞类型的n个细胞内的可能性，其中n＝选自一至十的整数。
作为确定生物样本中多种细胞类型的空间分布的方法的本发明该方面的实施方案，本文具体考虑的是本文阐述的涉及本文阐述的本发明的先前方面的所有实施方案，包括但不限于抗体、荧光团、Ab-FP、靶抗原、生物标志物、组织、细胞类型，以及检测多种靶抗原、生物标志物和细胞类型的方法，包括标记、多光谱成像和多光谱图像分析，但不限于此。
在另一方面，本发明涉及一种从一组患者中鉴定患者亚组的方法，其包括：
a)用至少两种、优选三种、四种、五种、六种、优选七种独特的抗体-荧光团缀合物(Ab-FP)同时标记来自患者的平面生物样本中的至少三种、优选四种、五种、六种、优选七种不同的生物标志物，其中每种Ab-FP特异性结合生物标志物上的靶抗原，
b)通过同时分别检测每种Ab-FP中的每种FP的荧光发射光谱来生成经标记的平面样本部分的多光谱图像，
c)检测b)中生成的图像中每种生物标志物的存在或丰度，其中每种生物标志物在图像中鉴定为与独特的Ab-FP的特异性结合相关联的不同颜色，以及
d)基于与每种生物标志物特异性结合的每种Ab-FP的存在或丰度，从图像中确定患者处于亚组中。
在一个实施方案中，每种生物标志物存在于样本中的不同细胞类型上。
在一个实施方案中，患者亚组是具有共同细胞表型的患者组。
在一个实施方案中，患者亚组通过一种或多种靶抗原、生物标志物和/或细胞类型的存在来定义。
作为从一组患者中鉴定患者亚组的方法的本发明该方面的实施方案，本文具体考虑的是本文阐述的涉及本文阐述的本发明的先前方面的所有实施方案，包括但不限于抗体、荧光团、Ab-FP、靶抗原、生物标志物、组织、细胞类型，以及检测多种靶抗原、生物标志物和细胞类型的方法，包括标记、多光谱成像和多光谱图像分析，但不限于此。
在另一方面，本发明涉及一种制备抗体-荧光团缀合物(Ab-FP)的诊断面板的方法，其包括：
a)鉴定预先确定的疾病或病症的至少三种、优选四种、五种、六种、优选七种生物标志物，
b)获得每种经鉴定的生物标志物的独特的Ab-FP，每种Ab-FP包括特异性结合a)中鉴定的生物标志物中的一种、优选a)中鉴定的每种生物标志物上的靶抗原的抗体，每种Ab-FP具有最大荧光发射波长为约420nm至约850nm的荧光团(FP)，
c)用b)中的Ab-FP同时标记平面生物样本，其中标记包括将每种Ab-FP特异性结合至生物标志物，优选地其中每种Ab-FP分别结合不同的生物标志物，
d)获得每种FP的荧光发射光谱的多光谱图像，
e)在多光谱图像中鉴定每种生物标志物的存在或丰度，其中每种生物标志物在图像中鉴定为与不同Ab-FP和生物标志物上的靶抗原的特异性结合相关联的不同颜色，以及
f)选择独特的Ab-FP缀合物，其可以在e)中的图像中鉴定为一组Ab-FP，用于诊断a)中预先确定的疾病或病症。
作为制备抗体-荧光团缀合物的诊断面板的方法的本发明该方面的实施方案，本文具体考虑的是本文阐述的涉及本文阐述的本发明的先前方面的所有实施方案，包括但不限于抗体、荧光团、Ab-FP、靶抗原、生物标志物、组织、细胞类型，以及检测多种靶抗原、生物标志物和细胞类型的方法，包括标记、多光谱成像和多光谱图像分析，但不限于此。
在另一方面，本发明涉及一种鉴定用于生物样本的直接免疫荧光分析的替换抗体-荧光团(Ab-FP)缀合物的方法，其包括：
a)根据本文所述的方法，使用第一组至少两种至至少七种独特的Ab-FP缀合物来生成来自单个平面生物样本的第一多光谱免疫荧光图像，该第一多光谱免疫荧光图像包括多达八种不同的颜色，其中多达七种颜色各自与独特的Ab-FP缀合物相关联，
b)从第一组中选择Ab-FP缀合物中至少一种，用于用替换Ab-FP替换，
c)鉴定用于替换Ab-FP的合适抗体
d)鉴定用于替换Ab-FP的合适荧光团
e)获得替换Ab-FP，
f)用替换Ab-FP替换b)中所选择的Ab-FP，以生成第二组至少两种至至少七种独特的Ab-FP缀合物，
g)根据本文所述的方法，使用第二组Ab-FP缀合物生成第二免疫荧光图像，以及
h)比较第一多光谱免疫荧光图像和第二多光谱免疫荧光图像，
其中当在h)中比较第一图像和第二图像时，区分多光谱图像中每种不同颜色的能力无差异，这证实了替换Ab-FP缀合物的鉴定。
作为鉴定替换抗体-荧光团(Ab-FP)缀合物用于生物样本的直接免疫荧光分析的方法的本发明该方面的实施方案，本文具体考虑的是本文阐述的涉及本文阐述的本发明的先前方面的所有实施方案，包括但不限于抗体、荧光团、Ab-FP、靶抗原、生物标志物、组织、细胞类型，以及检测多种靶抗原、生物标志物和细胞类型的方法，包括标记、多光谱成像和多光谱图像分析，但不限于此。
在另一方面，本发明涉及一种用于确定至少一种细胞类型是否响应于候选药物的方法；该方法包括：
