CN116334000A - 一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法及低免疫原性iPSC细胞 - Google Patents

一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法及低免疫原性iPSC细胞 Download PDF

Info

Publication number
CN116334000A
CN116334000A CN202210973823.7A CN202210973823A CN116334000A CN 116334000 A CN116334000 A CN 116334000A CN 202210973823 A CN202210973823 A CN 202210973823A CN 116334000 A CN116334000 A CN 116334000A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ipsc
seq
cells
cell
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210973823.7A
Other languages
English (en)
Inventor
葛文雪
陈涛涛
王嘉显
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Help Stem Cell Innovations Co ltd
Original Assignee
Help Stem Cell Innovations Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Help Stem Cell Innovations Co ltd filed Critical Help Stem Cell Innovations Co ltd
Priority to CN202210973823.7A priority Critical patent/CN116334000A/zh
Publication of CN116334000A publication Critical patent/CN116334000A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于细胞技术领域，涉及一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法及低免疫原性iPSC细胞，所述制备方法包括使用CRISPR系统：向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向B2M位点的sgRNA的质粒，以敲除B2M蛋白；向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向CⅡTA位点的sgRNA的质粒，以敲除CⅡTA蛋白；向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向AAVS1位点并插入编码CD47蛋白胞外段的多核酸序列sgRNA的质粒。本申请采用快速的iPSC细胞编辑方式实现低免疫原性iPSC细胞系的构建。

