CN113322234A - 永生化人cd34+cd38-造血干细胞系的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了永生化人CD34+CD38‑造血干细胞系的制备方法及应用，该方法的步骤包括分离原代CD34+CD38‑造血干细胞，然后获得表达HPV16E6/E7的CD34+CD38‑造血干细胞，最后获得表达HPV16E6/E7的CD34+CD38‑单克隆细胞，将成功增殖的永生CD34+CD38‑单克隆细胞进行传代和冻存。较之以往建立的CD34造血干细胞系，本发明所制备的CD34+CD38‑造血干细胞系的造血干细胞特性更强，具有更好的长程造血重建潜能，且为单克隆细胞，遗传背景单一，具有更高的可控性，可望为造血干细胞移植提供源源不断的供体细胞，提高体外获得人工组分血、人工全血的可能性。
Description
技术领域
本发明属于造血干细胞系构建技术领域，具体涉及一种永生化人CD34+CD38-造血干细胞系的制备方法及应用。
背景技术
随着世界范围内对安全血液需求的不断增加，国际和国内同行均在尝试体外产生人工血液。造血干细胞是所有功能血细胞的来源，但是造血干细胞数量稀少，在全骨髓中的占比不到万分之一，难于在体外进行有效的增殖传代。仅表达CD34+的细胞系，其细胞群体组成较杂，主要是造血祖细胞而不是造血干细胞。较之CD34+干细胞系，建立可以体外培养的CD34+CD38-造血干细胞系，意义更大，但难度也更大。
2013年，日本Yukio Nakamura实验室首次利用HPV16 E6/E7导入人工诱导多能干细胞(iPSC)或脐带CD34+造血干祖细胞，体外获得永生造血红系祖细胞和成熟红细胞。但是他们并未获得和培养永生的CD34+CD38-造血干细胞。而且，他们通过iPSC获得的细胞，因引入了癌基因c-Myc，故具有潜在的高致癌性。
2017年，长春力太生物技术有限公司申请专利“缺氧诱导造血干细胞定向分化为永生红系祖细胞”，但是这种造血干细胞带有缺氧反应原件，缺氧容易导致干细胞诱导过程中其下游血细胞的应激反应，因而不适合作为造血干细胞移植的备选细胞。
特别是，以上研究中涉及的细胞均只带有CD34+细胞表面标记。这群细胞是多种祖细胞的混合，并非干性最强的造血干细胞。其全谱系分化能力弱，只具有某系偏向分化能力，比如红系组细胞。更重要的是，以上技术所获得的细胞都是多群体的混合细胞，这群纯度不高的细胞存在复杂的遗传背景。其本身或分化得到的下游细胞，将有较多未知的潜在危险。本专利获得的细胞均为单克隆细胞，遗传背景单一，能极大减少混杂遗传背景带来的潜在危险。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明旨在提供一种永生化人CD34+CD38-造血干细胞系的制备方法及应用，以获得体外可持续增殖的CD34+CD38-造血干细胞系，可望为造血干细胞移植提供源源不断的供体细胞，并提高体外获得人工组分血、人工全血的可能性。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种永生化人CD34+CD38-造血干细胞系的制备方法，包括以下步骤：
S1、分离原代CD34+CD38-造血干细胞，其具体步骤为：
S1.1、将人的全骨髓细胞悬液缓慢加到等体积的ficoll溶液上层，进行密度梯度离心；
S1.2、吸取梯度密度离心后的中间白色细胞层，加入含10％FBS的培养基或PBS溶液中，离心获得细胞沉淀；
S1.3、重复2～3次S1.2的操作；
S1.4、将获得的细胞与CD34和CD38荧光抗体进行孵育，流式分选获得CD34+CD38-细胞；
S1.5、将分选获得的CD34+CD38-细胞培养于含有SCF/FLT3L/IL6/G-CSF/IL3/TPO/UM171/SR1的干细胞培养基中；
S2、获得高表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-造血干细胞，其具体步骤为：
S2.1、将HPV16 E6/E7基因序列连接于慢病毒载体，获得慢病毒重组质粒Vector-HPV；所述的HPV16 E6/E7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S2.2、对获得慢病毒重组质粒Vector-HPV进行酶切鉴定和测序，确认慢病毒重组质粒Vector-HPV构建成功；
S2.3、将目的质粒与包装质粒REV、VSVG、HIV按照浓度要求加入DEPC水中，混匀后进行磷酸钙沉淀，静置若干时间后，缓慢均匀滴加到293T培养基上清中；
S2.4、在若干时间后更换新鲜的293T培养基，并在此后的两个规定时间节点收集慢病毒上清，并将慢病毒上清与293T细胞共培养，验证其侵染效率和目的基因表达情况；
S2.5、将两个规定时间节点收集到的慢病毒上清进行超速离心，并将沉淀重悬于细胞培养基溶液，获得高浓度慢病毒；
S2.6、将高浓度慢病毒加入CD34+CD38-细胞的培养基，即含有SCF/FLT3L/IL6/G-CSF/IL3/TPO/UM171/SR1的干细胞培养基中，并在若干时间后，清洗病毒；
S2.7、在病毒清洗完毕的若干时间后，分选荧光标记的CD34+CD38-细胞，即为高表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-细胞；
S3、获得表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-单克隆细胞，其具体步骤为：
S3.1、将分选获得的表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-细胞的阳性细胞群进行极限稀释，接种于96孔板，标记含有单细胞的孔；
S3.2、观察和记录单细胞增殖情况，结果显示获得成功增殖的永生CD34+CD38-单克隆细胞；
S3.3、将成功增殖的永生CD34+CD38-单克隆细胞进行传代和冻存。
进一步的，S1.1中的离心条件为800g，30分钟，缓慢加减速。
进一步的，S1.2中的离心条件为2000rpm，5分钟。
进一步的，S2.1中所述的HPV16 E6/E7的核苷酸序列具体如下所示：
进一步的，S2.3中的静置时间为5～10分钟。
进一步的，S2.4中更换新鲜的293T培养基的时间在8～12小时后，收集慢病毒上清的时间则在此后的24小时和48小时后。
进一步的，S2.5中进行超速离心的慢病毒上清的体积为34mL，离心条件为25000rpm，90分钟，4℃，且细胞培养基溶液的体积为250μL。
进一步的，S2.6中清洗病毒的时间点为高浓度慢病毒加入CD34+CD38-细胞的培养基后的24小时。
进一步的，S2.7中分选表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-细胞的时间点在病毒清洗完毕的48～72小时后。
本发明的所制备的永生化人CD34+CD38-造血干细胞系，其造血干细胞的纯度高，造血能力强，可望用于为造血干细胞移植提供源源不断的供体细胞。
本发明的所制备的永生化人CD34+CD38-造血干细胞系，利用本干细胞系定向分化，可用于获得造血干细胞的下游各系功能血细胞，籍此，将提高体外获得人工组分血、人工全血的可能性。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明属于首次制备出具有上述特点的单克隆永生造血干细胞系，国内外尚无类似技术。
2、现有技术中所涉及的细胞均只带有CD34+细胞表面标记，这群细胞是多种祖细胞的混合，并非干性最强的造血干细胞，其全谱系分化能力弱，只具有某系偏向分化能力，比如红系组细胞。而本发明所制备的CD34+CD38-造血干细胞，是血液系统干性最强的种子细胞，具有更强的长程造血重建能力。
3、更重要的是，现有技术中所获得的细胞都是多群体的混合细胞，这群纯度不高的细胞存在复杂的遗传背景。其本身或分化得到的下游细胞，将有较多未知的潜在危险。而本发明所制备的CD34+CD38-造血干细胞，均为单克隆细胞，遗传背景单一，具有更高的可控性，能极大减少混杂遗传背景带来的潜在危险。
4、且本发明的所制备的永生化人CD34+CD38-造血干细胞系，其造血干细胞的纯度高，造血能力强，体外可持续增殖，可望用于为造血干细胞移植提供源源不断的供体细胞；同时利用本干细胞系定向分化，可用于获得造血干细胞的下游各系功能血细胞，籍此，将提高体外获得人工组分血、人工全血的可能性。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明所采用的流式分选CD34+CD38-造血干细胞的示意图；
图2为本发明获得高表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-造血干细胞流程示意图；
图3为本发明获得慢病毒重组质粒Vector-HPV的酶切结果图，图中1，2号表示原质粒；3，4号表示酶切；
图4为本发明检测的被成功侵染的293T细胞中HPV16-E6/E7的mRNA水平的结果图；
图5为本发明检测的被成功侵染的293T细胞中HPV16-E6/E7的mRNA水平的结果图；
图6为本发明检测CD34+CD38-造血细胞中HPV16-E6/E7的mRNA水平的结果图；
图7为本发明获得永生CD34+CD38-造血干细胞的流程示意图；
图8为本发明获得的永生CD34+CD38-单克隆细胞的增殖分裂图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一种永生化人CD34+CD38-造血干细胞系的制备方法，包括以下步骤：
S1、分离原代CD34+CD38-造血干细胞，其具体步骤为：
S1.1、将人的全骨髓细胞悬液缓慢加到等体积的ficoll溶液上层，进行密度梯度离心；
S1.2、吸取梯度密度离心后的中间白色细胞层，加入含10％FBS的培养基或PBS溶液中，离心获得细胞沉淀；
S1.3、重复2～3次S1.2的操作；
S1.4、将获得的细胞与CD34和CD38荧光抗体进行孵育，流式分选获得CD34+CD38-细胞；
S1.5、将分选获得的CD34+CD38-细胞培养于含有SCF/FLT3L/IL6/G-CSF/IL3/TPO/UM171/SR1的干细胞培养基中；
S2、获得高表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-造血干细胞，其具体步骤为：
S2.1、将HPV16 E6/E7基因序列连接于慢病毒载体，获得慢病毒重组质粒Vector-HPV；所述的HPV16 E6/E7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S2.2、对获得慢病毒重组质粒Vector-HPV进行酶切鉴定和测序，确认慢病毒重组质粒Vector-HPV构建成功；
S2.3、将目的质粒与包装质粒REV、VSVG、HIV按照浓度要求加入DEPC水中，混匀后进行磷酸钙沉淀，静置若干时间后，缓慢均匀滴加到293T培养基上清中；
S2.4、在若干时间后更换新鲜的293T培养基，并在此后的两个规定时间节点收集慢病毒上清，并将慢病毒上清与293T细胞共培养，验证其侵染效率和目的基因表达情况；
S2.5、将两个规定时间节点收集到的慢病毒上清进行超速离心，并将沉淀重悬于细胞培养基溶液，获得高浓度慢病毒；
S2.6、将高浓度慢病毒加入CD34+CD38-细胞的培养基，即含有SCF/FLT3L/IL6/G-CSF/IL3/TPO/UM171/SR1的干细胞培养基中，并在若干时间后，清洗病毒；
S2.7、在病毒清洗完毕的若干时间后，分选荧光标记的CD34+CD38-细胞，即为高表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-细胞；
S3、获得表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-单克隆细胞，其具体步骤为：
S3.1、将分选获得的表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-细胞的阳性细胞群进行极限稀释，接种于96孔板，标记含有单细胞的孔；
S3.2、观察和记录单细胞增殖情况，结果显示获得成功增殖的永生CD34+CD38-单克隆细胞；
S3.3、将成功增殖的永生CD34+CD38-单克隆细胞进行传代和冻存。
实施例
下面以本发明的一个具体的实施例来进行详细说明，其具体步骤如下：
S1、分离原代CD34+CD38-造血干细胞，其具体步骤为：
S1.1、将人的全骨髓细胞悬液缓慢加到等体积的ficoll溶液上层，进行密度梯度离心，离心条件为800g，30分钟，缓慢加减速；
S1.2、吸取梯度密度离心后的中间白色细胞层，加入含10％FBS的培养基或PBS溶液中，离心获得细胞沉淀，离心条件为2000rpm，5分钟；
S1.3、重复2～3次S1.2的操作；
S1.4、将获得的细胞与CD34和CD38荧光抗体进行孵育，参见图1所示，流式分选获得CD34+CD38-细胞；
S1.5、将分选获得的CD34+CD38-细胞培养于含有SCF/FLT3L/IL6/G-CSF/IL3/TPO/UM171/SR1的干细胞培养基中；
S2、获得高表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-造血干细胞，参见图2所示，其具体步骤为：
S2.1、将HPV16 E6/E7基因序列连接于慢病毒载体，获得慢病毒重组质粒Vector-HPV；所述的HPV16 E6/E7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S2.2、对获得慢病毒重组质粒Vector-HPV进行酶切鉴定和测序，并确认慢病毒重组质粒Vector-HPV构建成功与否；
参见图3所示，图3表示慢病毒重组质粒Vector-HPV酶切结果，图3中的“1”表示单克隆1号原质粒，“2”表示单克隆2号原质粒，“3”表示单克隆1号酶切；“4”表示单克隆2号酶切，因此从图3所显示的酶切结果表明，慢病毒重组质粒Vector-HPV构建成功；
S2.3、将目的质粒与包装质粒REV、VSVG、HIV按照浓度要求加入DEPC水中，混匀后进行磷酸钙沉淀，静置5-10分钟后，缓慢均匀滴加到293T培养基上清中；
S2.4、在8～12小时后更换新鲜的293T培养基，并在此后的24小时和48小时后收集慢病毒上清，并将慢病毒上清与293T细胞共培养，验证其侵染效率和目的基因表达情况；
参见图4-5所示，图4表示慢病毒对于293T细胞的侵染效率，图5表示被成功侵染的293T细胞中HPV16-E6/E7的mRNA水平检测结果图，从图4-5的结果表明，侵染后293T细胞中HPV16 E6/E7的mRNA水平为高表达；
S2.5、将34mL慢病毒上清进行超速离心，离心条件为25000rpm，90分钟，4℃，并将沉淀重悬于250μL的细胞培养基溶液，获得高浓度慢病毒；
S2.6、将高浓度慢病毒加入CD34+CD38-细胞的培养基，即含有SCF/FLT3L/IL6/G-CSF/IL3/TPO/UM171/SR1的干细胞培养基中，并在24小时后，清洗病毒；
S2.7、在病毒清洗完毕的48～72小时后，分选荧光标记的CD34+CD38-细胞，即为高表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-细胞；
对CD34+CD38-细胞中HPV16 E6/E7的mRNA水平进行检测，参见图6所示，图6表示CD34+CD38-造血细胞中HPV16-E6/E7的mRNA水平检测结果图，从图6的Q-PCR结果显示，永生CD34+CD38-细胞中HPV16 E6/E7高表达。
S3、获得表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-单克隆细胞，参见图7所示，其具体步骤为：
S3.1、将分选获得的表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-细胞的阳性细胞群进行极限稀释，接种于96孔板，标记含有单细胞的孔；
S3.2、观察和记录单细胞增殖情况，参见图8所示，图8表示获得的永生CD34+CD38-单克隆细胞的增殖分裂图，从图8的结果显示，获得可成功增殖的永生CD34+CD38-单克隆细胞；
S3.3、将成功增殖的永生CD34+CD38-单克隆细胞进行传代和冻存。
现有技术中所涉及的细胞均只带有CD34+细胞表面标记，这群细胞是多种祖细胞的混合，并非干性最强的造血干细胞，其全谱系分化能力弱，只具有某系偏向分化能力，比如红系组细胞。而本发明所制备的CD34+CD38-造血干细胞，是血液系统干性最强的种子细胞，具有更强的长程造血重建能力。
更重要的是，现有技术中所获得的细胞都是多群体的混合细胞，这群纯度不高的细胞存在复杂的遗传背景。其本身或分化得到的下游细胞，将有较多未知的潜在危险。而本发明所制备的CD34+CD38-造血干细胞，均为单克隆细胞，遗传背景单一，具有更高的可控性，能极大减少混杂遗传背景带来的潜在危险。
本发明属于国内外首次制备出具有上述特点的单克隆永生造血干细胞系。并且基于上述特点，本发明所制备的永生化人CD34+CD38-造血干细胞系可以具备以下应用：
1、本发明的所制备的永生化人CD34+CD38-造血干细胞系，其造血干细胞的纯度高，造血能力强，体外可持续增殖，可望用于为造血干细胞移植提供源源不断的供体细胞。
2、本发明的所制备的永生化人CD34+CD38-造血干细胞系，利用本干细胞系定向分化，可用于获得造血干细胞的下游各系功能血细胞，籍此，将提高体外获得人工组分血、人工全血的可能性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 苏天生命科技（苏州）有限公司
<120> 永生化人CD34+CD38-造血干细胞系的制备方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtacaaaaa agcaggctcc accatgtttc aggacccaca ggagcgaccc agaaagttac 60
cacagttatg cacagagctg caaacaacta tacatgatat aatattagaa tgtgtgtact 120
gcaagcaaca gttactgcga cgtgaggtat atgactttgc ttttcgggat ttatgcatag 180
tatatagaga tgggaatcca tatgctgtat gtgataaatg tttaaagttt tattctaaaa 240
ttagtgagta tagacattat tgttatagtt tgtatggaac aacattagaa cagcaataca 300
acaaaccgtt gtgtgatttg ttaattaggt gtattaactg tcaaaagcca ctgtgtcctg 360
aagaaaagca aagacatctg gacaaaaagc aaagattcca taatataagg ggtcggtgga 420
ccggtcgatg tatgtcttgt tgcagatcat caagaacacg tagagaaacc cagctgtaat 480
catgcatgga gatacaccta cattgcatga atatatgtta gatttgcaac cagagacaac 540
tgatctctac tgttatgagc aattaaatga cagctcagag gaggaggatg aaatagatgg 600
tccagctgga caagcagaac cggacagagc ccattacaat attgtaacct tttgttgcaa 660
gtgtgactct acgcttcggt tgtgcgtaca aagcacacac gtagacattc gtactttgga 720
agacctgtta atgggcacac taggaattgt gtgccccatc tgttctcaga aaccataacc 780
cagctttctt gtaca 795
Claims (10)
1.永生化人CD34+CD38-造血干细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、分离原代CD34+CD38-造血干细胞，其具体步骤为：
S1.1、将人的全骨髓细胞悬液缓慢加到等体积的ficoll溶液上层，进行密度梯度离心；
S1.2、吸取梯度密度离心后的中间白色细胞层，加入含10％FBS的培养基或PBS溶液中，离心获得细胞沉淀；
S1.3、重复2～3次S1.2的操作；
S1.4、将获得的细胞与CD34和CD38荧光抗体进行孵育，流式分选获得CD34+CD38-细胞；
S1.5、将分选获得的CD34+CD38-细胞培养于含有SCF/FLT3L/IL6/G-CSF/IL3/TPO/UM171/SR1的干细胞培养基中；
S2、获得高表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-造血干细胞，其具体步骤为：
S2.1、将HPV16 E6/E7基因序列连接于慢病毒载体，获得慢病毒重组质粒Vector-HPV；所述的HPV16 E6/E7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
S2.2、对获得慢病毒重组质粒Vector-HPV进行酶切鉴定和测序，确认慢病毒重组质粒Vector-HPV构建成功；
S2.3、将目的质粒与包装质粒REV、VSVG、HIV按照浓度要求加入DEPC水中，混匀后进行磷酸钙沉淀，静置若干时间后，缓慢均匀滴加到293T培养基上清中；
S2.4、在若干时间后更换新鲜的293T培养基，并在此后的两个规定时间节点收集慢病毒上清，并将慢病毒上清与293T细胞共培养，验证其侵染效率和目的基因表达情况；
S2.5、将两个规定时间节点收集到的慢病毒上清进行超速离心，并将沉淀重悬于细胞培养基溶液，获得高浓度慢病毒；
S2.6、将高浓度慢病毒加入CD34+CD38-细胞的培养基，即含有SCF/FLT3L/IL6/G-CSF/IL3/TPO/UM171/SR1的干细胞培养基中，并在若干时间后，清洗病毒；
S2.7、在病毒清洗完毕的若干时间后，分选荧光标记的CD34+CD38-细胞，即为高表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-细胞；
S3、获得表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-单克隆细胞，其具体步骤为：
S3.1、将分选获得的表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-细胞的阳性细胞群进行极限稀释，接种于96孔板，标记含有单细胞的孔；
S3.2、观察和记录单细胞增殖情况，结果显示获得成功增殖的永生CD34+CD38-单克隆细胞；
S3.3、将成功增殖的永生CD34+CD38-单克隆细胞进行传代和冻存。
2.根据权利要求1所述的永生化人CD34+CD38-造血干细胞系的制备方法，其特征在于：S1.1中的离心条件为800g，30分钟，缓慢加减速。
3.根据权利要求1所述的永生化人CD34+CD38-造血干细胞系的制备方法，其特征在于：S1.2中的离心条件为2000rpm，5分钟。
4.根据权利要求1所述的永生化人CD34+CD38-造血干细胞系的制备方法，其特征在于：S2.3中的静置时间为5～10分钟。
5.根据权利要求1所述的永生化人CD34+CD38-造血干细胞系的制备方法，其特征在于：S2.4中更换新鲜的293T培养基的时间在8～12小时后，收集慢病毒上清的时间则在此后的24小时和48小时后。
6.根据权利要求1所述的永生化人CD34+CD38-造血干细胞系的制备方法，其特征在于：S2.5中进行超速离心的慢病毒上清的体积为34mL，离心条件为25000rpm，90分钟，4℃，且细胞培养基溶液的体积为250μL。
7.根据权利要求1所述的永生化人CD34+CD38-造血干细胞系的制备方法，其特征在于：S2.6中清洗病毒的时间点为高浓度慢病毒加入CD34+CD38-细胞的培养基后的24小时。
8.根据权利要求1所述的永生化人CD34+CD38-造血干细胞系的制备方法，其特征在于：S2.7中分选表达HPV16 E6/E7的CD34+CD38-细胞的时间点在病毒清洗完毕的48～72小时后。
9.一种永生化人CD34+CD38-造血干细胞系的应用，其特征在于：用于为造血干细胞移植提供供体细胞。
10.一种永生化人CD34+CD38-造血干细胞系的应用，其特征在于：用于获得造血干细胞的下游各系功能血细胞。
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