CN104946685A

CN104946685A - 一种利用重组蛋白体外制备猪树突状细胞的方法

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Publication number: CN104946685A
Application number: CN201510282338.5A
Authority: CN
Inventors: 杨倩; 涂冲智; 朱立麒; 林�建
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2015-05-25
Filing date: 2015-05-25
Publication date: 2015-09-30

Abstract

本发明涉及生物工程领域，分别公开了一种高效制备猪白细胞介素4(IL-4)和一种高效制备猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)重组蛋白的方法，以及利用这两种重组蛋白体外制备猪树突状细胞的应用。本发明方法简单，易操作，成本低，诱导细胞纯度高，具有良好应用前景和使用价值。

Description

一种利用重组蛋白体外制备猪树突状细胞的方法

一、技术领域

本发明涉及一种利用重组蛋白体外制备猪树突状细胞的方法，属于生物技术基因工程领域。具体涉及一种高效制备猪白细胞介素4(IL-4)和一种高效制备猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)重组蛋白的方法，以及利用这两种重组蛋白体外制备猪树突状细胞的应用。

二、背景技术

树突状细胞是目前已知的体内功能最强的抗原呈递细胞(APC)，通过直接激活并调控T淋巴细胞的免疫功能，对机体免疫反应发挥重要的调节作用，因此在免疫学研究中受到广泛的重视。

树突状细胞可以来源于外周血和脐带血的单核细胞，也可以从骨髓液的前体细胞分化而来，在不同的发育阶段具有不同的表型特征和生理功能。虽然树突状细胞在各种组织中都有分布，但含量稀少，而进行表型特征、抗原摄取、抗原递呈和免疫排斥及免疫耐受等基础研究需要使用大量的树突状细胞。运用细胞因子体外大量诱导树突状细胞扩增是获取研究所需树突状细胞的最佳途径。IL-4和GM-CSF两种细胞因子在诱导血液单核细胞和骨髓细胞成为未成熟的树突状细胞中发挥重要作用。利用IL-4和GM-CSF这两种细胞因子联合刺激外周血单核细胞和骨髓液前体细胞，可以诱导培养获得未成熟的树突状细胞。

进行猪树突状细胞相关的免疫学研究，在动物医学领域意义重大，能为深入研究猪传染病的防止打下了基础；其次，目前对于树突状细胞的研究主要集中在人和小鼠上，而猪作为与人极为相似的哺乳动物，在解剖和基因上十分接近于人类，可作为一种更具优势的大动物模型，是免疫学和病原微生物与宿主研究的理想对象；此外，猪作为最理想的异种器官移植供体动物，其树突状细胞在异种移植排斥反应及诱导免疫耐受中的作用越来越引起人们的关注。

IL-4和GM-CSF具有种属特异性，本研究提供了一种可以成功在真核细胞表达系中分别获得猪的IL-4和GM-CSF重组蛋白的方法，并建立了一种在体外大量制备猪树突状细胞的方法，为深入研究猪的树突状细胞的各项功能以及与各种病原微生物作用等研究奠定基础。

三、发明内容

技术问题

本发明提供了一种高效制备IL-4和一种高效制备GM-CSF重组蛋白的方法。可联合应用上述两种重组蛋白刺激猪外周血单核细胞和骨髓液前体细胞，体外诱导培养获得猪树突状细胞。这一生物学应用成本低，诱导细胞纯度高，具有良好应用前景和使用价值。

技术方案

本发明设计两种重组蛋白IL-4和GM-CSF，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。以及两种监测目的重组蛋白表达情况的融合重组蛋白IL-4-G和GM-CSF-G，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

A、从猪的总cDNA中扩增出扩增获得带有kozak序列、IL-4基因的CDS区和His₆标签(可串联绿色荧光蛋白基因)的序列片段，用in-fusion同源重组技术拼接到去除AcGFP1基因的pLVX-AcGFP1-N1载体的克隆位点中构建重组质粒；

B、从猪的总cDNA中扩增出扩增获得带有kozak序列、IL-4信号肽基因、GM-CSF成熟肽基因、His₆标签(可串联绿色荧光蛋白基因)的序列片段，用in-fusion同源重组技术拼接到去除AcGFP1基因的pLVX-AcGFP1-N1载体的克隆位点中构建重组质粒；

C、重组质粒转染HEK-293细胞进行重组蛋白的分泌表达。

在一个实施例中，经验证GM-CSF使用自身的信号肽序列表达效率较低，提高表达效率，两种目的蛋白IL-4和GM-CSF均使用IL-4的信号肽，具有可行性，再通过合适的表达系统进行蛋白表达，整个过程涉及到基因分子克隆重组、蛋白表达技术，所用技术方法均合乎该领域适合的技术方法。