Description

一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法及低免疫原性iPSC细胞
技术领域
本发明属于细胞技术领域，涉及一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法及低免疫原性iPSC细胞。
背景技术
诱导多能干细胞(iPSC)最初是日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)于2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc)的组合转入成人的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种多能干细胞。
人诱导多能干细胞具有如下特性：没有伦理问题；细胞来源容易，利用成体细胞（如皮肤，血液）可获得；具备强分化能力，能分化出不同的功能细胞；可无限扩增，可降低成本且细胞一致性高。
人诱导多能干细胞来源或衍生细胞产品具有用于临床移植治疗的前景。但实践证明，无论是何种来源的细胞产品，在移植进入人体时，均容易产生同种异体排斥。细胞表面表达的人白细胞抗原(HLA)，即由位于6号染色体上人主要组织相容性复合物中的基因编码的分子是免疫排斥的主要介体。供体与受试者之间单个HLA基因的错配可能引起稳健的免疫应答 [1]。HLA基因分为MHC I类(MHC-I)和MHC II类(MHC-II)。因此，敲除I类和II类HLA基因的表达，是获得低免疫原性细胞的有效方式。然而，也有研究表明，同时敲除了I类和II类HLA抗原表达的细胞，在移植到体内后容易受到NK细胞的攻击和杀伤；而过表达CD47基因，可有效避免NK细胞的杀伤[2]。
综上所述，为了尽可能降低同种异体免疫排斥，获得可用于细胞治疗的通用供体细胞，需要同时敲除I类和II类HLA基因，并引入耐受NK细胞杀伤的基因。现有技术如[3]公开了获得此种细胞的方法，但其步骤繁琐，引入三种编辑至少需要经过两步转染及两次克隆挑选及鉴定，不易实现标准化和高通量生产。
[1] Fleischhauer K .等人“Bone marrow-allograft rejection by Tlymphocytes recognizing a single amino acid difference in HLA-B44,”N Engl JMed .,1990 ,323:1818-1822。
[2] Jaiswal S et al. CD47 is upregulated on circulating hematopoieticstem cells and leukemia cells to avoid phagocytosis. Cell 138, 271–285(2009)。
[3] 中国专利CN113423727A 通用供体细胞。
[4] Wilkinson, Miles F. (2019). Genetic paradox explained bynonsense. Nature, 568(7751), 179–180. doi:10.1038/d41586-019-00823-5。
[5]CN106446600A“一种基于CRISPR/Cas9的sgRNA的设计方法”。
发明内容
本申请提供一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法及低免疫原性iPSC细胞，其优点在于采用一步法，仅需一步转染及克隆选择和鉴定，即可同时实现对I类、II类HLA的敲除和对NK杀伤耐受基因的引入，步骤简单，编辑效率高，效果明确。
为实现上述技术目的，本申请采取的技术方案为，一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法，包括基于电转染方式，使用CRISPR系统，对iPSC细胞的基因组同时进行如下编辑：
i）向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向B2M位点的sgRNA的质粒，以敲除B2M蛋白；
ii）向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向CⅡTA位点的sgRNA的质粒，以敲除CⅡTA蛋白；
iii）向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向AAVS1位点并插入编码CD47蛋白胞外段的多核酸序列sgRNA的质粒。
作为本申请改进的技术方案，iPSC细胞用量为1×106-1×107个细胞，各质粒用量分别为0.5μg-5μg。
作为本申请改进的技术方案，三种基因的编辑仅通过一步式电转染、一次克隆挑选和鉴定操作实现。
作为本申请改进的技术方案，在编码CD47蛋白胞外段的多核苷酸序列前添加提高mRNA表达量或提高mRNA剪接效率的DNA元件，DNA元件为剪接受体位点和2A肽序列，序列为：SEQ ID NO:33。
作为本申请改进的技术方案，向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向B2M位点的sgRNA的质粒，以敲除B2M蛋白，该sgRNA的序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。
作为本申请改进的技术方案，向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向CⅡTA位点的sgRNA的质粒，以敲除CⅡTA蛋白，该sgRNA的序列为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。
