CN106222202B - 一种高效转染大菱鲆肌肉细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效转染大菱鲆肌肉细胞的方法。以构建的大菱鲆肌肉细胞系为材料，以连接有绿色荧光蛋白GFP基因的质粒为外源基因，采用核转染的方法进行转染，通过荧光倒置显微镜以及流式细胞仪检测转染效率。采用本发明建立的转染方法，大菱鲆肌肉细胞系转染绿色荧光蛋白基因的效率可达65％，同时细胞生长状态良好。本方法的建立为鱼类细胞信号转导、鱼类功能基因组学、鱼类营养学、水生环境毒理学等领域的研究提供了有力工具。

Description

一种高效转染大菱鲆肌肉细胞的方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种高效转染大菱鲆肌肉细胞的方法。

背景技术

随着现代生物技术的发展，细胞培养技术已经成为鱼类繁殖选育、营养代谢、免疫调控等相关研究的重要手段。细胞瞬时转染技术作为研究基因功能的一项重要手段，其应用也越来越广泛。特别是随着相关研究水平的不断深入，细胞瞬时转染——基因过表达技术(Overexpression)已经为目前研究鱼类基因功能、细胞信号传导等必需的技术手段。

常规的细胞转染的方法包括：脂质体转染法、电穿孔转染法和病毒感染转染法。目前一般实验室中常用的主要是脂质体法和电穿孔法，而病毒感染法因其复杂的准备程序和对细胞类型极高的选择性应用范围较小。然而目前绝大多数的细胞转染产品以及相应的转染方案主要是针对哺乳动物细胞设计、生产的，其在鱼类细胞中应用效果往往不佳。仅有的少量研究报道鱼类细胞应用脂质体法转染效率极低(大部分低于10％)，而这也成为了限制鱼类功能基因组学、分子营养学、分子免疫学以及鱼类细胞生物学等相关学科发展的重要瓶颈。建立一种高效、安全的细胞转染方法已经成为目前鱼类细胞生物学等领域的迫切需求。

大菱鲆是我国北方大规模养殖的一种具有重要经济价值的肉食性海水鱼类。目前其已经成为鱼类良种选育、营养代谢、免疫病害等多学科研究的重要对象。随着鱼类细胞生物学研究的不断深入，目前已成功建立了多种自大菱鲆中分离获得的细胞系。分离获得的细胞系已经成为研究大菱鲆基因功能、营养素代谢、免疫应激调控的重要工具。已有研究报道大菱鲆肌肉细胞系可以用于研究鱼类氨基酸营养感知、蛋白质代谢等领域。但是尚未成熟的、转染效率极低的转染方法严重制约了相关研究领域的进一步发展。

因此，建立一种高效、安全的大菱鲆肌肉细胞系的转染方法，对于鱼类细胞生物学、鱼类分子营养学、鱼类分子免疫学等具有重要的意义。

发明内容

本发明目的是提供一种高效转染大菱鲆肌肉细胞的方法，从而解决目前鱼类细胞转染效率极低的瓶颈。

本发明的高效转染大菱鲆肌肉细胞的方法，包括如下的步骤：

1)将大菱鲆肌肉细胞接种于细胞培养皿中，24℃条件下在培养基中进行培养；

所述的培养基优选为L-15完全培养基；

2)待细胞融合度达到80％后，吸除原培养基，加入浓度为0.25％的胰酶-EDTA溶液消化细胞，并在显微镜下观察，待细胞皱缩、变圆后，加入含血清的L-15完全培养基终止消化，用移液器轻微吹打，获得细胞悬液；