a)使用本文所述的多光谱免疫荧光检测方法确定包括至少一种细胞类型的平面生物样本中至少一种细胞类型的丰度或空间分布，以及
b)任选地与合适的对照相比，基于样本中至少一种细胞类型的丰度或空间分布确定至少一种细胞类型是否响应于候选药物。
在一个实施方案中，平面生物样本包括体外培养的细胞。在一个实施方案中，平面生物样本包括生物组织或其一部分。
作为用于确定是否至少一种细胞类型是否响应于候选药物的方法的本发明该方面的实施方案，本文具体考虑的是本文阐述的涉及本文阐述的本发明的先前方面的所有实施方案，包括但不限于抗体、荧光团、Ab-FP、靶抗原、生物标志物、组织、细胞类型，以及检测多种靶抗原、生物标志物和细胞类型的方法，包括标记、多光谱成像和多光谱图像分析，但不限于此。
在另一方面，本发明涉及一种用于预测患者对预先确定的疾病或病症的建议治疗的治疗应答的方法，该方法包括：
a)使用本文所述的多光谱免疫荧光检测方法确定来自患者的平面生物样本中至少一种细胞类型的丰度或空间分布，以及
b)任选地与合适的对照相比，基于样本中至少一种细胞类型的丰度或空间分布确定患者将或将不响应于建议治疗。
作为用于预测患者的治疗应答的本发明该方面的实施方案，本文具体考虑的是本文阐述的涉及本文阐述的本发明的先前方面的所有实施方案，包括但不限于抗体、荧光团、Ab-FP、靶抗原、生物标志物、组织、细胞类型，以及检测多种靶抗原、生物标志物和细胞类型的方法，包括标记、多光谱成像和多光谱图像分析，但不限于此。
在另一方面，本发明涉及一种鉴定对候选药物的细胞应答的方法，其包括
a)使含有多种细胞的平面生物样本与候选药物接触，
b)使用本文所述的多光谱免疫荧光检测方法确定样本中至少一种细胞类型的丰度或空间分布，以及
c)任选地与合适的对照相比，从样本中至少一种细胞类型的丰度或空间分布确定存在对候选药物的细胞应答。
作为鉴定对候选药物的细胞应答的方法的本发明该方面的实施方案，本文具体考虑的是本文阐述的涉及本文阐述的本发明的先前方面的所有实施方案，包括但不限于抗体、荧光团、Ab-FP、靶抗原、生物标志物、组织、细胞类型，以及检测多种靶抗原、生物标志物和细胞类型的方法，包括标记、多光谱成像和多光谱图像分析，但不限于此。
在另一方面，本发明涉及一种鉴定将受益于候选疗法的患者的方法，其包括：
a)用至少一种独特的Ab-FP缀合物、优选用1至12种独特的Ab-FP缀合物标记从受试者获得的平面生物样本，
b)使用多光谱扫描仪获得经标记的样本的至少一个数字荧光图像；
c)提取与Ab-FP缀合物相关联的至少一个发射光谱相关联的数据，
d)计算捕获至少一个发射光谱的数据分布的分布函数；
e)从分布函数导出患者的总分数；
f)相对于至少一个参考值评估总分数；基于总分数选择受试者作为指定疗法的候选者，以及
g)任选地用指定疗法治疗受试者。
作为鉴定将受益于候选疗法的患者的方法的本发明该方面的实施方案，本文具体考虑的是本文阐述的涉及本文阐述的本发明的先前方面的所有实施方案，包括但不限于抗体、荧光团、Ab-FP、靶抗原、生物标志物、组织、细胞类型，以及检测多种靶抗原、生物标志物和细胞类型的方法，包括标记、多光谱成像和多光谱图像分析，但不限于此。
在本说明书中，引用了专利说明书、其他外部文献或其他信息来源，这通常是为了提供用于讨论本发明特征的上下文。除非另有明确说明，否则对此类外部文献的引用不应解释为承认此类文献；或此类信息来源在任何管辖范围内是现有技术，或构成本领域公知常识的一部分。
现在将参考以下实施例以非限制性方式说明本发明。
实施例
材料和方法
试剂
下文列出的荧光团缀合的抗体购自Biolegend和BD Biosciences(USA)：
CD31 BV480
CD141 BB515
CD3 AF532
CD34 PE-CF594
Ki67-AF647
CD21 BB700
以下实施例中使用的标准材料：
TissueTek OCT冰冻切片包埋剂(TissueTek OCT compound)
低温模具
异戊烷
液氮
带正电的载玻片(用于组织切片)
冰冷的丙酮
DAKO PAP笔
1X TBS
恒湿箱
封闭剂：在1X TBS中制备的10％人血清
抗体稀释缓冲液：在1X TBS中制备的10％人血清
DAPI(以1∶2000最终稀释度使用)
ProlongGold封固剂
盖玻片
组织样本
黑素瘤浸润淋巴结由我们的临床合作者从奥克兰市医院提供。
切片方案
(1)在无RNA酶的条件下，将组织切成合适大小的块。如果覆盖在血液或其他液体中，则在无菌纱布上吸干组织。
(2)将少量OCT冰冻切片包埋剂(OCT compound)放入低温模具的凹槽中。不要过度填充。将组织居中放在低温模具的底部。如果组织太大而不能装入低温模具中，则使用铝箔模具。