作为本申请改进的技术方案，编码CD47蛋白胞外段的多核苷酸序列为：SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16；靶向AAVS1位点并插入编码CD47蛋白的sgRNA序列为：SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25或SEQ ID NO:26。
本申请的另一目的是提供一种低免疫原性iPSC细胞，该低免疫原性iPSC细胞通过前述的方法产生。
作为本申请改进的技术方案，所述低免疫原性iPSC细胞具有分化为NK细胞、巨噬细胞、T细胞、心肌细胞、内皮细胞、神经祖细胞、神经元细胞、间充质干细胞、肺部细胞以及肝脏细胞的能力。
有益效果
已有公开技术方案采用慢病毒载体转染的方式导入Cas9和sgRNA质粒对iPSC进行基因编辑。相对于现有技术，本申请提供采用电转染导入Cas9和sgRNA质粒的方式对iPSC进行基因编辑，其具有有效转染细胞所需的时间短、外源基因表达时间较快、转染后24小时可以观察到目的基因高效表达的特性。相对于现有技术利用病毒载体系统至少需要72小时之后才可以观察到目的基因的表达，这极大地减少了后续临床转化应用中iPSC体外培养的时间。
本申请采用一步式（定义：即一次操作）同时进行B2M与CⅡTA的敲除以及CD47的插入，并设定CD47的插入位点。通过结合目标基因的家族基因共性、电转特性以及电转步骤设计的方式，有效避免多位点基因同时敲除带来遗传基因的突变、以及基因敲除过程中遗传补偿等综合因素，最终实现B2M与CⅡTA的不表达以及CD47的过表达；同时通过单次电转实现多个位点的编辑，能够有效降低电穿孔导致的高细胞死亡率。
本申请通过B2M、CⅡTA以及CD47编辑位点的选择，促使B2M、CⅡTA不再表达，同时CD47具有较高的阳性表达率，同时保证经过编辑后的iPSC细胞后期优良的分化效果、以及稳定性。
附图说明
图1 绘示靶向AAVS1位点的CD47同源重组模板质粒图谱；
图2 绘示未编辑的iPSC的B2M流式检测图；
图3绘示一步式电转染编辑的iPSC的B2M流式检测图；
图4绘示分步式电转染编辑的iPSC的B2M流式检测图；
图5绘示未编辑的iPSC的CⅡTA流式检测图；
图6绘示一步式电转染编辑的iPSC的CⅡTA流式检测图；
图7绘示分步式电转染编辑的iPSC的CⅡTA流式检测图；
图8绘示未编辑的iPSC的CD47流式检测图；
图9绘示一步式电转染编辑的iPSC的CD47流式检测图；
图10绘示分步式电转染编辑的iPSC的CD47流式检测图；
图11绘示iPSC检测CD47的免疫荧光强度：(a)绘示图8免疫荧光强度，(b)绘示图10免疫荧光强度，(c)绘示图9免疫荧光强度；
图12绘示一步式电转染编辑的iPSC的B2M基因qPCR测序图；
图13绘示一步式电转染编辑的iPSC的CⅡTA基因qPCR测序图；
图14绘示一步式电转染编辑的iPSC的CD47基因qPCR测序图；
图15 绘示未编辑的iPSC分化NK流式测试图；
图16 绘示一步式电转染编辑的iPSC分化NK流式测试图；
图17 绘示分步式电转染编辑的iPSC分化NK流式测试图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例,本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。除非另作定义,此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
定义
低免疫原性iPSC细胞：通常是指相对于未经修饰的iPSC细胞，在细胞移植过程中较不易发生同种异体排斥和/或在移植后展示出增加的存活的经基因编辑的细胞。在一些实施例中，如本文所述的经基因编辑的细胞是低免疫原性iPSC细胞。在一些实施例中，与未经基因编辑的iPSC细胞相比，低免疫原性iPSC细胞不表达HLA-ABC和HLA-DR，并高表达CD47，因而具有逃避或耐受免疫反应，从而在移植宿主体内实现更长存活的特性。
CRISPR-内切核酸酶系统：是原核生物中天然存在的防御机制，该防御机制经改造后可以用于真核细胞的定点基因编辑。CRISPR系统包括I、II、III、IV、V和VI型系统。在一些方面，CRISPR系统是II型CRISPR/Cas9系统。
基因编辑：对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。基因编辑的技术原理为：在细胞内利用外源切割复合体特异性识别并切割目的基因序列，在目的基因序列上制造断裂端，这种断裂端随即会被细胞内部的DNA损伤修复系统修复，重新连接起来。本申请主要应用的基因编辑技术集中于同源重组与CRISPR系统。一般的基因编辑的流程包括如下环节：基因选择，设计序列，CRISPR载体和同源重组模板载体的构建，CRISPR载体和同源重组模板载体向细胞内的导入，克隆挑取和克隆鉴定；本申请集中于通过一步式电转染的方式实现三种免疫原性相关目的位点的基因编辑，并相应的仅通过一次克隆挑选和鉴定操作获得基因组中同时含有三种基因编辑的低免疫原性iPSC细胞系。
同时进行：是在同一基因编辑的步骤中采用多种质粒，每种质粒携带各自独立的sgRNA，结合Cas9酶，在CRISPR系统中对iPSC细胞（人诱导多能干细胞）进行多个目标基因的编辑；或者是在同一质粒上携带多种基因的sgRNA，该质粒结合Cas9酶，在CRISPR系统中对iPSC细胞（人诱导多能干细胞）进行多个目标基因的编辑。编辑包括基因的定点删除与基因的定点插入。