所述的血清在L-15完全培养基的添加浓度为20％；

3)取细胞悬液进行离心，用室温预热的SG电转缓冲液将细胞重悬；获得的细胞悬液中细胞浓度为10⁷个/ml；

4)向细胞悬液中加入无内毒素的待转染的质粒，混匀获得细胞-质粒混合液；

5)将细胞-质粒混合液转入电转杯中，使用核转染系统4D-Nucleofector的X-Unit的EN-150程序进行电击；

6)电击结束后，将电转杯取出，4℃放置5min，然后在室温放置5min；

7)向电转杯中加入24℃预热的L-15完全培养基中进行培养。

本发明的优点在于：

1、本发明构建的大菱鲆肌肉细胞转染方法可以使得转染24h后大菱鲆肌肉细胞系的瞬时表达效率达到65％。

2、与脂质体转染法、磷酸钙转染法等相比，本发明构建的大菱鲆肌肉细胞转染方法转染效率更高、细胞生长状态更好。

3、本发明构建的大菱鲆转染细胞转染方法采用外源基因直接入核的方式，蛋白启动表达、翻译更快。

4、本发明构建的转染方法，同时可以转染含有其他功能基因的外源质粒DNA，可应用于利于大菱鲆肌肉细胞开展其他相关领域的研究。

附图说明

图1：核转染法转染24h后明场条件下，细胞形态观察图，

图2：核转染法转染24h后，绿色荧光蛋白表达情况观察图，

图3：脂质体法转染24h后明场条件下，细胞形态观察图，

图4：脂质体法转染24h后，绿色荧光蛋白表达情况观察图，

图5：磷酸钙法转染24h后明场条件下，细胞形态观察图，

图6：磷酸钙法转染24h后，绿色荧光蛋白表达情况观察图。

具体实施方式

目前使用最为普遍的细胞转染方法为脂质体法和磷酸钙法，但是由于相关产品及转染方案主要是针对哺乳动物细胞设计的，在鱼类细胞中应用效果往往欠佳。本发明应用电转染的方法，是通过系列优化获得一种可以高效、安全转染大菱鲆肌肉细胞的转染方法，转染效率可达65％以上，其远远高于其他两种常规的转染方法。

所使用的L-15完全培养基为(Sigma公司，货号#L5520)，20％胎牛血清(Gibco公司，货号#10099141)，1％青链霉素(Gibco公司，货号#15140122)，成纤维细胞生长因子(Gibco公司，货号#PHG0266).

所述0.25％的胰酶-EDTA溶液为：0.25％胰酶-EDTA溶液(Gibco公司，货号#25200056)。

所述SG电转缓冲液为：SG电转缓冲液(Lonza公司，货号#V4XC-3012)

所述DPBS溶液为：无钙、镁的DPBS溶液(Gibco公司，货号#14190250)。

以下结合实施例进一步阐明本发明的主要内容。

实施例1

1)大菱鲆肌肉细胞系的复苏与培养

细胞解冻前首先将L-15完全培养基于水浴锅中预热至24℃。将冻存细胞从深低温冰箱中取出后，迅速放置于24℃水浴中，水浴加热约90s，待细胞冻存管冻存细胞尚未完全融化时移入超净台。将溶解的细胞转移至细胞培养皿中，加入10ml预热的L-15完全培养基，后放置于细胞培养箱中24℃静置培养。约12h后，将培养基更换为新的L-15完全培养基，以移除未贴壁的死细胞和二甲基亚砜。待细胞长满平板后，即可传代培养。细胞复苏后，传代2～3次即可用于细胞转染实验。

2)核转染法转染大菱鲆肌肉细胞系

将生长状态良好的大菱鲆肌肉细胞接种于100mm细胞培养皿中，24℃条件下，L-15完全培养基中培养。待细胞融合度达到约80％后，吸除原培养基，加入2ml 0.25％的胰酶-EDTA消化细胞，并在显微镜下观察，待细胞皱缩、变圆后，加入5ml含血清的L-15完全培养基终止消化，用移液器轻微吹打，获得细胞悬液。取100μl细胞悬液，进行细胞计数。依据细胞密度，取约含10⁶个细胞的细胞悬液进行离心，室温300g，离心10min。弃上清，用室温预热的100μl SG电转缓冲液将细胞重悬。然后向细胞悬液中加入2μg无内毒素的含有绿色荧光蛋白基因的DNA纯化质粒，小心吸打、混匀。将细胞-质粒混合液小心转入电转杯中，使用核转染系统4D-Nucleofector的X-Unit的EN-150程序进行电击。电击结束后，将电转杯取出，室温分别放置5min、10min、15min。向电转杯中加入500μl 24℃预热的L-15完全培养基，小心吸打，混匀。将混匀后的细胞接种于6-孔细胞培养板中，用预热的L-15完全培养基补足为2ml，然后将细胞放置于24℃的细胞培养箱中静置培养。转染24h后，使用0.25％的胰酶-EDTA将细胞消化、分离下来，300g离心5min，弃上清，用无Ca²⁺、Mg²⁺的DPBS重悬、离心2次，后用500μl DPBS重悬细胞，使用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的瞬时表达效率。

为进一步提高转染大菱鲆肌肉细胞的成活率，对转染温度进行了进一步的探索优化。具体措施为：在电击结束后，首先将电转杯在4℃放置5min，然后在室温放置5min；再向电转杯中加入24℃预热的L-15完全培养基中进行培养，这样相比于电击结束后，将电转杯取出，室温放置10min，再向电转杯中加入24℃预热的L-15完全培养基中进行培养的步骤，能明显的提高成活率(转染的大菱鲆肌肉细胞的成活率从60％提高到80％)。多次实验也表明上述的改进具有可重复性，从而有效的提高了获得转染大菱鲆肌肉细胞的效率。

3)磷酸钙法转染大菱鲆肌肉细胞系

将生长状态良好的大菱鲆肌肉细胞接种于6孔细胞培养板中，24℃条件下，L-15完全培养基中培养。待细胞汇合度达到80％后进行转染。取2μg质粒DNA与100μl氯化钙溶液混合，然后100μl的BBS溶液，混匀，室温孵育20min。然后将会DNA-氯化钙-BBS混合溶液逐滴加至细胞培养皿中。放置于细胞培养箱中孵育4h后，更换新的L-15完全培养基，静置孵育24h后，使用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的瞬时表达效率。

4)脂质体法转染大菱鲆肌肉细胞系

将生长状态良好的大菱鲆肌肉细胞接种于6孔细胞培养板中，24℃条件下，L-15完全培养基中培养。待细胞汇合度达到80％后进行转染。取2μg质粒DNA和5μg脂质体分别与150μl预热的Opti-MEM培养基混匀，室温孵育5min。然后将DNA与脂质体溶液按1:1混合，小心吸打、混匀，室温静置20min。然后将会DNA-脂质体混合溶液逐滴加至细胞培养皿中。放置于细胞培养箱中静置培养。静置孵育24h后，使用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的瞬时表达效率。

5)实验结果

利用流式细胞仪检测不同转染方法转染24h后大菱鲆肌肉细胞表达绿色荧光蛋白的效率。结果发现，应用本发明构建的方法，大菱鲆肌肉细胞系绿色荧光蛋白的瞬时表达效率最高，其中电转结束后先在4℃放置5min，然后在室温放置5min的转染效率、细胞存活率均最高，转染效率可达65％，而使用脂质体法和磷酸钙法转染大菱鲆肌肉细胞的转染效率分别为8.1％和0.1％。

Claims (1)

1.一种高效转染大菱鲆肌肉细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)将大菱鲆肌肉细胞接种于细胞培养皿中，24℃条件下在L-15完全培养基中进行培养；

2)待细胞融合度达到80％后，吸除原培养基，加入浓度为0.25％的胰酶-EDTA溶液消化细胞，并在显微镜下观察，待细胞皱缩、变圆后，加入含血清的L-15完全培养基终止消化，用移液器轻微吹打，获得细胞悬液；

血清在L-15完全培养基的添加浓度为20％；

3)取细胞悬液进行离心，用室温预热的SG电转缓冲液将细胞重悬；获得细胞悬液，细胞悬液中细胞浓度为10⁷个/ml；

4)向细胞悬液中加入无内毒素的待转染的质粒，混匀获得细胞-质粒混合液；

5)将细胞-质粒混合液转入电转杯中，使用核转染系统4D-Nucleofector的X-Unit的EN-150程序进行电击；

6)电击结束后，将电转杯取出，先在4℃放置5min，然后室温放置5min；

7)向电转杯中加入24℃预热的L-15完全培养基中进行培养。

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