(3)用Tissue-Tek OCT冰冻切片包埋剂(Tissue-Tek OCT Compound)缓慢填充模具，避免气泡形成，直到OCT覆盖组织。
(4)将约60 ml的异戊烷倒入小塑料烧杯中。这应该足以覆盖组织块至少两次。
(5)将填充有异戊烷的塑料烧杯降低到含有液氮的烧瓶中。烧杯底部三分之一应位于液氮表面下方。用涂抹棒偶尔搅拌异戊烷(每30秒搅拌5秒)。约4 min后，在烧杯底部开始形成小的白色晶体。异戊烷冷却到足以使用。如果液氮不可用，则可以将烧杯放在干冰上，但异戊烷将需要更长的时间来冷却。
(6)用镊子将填充有组织/OCT的模具降低到异戊烷中，并且保持在那里直到OCT完全冰冻(约7-10秒)。取出模具，并放入预冷的储存瓶中。
(7)将组织模具储存在-80℃下直到切片。
(8)使用低温恒温器(Leica)切成5μm厚的OCT包埋的组织
标记方案
(1)从-80℃冰箱中取出带有冰冻切片的载玻片，将载玻片温热至室温并干燥
(2)用DAKO PAP笔描画载玻片
(3)在室温下用冰冷的丙酮固定组织切片5min。丙酮应该会挥发，载玻片干燥。
(4)用TBS简单洗涤载玻片
(5)将组织切片与封闭剂一起在室温下于暗处的恒湿箱中温育10min
(6)拂去封闭剂
(7)将在抗体稀释缓冲液中制备的荧光团缀合的抗体同时加入到组织切片中，并且在室温下于暗处的恒湿箱中温育1小时(避光)。
(8)用TBS简单洗涤1次，随后在摇床上用TBS洗涤3次，每次5min
(9)将DAPI(1∶2000)加入到组织切片中，并且在室温下于暗处的恒湿箱中温育5min(避光)。
(10)洗涤3次，每次2min后，在摇床上用TBS洗涤，使用ProlongGold封固带有盖玻片的载玻片。
(11)使用Vectra Polaris继续成像。
扫描方案(来自Vectra Polaris使用手册1.0.7)
(1)打开Vectra Polaris仪器和计算机
(2)启动Vectra Polaris软件
(3)将载玻片装入载物台
(4)将载物台装入载物台放置室(slide carrier hotel)进行显微镜载玻片扫描
(5)在“编辑方案”页面(Vectra Polaris软件)中，创建成像方案。选择荧光模式和空间分辨率(通常为x20放大倍数，也可用x10或x20)用于整个载玻片扫描(WSS)和感兴趣区域(ROI)的多光谱成像(MSI)。还设置WSS和MSI的曝光时间以及用于聚焦和成像的滤镜。
(6)在“扫描载玻片”页面(Vectra Polaris软件)中，定位待扫描的载玻片，并且使用(5)中创建的WSS方案进行整个载玻片扫描(WSS)
(7)启动Phenochart程序(PerkinElmer)，以查看WSS图像，并且选择ROI进行多光谱成像(MSI)。
(8)在“扫描载玻片”页面(Vectra Polaris软件)中，定位含有将以多光谱方式成像的选定ROI的载玻片。使用(5)中创建的MSI方案进行选定ROI的多光谱成像(MSI)
(9)在对选定ROI成像之后，在InForm软件(PerkinElmer)中使用从每种Ab-FP的单染色组织的图像构建的光谱库，去混合获取的MSI图像。在InForm软件中处理和分析去混合的图像
实施例1：
以下方案用于使用本文所述的Ab-FP来特异性检测肿瘤组织的冰冻切片中的六种不同靶抗原。
遵循本文所述的本发明方法，生成七种颜色的多重免疫荧光图像(6种Ab+DAPI)。
因此，遵循本文所述的方法允许快速且特异性多重检测多种靶抗原，而不需要二抗温育步骤。
在该方案中同时加入六种抗体，而在七种颜色的opal方案(FFPE)中一次加入一种一抗。因此，本发明方法的该实施例说明了所提供的显著优点，即极大地减少了特异性检测和鉴定多种靶抗原所需的总时间。
本发明方法的该实施例采用冰冻组织，因此不需要脱蜡和抗原修复。
材料
冰冻组织载玻片
冰冷的丙酮
DAKO PAP笔
1X TBS
恒湿箱
封闭剂：在1X TBS中制备的10％人血清
稀释缓冲液：在1X TBS中制备的10％人血清
荧光团缀合的抗体
-CD31 BV480
-CD141 BB515
-CD3 AF532
-CD34 PE-CF594
-Ki67 AF647
-CD21 BB700
DAPI(以1∶2000最终稀释度使用)
ProlongGold封固剂
盖玻片
方法
1.选择载玻片：
从-80℃冰箱中取出带有冰冻切片的载玻片。
使载玻片温热至室温并干燥
2.用DAKO PAP笔描画载玻片
3.在室温下用冰冷的丙酮固定5min。丙酮应该会挥发，载玻片干燥。
4.用1x TBS简单洗涤
5.用10％人AB血清封闭剂在室温下于恒湿箱中封闭10min
6.在稀释缓冲液(含10％人血清)中制备Ab混合物。
7.在槽上拂去封闭剂。