在基因内或附近：是指基因组DNA的作为所述基因的内含子或外显子组分、或位于所述基因近侧的位点或区域。在一些实施例中，如果基因组DNA的位点包含基因的内含子或外显子的至少一部分，则该基因组DNA的位点在所述基因内。在一些实施例中，基因组DNA的位于基因附近的位点可以在所述基因的5'或3'端(例如，所述基因的编码区的5'或3'端)。在一些实施例中，基因组DNA的位于基因附近的位点可以是调控所述基因的表达的启动子区或阻遏子区。在一些实施例中，基因组DNA的位于基因附近的位点可以与所述基因在同一染色体上。在一些实施例中，如基因组DNA的位点或区域在基因的5'或3'端(例如，所述基因的编码区的5'或3'端)的50Kb范围内，如50Kb、40Kb、30Kb、20Kb、10Kb、5Kb、1Kb、500bp、100bp内或更接近，则该基因组DNA的位点或区域在所述基因附近。
靶点选择：一旦CRISPR-内切核酸酶复合物在靶位点处与DNA结合，内切核酸酶内的两个独立的核酸酶结构域便各自在PAM位点上游三个碱基处裂解DNA链之一，从而留下双链断裂(DSB)，在这里DNA的两条链以碱基对(平末端)终止。
碱基缺失或插入：基因编辑序列中插入或丢失一个或多个碱基，其结果是突变点下游碱基序列发生移码，编辑氨基酸序列都发生改变，又称移码突变，并可在突变点下游提前出现终止密码。
本申请的技术原理
本申请是通过基因编辑的方式敲除I类和II类HLA的表达调控基因B2M和CⅡTA，实现了对I类和II类HLA表达的敲除；引入CD47基因，实现了对于NK细胞杀伤的耐受。主要是包括使用CRISPR系统，对iPSC细胞的基因组同时进行如下编辑：i）在该细胞编码B2M蛋白的基因内或其附近的位点处引入至少一个碱基对的缺失和/或插入；ii）在该细胞编码CⅡTA蛋白的基因内或其附近的位点处引入至少一个碱基对的缺失和/或插入；iii）在该细胞基因组设定的位点处引入编码表达CD47蛋白或其一部分的至少一种多个碱基的插入；设定的位点为编码AAVS1的基因位点内；以上三种基因编辑仅使用一步式电转染操作实现。
本申请充分利用现有技术sgRNA的设计原理，并结合电转染快速特性，创造性将电转染与CRISPR结合应用于多位点的同步转染，既避免慢病毒转染所带来的不良免疫反应、毒性作用以及病毒基因组整合导致遗传性缺陷等风险，又避免了多次电转对细胞的损伤（如细胞死亡、多个位点在进行敲除与插入时由于移码产生的突变）。同时，本申请采用一步式电转染操作有效缩短操作时间，能够实现批量化编辑iPSC细胞，同时保证编辑后iPSC细胞存活率以及后期分化效率。
在一些实施例中，该细胞编码B2M蛋白的基因内或其附近的位点处引入至少一个碱基对缺失或插入：是在B2M蛋白的基因的起始密码子的第二个碱基处引入至少一个碱基的缺失或插入，或者在B2M蛋白的基因的起始密码子上游1bp-100bp处进行引入至少十个碱基的缺失，或是在B2M蛋白的基因的起始密码子下游1bp-400bp处进行引入至少一个碱基的缺失。
优选地是，编码B2M蛋白的基因内或其附近的位点处引入至少一个碱基对缺失或插入：是采用编码B2M的sgRNA（向导RNA）结合质粒，共同构建B2M-CRISPR质粒；其中，质粒选用PX458；编码B2M的sgRNA的序列为：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。
在一些实施例中，编码CⅡTA蛋白的基因内或其附近的位点处引入至少一个碱基对缺失或插入：是在CⅡTA蛋白基因的起始密码子的第二个碱基处引入至少一个碱基的缺失或插入，或者在CⅡTA蛋白基因的起始密码子上游1bp-300bp处进行引入至少一个碱基的缺失，或是在CⅡTA蛋白基因的起始密码子下游1bp-600bp处进行引入至少一个碱基的缺失。
优选地是，编码CⅡTA蛋白的基因内或其附近的位点处引入至少一个碱基对缺失或插入的方法是采用编码CⅡTA位点的sgRNA（向导RNA）结合质粒，共同构建CⅡTA-CRISPR质粒；其中，质粒选用PX458；编码sgRNA的序列为：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。
本申请直接将CD47的插入位点设计为AAVS1的基因内,并设计在设定的位点处引入编码表达CD47蛋白或其一部分的至少一种多个碱基的插入的sgRNA。该方式既简化sgRNA的设计程序，也有效利用了AAVS1位点染色体组成型活跃表达的特点，避免了插入的CD47基因在iPSC分化后可能的基因沉默。
其中，CD47的插入方式为：建立CD47插入序列，并将该插入序列导入克隆载体，形成CD47-insert质粒（CD47-插入质粒），CD47-insert质粒在Cas9酶的作用下基于CRISPR系统导入iPSC细胞。在一些方案中CD47插入序列可选择编码CD47全长蛋白的多核苷酸序列；在另一些方案中CD47插入序列可选择编码CD47部分长度蛋白的多核苷酸序列如SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16。优选选择编码CD47部分长度蛋白的多核苷酸序列，目的在于：其一降低载体质粒的大小，降低电转染的工艺复杂度要求，从而提高转染效率，进而提高基因编辑效率；其二降低细胞对外源蛋白的转录和翻译压力，有效提高CD47在膜表面的表达水平。
优选地是，在编码CD47部分长度蛋白的多核苷酸序列前可添加提高mRNA表达量或提高mRNA剪接效率的DNA元件，其中优选的DNA元件为剪接受体位点（SA）和2A肽序列（2A），序列为：ctgacctcttctcttcctcccacagggcctcgagagatctggcagcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccct （SEQ ID NO:33），其具有的优势：相对于未添加合成剪接受体位点（SA）和2A肽序列（2A），iPSC具有B2M和CⅡTA低表达，以及高表达的CD47（编辑后的iPSC具有更高CD47的表达量），该部分和未添加合成剪接受体位点（SA）和2A肽序列（2A）的CD47插入的实验步骤一致、实验结果相差无几，故本文省略重复描述；但在后期大量的iPSC分化为NK细胞、巨噬细胞、T细胞、心肌细胞、内皮细胞、神经祖细胞、神经元细胞、间充质干细胞、肺部细胞以及肝脏细胞过程中，统计发现添加合成剪接受体位点（SA）和2A肽序列（2A）的iPSC分化后的细胞具有更稳定的低免疫原性。