在一个实施例中，将目的蛋白IL-4和GM-CSF于绿色荧光蛋白ZsGreen1进行融合表达作为对照，可对目的蛋白表达情况进行监督控制。

在一个实施例中，由于GM-CSF和IL-4属于外源重组蛋白，选择HEK-293细胞作为表达系统适合外源蛋白的表达，能提高重组蛋白的成功率和表达量，便于后续蛋白纯化。目的蛋白带有His₆标签，可通过Ni磁珠进行纯化。

本发明还提供一种体外制备猪树突状细胞的方法，其特征在于用上述两种重组蛋白体外刺激诱导猪外周血单核细胞和骨髓液前体细胞，从而产生大量高纯度的猪树突状细胞。

本发明方法简单，易操作，成本低，诱导细胞纯度高，具有良好应用前景和使用价值。

有益效果

本发明表达的两种重组蛋白可联合使用于体外制备猪骨髓源和外周血源树突状细胞。经形态学观察、免疫荧光和流式细胞术鉴定、吞噬功能验证，为高纯度的未成熟树突状细胞，可用于免疫学基础研究。

本发明表达的两种重组蛋白还可用作其他用途，如疫苗免疫增强剂。

四、附图说明

图1：构建的重组型表达质粒pLVX-S-IL-4示意图

图2：构建的重组型表达质粒pLVX-S-GM-CSF示意图

图3：构建的重组型表达质粒pLVX-S-IL-4-G示意图

图4：构建的重组型表达质粒pLVX-S-GM-CSF-G示意图

图5：重组型表达质粒pLVX-S-IL-4-G、pLVX-S-GM-CSF-G瞬时转染HEK-293细胞48h荧光蛋白表达情况

图6：利用重组蛋白制备的猪骨髓源树突状细胞细胞形态学观察

图7：利用重组蛋白制备的猪骨髓源树突状细胞免疫荧光观察

图8：流式细胞术鉴定利用重组蛋白制备的猪骨髓源树突状细胞表型

图9：利用重组蛋白制备的猪骨髓源树突状细胞吞噬功能验证

图10：利用重组蛋白制备的猪外周血源树突状细胞细胞形态学观察

图11：流式细胞术鉴定利用重组蛋白制备的猪外周血源树突状细胞表型

五、具体实施方式

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。本申请中的方法若无特殊说明，都是本领域常规方法。具体涉及的材料和试剂如下：

E.coli JM109购自Takara公司、质粒pLVX-AcGFP1-N1和pLVX-shRNA2购自Clontech公司、pCDNA3.1购自Life Technologies公司；HEK-293细胞为南京农业大学动物医学院组织胚胎学实验室提供。

试剂：TRizol、反转录试剂盒购自Takara公司；Q5高保真酶购自NEB公司；Agarose Gel DNA Purification Kit，限制性内切酶购自Thermo公司；DNA纯化试剂盒、无内毒素质粒提取试剂盒等均购自OMEGA公司；ClonExpress II重组克隆试剂盒购自Vazyme公司；脂质体X-tremeGENE HP DNA购自Roche公司、培养基DMEM、胎牛血清购自Invitrogen公司；猪源GM-CSF和猪源IL-4购自以色列ProSpec公司；PE标记小鼠抗猪CD1a单抗购自Abcam公司；FITC标记小鼠抗猪SLA-II-DR单抗购自Lifespan公司；PE标记小鼠抗猪SWC3a单抗购自BD公司；FITC标记的葡聚糖购自Sigma公司。其他试剂均为国产或进口分析纯级。

实施例1. pLVX-S-IL-4、pLVX-S-GM-CSF重组表达载体的构建

1.1猪IL-4基因的克隆

用TRizol法从猪的脾脏中提取总mRNA，以提取的总RNA为模板，用反转录试剂盒合成cDNA。

以上述cDNA为模板，根据NCBI中收录的猪的IL-4基因序列(NM_214123.1)设计引物，扩增猪IL-4的CDS区序列。并在上游引物5’端引入载体同源臂、kozak序列、NheI酶切位点(下划线为酶切位点)，下游引物5’端分别引入His₆标签序列，引物序列如下：

P1：ACCCAAGCTGGCTAGCGCCACCATGGGTCTCACCTCCCAAC

P2：TTAATGATGATGATGATGGTGACACTTTGAGTATTTCTCCTTCATAATC

PCR反应结束后，在1.0％琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后，设计一对引物，并在下游引物5’端引入XhoI酶切位点(下划线为酶切位点)和载体同源臂，引物序列如下：

