CN113930385A - 一种快速筛选大分子免疫活性物质的体外模型构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种快速筛选大分子免疫活性物质的体外模型构建方法，该方法包括：制备合格的条件培养基，并利用条件培养基刺激肠上皮细胞；然后将待测样(上室)和免疫感知细胞RAW264.7(下室)同时加入到Caco‑2肠上皮单层细胞共同培养和孵育；孵育后并弃除上室培养基，将待测样和条件培养基加入到上室；收集下室培养基，并检测炎症因子水平。本发明将肠上皮细胞和免疫细胞共同培养模拟肠道内环境，利用待筛样品和条件培养基共同作用于上层的上皮细胞模拟肠道内食物大分子对肠损伤和机体免疫调节作用。

Description

一种快速筛选大分子免疫活性物质的体外模型构建方法
技术领域
本发明属于免疫物质的技术领域，特别涉及一种快速筛选大分子免疫活性物质的体外模型构建方法及应用方法。
背景技术
近年来，大量研究结果表明，多糖、多肽等天然大分子具有免疫调节活性。以多糖为例，其作为最重要的生物大分子之一，广泛存在于植物、动物和微生物，种类丰富且储量巨大，且不同来源的多糖具有不同的功能，如芦荟多糖促进免疫细胞产生细胞因子，三七多糖激活补体系统，印尼莪术多糖提高巨噬细胞吞噬功能等。因此筛选具有调节肠道和机体的免疫功能的大分子物质具有十分重要的意义。
然而，现有的大分子物质免疫活性筛选模型多采用直接刺激免疫细胞，再通过检测免疫细胞活性、炎症因子水平等，但食用的这些大分子是很难直接穿过肠上皮细胞而激活免疫细胞和调节免疫细胞发挥生物活性，所以这种筛选模型合理性欠佳(Luo et al.,Characterization and immunological activity of polysaccharides from Ixerispolycephala 113(2018)804-812)。另外一种利用混合培养细胞肠炎模型，Tanoue et al(In vitro model to estimate gut inflammation using co-cultured Caco-2andRAW264.7 cells，Biochemical and Biophysical Research Communications 374(2008)565–569)报道了Caco-2细胞和RAW264.7细胞共培养模型，利用脂多糖激活下室的RAW264.7免疫细胞，在上室加入TNF-α抗体，布地奈德和岩藻多糖模拟食物成分对肠炎的影响，该模型特点是激活免疫细胞缓慢产生炎症因子，模拟过程中产生炎症因子的量过多破坏上室的单层膜细胞，导致上室中的待测样漏到下室直接作用于免疫细胞，进而实现待测样对肠上皮细胞的保护作用的评价。所以目前急需一种大分子体外免疫评价的快速筛选模型。
发明内容
为解决上述问题，本发明的首要目的在于提供一种快速筛选大分子免疫活性物质的体外模型构建方法，该方法制备合格的条件培养基，并利用条件培养基刺激肠上皮细胞且不会造成肠上皮单层细胞的破坏，利用待筛样品和条件培养基共同作用于上层的上皮细胞模拟肠道内食物大分子对肠损伤和机体免疫调节作用。
本发明的另一目的在于提供一种快速筛选大分子免疫活性物质的体外模型构建方法，该方法排除了大分子直接诱导的免疫细胞产生免疫反应，提高准确性；简化动物实验过程，可用于代替动物模型而快速评估大分子对肠道和机体免疫的保护作用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下。
一种快速筛选大分子免疫活性物质的体外模型构建方法，包括：制备合格的条件培养基，并利用条件培养基刺激肠上皮细胞且不会造成肠上皮单层细胞的破坏(不显著降低单层细胞的通透性和跨膜电阻值)；然后将待测样(上室)和免疫感知细胞RAW264.7(下室)同时加入到Caco-2肠上皮单层细胞共同培养和孵育；
孵育后并弃除上室培养基，将待测样和条件培养基加入到上室；收集下室培养基，检测炎症因子。
所述合格条件培养基个炎症因子范围：IL-6为500-2000pg/ml,TNF-α为3000-20000pg/ml，NO为4-6μM。
所述待测样和免疫感知细胞同时孵育4-8h。
孵育后，所述待测样和条件培养基共同加入Trans-well上室,培养时间在12-48h。
同时检测下室培养基中的TNF-α和IL-10的含量。