本申请的另一目的是提供一种低免疫原性iPSC细胞，该低免疫原性iPSC细胞通过前述的方法产生。
在一些实施方案中，所述低免疫原性iPSC细胞具有分化为NK细胞、巨噬细胞、T细胞、心肌细胞、内皮细胞、神经祖细胞、神经元细胞、间充质干细胞、肺部细胞以及肝脏细胞的能力。具体分化，可引入专利CN113801846A、CN109504654B。
在一些实施方案中，所述NK细胞具有在治疗实体瘤与血液瘤中的用途；所述心肌细胞具有在治疗心血管疾病中的用途；所述神经元细胞具有在治疗神经退行性疾病中的用途；所述肺部细胞具有在治疗肺部系统疾病中的用途。
本申请还提供一种低免疫原性iPSC细胞的组合物，包含低免疫原性iPSC细胞，所述低免疫原性iPSC细胞的制备是基于前述的方法获得；或所述低免疫原性iPSC细胞是前述的低免疫原性iPSC细胞。
实施例1
载体的构建
1）CRISPR基因编辑载体的选择：同时表达Cas9和sgRNA的质粒/载体选择获取自Addgene的PX458；
2）将目标sgRNA的插入PX458：通过常规分子克隆方法将两个BbsI位点（245位点和267位点）之间的序列替换为相应的sgRNA序列，即获得了相应的目标sgRNA载体。
实验共构建4个sgRNA质粒，其编号和sgRNA序列对应的表格如表1：
表1 4个sgRNA
名称/编号 用途 针对位点 序列
B2M-sgRNA CRISPR载体 B2M SEQ ID NO:2
CⅡTA-sgRNA CRISPR载体 CⅡTA SEQ ID NO:8
AAVS1-sgRNA CRISPR载体 AAVS1 SEQ ID NO:21
AAVS1-CD47序列 同源重组模板载体 AAVS1（插入CD47） SEQ ID NO:20
3）CD47同源重组模板载体的选择：选择获取自Addgene的pUC57载体作为骨架。
4）靶向AAVS1位点的CD47同源重组模板质粒的构建：合成AAVS1左侧同源臂，序列为：SEQ ID NO:17；合成AAVS1右侧同源臂，序列为：SEQ ID NO:18；合成编码CD47胞外段DNA，序列为：SEQ ID NO:13；通过常规分子克隆方法将上述三段序列依次插入pUC57载体的EcoRⅠ位点至HindⅢ位点之间，即获得携带左右同源臂和同源重组模板的目标质粒，测序正确，图谱如图1，AAVS1-CD47的序列如下：SEQ ID NO:19。
实施例2电转染
2.1 iPSC使用标准方法培养至90%汇合度，iPSC使用标准方法培养至90%汇合度，消化细胞并计数。
2.2 细胞计数后，取出1×106-1×107个细胞（本实施例为1×106），低速离心，取出离心管至生物安全柜中，拧开管盖，吸弃上清。定义，低速离心为转速为8000 r/min以下，相对离心力为10000×g以下的离心。
2.3将上述四种质粒分别吸取0.5μg-5μg（优选为0.5μg-2μg，本实施例选用1μg），加入电转buffer中。四种质粒分别吸取0.5μg-5μg，具体可设计为0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1μg、1.1μg、1.2μg、1.3μg、1.4μg、1.5μg、1.6μg、1.7μg、1.8μg、1.9μg、2μg 、2.1μg、2.2μg、2.3μg、2.4μg、2.5μg、2.6μg、2.7μg、2.8μg、2.9μg……。这里电转缓冲液（buffer）也可选择如下几类：第1 类为细胞培养液，如RPMI 1640，DMEM，DMEM／F12等；第 2 类为磷酸缓冲液，如K—PBS、HBS、HeBs、PBS等；第3类为Cytomix缓冲液，Cytomix 配方如下：120mmol／LKCl、0.15mmol／L CaCl2、10mmol／L K2HP04 (pH=7.6)、25mmol／L HEPES(pH=7.6)、2mmol／LEGTA(pH=7.6)、5mmol／L MgCl2、2mmol／L ATP与5mmol／L谷胱苷肽。本实施例选用电转buffer来自厂家百恩维、货号：UES0001。
2.4 用100μl移液枪吹打8-10次混匀后，将全部液体吸出后加入前述获得的细胞沉淀中；将电转杯取出并放入电转仪的转染室中进行电转，其中电转仪使用Lonza2b，电转程序为B016（系统设定程序）。电转结束后取出电转杯放进生物安全柜中。
实施例3电转挑克隆
3.1 每天更换2ml Stemflex培养基，培养两天后，将细胞消化、计数，并接种5000个细胞于10cm皿中（预先铺好Matrigel，并加入10ml Stemflex+Rocki培养基），Stemflex+Rocki培养基中Rocki浓度为10μM。
3.2 培养7天左右，在层流工作台中进行单克隆的挑取，共挑取48个克隆，分别接种于2块24孔板（预先铺好Matrigel，每孔加入500ul Stemflex+Rocki培养基），继续培养7天左右，进行阳性克隆的验证。
3.3 三重编辑克隆的鉴定。
实施例4 比对分析
方式一：一步式电转染，是在电转染过程中一次将B2M-sgRNA（SEQ ID NO:2）、CⅡTA-sgRNA（SEQ ID NO:8）、AAVS1-sgRNA（SEQ ID NO:21）、和AAVS1-CD47载体（SEQ ID NO:20）同时加入电转buffer，并在电转结束后进行一次挑克隆。周期大概1个月。
方式二：分步式电转染，是在电转染过程中先加入B2M-sgRNA载体，在电转结束并培养7天后进行第一次挑克隆，获得第一重基因编辑的阳性克隆；随后在电转染过程中加入B2M-sgRNA载体，在电转结束并培养7天后进行第二次挑克隆，获得第二重基因编辑的阳性克隆；随后在电转染过程中加入AAVS1-sgRNA载体和AAVS1-CD47同源重组模板载体，在电转结束并培养7天后进行第三次挑克隆，最终获得第三重基因编辑的阳性克隆，周期3个月。