8.将切片与Ab混合物一起在室温下于暗处的恒湿箱中同时温育1小时
9.拂去Ab混合物
10.用TBS简单洗涤1次，随后在摇床上用TBS洗涤3次，每次5min
11.加入DAPI(终浓度为1∶2000)，并且在室温下于暗处的恒湿箱中温育5min。
12.洗涤3次，每次2min后，在摇床上用TBS洗涤，用于ProlongGold封固载玻片。
13.使用Vectra Polaris对载玻片成像
结果
将黑素瘤浸润淋巴结的冰冻组织切片用丙酮固定，用0.25％酪蛋白+10％人血清封闭，并且在室温下用六种同时与不同荧光团缀合的抗体(包括抗CD31 BV480、抗CD141BB515、抗CD3 AF532、抗CD34 PE-CF594、抗Ki67-AF647以及抗CD21 BB700)标记1小时。洗涤后，然后在室温下用DAPI标记组织切片5min，并且封固。随后，使用Vectra Polaris的多光谱扫描仪在整个载玻片上扫描组织切片，并且选择感兴趣区域(ROI)进行多光谱成像。获取的图像在InForm软件(PerkinElmer)中去混合(图1至6)。
图1至13中清楚地说明了本文所公开的方法能够同时检测多种靶抗原、生物标志物和细胞类型的存在和丰度，图1至13显示了在用本文所述的DAPI和六种Ab-FP同时标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片内不同免疫和基质细胞群体的分布。
实施例2
以下方案与实施例1阐述的基本相同，用于使用本文所述的Ab-FP特异性检测肿瘤组织冰冻切片中的七种不同靶抗原。
遵循本文所述的本发明方法，生成八种颜色的多重免疫荧光图像(7种Ab+DAPI)。
如实施例1中一样，在该方案中同时加入所有Ab-FP(七种)，再次说明了本文所公开的显著优点，即极大地减少了特异性检测和鉴定单个样本中的多种靶抗原所需的总时间。
本发明方法的该实施例也采用冰冻组织，因此不需要脱蜡和抗原修复。
材料
冰冻组织载玻片
冰冷的丙酮
DAKO PAP笔
1X TBS
恒湿箱
封闭剂：在1X TBS中制备的10％人血清
稀释缓冲液：在1X TBS中制备的10％人血清
荧光团缀合的抗体
-CD31 BV480
-CD141 BB515
-CD3 AF532
-CD34 PE-CF594
-Ki67 AF647
-CD21 BB700
-CD11c AF700
DAPI(以1∶2000最终稀释度使用)
ProlongGold封固剂
盖玻片
方法
1.选择载玻片：
从-80℃冰箱中取出带有冰冻切片的载玻片。
使载玻片温热至室温并干燥
2.用DAKO PAP笔描画载玻片
3.在室温下用冰冷的丙酮固定5min。丙酮应该会挥发，载玻片干燥。
4.用1x TBS简单洗涤
5.用10％人AB血清封闭剂在室温下于恒湿箱中封闭10min
6.在稀释缓冲液(含10％人血清)中制备Ab混合物。
7.在槽上拂去封闭剂。
8.将切片与Ab混合物一起在室温下于暗处的恒湿箱中同时温育1小时
9.拂去Ab混合物
10.用TBS简单洗涤1次，随后在摇床上用TBS洗涤3次，每次5min
11.加入DAPI(终浓度为1∶2000)，并且在室温下于暗处的恒湿箱中温育5min。
12.洗涤3次，每次2min后，在摇床上用TBS洗涤，用于ProlongGold封固载玻片。
13.使用Vectra Polaris对载玻片成像
结果
将黑素瘤浸润淋巴结的冰冻组织切片用丙酮固定，用0.25％酪蛋白+10％人血清封闭，并且在室温下用七种同时与不同荧光团缀合的抗体(包括抗CD31 BV480、抗CD141BB515、抗CD3 AF532、抗CD34 PE-CF594、抗Ki67-AF647、抗CD11c AF700以及抗CD21 BB700)标记1小时。洗涤后，然后在室温下用DAPI标记组织切片5min，并且封固。随后，使用VectraPolaris的多光谱扫描仪在整个载玻片上扫描组织切片，并且选择感兴趣区域(ROI)进行多光谱成像。获取的图像在InForm软件(PerkinElmer)中去混合(图14-23)。
图1至25中清楚地说明了本文所公开的方法能够同时检测冰冻组织切片中多种靶抗原、生物标志物和细胞类型的存在和丰度，图1至25显示了在用本文所述的DAPI和六种或七种Ab-FP同时标记的黑素瘤浸润淋巴结组织切片内不同免疫和基质细胞群体的分布。
实施例3
以下方案与实施例1阐述的基本相同，用于使用本文所述的CD163 APC/Fire750Ab-FP缀合物特异性检测肿瘤组织冰冻切片中的CD163+细胞。
遵循本文所述的本发明方法，生成去混合的免疫荧光图像，以进一步说明本文所公开的方法能够检测包括在光谱的远红外端发射的FP的Ab-FP缀合物。