P3：ACCCAAGCTGGCTAGCGCC

P4：GCCCTCTAGACTCGAGTTAATGATGATGATGATGGTGACAC

PCR反应结束后，在1.0％琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后，连接到pcDNA3.1载体上，构建的质粒命名为p-S-IL-4，经菌落PCR及酶切验证后，送去测序。所获得的序列经BLAST及DNAstar与Genbank上已发表的序列比对。所克隆的猪的IL-4序列与已经在Genebank上发表的序列的同源性为100％。

1.2重组蛋白表达质粒pLVX-S-IL-4的构建

设计一对引物，上游引物5’端引入载体同源臂、BamHI酶切位点(下划线为酶切位点)，下游引物5’端引入XbaI酶切位点(下划线为酶切位点)，引物序列如下：

P5：CGCGGGCCCGGGATCCGCCACCATGGGTCTCACCTC

P6：GGTAGAATTATCTAGATTAATGATGATGATGATGGTGACAC

以PCR反应结束后，在1.0％琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后，连接到线性化的质粒pLVX-N1(pLVX-AcGFP1-N1去除绿色荧光蛋白AcGFP1基因并线性化，末端为BamHI和XbaI酶切位点)上，构建的质粒命名为pLVX-S-IL-4，经菌落PCR及酶切验证后，送去测序。所获得的序列经BLAST及DNAstar与Genbank上已发表的序列比对。所克隆的猪的IL-4序列与已经在Genebank上发表的序列的同源性为99％，仅在85处有一个碱基C突变成T，进一步分析表明这个点突变并不引起氨基酸的突变，和Genebank上已发表的猪的IL-4序列表达相同的IL-4蛋白。

1.3猪IL-4信号肽基因的克隆

以上述pLVX-S-IL-4为模板，根据NCBI中收录的猪的IL-4基因序列(NM_214123.1)设计引物扩增猪IL-4的信号肽序列，引物序列如下：

P7：CGCGGGCCCGGGATCCGC

P8：GGGTGGGCGGGTGGGAGCTCCGTGGACGAAGTTGCTGGTAC

PCR反应结束后，在2.0％琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后保存备用。

1.4猪GM-CSF基因的克隆

以上述cDNA为模板，根据NCBI中收录的猪的GM-CSF基因序列(NM_214118.2)设计引物，扩增猪的GM-CSF的CDS区序列。并在上游引物5’端引入载体同源臂、kozak序列、NheI酶切位点(下划线为酶切位点)，下游引物5’端分别引入His₆标签序列，引物序列如下：

P9：ACCCAAGCTGGCTAGCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTGCTTC

P10：TTAATGATGATGATGATGGTGCTTTTTGACTGGCCCCCAGCAG

P11：ACCCAAGCTGGCTAGCGCC

P12：GCCCTCTAGACTCGAGTTAATGATGATGATGATGGTGCTTTTTG

PCR反应结束后，在1.0％琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后，连接到pcDNA3.1载体上，构建的质粒命名为p-S-GM-CSF，经菌落PCR及酶切验证后，送去测序。所获得的序列经BLAST及DNAstar与Genbank上已发表的序列比对。所克隆的猪的GM-CSF序列与已经在Genebank上发表的序列的同源性为100％。

1.5猪GM-CSF成熟肽基因的克隆

以上述p-S-GM-CSF为模板，根据NCBI中收录的猪的GM-CSF基因序列(NM_214118.2)设计引物扩增猪GM-CSF的成熟肽序列，引物序列如下：

P13：GTACCAGCAACTTCGTCCACGGAGCTCCCACCCGCCCACCC

P14：GGTAGAATTATCTAGATTAATGATGATGATGATGGTGCTTT

PCR反应结束后，在1.0％琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后保存备用。

1.6重组蛋白表达质粒pLVX-S-GM-CSF的构建

将已经回收的猪的IL-4信号肽基因片段和GM-CSF成熟肽基因片段通过in-fusion的方法连接到线性化的质粒pLVX-N1上，转化JM109感受态菌株。构建的质粒命名为pLVX-S-GM-CSF，经菌落PCR验证后，送去测序。所获得的序列经BLAST及DNAstar与Genbank上已发表的序列比对。所克隆的猪的IL-4信号肽和GM-CSF成熟肽序列与已经在Genbank上发表的序列的同源性为100％。