细胞活率与转染效率（阳性率）比较:
一步法：四种质粒用量分别为0.5μg-5μg，此时阳性率约10%，实验周期1个月。
分步法：四种质粒用量分别为0.5μg-5μg，每次电转阳性率约20%，总电转阳性率为20%的四次方，实验周期每次电转周期为1个月，总周期4个月。
流式检测：
分别对未编辑的iPSC、方式一获得的iPSC以及方式二获得的iPSC进行流式细胞仪检测。
图2、图3和图4分别显示的为未编辑的iPSC、方式一获得的iPSC、方式二获得的iPSC检测B2M的流式检测结果，结果显示方式一获得的iPSC、方式二获得的iPSC相对于未编辑的iPSC均具有较低表达的B2M。
图5、图6和图7分别显示的为未编辑的iPSC、方式一获得的iPSC、方式二获得的iPSC检测CⅡTA的流式测试结果，结果显示方式一获得的iPSC、方式二获得的iPSC相对于未编辑的iPSC均具有较低表达的CⅡTA。
图8、图9和图10分别显示的为未编辑的iPSC、方式一获得的iPSC、方式二获得的iPSC检测CD47的流式测试结果，图11则显示未编辑的iPSC、方式一获得的iPSC、方式二获得的iPSC检测CD47的免疫荧光强度，结果显示方式一获得的iPSC、方式二获得的iPSC相对于未编辑的iPSC均具有更高表达的CD47。
综合结果见表2。分析上述结果能明确得到：无论是方式一还是方式二均能获得低表达的B2M和CⅡTA，以及高表达的CD47（编辑后的iPSC具有更高CD47的表达量），且在iPSC分化为其他细胞过程中CD47能够继续表达，因此分化后的iPSC具有低免疫原性（未编辑的iPSC在分化为其他细胞过程中CD47低表达或不表达，因此具有免疫原性）。同时，方式一对iPSC进行编辑后B2M、CⅡTA的表达均略低于方式二对iPSC进行编辑后B2M、CⅡTA的表达，方式一对iPSC进行编辑后CD47的表达略高于方式二对iPSC进行编辑后CD47的表达。
表2 流式检测结果表
方式 目标基因 目标基因表达量（%）
未编辑的iPSC B2M 46.75
未编辑的iPSC CⅡTA 0.71
未编辑的iPSC CD47 99.93（平均荧光强度10095.5）
方式一获得的iPSC B2M 0.13
方式一获得的iPSC CⅡTA 0.06
方式一获得的iPSC CD47 99.94（平均荧光强度：729692.6）
方式二获得的iPSC B2M 0.50
方式二获得的iPSC CⅡTA 0.21
方式二获得的iPSC CD47 99.75（平均荧光强度：629964.6）
实施例5 对经方式一获得的iPSC细胞进行PCR即测序：
用DNA提取试剂盒提取各孔细胞基因组DNA，进行RCR克隆。
克隆验证基于的测序引物如下表3：
表3 PCR实验用引物设计
基因表达 引物名称 序列 (5’--->3’)
B2M B2M Primer F ggagaaaccc tgcagggaat （SEQ ID NO:27）
B2M B2M Primer R tctaagggaa gcagagccgc （SEQ ID NO:28）
CⅡTA CⅡTA Primer F caccctgtga ggtgactgag（SEQ ID NO:29）
CⅡTA CⅡTA Primer R tgcaaacttg ggtaggtcgt （SEQ ID NO:30）
CD47 CD47 Primer F ccactgtccc cactgacttt （SEQ ID NO:31）
CD47 CD47 Primer R agctcgatga tcgtttcacc （SEQ ID NO:32）
注：Primer F代表上游引物，Primer R代表下游引物。
B2M的检测：提取B2M敲除株的基因组DNA，并通过特定引物进行PCR（B2M Primer F与B2M Primer R），测序验证。将敲除株的测序序列与原始序列进行比对，比对图如图12：白色区域为不匹配序列，表示B2M基因极有可能被敲除，同时结合流式检测数据（见图3），可判定B2M基因被完全敲除。
CⅡTA的检测：提取CⅡTA敲除株的基因组DNA，并通过特定引物进行PCR（CⅡTAPrimer F与CⅡTA Primer R），测序验证。将敲除株的测序序列与原始序列进行比对，比对图13。其中，白色区域为不匹配序列，表示CⅡTA基因极有可能被敲除，同时结合流式检测数据（见图6），可判定CⅡTA基因被完全敲除。
CD47的检测：提取CD47敲入株的基因组DNA，并通过特定引物进行PCR（CD47Primer F与CD47 Primer R），测序验证。将敲入株的测序序列与AAVS1位点的基因组序列和CD47胞外段编码序列进行比对，比对图14，实线表示完全匹配序列。可见CD47胞外段编码序列成功插入了AAVS1位点的基因组序列中（见图9和图11）。
综上，测序结果显示，B2M及CⅡTA两个基因被成功敲除，且CD47基因成功插入AAVS1位点；流式结果显示，HLA-ABC基因和HLA-DR基因的表达被成功敲除（体现为阳性细胞比例的显著下降直至阴性），且CD47基因实现了均一的过表达（表现为平均荧光强度的显著提高）。
实施例6：采用一步式电转染获得的iPSC细胞分化为NK
本文引入202111109284.4中iPSC分化为NK的实验方式，分别验证未编辑的iPSC、经过方式一编辑的iPSC分化NK细胞和经过方式二编辑的iPSC分化NK细胞的结果，见图15、图16和图17。比较图15、图16和图17结果，未编辑的iPSC分化NK细胞的流式检测结果显示NK细胞纯度（CD56+%）为85.17%；方式一编辑的iPSC分化NK细胞的流式检测结果显示NK细胞纯度（CD56+%）为96.52%；方式二编辑的iPSC分化NK细胞的流式检测结果显示NK细胞纯度（CD56+%）为94.91%。