如实施例1中一样，Ab-FP缀合物用于直接标记组织，这进一步说明了本发明的显著优点，即通过使用单一Ab-FP缀合物直接检测(与间接或二次检测相比)来特异性检测抗原表达，以鉴定组织样本中的靶抗原。
本发明方法的该实施例也采用冰冻组织，因此不需要脱蜡和抗原修复。
材料
冰冻组织载玻片
冰冷的丙酮
DAKO PAP笔
1X TBS
恒湿箱
封闭剂：在1X TBS中制备的10％人血清
稀释缓冲液：在1X TBS中制备的10％人血清
荧光团缀合的抗体
-CD163 APC/Fire 750
ProlongGold封固剂
盖玻片
方法
1.选择载玻片：
从-80℃冰箱中取出带有冰冻切片的载玻片。
使载玻片温热至室温并干燥
2.用DAKO PAP笔描画载玻片
3.在室温下用冰冷的丙酮固定5min。丙酮应该会挥发，载玻片干燥。
4.用1x TBS简单洗涤
5.用10％人AB血清封闭剂在室温下于恒湿箱中封闭10min
6.在稀释缓冲液(含10％人血清)中制备Ab。
7.在槽上拂去封闭剂。
8.将切片与Ab一起在室温下于暗处的恒湿箱中同时温育1小时
9.拂去Ab
10.用TBS简单洗涤1次，随后在摇床上用TBS洗涤3次，每次5min
11.用ProlongGold封固载玻片
12.使用Vectra Polaris对载玻片成像
结果
黑素瘤浸润淋巴结的冰冻组织切片用丙酮固定，用0.25％酪蛋白+10％人血清封闭，并且用单一Ab-FP缀合物标记；抗CD163 APC/Fire 750在室温下1小时。洗涤后，封固组织切片。随后，使用多光谱扫描仪Vectra Polaris对组织切片进行多光谱成像。获取的图像在InForm软件(PerkinElmer)中去混合(图24和25)。
图24和25中清楚地说明了本文所公开的方法能够通过使用包括荧光团的Ab-FP缀合物直接标记来检测靶抗原、生物标志物和细胞类型的存在和丰度，该荧光团如本文所述在光谱的远红外端发射。这些图显示了黑素瘤浸润淋巴结组织切片中CD163+细胞群体的分布。
实施例4
以下方案用于使用本文所述的Ab-FP特异性检测福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)扁桃体组织切片中的两种不同靶抗原。使用以下Ab-FP：CD45RO-AF488、CD19-AF647和CD8-AF647。
遵循本文所述的本发明方法，生成三种颜色的多重免疫荧光图像(2种Ab+DAPI)。
因此，遵循本文所述的方法允许快速且特异性多重检测FFPE组织切片中的多种靶抗原，而不需要二抗温育步骤。
与已知的多重免疫荧光检测方法相比，本文所述的方法允许更快速地检测相同亚细胞区室中的标志物共定位。由于来自Ab-FP中荧光团的荧光发射的扩散减少，所述方法还生成更高分辨率的图像，这是由于荧光团与一抗的直接缀合。
在所述方法中，在一步染色方案中同时加入两种一抗。相比之下，遵循Opal方案，在多个不同步骤中仅加入单一一抗，以获得多色图像。因此，本文所述的方法与已知方法相比提供了至少一个显著优点，即极大地减少了在单个组织切片中、特别是在FFPE组织切片中特异性免疫荧光检测和鉴定多种靶抗原所需的总时间。
材料和方法
试剂
下列荧光团缀合的抗体购自Biolegend和BD Biosciences：
CD19 AF647
CD8 AF647
CD45RO AF488
CD45RO AF594
CD45RO AF700
CD45RO BV510
CD45RO BV650
CD45RO PE/Dazzle 594
CD45RO APC/Fire 750
以下实施例中使用的标准材料：
带正电的载玻片(用于组织切片)
盖玻片
用于FFPE组织脱蜡和再水化的浴液和溶剂
修复器2100(用于抗原修复)
二甲苯
乙醇
H2O
10％NBF
DAKO PAP笔
1X抗原修复缓冲液
1X TBS
恒湿箱
封闭剂：在1X TBS中制备的0.25％酪蛋白+10％人血清
抗体稀释缓冲液：在1X TBS中制备的10％人血清
DAPI(以1∶2000最终稀释度使用)
ProlongGold封固剂
组织样本
福尔马林固定的石蜡包埋扁桃体组织由我们的临床合作者从奥克兰市医院提供。
组织制备和染色方案
(1)在温度设定为60℃的烘箱中烘烤载玻片至少1小时直至过夜
(2)脱蜡和再水化：将载玻片装入染色架中，并且进行下列处理：
二甲苯：3次，每次10min
99％乙醇：2次，每次5min
90％EtOH：1次，每次10min
70％EtOH：30秒
dH2O：30秒
10％NBF：1次，每次10min
dH2O：30秒
(3)将载玻片装如含有1X抗原修复缓冲液的载玻片室中
(4)将载玻片室放入填充有dH2O的修复器2100中。按下开始
(5)冷却载玻片后，用dH2O冲洗5次，并且在1x TBS中洗涤两次，每次5min。
