CN117844759A - 一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激car-t细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR‑T细胞的方法，S1、使用PBS与牛血清白蛋白、RPMI1640与胎牛血清分别配置Buffer与完全培养液；S2、震荡混匀链霉亲和素磁珠；S3、对S2中混匀的链霉亲和素磁珠分别与无菌双蒸水、生物素化肿瘤相关靶蛋白混合；S4、取靶向生物素化TAACAR‑T细胞至完全培养液中重悬；S5、设置空白组、对照组以及实验组，加入相同数目的CAR‑T细胞；S6、空白组添加完全培养液、对照组与链霉亲和素磁珠共培养、实验组与链霉素亲和素和生物素化TAA共培养；S7、检测空白组、对照组以及实验组培养上清细胞因子释放；此方法可在CAR‑T细胞体外培养中适时添加、去除“肿瘤细胞”，为探索CAR‑T细胞在接受肿瘤细胞刺激中表型、功能的变化及潜在机制提供便利。
Description
技术领域
本发明属于生物医疗技术领域，具体涉及一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞的方法。
背景技术
嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)-T细胞免疫疗法是靶向免疫治疗的重要组分，在血液肿瘤的治疗中取得显著疗效。研究表明，CAR-T细胞会因肿瘤抗原的持续刺激而过度活化以至于走向衰老与耗竭，此与患者的不良预后密切相关，因此探索CAR-T细胞与肿瘤细胞相互作用时表型与功能发生的变化以及潜在机制对临床治疗有一定的指导作用，其中恰当的模型至关重要。
目前模拟CAR-T细胞与肿瘤细胞体内相互作用的方法是CAR-T细胞与肿瘤细胞体外共培养；然而，此模型中混杂的细胞种类限制了细胞计数、流式细胞术、转录组测序等常规实验方法的准确性。目前尚无成熟的方法替代肿瘤细胞瘤刺激CAR-T细胞，并且缺乏在体外CAR-T细胞培养中去除肿瘤抗原的方法，为此我们提出一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞的方法，以解决上述背景技术中提出的模型中混杂的细胞种类限制常规实验方法的准确性、缺乏替代肿瘤细胞瘤刺激CAR-T细胞及在体外CAR-T细胞培养中去除肿瘤抗原方法的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞的方法，其方法如下：
S1、使用PBS与牛血清白蛋白、RPMI1640与胎牛血清分别配置Buffer与完全培养液；
S2、震荡混匀链霉亲和素磁珠；
S3、对S2中混匀的链霉亲和素磁珠分别与无菌双蒸水、生物素化TAA进行重悬；
S4、取靶向生物素化TAA的CAR-T细胞至完全培养液中进行重悬；
S5、设置空白组、对照组以及实验组，并加入相同数目的CAR-T细胞；
S6、空白组添加对应体积完全培养液、对照组与链霉亲和素磁珠共培养、实验组与链霉素亲和素和生物素化TAA共培养；
S7、检测空白组、对照组以及实验组培养上清细胞因子释放，并计算其细胞、磁珠的比例；
S8、使用FCAPArray软件分析IL-2与IFN-γ的绝对值。
优选的，所述S1具体为，使用PBS+0.1％牛血清白蛋白配制实验所需Buffer；使用PRMI1640+10％胎牛血清配制实验所需完全培养液。
优选的，所述S2具体为，充分震荡混匀链霉亲和素磁珠，分别取实验所需3μL链霉亲和素磁珠至a无菌EP管与b无菌EP管中，加入1mLPBS并震荡混匀，于磁力架上静置1分钟后去上清，重复此步骤3次，3μLPBS重选磁珠。
优选的，所述S3具体为，分别取3μL无菌双蒸水、3μL浓度为0.1μg/μL生物素化TAA与重悬后的a无菌EP管中磁珠、b无菌EP管中磁珠混匀后室温共孵育30分钟，加入1mLBuffer并轻柔混匀，于磁力架上静置1分钟后去上清，重复此步骤5次，a无菌EP管中溶液、b无菌EP管中溶液分别用150μL完全培养液重悬。
优选的，所述S4具体为，取4x105靶向生物素化TAA的CAR-T细胞，重悬至200μL完全培养液。
优选的，所述S5具体为，空白组、对照组、实验组均加入50μL靶向生物素化TAA的CAR-T细胞。
优选的，所述S6具体为，空白组添加50μL完全培养液，对照组添加50μLa无菌EP管中溶液，实验组添加50μLb无菌EP管中溶液，于37℃培养箱静置培养24小时。
优选的，所述S7具体为，倒置光学显微镜观察后，离心取空白组、对照组、实验组上清各25μL并用50μL完全培养液稀释3倍；1mLPBS重悬沉淀，于磁力架上静置1分钟，取上清记为A，1mLPBS重悬吸附在磁力架侧EP管壁沉淀记为B，离心去上清，100μLBuffer重悬后于流式仪上机检测并计算A、B中细胞、磁珠的比例。