具体地说，本发明采用Caco-2单层膜细胞和RAW264.7巨噬细胞共培养体系：所述的共培养体系在膜孔径为0.4μm的Trans-well；所述的条件培养基不损伤Caco-2单层细胞膜，不影响膜的通透性；所述的Caco-2代数为40-50，单层膜细胞是培养21天后，且电阻值大于1000Ω·cm2。所述的共培养RAW264.7巨噬细胞为10代以内且未被激活，细胞密度为3.9-7.9万个/cm2。
本发明所用的培养基均为DMEM和10％胎牛血清(Gibco，美国)，待测样和条件培养基均加在上室。发明通过评价下室培养基中促炎因子TNF-α和抗炎因子IL-10的表达水平。
本发明首先通过优化脂多糖的浓度、免疫细胞的密度及其孵育时间制备适度炎症因子浓度的条件培养基，从而避免炎症因子浓度过高破坏肠上皮细胞的单层膜结构；再利用Caco-2肠上皮细胞21天后形成的单层膜与免疫细胞共同培养模拟肠组织结构和机体免疫系统，整个体系经上室的Caco-2单层膜结构将孔板分成肠道和体内；将条件培养基和待测样刺激肠上皮细胞，模拟有害物质和免疫活性物质共同作用于肠道内，下层免疫细胞代替机体免疫系统对有害物质和免疫活性物质产生免疫反应。
本发明的有益效果在于：
本发明将肠上皮细胞和免疫细胞共同培养模拟肠道内环境，利用待筛样品和条件培养基共同作用于上层的上皮细胞模拟肠道内食物大分子对肠损伤和机体免疫调节作用。本模型排除了大分子直接诱导的免疫细胞产生免疫反应，提高准确性；简化动物实验过程，可用于代替动物模型而快速评估大分子对肠道和机体免疫的保护作用。
附图说明
图1是本发明所实现的流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
参照图1所示，为本发明所实现的快速筛选大分子免疫活性物质的体外模型构建方法，包括：制备合格的条件培养基，并利用条件培养基刺激肠上皮细胞且不会造成肠上皮单层细胞的破坏(不显著降低单层细胞的通透性和跨膜电阻值)；然后将待测样(上室)和免疫感知细胞(下室)同时加入到Caco-2肠上皮单层细胞共同培养和孵育；孵育后并弃除上室培养基，将待测样和条件培养基加入到上室；收集下室培养基，检测炎症因子。
所述合格条件培养基个炎症因子范围：IL-6为500-2000pg/ml,TNF-α为3000-20000pg/ml，NO为4-6μM。
同时检测下室培养基中的TNF-α和IL-10的含量。
具体地说，条件培养基先是对RAW264.7巨噬细胞进行培养，经LPS培育后离心过滤，得到条件培养基A；同时还将Caco-2单层膜细胞和RAW264.7巨噬细胞(RAW264.7巨噬细胞需提取一天接种)共培养体系：所述的共培养体系在膜孔径为0.4μm的Trans-well；所述的条件培养基不损伤Caco-2单层细胞膜，不影响膜的通透性；所述的Caco-2代数为40-50，单层膜细胞是培养21天后，且电阻值大于1000Ω·cm2。所述的共培养RAW264.7巨噬细胞为10代以内且未被激活，细胞密度为3.9-7.9万个/cm2。
Caco-2单层膜细胞培养21天后，将Caco-2单层膜细胞和RAW264.7巨噬细胞混合培养，并加入待测样共孵育，孵育后，所述待测样和免疫感知细胞同时孵育4-8h后，加入条件培养基，具体地说，所述待测样和条件培养基共同加入Trans-well上室,培养时间在12-48h。
最后定量检测培养基中的TNF-α和IL-10的含量。
发明的效果：对比多糖、多肽等大分子的免疫活性评价方法，通常包括体模型和体内模型，在体外模型中，待测样被直接加入免疫细胞或脂多糖激活的免疫细胞中，通过检测炎症因子及其相关通路蛋白评价大分子的免疫活性，但实际上许多大分子很难直接穿过肠表皮细胞而作用于机体免疫细胞。另外，体内模型要求较高，个体差异较大，易受其它因素干扰。本发明通过优化脂多糖的浓度，及其诱导RAW264.7免疫细胞的数量和时间，得到条件培养基。本条件培养基对上室的肠表皮细胞形成的单层膜结构无显著影响，不会发生上层的待测大分子漏到下室的情况。此外，本发明中的待测样和条件培养基均被加入到上室，最终检测下室的炎症因子，建立了大分子体外的免疫活性评价模型。本发明模拟肠道的食物成分对机体的免疫调节作用，实现了天然大分子在肠道中的免疫活性快速体外评价。
具体的实例为：
1.实验材料
1.1、细胞株RAW264.7和Caco-2细胞株均购自ATCC(American Typer CultureCollection,美国)。
1.2、主要试剂包括胰蛋白酶、胎牛血清、培养基DMEM、磷酸缓冲液PBS(pH7.4)青霉素和链霉素购自Gibco公司；荧光素钠和非必需氨基酸购自Sigma公司；TNF-α和IL-10试剂盒购自R&D system公司.
1.3、主要器材和仪器包括：根据需要选择适合的孔板和悬挂是的培养皿，Milliproe-ERS跨膜电阻仪，Thermo水套式CO2恒温培养箱、Eppendorf控温台式离心机，酶标仪(BIOTEK,美国)，计数板，显微镜。
2.实验方法
2.1、Caco-2细胞培养在DMEM培养基并添加10％胎牛血清、1％的青霉素和链霉素、1％非必需氨基酸的培养基中，并放置于5％CO2的37℃培养箱。当培养瓶内细胞回合率达到90％，弃除培养基并用PBS洗一遍，加入0.25％胰酶消化3分钟，加入培养基并轻轻将细胞吹落，在25℃条件下离心3分钟1000转/分钟，倒去上清，加入10ml培养基混匀，显微镜下计数，调整细胞密度1-5万个/cm2接种与悬挂式的培养小室，前一周每隔两天换一次培养基，后两周每天换一次培养基，连续培养21天，跨膜电阻值大于等于1000Ω·cm2。
2.2、Caco-2细胞培养的第十九天，接种10-15万个/cm2的RAW264.7细胞，24小时后加入脂多糖，并孵育24小时，收集培养基,5000转/分离心,经0.2μm过滤备用。
2.3、Caco-2细胞培养的第二十天，接种4-8万个/cm2的RAW264.7细胞于孔板，培养过夜，更换新培养基与接种Caco-2的小室共同培养，在上室加入待测样孵育6小时，再从新加入同样浓度的待测样和条件培养基，12-48小时内收集下室培养基，检测培养基中TNF-α和IL-10的水平。
总之，本发明将肠上皮细胞和免疫细胞共同培养模拟肠道内环境，利用待筛样品和条件培养基共同作用于上层的上皮细胞模拟肠道内食物大分子对肠损伤和机体免疫调节作用。本模型排除了大分子直接诱导的免疫细胞产生免疫反应，提高准确性；简化动物实验过程，可用于代替动物模型而快速评估大分子对肠道和机体免疫的保护作用。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种快速筛选大分子免疫活性物质的体外模型构建方法，其特征在于该方法包括：制备合格的条件培养基，并利用条件培养基刺激肠上皮细胞；然后将待测样(上室)和免疫感知细胞RAW264.7(下室)同时加入到Caco-2肠上皮单层细胞共同培养和孵育；
孵育后并弃除上室培养基，将待测样和条件培养基加入到上室；收集下室培养基，检测炎症因子。
2.如权利要求1所述的快速筛选大分子免疫活性物质的体外模型构建方法，其特征在于所述合格条件培养基个炎症因子范围：IL-6为500-2000pg/ml,TNF-α为3000-20000pg/ml，NO为4-6μM。
3.如权利要求2所述的快速筛选大分子免疫活性物质的体外模型构建方法，其特征在于所述待测样和免疫感知细胞同时孵育4-8h。
4.如权利要求3所述的快速筛选大分子免疫活性物质的体外模型构建方法，其特征在于孵育后，所述待测样和条件培养基共同加入Trans-well上室,培养时间在12-48h。
5.如权利要求4所述的快速筛选大分子免疫活性物质的体外模型构建方法，其特征在于同时检测下室培养基中的TNF-α和IL-10的含量。
6.如权利要求1所述的快速筛选大分子免疫活性物质的体外模型构建方法，其特征在于采用Caco-2单层膜细胞和RAW264.7巨噬细胞共培养体系：所述的共培养体系在膜孔径为0.4μm的Trans-well；所述的Caco-2代数为40-50，单层膜细胞是培养21天后，且电阻值大于1000Ω·cm2；所述的共培养RAW264.7巨噬细胞为10代以内且未被激活，细胞密度为3.9-7.9万个/cm2。
7.如权利要求1所述的快速筛选大分子免疫活性物质的体外模型构建方法，其特征在于培养基均为DMEM和10％胎牛血清，待测样和条件培养基均加在上室，通过评价下室培养基中促炎因子TNF-α和抗炎因子IL-10的表达水平。
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