(6)用纸巾擦拭切片周围的液体。用PAP笔对切片画圈，以限制区域
(7)将组织切片与10％HS封闭剂一起在室温下于恒湿箱中温育10min
(8)拂去封闭剂
(9)将在抗体稀释缓冲液中制备的荧光团缀合的抗体同时加入到组织切片中，并且在室温下于暗处的恒湿箱中温育1小时(避光)。
(10)在槽上拂去Ab。用TBS简单洗涤1次，随后在摇床上用TBS洗涤3次，每次5min
(11)将DAPI(1∶2000)加入到组织切片中，并且在室温下于暗处的恒湿箱中温育5min(避光)。
(12)洗涤3次，每次2min后，在摇床上用TBS洗涤，使用ProlongGold封固带有盖玻片的载玻片。
(13)使用Vectra Polaris继续成像。
扫描方案(来自Vectra Polaris使用手册1.0.7)
(1)打开Vectra Polaris仪器和计算机
(2)启动Vectra Polaris软件
(3)将载玻片装入载物台
(4)将载物台装入载物台放置室(slide carrier hotel)进行显微镜载玻片扫描
(5)在“编辑方案”页面(Vectra Polaris软件)中，创建成像方案。选择荧光模式和空间分辨率(通常为x20放大倍数，也可用x10或x40)用于整个载玻片扫描(WSS)和感兴趣区域(ROI)的多光谱成像(MSI)。还设置WSS和MSI的曝光时间以及用于聚焦和成像的滤镜。
(6)在“扫描载玻片”页面(Vectra Polaris软件)中，定位待扫描的载玻片，并且使用(5)中创建的WSS方案进行整个载玻片扫描(WSS)
(7)启动Phenochart程序(PerkinElmer)，以查看WSS图像，并且选择ROI进行多光谱成像(MSI)。
(8)在“扫描载玻片”页面(Vectra Polaris软件)中，定位含有将以多光谱方式成像的选定ROI的载玻片。使用(5)中创建的MSI方案进行选定ROI的多光谱成像(MSI)
(9)在对选定ROI成像之后，在InForm软件(PerkinElmer)中使用从每种Ab-FP的单染色组织的图像构建的光谱库，去混合获取的MSI图像。在InForm软件中处理和分析去混合的图像
结果
将来自扁桃体的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织切片在二甲苯中脱蜡、再水化，并且在具有抗原修复缓冲液的修复器中热处理。然后用0.25％酪蛋白+10％人血清封闭组织切片，并用Ab-FP缀合物和DAPI标记。随后，使用多光谱扫描仪Vectra Polaris对组织切片进行多光谱成像。获取的图像在InForm软件(PerkinElmer)中去混合。
图26至36中清楚地说明了本文所公开的方法能够同时检测FFPE组织切片中多种靶抗原、生物标志物和细胞类型的存在和丰度，图26至36显示了在用本文所述的DAPI和一种或两种Ab-FP同时标记的扁桃体组织切片中抗原和细胞群体的分布。
工业实用性
本发明的抗体-荧光团缀合物和使用其的方法在分子生物学中具有工业实用性，提供了诊断和管理包括癌症在内的疾病的手段。
参考文献
Gorriset al.MAJ,.(2018).Eight-Color Multiplex Immunohistochemistryfor Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within theTumor Microenvironment.J Immunol.,200(1),347-354.
Hofmanet al.Paul,.(2019).Multiplexed Immunohistochemistry forMolecular and Immune Profiling in Lung Cancer—Just About Ready for Prime-Time？Cancers(Basel),11(3):283.
Majtahedet al.Amirkaveh,.(2011).A two-antibody mismatch repairprotein immunohistochemistry screening approach for colorectal carcinomas,skin sebaceous tumors,and gynecologic tract carcinomas.Modern Pathology,24,1004-1014.
Soodet al.Anup,.(2016).Multiplexed immunofluorescence delineatesproteomic cancer cell states associated with metabolism.JCI Insight,1(6).

Claims (51)

1.一种组合物，其包含至少三种、四种、五种、六种或至少七种抗体-荧光团缀合物(Ab-FP)，其中每种FP具有不同的荧光激发和发射光谱(Ex)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其包含七种Ab-FP。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中每种Ab-FP是独特的Ab-FP。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少八种、九种、十种、十一种或十二种Ab-FP。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中每种FP的最大激发和发射波长(Ex/Em)选自由348/395、404/448、405/421、405/510、405/570、405/603、405/646、405/711、407/421、415/500、436/478nm、490/515nm、494/520nm、495/519nm、485/693nm、496/578、532/554nm、566/610nm、590/620nm、650/660nm、650/668nm、652/704、696/719nm、753/785nm、754/787nm、755/775nm和759/775nm组成的组。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述FP中的至少一种、两种或三种的所述最大荧光发射波长(Em)为约710nm至约850nm。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述FP中的至少一种、两种或三种的所述Em为约753nm至约759nm，优选753nm、754nm、755nm或759nm。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述FP选自由Ex/Em为348/395的BrilliantTMUltraviolet 395(BUV395)、Ex/Em为436/478nm的BrilliantTMViolet 480(BV480)、Ex/Em为405/421的Brilliant Violet 421TM、Ex/Em为407/421的BrilliantTMViolet 421(BV421)、Ex/Em为405/510的BrilliantTMViolet 510(BV510)、Ex/Em为405/570的Brilliant Violet 570TM、Ex/Em为405/603的Brilliant Violet 605TM、Ex/Em为405/646的Brilliant Violet 650TM、Ex/Em为405/711的Brilliant Violet 711TM、Ex/Em为404/448的BD HorizonTMV450、Ex/Em为415/500的BD HorizonTMV500、Ex/Em为490/515nm的BrilliantTMBlue 515(BB515)、Ex/Em为494/520nm的异硫氰酸荧光素(FITC)、Ex/Em为495/519nm的Alexa Fluor 488(AF488)、Ex/Em为532/554nm的Alexa Fluor 532(AF532)、Ex/Em为496/578的R-藻红蛋白(PE)、Ex/Em为590/620nm的Alexa Fluor 594(AF594)、Ex/Em为566/610nm的PE-Dazzle 594(PE594)或PE-CF594(CF594)、Ex/Em为650/668nm的AlexaFluor 647(AF647)、Ex/Em为650/660nm的别藻蓝蛋白(APC)、Ex/Em为485/693nm的BDHorizonTM700(BB700)、Ex/Em为696/719nm的Alexa Fluor 700(AF700)、Ex/Em为753/785nm的APC/Alexa Fluor 750、Ex/Em为754/787nm的APC/Fire 750、Ex/Em为652/704的APC-R700、Ex/Em为755/775nm的APC-Cy7以及Ex/Em为759/775nm的AF750组成的组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述荧光团选自由BV480、BB515、AF532、PE-CF594、AF647、AF700以及BB700组成的组。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述Ab-FP中的所述Ab选自由抗CD31、CD141、CD144、CD3、CD34、CD163、CD11c、CD14、CD16、CD68、Foxp3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD38、PD-1、PDL1、PDL2、CD68、Ki-67、Sox10、S100、PRAME、MART1以及抗CD21抗体组成的组。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述Ab-FP中的所述Ab选自由抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki-67、CD11c以及抗CD21抗体组成的组。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其包含所述以下抗体中的至少三种，优选四种、五种、六种或优选所有七种：抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki-67、CD11c和抗CD21抗体。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其包含所述以下Ab-FP中的至少三种，优选四种、五种、六种或优选所有七种：CD31-BV480；CD141-BB515；CD3-AF532；CD34-PE-CF594；Ki67-AF647、CD11c-AF700和CD21-BB700。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述Ab-FP中的所述Ab包括选自由抗雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、her2以及抗细胞角蛋白抗体组成的组的一种或多种Ab。
15.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述Ab-FP中的所述Ab包括一种或多种抗错配修复蛋白抗体或抗突变型错配修复蛋白抗体。
16.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述Ab-FP中的所述Ab包括选自由抗b-raf(V600E突变)、MLH1、MSH2、MSH6以及抗PMS2抗体组成的组的一种或多种抗体。
17.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中每种Ab特异性结合靶抗原。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中每种靶抗原是蛋白质或细胞类型、优选不同蛋白质或不同细胞类型的生物标志物。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的组合物，其中每种靶抗原是细胞表面受体或细胞内抗原的生物标志物。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的组合物，其中每种靶抗原是T细胞、B细胞、巨噬细胞、单核细胞或树突细胞抗原。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的组合物，其中每种靶抗原是选自由CD3、CD4、CD8、FoxP3、CD25、CD137、CD38、CD69、PD-1、CTLA-4以及Ki67抗原组成的组的T细胞抗原。
22.根据权利要求17至20中任一项所述的组合物，其中每种靶抗原是选自由CD19、CD20、CD21、BCL-6、BLIMP1、Ki67以及CD138抗原组成的组的B细胞抗原。
23.根据权利要求17至20中任一项所述的组合物，其中每种靶抗原是选自由CD14、CD16、CD68以及CD163抗原组成的组的巨噬细胞或单核细胞抗原。
24.根据权利要求17至20中任一项所述的组合物，其中每种靶抗原是树突细胞抗原，即CD1c或CLEC9a抗原。
25.一种生物样本的直接免疫荧光分析方法，其包括：
a.用至少一种独特的Ab-FP缀合物在平面生物样本中标记至少一种靶抗原，以及
b.使用多光谱扫描仪生成所述经标记的平面样本的多光谱荧光图像，其中所述图像包括至少两种颜色，其中至少一种颜色与所述至少一种独特的Ab-FP缀合物和所述至少一种靶抗原的所述特异性结合相关联，以及
c.从所述图像中确定包括所述至少一种靶抗原的至少一种生物标志物的存在或不存在。
26.根据权利要求25所述的方法，其中a)中的标记包括用至少两种、优选至少三种、四种、五种、六种、优选至少七种独特的Ab-FP缀合物同时标记至少两种、优选至少三种、四种、五种、六种、优选至少七种不同的靶抗原。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中a)中的标记包括用七种独特的Ab-FP缀合物同时标记。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中b)中的一种颜色与核染剂(优选DAPI或Hoechst33342)的所述荧光发射光谱相关联。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，其中b)中的所述多光谱图像包括至少三种、优选至少四种、五种、六种、优选七种不同的颜色，其中每种不同的颜色与Ab-FP和靶抗原的所述特异性结合相关联。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中b)中的生成所述多光谱图像包括使用所述多光谱扫描仪分别检测至少两种、优选三种、四种、五种、六种、优选七种不同的荧光光谱，其中每种检测到的光谱对应于与靶抗原特异性结合的Ab-FP。
31.根据权利要求25至30中任一项所述的方法，其中所述平面生物样本是组织切片，优选冰冻组织切片。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述组织切片来自哺乳动物，优选人。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述组织切片来自肝、皮肤、肺、乳腺、结肠或淋巴结。
34.根据权利要求25至33中任一项所述的方法，其中所述靶抗原如权利要求18至24中任一项所定义。
35.根据权利要求25至33中任一项所述的方法，其中所述Ab如权利要求10至12和14至17中任一项所定义。
36.根据权利要求25至35中任一项所述的方法，其中a)中的标记包括用所述以下抗体中的至少两种、优选三种、四种、五种、六种或优选七种来标记：抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki67、CD11c和抗CD21抗体。
37.根据权利要求25至36中任一项所述的方法，其中a)中的标记包括用所述以下Ab-FP中的至少两种、优选三种、四种、五种或优选所有六种来标记：CD31-BV480；CD141-BB515；CD3-AF532；CD34-PE-CF594；Ki67-AF647；CD11c-AF700和CD21-BB700。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的方法，其中a)中的标记进一步包括用不同的Ab-FP替换一种Ab-FP，其中所述替换Ab-FP包括所述相同的Ab以及Ex/Em为约753nm至约759nm、优选753nm、754nm、755nm或759nm的FP。
39.根据权利要求25至37中任一项所述的方法，其中a)中的标记进一步包括用另外的Ab-FP标记另外的靶抗原，该另外的Ab-FP包括Ex/Em为约753nm至约759nm、优选753nm、754nm、755nm或759nm的FP。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述另外的Ab-FP包括抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki-67、CD11c或抗CD21 Ab。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述另外的Ab不包括抗CD31、CD141、CD3、CD34、Ki-67、CD11c或抗CD21 Ab。
42.根据权利要求25至40中任一项所述的方法，其中c)中的确定是检测至少两种、优选至少三种、四种、五种、六种、优选至少七种不同生物标志物的存在。
43.根据权利要求25至42中任一项所述的方法，其中c)中的确定包括确定至少两种、优选至少三种、四种、五种、六种、优选至少七种不同生物标志物的丰度，优选相对丰度。
44.根据权利要求25至43中任一项所述的方法，其中c)中的确定包括检测所述免疫系统细胞上或细胞中的一种或多种生物标志物，其中所述免疫系统的所述细胞选自由T细胞、B细胞、巨噬细胞、单核细胞和树突细胞组成的组。
45.根据权利要求25至33、42和43中任一项所述的方法，其中在c)中的确定包括检测至少一种肿瘤细胞上或至少一种肿瘤细胞中的一种或多种生物标志物。
46.根据权利要求25至43中任一项所述的方法，其中c)中的确定包括检测临床相关水平的一种或多种生物标志物。
47.根据权利要求25至46中任一项所述的方法，其中b)中的所述多光谱图像是通过对来自由所述多光谱扫描仪捕获的所述图像中的每个像素的荧光强度数据进行计算机图像分析而生成的。
48.根据权利要求26至47中任一项所述的方法，其中b)中生成的所述图像包括至少两种独特的颜色，优选至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种，优选十二种独特的颜色，其中每种颜色与不同的FP荧光发射光谱相关联。
49.根据权利要求26至48中任一项所述的方法，其中b)中生成的所述图像包括至少四种、优选至少五种、六种、七种或八种独特的颜色，其中每种颜色与不同的FP荧光发射光谱相关联。
50.根据权利要求49所述的方法，其中b)中生成的所述图像包括至少六种或七种独特的颜色。
51.根据权利要求50所述的方法，其中至少一种、两种或三种独特的颜色具体对应的FP发射光谱为约710和约850nm，优选对应的FP最大发射波长为约753nm至约759nm，优选753nm、754nm、755nm或759nm。
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