实施例2. pLVX-S-IL-4-G、pLVX-S-GM-CSF-G重组表达载体的构建

2.1 ZsGreen1基因的克隆

参照载体说明书设计一对扩增绿色荧光蛋白ZsGreen1基因的引物，在上游引物引入与His₆标签3’末端的同源臂序列；在下游引物引入骨架载体5’末端的同源臂序列，两序列之间引入XbaI酶切位点(下划线为酶切位点)，引物序列如下：

P15：CACCATCATCATCATCATATGGCCCAGTCCAAGCAC

P16：GGTAGAATTATCTAGATCAGGGCAAGGCGGAGCC

以pLVX-shRNA2质粒为模板，用合成的P15、P16引物常规PCR克隆，PCR反应结束后，在1.0％琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后保存备用。

2.2重组蛋白表达质粒pLVX-S-IL-4-G的构建

设计一对引物，上引物5’端分别引入载体同源臂、BamHI酶切位点(下划线为酶切位点)，下游引物引入与ZsGreen1 5’末端的同源臂序列，引物序列如下：

P17：CGCGGGCCCGGGATCCGCCACCATGGGTCTCACCTC

P18：GTGCTTGGACTGGGCCATATGATGATGATGATGGTG

以p-S-IL-4为模板，用合成的P17、P18引物常规PCR克隆。反应结束后，在1.0％琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后保存备用。将回收的DNA片段与绿色荧光蛋白ZsGreen1基因片段通过in-fusion的方法连接到线性化的质粒pLVX-N1上，转化JM109感受态菌株。构建的质粒命名为pLVX-S-IL-4-G，经菌落PCR验证后，送去测序。所获得的序列经BLAST跟所需序列比对，同源性为100％。

2.3重组蛋白表达质粒pLVX-S-GM-CSF-G的构建

P19：CGCGGGCCCGGGATCCGCCACCATGTGGCTGCAGAAC

P20：GTGCTTGGACTGGGCCATATGATGATGATGATGGTG

以pLVX-S-GM-CSF为模板，用合成的P19、P20引物常规PCR克隆。反应结束后，在1.0％琼脂糖中电泳，切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后保存备用。将回收的DNA片段与绿色荧光蛋白ZsGreen1基因片段通过in-fusion的方法连接到线性化的质粒pLVX-N1上，转化JM109感受态菌株。构建的质粒命名为pLVX-S-GM-CSF-G，经菌落PCR验证后，送去测序。所获得的序列经BLAST跟所需序列比对，同源性为100％。

实施例3.重组蛋白GM-CSF和IL-4在HEK-293细胞中瞬时表达

转化大肠杆菌，将重组质粒pLVX-S-GM-CSF、pLVX-S-IL-4、pLVX-S-GM-CSF-G、pLVX-S-IL-4-G用无内毒素质粒提取试剂盒提取和纯化质粒，具体操作步骤见说明书，提取的质粒保存于-20℃，准备细胞转染。重组表达载体转染细胞可用本领域技术人员熟知的常规方法进行。本发明采用脂质体法，分别在四个75mL细胞瓶中转染四种质粒。待细胞铺满培养皿底的70％-80％时，改用无血清、无抗生素的DMEM培养基洗涤细胞2次，按X-tremeGENE HP DNA转染试剂说明书，将四种重组质粒分别转染。细胞培养8h后弃去混合液，用无血清、无抗生素的DMEM培养基洗涤细胞2次，用体积分数10％胎牛血清、链霉素100ug/mL，青霉素100U/mL的DMEM培养基培养60h。pLVX-S-GM-CSF-G和pLVX-S-IL-4-G转染组作为对照，通过荧光显微镜观察，图5显示重组蛋白表达情况。

实施例4.重组蛋白诱导猪骨髓源树突状细胞

取健康仔猪股骨骨髓制成单细胞悬液，去除红细胞，加入完全培养基，台盼蓝染色计数后以2×10⁵细胞/孔接种到24孔板，再加入含有的GM-CSF和IL-4两种重组蛋白的细胞培养上清，以1∶5-1∶2560共10个稀释度加入到细胞中，设阴性对照(只含完全培养基)和阳性对照(按照说明书添加商品化的细胞因子IL-4和GM-CSF)，37℃，5％CO₂培养箱中静置培养，48h全量换液，96h半量换液，6天后收集细胞。(1)显微镜下进行形态学观察：图6结果显示诱导的细胞形成集落，具有典型树突状细胞的形态。(2)免疫荧光观察和流式细胞术鉴定树突状细胞表型：取稀释度为1∶5、1∶20、1∶80、1∶320的重组蛋白处理组，每组分成两份，第一份分别加入10μL PE标记小鼠抗猪CD1a单抗和10μL FITC标记小鼠抗猪SLA-II-DR单抗；第二份分别加入10μL PE标记小鼠抗猪SWC3a单抗和10μL FITC标记小鼠抗猪SLA-II-DR单抗，室温下避光孵育30min；2500r/min，离心5min，用0.01M PBS洗涤细胞2次，除去未吸附的荧光抗体；最后加入200uL的0.01M PBS重悬细胞，用少量细胞制备细胞爬片在荧光显微镜下进行观察。图7结果显示CD1a、SLA-II、SWC3a分子均匀分布在细胞膜上，且诱导产生的细胞具有典型树突结构。用1×10⁴个细胞进行流式细胞术检测。用未加荧光抗体(用0.01M PBS代替)的细胞作为细胞本底。图8结果显示CD1a⁺/SLA-II⁺的细胞为46.5％-67.6％，SWC3a⁺/SLA-II⁺的细胞为36.6-51.4％，说明通过本发明技术得到的细胞为未成熟的猪树突状细胞。(3)细胞吞噬试验鉴定树突状细胞功能：取稀释度为1∶10、1∶40、1∶160、1∶640、1∶1280的重组蛋白处理组，每组分成两份，第一份加入FITC标记的葡聚糖置于37℃避光作用30min，第二份加入FITC标记的葡聚糖置于4℃避光作用30min；作用完毕后，各组细胞加入0.01M PBS，2500r/min，离心5min，弃上清，重复洗涤2次，除去未吸附的葡聚糖；用1×10⁴个细胞进行流式细胞术检测。0.01M PBS替代FITC标记葡聚糖的细胞作为阴性对照。图9结果显示诱导产生的树突状细胞细胞具有很强的吞噬葡聚糖颗粒的功能。

实施例5.重组蛋白诱导猪外周血源树突状细胞

取健康仔猪前腔静脉外周血，抗凝处理，用淋巴细胞分离液梯度离心获得单个核细胞(PBMC)，去除红细胞，加入完全培养基，台盼蓝染色计数后以5×10⁵细胞/孔接种到6孔板，再加入含有的GM-CSF和IL-4重组蛋白的细胞培养上清，以1∶40-1∶160共3个稀释度加入到细胞中，设阴性对照(只含完全培养基)和阳性对照(按照说明书添加商品化的细胞因子IL-4和GM-CSF)，37℃，5％CO₂培养箱中培养48h，半量换液，再静置培养48h，半量换液，再培养48h。(1)收集细胞进行形态学观察：图10结果显示诱导的细胞形成集落，具有典型树突状细胞的形态。(2)流式细胞术鉴定树突状细胞表型：每个稀释度分成两份，第一份分别加入10μL PE标记小鼠抗猪CD1a单抗和10μL FITC标记小鼠抗猪SLA-II-DR单抗；第二份分别加入10μL PE标记小鼠抗猪SWC3a单抗和10μL FITC标记小鼠抗猪SLA-II-DR单抗，室温下避光孵育30min；2500r/min，离心5min，用0.01M PBS洗涤细胞2次，除去未吸附的荧光抗体；最后加入200uL的0.01MPBS重悬细胞。用未加荧光抗体(用0.01M PBS代替)的细胞作为细胞本底。用1×10⁴个细胞进行流式细胞术检测，图11结果显示CD1a⁺/SLA-II⁺的细胞为89.3-92.1％，SWC3a⁺/SLA-II⁺的细胞为44.7-53.1％。说明通过本发明技术得到的细胞为未成熟的猪树突状细胞。

Claims

1.一种高效制备猪IL-4重组蛋白的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：通过PCR扩增获得带有kozak序列、IL-4基因的CDS区和His₆标签的序列，用in-fusion同源重组技术拼接到去除AcGFP1基因的pLVX-AcGFP1-N1载体的克隆位点中构建重组质粒；重组质粒转染哺乳动物细胞进行重组蛋白的分泌表达。

2.一种高效制备猪GM-CSF重组蛋白的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：通过PCR扩增获得带有kozak序列、IL-4信号肽基因、GM-CSF成熟肽基因、His₆标签的序列片段，用in-fusion同源重组技术拼接到去除AcGFP1基因的pLVX-AcGFP1-N1载体的克隆位点中构建重组质粒；重组质粒转染哺乳动物细胞进行重组蛋白的分泌表达。

3.一种体外制备猪骨髓源树突状细胞的方法，其特征在于，所述树突状细胞是通过使用权利要求1中所述的重组蛋白制备的。

4.一种体外制备猪外周血源树突状细胞的方法，其特征在于，所述树突状细胞是通过使用权利要求1中所述的重组蛋白制备的。