Claims (9)

1.一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法，其特征在于，包括基于电转染方式，使用CRISPR系统，对iPSC细胞的基因组同时进行如下编辑：
i）向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向B2M位点的sgRNA的质粒，以敲除B2M蛋白；
ii）向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向CⅡTA位点的sgRNA的质粒，以敲除CⅡTA蛋白；
iii）向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向AAVS1位点并插入编码CD47蛋白胞外段的多核酸序列sgRNA的质粒。
2.根据权利要求1所述的一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法，其特征在于，iPSC细胞用量为1×106-1×107个细胞，各质粒用量分别为0.5μg-5μg。
3.根据权利要求1所述的一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法，其特征在于，三种基因的编辑仅通过一步式电转染、一次克隆挑选和鉴定操作实现。
4.根据权利要求1所述的一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法，其特征在于，在编码CD47蛋白胞外段的多核苷酸序列前添加提高mRNA表达量或提高mRNA剪接效率的DNA元件，DNA元件为剪接受体位点和2A肽序列，序列为：SEQ ID NO:33。
5.根据权利要求1所述的一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法，其特征在于，向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向B2M位点的sgRNA的质粒，以敲除B2M蛋白，该sgRNA的序列为SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。
6.根据权利要求1所述的一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法，其特征在于，向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向CⅡTA位点的sgRNA的质粒，以敲除CⅡTA蛋白，该sgRNA的序列为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。
7.根据权利要求1所述的一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法，其特征在于，编码CD47蛋白胞外段的多核苷酸序列为：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ IDNO:16；靶向AAVS1位点并插入编码CD47蛋白的sgRNA序列为：SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26。
8.一种低免疫原性iPSC细胞，其特征在于，该低免疫原性iPSC细胞通过如权利要求1-7任一项所述的方法产生。
9.根据权利要求8所述的低免疫原性iPSC细胞，其特征在于，所述低免疫原性iPSC细胞具有分化为NK细胞、巨噬细胞、T细胞、心肌细胞、内皮细胞、神经祖细胞、神经元细胞、间充质干细胞、肺部细胞以及肝脏细胞的能力。
CN202210973823.7A 2022-05-31 2022-05-31 一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法及低免疫原性iPSC细胞 Pending CN116334000A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210973823.7A CN116334000A (zh) 2022-05-31 2022-05-31 一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法及低免疫原性iPSC细胞