优选的，所述S8具体为，充分震荡混匀人IL-2、IFN-γ细胞因子定量试剂盒中CaptureBeads后各取10μL添加至480μLBuffer中稀释50倍，取人IL-2、IFN-γ细胞因子定量试剂盒中PEDetectionReagent各10μL添加至480μLBuffer中稀释50倍，取稀释后的CaptureBeads、PEDetectionReagent各50μL与已稀释的50μL细胞培养上清按1:1:1室温共孵育3小时；加入1mLBuffer，300g离心5分钟后去上清，100μLBuffer重悬后于流式仪上机检测，共计收集10000细胞因子混合微珠，使用FCAPArray软件分析IL-2与IFN-γ的绝对值。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本申请中蛋白磁珠偶联替代肿瘤细胞与CAR-T细胞共培养，以在体外可控地模拟CAR-T细胞接受靶向肿瘤抗原刺激,能够在CAR-T体外培养中适时添加、去除“肿瘤细胞”，为探索CAR-T细胞在接受肿瘤细胞刺激中表型、功能的变化及潜在机制提供了便利。
附图说明
图1为空白组(CAR-T)、对照组(CAR-T+磁珠)与实验组(CAR-T+磁珠/蛋白)培养24小时后，于10倍以及40倍显微镜下观察细胞生长状态示意图；
图2为空白组(CAR-T)、对照组(CAR-T+磁珠)与实验组(CAR-T+磁珠/蛋白)培养24小时后，使用流式细胞术检测IL-2与IFN-γ释放水平示意图；
图3为对照组(CAR-T+磁珠)与实验组(CAR-T+磁珠/蛋白)培养24小时后，使用磁力架去除磁珠/蛋白模拟移除肿瘤细胞，使用流式细胞术分析上清(A)、吸附在磁力架侧EP管壁的沉淀(B)中细胞与磁珠的比例图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-图3，本发明提供一种技术方案：一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞的方法，其方法为：
S1，使用PBS+0.1％牛血清白蛋白配制实验所需Buffer；使用PRMI 1640+10％胎牛血清配制实验所需完全培养液。
S2，充分震荡混匀链霉亲和素磁珠，分别取实验所需3μL链霉亲和素磁珠至a无菌EP管与b无菌EP管中，加入1mLPBS并震荡混匀，于磁力架上静置1分钟后去上清，重复此步骤3次，3μLPBS重选磁珠。
S3，分别取3μL无菌双蒸水、3μL浓度为0.1μg/μL生物素化CD19蛋白与重悬后的a无菌EP管中磁珠、b无菌EP管中磁珠混匀后室温共孵育30分钟，加入1mLBuffer并轻柔混匀，于磁力架上静置1分钟后去上清，重复此步骤5次，a无菌EP管中溶液、b无菌EP管中溶液分别用150μL完全培养液重悬。
S4，于3个供者来源的CD19CAR-T细胞中，各取4x105细胞，分别重悬至200μL完全培养液。
S5，空白组、对照组、实验组均加入50μLCD19CAR-T细胞(n＝3)。
S6，空白组添加50μL完全培养液，对照组添加50μLa无菌EP管中溶液，实验组添加50μLb无菌EP管中溶液，于37℃培养箱静置培养24小时(n＝3)。
S7，倒置光学显微镜观察后，离心取空白组、对照组、实验组上清各25μL并用50μL完全培养液稀释3倍；1mLPBS重悬沉淀，于磁力架上静置1分钟，取上清记为A，1mLPBS重悬吸附在磁力架侧EP管壁沉淀记为B，离心去上清，100μLBuffer重悬后于流式仪上机检测并计算A、B中细胞、磁珠的比例。
S8，充分震荡混匀人IL-2、IFN-γ细胞因子定量试剂盒中CaptureBeads后各取10μL添加至480μLBuffer中稀释50倍，取人IL-2、IFN-γ细胞因子定量试剂盒中PEDetectionReagent各10μL添加至480μLBuffer中稀释50倍，取稀释后的CaptureBeads、PEDetectionReagent各50μL与已稀释的50μL细胞培养上清按1:1:1室温共孵育3小时；加入1mLBuffer，300g离心5分钟后去上清，100μLBuffer重悬后于流式仪上机检测，共计收集10000细胞因子混合微珠，使用FCAPArray软件分析IL-2与IFN-γ的绝对值。
上述方法对生物素化CD19磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CD19CAR-T细胞技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例为仅仅是本发明一部分实施例，生物素化TAA磁珠偶联模拟相应肿瘤细胞刺激靶向TAA CAR-T细胞均属于本发明保护的范围。
对结果进行分析：
1、对培养后细胞形态进行分析：
请参阅图1，通过图1中图示可知，实验组聚团现象最明显，表明磁珠/蛋白与CAR-T细胞相互作用，即磁珠蛋白偶联有效地模拟了肿瘤细胞。
2、对细胞因子释放进行分析：
请参阅图2，通过图2中的柱状示意图可知，实验组细胞因子释放水平最高，表明磁珠/蛋白刺激CAR-T细胞活化，即磁珠蛋白偶联有效地模拟了肿瘤细胞。
3、原效率检测；
请参阅图3，结果表明，对照组与实验组中上清中磁珠/细胞比例明显低于沉淀中磁珠/细胞比例，并且对照组与实验组中磁珠/细胞的比例没有差异，表明蛋白的偶联没有对影响移除磁珠的效率。综上所述，蛋白磁珠偶联在模拟肿瘤抗原刺激CAR-T细胞后，可以被有效地移除。
综上所得结论如下：在蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞的方法学建立过程中，首先从形态学以及细胞因子释放水平评估了蛋白磁珠偶联刺激CAR-T细胞的有效性；随后，使用流式细胞术检测利用磁力架去除蛋白磁珠的有效性。结果表明蛋白磁珠偶联可有效模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞，并且蛋白磁珠能够可控地被去除。此方法能够在CAR-T体外培养中适时添加、去除“肿瘤细胞”，为探索CAR-T细胞在接受肿瘤细胞刺激中表型、功能的变化及潜在机制提供了便利。
本申请中所需的试剂与耗材如下：链霉亲和素磁珠(Invitrogen,Cat#11205D)；生物素CD19蛋白(AcroBiosystem,Cat#CD9-H82E9)；人IL-2细胞因子定量试剂盒(BDBiosciences,Cat#558270)；人IFN-γ细胞因子定量试剂盒(BDBiosciences,Cat#56011)；RPMI1640培养液(Gibco,Cat#C11995500BT)；胎牛血清(Gibco,Cat#10099-141)；DynaMag-2磁力架(Invitrogen,Cat#12321D)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞的方法，其特征在于：具体方法如下：
S1、使用PBS与牛血清白蛋白、RPMI1640与胎牛血清分别配置Buffer与完全培养液；
S2、震荡混匀链霉亲和素磁珠；
S3、对S2中混匀的链霉亲和素磁珠分别与无菌双蒸水、生物素化TAA进行重悬；
S4、取靶向生物素化TAA的CAR-T细胞至完全培养液中进行重悬；
S5、设置空白组、对照组以及实验组，并加入相同数目的CAR-T细胞；
S6、空白组添加对应体积完全培养液、对照组与链霉亲和素磁珠共培养、实验组与链霉素亲和素和生物素化TAA共培养；
S7、将空白组、对照组以及实验组离心取上清，并分别计算其细胞、磁珠的比例；
S8、使用FCAPArray软件分析IL-2与IFN-γ的绝对值。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述S1具体为，使用PBS+0.1％牛血清白蛋白配制实验所需Buffer；使用PRMI1640+10％胎牛血清配制实验所需完全培养液。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述S2具体为，充分震荡混匀链霉亲和素磁珠，分别取实验所需3μL链霉亲和素磁珠至a无菌EP管与b无菌EP管中，加入1mL PBS并震荡混匀，于磁力架上静置1分钟后去上清，重复此步骤3次，3μLPBS重选磁珠。
4.根据权利要求1所述的一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述S3具体为，分别取3μL无菌双蒸水、3μL浓度为0.1μg/μL生物素化蛋白与重悬后的a无菌EP管中磁珠、b无菌EP管中磁珠混匀后室温共孵育30分钟，加入1mLBuffer并轻柔混匀，于磁力架上静置1分钟后去上清，重复此步骤5次，a无菌EP管中溶液、b无菌EP管中溶液分别用150μL完全培养液重悬。
5.根据权利要求1所述的一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述S4具体为，取4x105靶向生物素化TAA的CAR-T细胞，重悬至200μL完全培养液。
6.根据权利要求1所述的一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述S5具体为，空白组、对照组、实验组均加入50μL靶向生物素化TAA的CAR-T细胞。
7.根据权利要求1所述的一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述S6具体为，空白组添加50μL完全培养液，对照组添加50μLa无菌EP管中溶液，实验组添加50μLb无菌EP管中溶液，于37℃培养箱静置培养24小时。
8.根据权利要求1所述的一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述S7具体为，倒置光学显微镜观察后，离心取空白组、对照组、实验组上清各25μL并用50μL完全培养液稀释3倍；1mLPBS重悬沉淀，于磁力架上静置1分钟，取上清记为A，1mLPBS重悬吸附在磁力架侧EP管壁沉淀记为B，离心去上清，100μLBuffer重悬后于流式仪上机检测并计算A、B中细胞、磁珠的比例。
9.根据权利要求1所述的一种蛋白磁珠偶联模拟肿瘤细胞刺激CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述S8具体为，充分震荡混匀人IL-2、IFN-γ细胞因子定量试剂盒中CaptureBeads后各取10μL添加至480μLBuffer中稀释50倍，取人IL-2、IFN-γ细胞因子定量试剂盒中PEDetectionReagent各10μL添加至480μLBuffer中稀释50倍，取稀释后的CaptureBeads、PEDetection Reagent各50μL与已稀释的50μL细胞培养上清按1:1:1室温共孵育3小时；加入1mLBuffer，300g离心5分钟后去上清，100μLBuffer重悬后于流式仪上机检测，共计收集10000细胞因子混合微珠，使用FCAPArray软件分析IL-2与IFN-γ的绝对值。
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