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210603609.2A CN114686440B (zh) 2022-05-31 2022-05-31 一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法、低免疫原性iPSC细胞及组合物
CN202210973823.7A CN116334000A (zh) 2022-05-31 2022-05-31 一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法及低免疫原性iPSC细胞

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210603609.2A Division CN114686440B (zh) 2022-05-31 2022-05-31 一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法、低免疫原性iPSC细胞及组合物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116334000A true CN116334000A (zh) 2023-06-27

Family

ID=82131385

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210973823.7A Pending CN116334000A (zh) 2022-05-31 2022-05-31 一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法及低免疫原性iPSC细胞
CN202210603609.2A Active CN114686440B (zh) 2022-05-31 2022-05-31 一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法、低免疫原性iPSC细胞及组合物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210603609.2A Active CN114686440B (zh) 2022-05-31 2022-05-31 一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法、低免疫原性iPSC细胞及组合物

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN116334000A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116732099A (zh) * 2023-08-07 2023-09-12 北赛泓升(北京)生物科技有限公司 一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112020025824A2 (pt) * 2018-06-28 2021-03-23 Crispr Therapeutics Ag composições e métodos para edição genômica por inserção de polinucleotídeos doadores
WO2021202898A1 (en) * 2020-04-01 2021-10-07 National Jewish Health Methods of making pluripotent stem cells and uses thereof
AU2021325941A1 (en) * 2020-08-13 2023-03-09 Sana Biotechnology, Inc. Methods of treating sensitized patients with hypoimmunogenic cells, and associated methods and compositions

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116732099A (zh) * 2023-08-07 2023-09-12 北赛泓升(北京)生物科技有限公司 一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法
CN116732099B (zh) * 2023-08-07 2023-11-24 北赛泓升(北京)生物科技有限公司 一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114686440B (zh) 2022-09-27
CN114686440A (zh) 2022-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10280402B2 (en) Immune-compatible cells created by nuclease-mediated editing of genes encoding HLA
US20210008161A1 (en) Methods and compositions for improved homology directed repair
WO2019160077A1 (ja) 低抗原性細胞の製造方法
JP2018518182A (ja) ゲノム編集のためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９複合体
WO2020049535A1 (en) Universal donor cells
CN109750035B (zh) 靶向并引导Cas9蛋白高效切割TCR及B2M基因座的sgRNA
CN112746071B (zh) 一种造血干细胞hbb基因修复的方法及产品
US20210130817A1 (en) Gene Editing System and Gene Editing Method
CN114901808A (zh) 生产car-t细胞的方法
CA3100247A1 (en) Drug-resistant immune cells and methods of use thereof
US20240016934A1 (en) Compositions and Methods for Reducing MHC Class II in a Cell
CN116334000A (zh) 一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法及低免疫原性iPSC细胞
CN110819592A (zh) 一种通用供体干细胞及其制备方法
EP4041864A1 (en) Cells with sustained transgene expression
EP3912629A1 (en) Method for delivering gene in cells
Kwon et al. Human leukocyte antigen class I pseudo-homozygous mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells
CN118056014A (zh) 单碱基编辑修复hba2基因突变的方法及其应用
CN113195724A (zh) 低免疫原性的工程化人类间充质基质细胞，制备方法和试剂盒
CN114934066A (zh) 石骨症的基因编辑体系及其应用
KR20230124664A (ko) 세포에서 hla-a를 감소시키기 위한 조성물 및 방법
US10918672B1 (en) Small tissue CCR5−MSCs for treatment of HIV
CN116732099B (zh) 一种干细胞多重CRISPR/Cas基因组编辑方法
CN115141817B (zh) 一种细胞中hbb基因修复的方法及产品
CN112391410B (zh) 一种sgRNA及其在修复内含子异常剪接中的应用
WO2020179931A1 (ja) ハイスループット遺伝子編集技術

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination