CN114686440A

CN114686440A - 一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法、低免疫原性iPSC细胞及组合物

Info

Publication number: CN114686440A
Application number: CN202210603609.2A
Authority: CN
Inventors: 葛文雪; 陈涛涛; 王嘉显
Original assignee: Help Stem Cell Innovations Co ltd
Current assignee: Help Stem Cell Innovations Co ltd
Priority date: 2022-05-31
Filing date: 2022-05-31
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2042-05-31
Also published as: CN114686440B; CN116334000A

Abstract

本发明属于细胞技术领域，涉及一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法、低免疫原性iPSC细胞及组合物，所述制备方法包括使用CRISPR系统：向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向B2M位点的sgRNA的质粒，以敲除B2M蛋白；向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向CⅡTA位点的sgRNA的质粒，以敲除CⅡTA蛋白；向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向AAVS1位点并插入编码CD47蛋白胞外段的多核酸序列sgRNA的质粒；以上三种基因的编辑仅使用一步式电转染操作实现。本申请采用快速的iPSC细胞编辑方式实现低免疫原性iPSC细胞系的构建。

Description

一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法、低免疫原性iPSC细胞及组合物

技术领域

本发明属于细胞技术领域，涉及一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法、低免疫原性iPSC细胞及组合物。

背景技术

诱导多能干细胞(iPSC)最初是日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)于2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc)的组合转入成人的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种多能干细胞。

人诱导多能干细胞具有如下特性：没有伦理问题；细胞来源容易，利用成体细胞（如皮肤，血液）可获得；具备强分化能力，能分化出不同的功能细胞；可无限扩增，可降低成本且细胞一致性高。

人诱导多能干细胞来源或衍生细胞产品具有用于临床移植治疗的前景。但实践证明，无论是何种来源的细胞产品，在移植进入人体时，均容易产生同种异体排斥。细胞表面表达的人白细胞抗原(HLA)，即由位于6号染色体上人主要组织相容性复合物中的基因编码的分子是免疫排斥的主要介体。供体与受试者之间单个HLA基因的错配可能引起稳健的免疫应答 [1]。HLA基因分为MHC I类(MHC-I)和MHC II类(MHC-II)。因此，敲除I类和II类HLA基因的表达，是获得低免疫原性细胞的有效方式。然而，也有研究表明，同时敲除了I类和II类HLA抗原表达的细胞，在移植到体内后容易受到NK细胞的攻击和杀伤；而过表达CD47基因，可有效避免NK细胞的杀伤[2]。

综上所述，为了尽可能降低同种异体免疫排斥，获得可用于细胞治疗的通用供体细胞，需要同时敲除I类和II类HLA基因，并引入耐受NK细胞杀伤的基因。现有技术如[3]公开了获得此种细胞的方法，但其步骤繁琐，引入三种编辑至少需要经过两步转染及两次克隆挑选及鉴定，不易实现标准化和高通量生产。

[1] Fleischhauer K .等人“Bone marrow-allograft rejection by Tlymphocytes recognizing a single amino acid difference in HLA-B44,”N Engl JMed .,1990 ,323:1818-1822。

[2] Jaiswal S et al. CD47 is upregulated on circulating hematopoieticstem cells and leukemia cells to avoid phagocytosis. Cell 138, 271–285(2009)。

[3] 中国专利CN113423727A 通用供体细胞。

[4] Wilkinson, Miles F. (2019). Genetic paradox explained bynonsense. Nature, 568(7751), 179–180. doi:10.1038/d41586-019-00823-5。

[5]CN106446600A“一种基于CRISPR/Cas9的sgRNA的设计方法”。

发明内容

本申请提供一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法、低免疫原性iPSC细胞及组合物，其优点在于采用一步法，仅需一步转染及克隆选择和鉴定，即可同时实现对I类、II类HLA的敲除和对NK杀伤耐受基因的引入，步骤简单，编辑效率高，效果明确。

为实现上述技术目的，本申请采取的技术方案为，一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法，包括使用CRISPR系统，对iPSC细胞的基因组同时进行如下编辑：

i）向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向B2M位点的sgRNA的质粒，以敲除B2M蛋白，该sgRNA的序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQID NO:6；

ii）向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向CⅡTA位点的sgRNA的质粒，以敲除CⅡTA蛋白，该sgRNA的序列为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12；

iii）向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向AAVS1位点并插入编码CD47蛋白胞外段的多核酸序列sgRNA的质粒；其中，编码CD47蛋白胞外段的多核苷酸序列为：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16；靶向AAVS1位点并插入编码CD47蛋白的sgRNA序列为：SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26；

其中，以上三种基因的编辑仅使用一步式电转染操作实现。

作为本申请改进的技术方案，采用一步式电转染过程中，iPSC细胞用量为1×10⁶-1×10⁷个细胞，各质粒用量分别为0.5ug-5ug。

作为本申请改进的技术方案，三种基因编辑仅通过一次克隆挑选和鉴定操作实现。

作为本申请改进的技术方案，在编码CD47蛋白胞外段的多核苷酸序列前添加提高mRNA表达量或提高mRNA剪接效率的DNA元件，DNA元件为剪接受体位点（SA）和2A肽序列（2A），序列为：SEQ ID NO:33。

本申请的另一目的是提供一种低免疫原性iPSC细胞，该低免疫原性iPSC细胞通过前述的方法产生。

作为本申请改进的技术方案，所述低免疫原性iPSC细胞具有分化为NK细胞、巨噬细胞、T细胞、心肌细胞、内皮细胞、神经祖细胞、神经元细胞、间充质干细胞、肺部细胞以及肝脏细胞的能力。

本申请的再一技术目的是提供一种低免疫原性iPSC细胞的组合物，包含低免疫原性iPSC细胞，所述低免疫原性iPSC细胞是基于前述的方法获得。

有益效果

已有公开技术方案采用慢病毒载体转染的方式导入Cas9和sgRNA质粒对iPSC进行基因编辑。相对于现有技术，本申请提供采用电转染导入Cas9和sgRNA质粒的方式对iPSC进行基因编辑，其具有有效转染细胞所需的时间短、外源基因表达时间较快、转染后24小时可以观察到目的基因高效表达的特性。相对于现有技术利用病毒载体系统至少需要72小时之后才可以观察到目的基因的表达，这极大地减少了后续临床转化应用中iPSC体外培养的时间。

本申请采用一步式（定义：即一次操作）同时进行B2M与CⅡTA的敲除以及CD47的插入，并设定CD47的插入位点。通过结合目标基因的家族基因共性、电转特性以及电转步骤设计的方式，有效避免多位点基因同时敲除带来遗传基因的突变、以及基因敲除过程中遗传补偿等综合因素，最终实现B2M与CⅡTA的不表达以及CD47的过表达；同时通过单次电转实现多个位点的编辑，能够有效降低电穿孔导致的高细胞死亡率。

本申请通过B2M、CⅡTA以及CD47编辑位点的选择，促使B2M、CⅡTA不再表达，同时CD47具有较高的阳性表达率，同时保证经过编辑后的iPSC细胞后期优良的分化效果、以及稳定性。

附图说明

图1 绘示靶向AAVS1位点的CD47同源重组模板质粒图谱；

图2 绘示未编辑的iPSC的B2M流式检测图；

图3绘示一步式电转染编辑的iPSC的B2M流式检测图；

图4绘示分步式电转染编辑的iPSC的B2M流式检测图；

图5绘示未编辑的iPSC的CⅡTA流式检测图；

图6绘示一步式电转染编辑的iPSC的CⅡTA流式检测图；

图7绘示分步式电转染编辑的iPSC的CⅡTA流式检测图；

图8绘示未编辑的iPSC的CD47流式检测图；

图9绘示一步式电转染编辑的iPSC的CD47流式检测图；

图10绘示分步式电转染编辑的iPSC的CD47流式检测图；

图11绘示iPSC检测CD47的免疫荧光强度：(a)绘示图8免疫荧光强度，(b)绘示图9免疫荧光强度，(c)绘示图10免疫荧光强度；

图12绘示一步式电转染编辑的iPSC的B2M基因qPCR测序图；

图13绘示一步式电转染编辑的iPSC的CⅡTA基因qPCR测序图；

图14绘示一步式电转染编辑的iPSC的CD47基因qPCR测序图；

图15 绘示未编辑的iPSC分化NK流式测试图；

图16 绘示一步式电转染编辑的iPSC分化NK流式测试图；

图17 绘示分步式电转染编辑的iPSC分化NK流式测试图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例,本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。除非另作定义,此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

定义

低免疫原性iPSC细胞：通常是指相对于未经修饰的iPSC细胞，在细胞移植过程中较不易发生同种异体排斥和/或在移植后展示出增加的存活的经基因编辑的细胞。在一些实施例中，如本文所述的经基因编辑的细胞是低免疫原性iPSC细胞。在一些实施例中，与未经基因编辑的iPSC细胞相比，低免疫原性iPSC细胞不表达HLA-ABC和HLA-DR，并高表达CD47，因而具有逃避或耐受免疫反应，从而在移植宿主体内实现更长存活的特性。

CRISPR-内切核酸酶系统：是原核生物中天然存在的防御机制，该防御机制经改造后可以用于真核细胞的定点基因编辑。CRISPR系统包括I、II、III、IV、V和VI型系统。在一些方面，CRISPR系统是II型CRISPR/Cas9系统。

基因编辑：对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。基因编辑的技术原理为：在细胞内利用外源切割复合体特异性识别并切割目的基因序列，在目的基因序列上制造断裂端，这种断裂端随即会被细胞内部的DNA损伤修复系统修复，重新连接起来。本申请主要应用的基因编辑技术集中于同源重组与CRISPR系统。一般的基因编辑的流程包括如下环节：基因选择，设计序列，CRISPR载体和同源重组模板载体的构建，CRISPR载体和同源重组模板载体向细胞内的导入，克隆挑取和克隆鉴定；本申请集中于通过一步式电转染的方式实现三种免疫原性相关目的位点的基因编辑，并相应的仅通过一次克隆挑选和鉴定操作获得基因组中同时含有三种基因编辑的低免疫原性iPSC细胞系。

同时进行：是在同一基因编辑的步骤中采用多种质粒，每种质粒携带各自独立的sgRNA，结合Cas9酶，在CRISPR系统中对iPSC细胞（人诱导多能干细胞）进行多个目标基因的编辑；或者是在同一质粒上携带多种基因的sgRNA，该质粒结合Cas9酶，在CRISPR系统中对iPSC细胞（人诱导多能干细胞）进行多个目标基因的编辑。编辑包括基因的定点删除与基因的定点插入。

在基因内或附近：是指基因组DNA的作为所述基因的内含子或外显子组分、或位于所述基因近侧的位点或区域。在一些实施例中，如果基因组DNA的位点包含基因的内含子或外显子的至少一部分，则该基因组DNA的位点在所述基因内。在一些实施例中，基因组DNA的位于基因附近的位点可以在所述基因的5'或3'端(例如，所述基因的编码区的5'或3'端)。在一些实施例中，基因组DNA的位于基因附近的位点可以是调控所述基因的表达的启动子区或阻遏子区。在一些实施例中，基因组DNA的位于基因附近的位点可以与所述基因在同一染色体上。在一些实施例中，如基因组DNA的位点或区域在基因的5'或3'端(例如，所述基因的编码区的5'或3'端)的50Kb范围内，如50Kb、40Kb、30Kb、20Kb、10Kb、5Kb、1Kb、500bp、100bp内或更接近，则该基因组DNA的位点或区域在所述基因附近。

靶点选择：一旦CRISPR-内切核酸酶复合物在靶位点处与DNA结合，内切核酸酶内的两个独立的核酸酶结构域便各自在PAM位点上游三个碱基处裂解DNA链之一，从而留下双链断裂(DSB)，在这里DNA的两条链以碱基对(平末端)终止。

碱基缺失或插入：基因编辑序列中插入或丢失一个或多个碱基，其结果是突变点下游碱基序列发生移码，编辑氨基酸序列都发生改变，又称移码突变，并可在突变点下游提前出现终止密码。

本申请的技术原理

本申请是通过基因编辑的方式敲除I类和II类HLA的表达调控基因B2M和CⅡTA，实现了对I类和II类HLA表达的敲除；引入CD47基因，实现了对于NK细胞杀伤的耐受。主要是包括使用CRISPR系统，对iPSC细胞的基因组同时进行如下编辑：i）在该细胞编码B2M蛋白的基因内或其附近的位点处引入至少一个碱基对的缺失和/或插入；ii）在该细胞编码CⅡTA蛋白的基因内或其附近的位点处引入至少一个碱基对的缺失和/或插入；iii）在该细胞基因组设定的位点处引入编码表达CD47蛋白或其一部分的至少一种多个碱基的插入；设定的位点为编码AAVS1的基因位点内；以上三种基因编辑仅使用一步式电转染操作实现。

本申请充分利用现有技术sgRNA的设计原理，并结合电转染快速特性，创造性将电转染与CRISPR结合应用于多位点的同步转染，既避免慢病毒转染所带来的不良免疫反应、毒性作用以及病毒基因组整合导致遗传性缺陷等风险，又避免了多次电转对细胞的损伤（如细胞死亡、多个位点在进行敲除与插入时由于移码产生的突变）。同时，本申请采用一步式电转染操作有效缩短操作时间，能够实现批量化编辑iPSC细胞，同时保证编辑后iPSC细胞存活率以及后期分化效率。

在一些实施例中，该细胞编码B2M蛋白的基因内或其附近的位点处引入至少一个碱基对缺失或插入：是在B2M蛋白的基因的起始密码子的第二个碱基处引入至少一个碱基的缺失或插入，或者在B2M蛋白的基因的起始密码子上游1bp-100bp处进行引入至少十个碱基的缺失，或是在B2M蛋白的基因的起始密码子下游1bp-400bp处进行引入至少一个碱基的缺失。

优选地是，编码B2M蛋白的基因内或其附近的位点处引入至少一个碱基对缺失或插入：是采用编码B2M的sgRNA（向导RNA）结合质粒，共同构建B2M-CRISPR质粒；其中，质粒选用PX458；编码B2M的sgRNA的序列为：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。

在一些实施例中，编码CⅡTA蛋白的基因内或其附近的位点处引入至少一个碱基对缺失或插入：是在CⅡTA蛋白基因的起始密码子的第二个碱基处引入至少一个碱基的缺失或插入，或者在CⅡTA蛋白基因的起始密码子上游1bp-300bp处进行引入至少一个碱基的缺失，或是在CⅡTA蛋白基因的起始密码子下游1bp-600bp处进行引入至少一个碱基的缺失。

优选地是，编码CⅡTA蛋白的基因内或其附近的位点处引入至少一个碱基对缺失或插入的方法是采用编码CⅡTA位点的sgRNA（向导RNA）结合质粒，共同构建CⅡTA-CRISPR质粒；其中，质粒选用PX458；编码sgRNA的序列为：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。

本申请直接将CD47的插入位点设计为AAVS1的基因内,并设计在设定的位点处引入编码表达CD47蛋白或其一部分的至少一种多个碱基的插入的sgRNA。该方式既简化sgRNA的设计程序，也有效利用了AAVS1位点染色体组成型活跃表达的特点，避免了插入的CD47基因在iPSC分化后可能的基因沉默。

其中，CD47的插入方式为：建立CD47插入序列，并将该插入序列导入克隆载体，形成CD47-insert质粒（CD47-插入质粒），CD47-insert质粒在Cas9酶的作用下基于CRISPR系统导入iPSC细胞。在一些方案中CD47插入序列可选择编码CD47全长蛋白的多核苷酸序列；在另一些方案中CD47插入序列可选择编码CD47部分长度蛋白的多核苷酸序列如SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16。优选选择编码CD47部分长度蛋白的多核苷酸序列，目的在于：其一降低载体质粒的大小，降低电转染的工艺复杂度要求，从而提高转染效率，进而提高基因编辑效率；其二降低细胞对外源蛋白的转录和翻译压力，有效提高CD47在膜表面的表达水平。

优选地是，在编码CD47部分长度蛋白的多核苷酸序列前可添加提高mRNA表达量或提高mRNA剪接效率的DNA元件，其中优选的DNA元件为剪接受体位点（SA）和2A肽序列（2A），序列为：ctgacctcttctcttcctcccacagggcctcgagagatctggcagcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccct （SEQ ID NO:33），其具有的优势：相对于未添加合成剪接受体位点（SA）和2A肽序列（2A），iPSC具有B2M和CⅡTA低表达，以及高表达的CD47（编辑后的iPSC具有更高CD47的表达量），该部分和未添加合成剪接受体位点（SA）和2A肽序列（2A）的CD47插入的实验步骤一致、实验结果相差无几，故本文省略重复描述；但在后期大量的iPSC分化为NK细胞、巨噬细胞、T细胞、心肌细胞、内皮细胞、神经祖细胞、神经元细胞、间充质干细胞、肺部细胞以及肝脏细胞过程中，统计发现添加合成剪接受体位点（SA）和2A肽序列（2A）的iPSC分化后的细胞具有更稳定的低免疫原性。

在一些实施方案中，所述低免疫原性iPSC细胞具有分化为NK细胞、巨噬细胞、T细胞、心肌细胞、内皮细胞、神经祖细胞、神经元细胞、间充质干细胞、肺部细胞以及肝脏细胞的能力。具体分化，可引入专利CN113801846A、CN109504654B。

在一些实施方案中，所述NK细胞具有在治疗实体瘤与血液瘤中的用途；所述心肌细胞具有在治疗心血管疾病中的用途；所述神经元细胞具有在治疗神经退行性疾病中的用途；所述肺部细胞具有在治疗肺部系统疾病中的用途。

本申请还提供一种低免疫原性iPSC细胞的组合物，包含低免疫原性iPSC细胞，所述低免疫原性iPSC细胞的制备是基于前述的方法获得；或所述低免疫原性iPSC细胞是前述的低免疫原性iPSC细胞。

实施例1

载体的构建

1）CRISPR基因编辑载体的选择：同时表达Cas9和sgRNA的质粒/载体选择获取自Addgene的PX458；

2）将目标sgRNA的插入PX458：通过常规分子克隆方法将两个BbsI位点（245位点和267位点）之间的序列替换为相应的sgRNA序列，即获得了相应的目标sgRNA载体。

实验共构建4个sgRNA质粒，其编号和sgRNA序列对应的表格如表1：

表1 4个sgRNA

名称/编号	用途	针对位点	序列
				B2M-sgRNA	CRISPR载体	B2M	SEQ ID NO:2
CⅡTA-sgRNA	CRISPR载体	CⅡTA	SEQ ID NO:8
				AAVS1-sgRNA	CRISPR载体	AAVS1	SEQ ID NO:21
AAVS1-CD47序列	同源重组模板载体	AAVS1（插入CD47）	SEQ ID NO:20

3）CD47同源重组模板载体的选择：选择获取自Addgene的pUC57载体作为骨架。

4）靶向AAVS1位点的CD47同源重组模板质粒的构建：合成AAVS1左侧同源臂，序列为：SEQ ID NO:17；合成AAVS1右侧同源臂，序列为：SEQ ID NO:18；合成编码CD47胞外段DNA，序列为：SEQ ID NO:13；通过常规分子克隆方法将上述三段序列依次插入pUC57载体的EcoRⅠ位点至HindⅢ位点之间，即获得携带左右同源臂和同源重组模板的目标质粒，测序正确，图谱如图1，AAVS1-CD47的序列如下：SEQ ID NO:19。

实施例2电转染

2.1 iPSC使用标准方法培养至90%汇合度，iPSC使用标准方法培养至90%汇合度，消化细胞并计数。

2.2 细胞计数后，取出1×10⁶-1×10⁷个细胞（本实施例为1×10⁶），低速离心，取出离心管至生物安全柜中，拧开管盖，吸弃上清。定义，低速离心为转速为8000 r/min以下，相对离心力为10000×g以下的离心。

2.3将上述四种质粒分别吸取0.5ug-5ug（优选为0.5ug-2ug，本实施例选用1ug），加入电转buffer中。四种质粒分别吸取0.5ug-5ug，具体可设计为0.5ug、0.6ug、0.7ug、0.8ug、0.9ug、1ug、1.1ug、1.2ug、1.3ug、1.4ug、1.5ug、1.6ug、1.7ug、1.8ug、1.9ug、2ug 、2.1ug、2.2ug、2.3ug、2.4ug、2.5ug、2.6ug、2.7ug、2.8ug、2.9ug……。这里电转缓冲液（buffer）也可选择如下几类：第1 类为细胞培养液，如RPMI 1640，DMEM，DMEM／F12等；第 2类为磷酸缓冲液，如K—PBS、HBS、HeBs、PBS等；第3类为Cytomix缓冲液，Cytomix 配方如下：120mmol／L KCl、0.15mmol／L CaCl₂、10mmol／L K₂HP0₄ (pH=7.6)、25mmol／L HEPES(pH=7.6)、2mmol／L EGTA(pH=7.6)、5mmol／L MgCl₂、2mmol／L ATP与5mmol／L谷胱苷肽。本实施例选用电转buffer来自厂家百恩维、货号：UES0001。

2.4 用100μl移液枪吹打8-10次混匀后，将全部液体吸出后加入前述获得的细胞沉淀中；将电转杯取出并放入电转仪的转染室中进行电转，其中电转仪使用Lonza2b，电转程序为B016（系统设定程序）。电转结束后取出电转杯放进生物安全柜中。

实施例3电转挑克隆

3.1 每天更换2ml Stemflex培养基，培养两天后，将细胞消化、计数，并接种5000个细胞于10cm皿中（预先铺好Matrigel，并加入10ml Stemflex+Rocki培养基），Stemflex+Rocki培养基中Rocki浓度为10μM。

3.2 培养7天左右，在层流工作台中进行单克隆的挑取，共挑取48个克隆，分别接种于2块24孔板（预先铺好Matrigel，每孔加入500ul Stemflex+Rocki培养基），继续培养7天左右，进行阳性克隆的验证。

3.3 三重编辑克隆的鉴定。

实施例4 比对分析

方式一：一步式电转染，是在电转染过程中一次将B2M-sgRNA（SEQ ID NO:2）、CⅡTA-sgRNA（SEQ ID NO:8）、AAVS1-sgRNA（SEQ ID NO:21）、和AAVS1-CD47载体（SEQ ID NO:20）同时加入电转buffer，并在电转结束后进行一次挑克隆。周期大概1个月。

方式二：分步式电转染，是在电转染过程中先加入B2M-sgRNA载体，在电转结束并培养7天后进行第一次挑克隆，获得第一重基因编辑的阳性克隆；随后在电转染过程中加入B2M-sgRNA载体，在电转结束并培养7天后进行第二次挑克隆，获得第二重基因编辑的阳性克隆；随后在电转染过程中加入AAVS1-sgRNA载体和AAVS1-CD47同源重组模板载体，在电转结束并培养7天后进行第三次挑克隆，最终获得第三重基因编辑的阳性克隆，周期3个月。

细胞活率与转染效率（阳性率）比较:

一步法：四种质粒用量分别为0.5ug-5ug，此时阳性率约10%，实验周期1个月。

分步法：四种质粒用量分别为0.5ug-5ug，每次电转阳性率约20%，总电转阳性率为20%的四次方，实验周期每次电转周期为1个月，总周期4个月。

流式检测：

分别对未编辑的iPSC、方式一获得的iPSC以及方式二获得的iPSC进行流式细胞仪检测。

图2、图3和图4分别显示的为未编辑的iPSC、方式一获得的iPSC、方式二获得的iPSC检测B2M的流式检测结果，结果显示方式一获得的iPSC、方式二获得的iPSC相对于未编辑的iPSC均具有较低表达的B2M。

图5、图6和图7分别显示的为未编辑的iPSC、方式一获得的iPSC、方式二获得的iPSC检测CⅡTA的流式测试结果，结果显示方式一获得的iPSC、方式二获得的iPSC相对于未编辑的iPSC均具有较低表达的CⅡTA。

图8、图9和图10分别显示的为未编辑的iPSC、方式一获得的iPSC、方式二获得的iPSC检测CD47的流式测试结果，图11则显示未编辑的iPSC、方式一获得的iPSC、方式二获得的iPSC检测CD47的免疫荧光强度，结果显示方式一获得的iPSC、方式二获得的iPSC相对于未编辑的iPSC均具有更高表达的CD47。

综合结果见表2。分析上述结果能明确得到：无论是方式一还是方式二均能获得低表达的B2M和CⅡTA，以及高表达的CD47（编辑后的iPSC具有更高CD47的表达量），且在iPSC分化为其他细胞过程中CD47能够继续表达，因此分化后的iPSC具有低免疫原性（未编辑的iPSC在分化为其他细胞过程中CD47低表达或不表达，因此具有免疫原性）。同时，方式一对iPSC进行编辑后B2M、CⅡTA的表达均略低于方式二对iPSC进行编辑后B2M、CⅡTA的表达，方式一对iPSC进行编辑后CD47的表达略高于方式二对iPSC进行编辑后CD47的表达。

表2 流式检测结果表

方式	目标基因	目标基因表达量（%）
			未编辑的iPSC	B2M	46.75
未编辑的iPSC	CⅡTA	0.71
			未编辑的iPSC	CD47	99.93（平均荧光强度10095.5）
方式一获得的iPSC	B2M	0.13
			方式一获得的iPSC	CⅡTA	0.06
方式一获得的iPSC	CD47	99.94（平均荧光强度：729692.6）
			方式二获得的iPSC	B2M	0.50
方式二获得的iPSC	CⅡTA	0.21
			方式二获得的iPSC	CD47	99.75（平均荧光强度：629964.6）

实施例5 对经方式一获得的iPSC细胞进行PCR即测序：

用DNA提取试剂盒提取各孔细胞基因组DNA，进行RCR克隆。

克隆验证基于的测序引物如下表3：

表3 PCR实验用引物设计

基因表达	引物名称	序列 (5’--->3’)
			B2M	B2M Primer F	ggagaaaccc tgcagggaat （SEQ ID NO:27）
B2M	B2M Primer R	tctaagggaa gcagagccgc （SEQ ID NO:28）
			CⅡTA	CⅡTA Primer F	caccctgtga ggtgactgag（SEQ ID NO:29）
CⅡTA	CⅡTA Primer R	tgcaaacttg ggtaggtcgt （SEQ ID NO:30）
			CD47	CD47 Primer F	ccactgtccc cactgacttt （SEQ ID NO:31）
CD47	CD47 Primer R	agctcgatga tcgtttcacc （SEQ ID NO:32）

注：Primer F代表上游引物，Primer R代表下游引物。

B2M的检测：提取B2M敲除株的基因组DNA，并通过特定引物进行PCR（B2M Primer F与B2M Primer R），测序验证。将敲除株的测序序列与原始序列进行比对，比对图如图12：白色区域为不匹配序列，表示B2M基因极有可能被敲除，同时结合流式检测数据（见图3），可判定B2M基因被完全敲除。

CⅡTA的检测：提取CⅡTA敲除株的基因组DNA，并通过特定引物进行PCR（CⅡTAPrimer F与CⅡTA Primer R），测序验证。将敲除株的测序序列与原始序列进行比对，比对图13。其中，白色区域为不匹配序列，表示CⅡTA基因极有可能被敲除，同时结合流式检测数据（见图6），可判定CⅡTA基因被完全敲除。

CD47的检测：提取CD47敲入株的基因组DNA，并通过特定引物进行PCR（CD47Primer F与CD47 Primer R），测序验证。将敲入株的测序序列与AAVS1位点的基因组序列和CD47胞外段编码序列进行比对，比对图14，实线表示完全匹配序列。可见CD47胞外段编码序列成功插入了AAVS1位点的基因组序列中（见图9和图11）。

综上，测序结果显示，B2M及CⅡTA两个基因被成功敲除，且CD47基因成功插入AAVS1位点；流式结果显示，HLA-ABC基因和HLA-DR基因的表达被成功敲除（体现为阳性细胞比例的显著下降直至阴性），且CD47基因实现了均一的过表达（表现为平均荧光强度的显著提高）。

实施例6：采用一步式电转染获得的iPSC细胞分化为NK

本文引入202111109284.4中iPSC分化为NK的实验方式，分别验证未编辑的iPSC、经过方式一编辑的iPSC分化NK细胞和经过方式二编辑的iPSC分化NK细胞的结果，见图15、图16和图17。比较图15、图16和图17结果，未编辑的iPSC分化NK细胞的流式检测结果显示NK细胞纯度（CD56+%）为85.17%；方式一编辑的iPSC分化NK细胞的流式检测结果显示NK细胞纯度（CD56+%）为96.52%；方式二编辑的iPSC分化NK细胞的流式检测结果显示NK细胞纯度（CD56+%）为94.91%。

序列表

<110> 南京艾尔普再生医学科技有限公司

<120> 一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法、低免疫原性iPSC细胞及组合物

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(B2M-sgRNA-1)

<400> 1

cgataagcgt cagagcgccg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(B2M-sgRNA-2)

<400> 2

ggccacggag cgagacatct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(B2M-sgRNA-3)

<400> 3

ggagcgagag agcacagcga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(B2M-sgRNA-4)

<400> 4

cccctgctcc ccgccgaaag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(B2M-sgRNA-5)

<400> 5

gccctggact agccccacgg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(B2M-sgRNA-6)

<400> 6

gcctacggcg acgggagggt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(CIITA-sgRNA-1)

<400> 7

ccacagaaat cattgcaagg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(CIITA-sgRNA-2)

<400> 8

gatattggca taagcctccc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(CIITA-sgRNA-3)

<400> 9

gaatgggtga tattgacaag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(CIITA-sgRNA-4)

<400> 10

agaaatgcgt atagaaatgg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(CIITA-sgRNA-5)

<400> 11

tggaatcctt acaacaacaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(CIITA-sgRNA-6)

<400> 12

atactagagt agcttggcta 20

<210> 13

<211> 972

<212> DNA

<213> 人工序列(CD47胞外-1)

<400> 13

atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 60

ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 120

tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 180

aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 240

tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300

gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360

agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat 420

gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt tttgctatac tcctgttctg gggacagttt 480

ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt 540

gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc attgttggag ccattctttt cgtcccaggt 600

gaatattcat taaagaatgc tactggcctt ggtttaattg tgacttctac agggatatta 660

atattacttc actactatgt gtttagtaca gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc 720

atattggtta ttcaggtgat agcctatatc ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt 780

gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta 840

gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa tttgtggctt ccaatcagaa gactatacaa 900

cctcctagga aagctgtaga ggaacccctt aatgcattca aagaatcaaa aggaatgatg 960

aatgatgaat aa 972

<210> 14

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列(CD47胞外-2)

<400> 14

atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 60

ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 120

tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 180

aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 240

tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300

gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360

agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat 420

gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt tttgctatac tcctgttctg gggacagttt 480

ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt 540

gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc attgttggag ccattctttt cgtcccaggt 600

gaatattcat taaagaatgc tactggcctt ggtttaattg tgacttctac agggatatta 660

atattacttc actactatgt gtttagtaca gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc 720

atattggtta ttcaggtgat agcctatatc ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt 780

gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta 840

gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa tttgtggaat aactgaagtg aagtgatgga 900

ctccgatttg gagagtagta agacgtgaaa ggaatacact tgtgtttaag caccatggcc 960

ttgatgattc actgttgggg agaagaaaca agaaaa 996

<210> 15

<211> 1046

<212> DNA

<213> 人工序列(CD47胞外-3)

<400> 15

gttcgttgca acaaattgat gagcaatgct tttttataat gccaactttg tacaagaaag 60

ttggcatgtg gcccctggta gcggcgctgt tgctgggctc ggcgtgctgc ggatcagctc 120

agctactatt taataaaaca aaatctgtag aattcacgtt ttgtaatgac actgtcgtca 180

ttccatgctt tgttactaat atggaggcac aaaacactac tgaagtatac gtaaagtgga 240

aatttaaagg aagagatatt tacacctttg atggagctct aaacaagtcc actgtcccca 300

ctgactttag tagtgcaaaa attgaagtct cacaattact aaaaggagat gcctctttga 360

agatggataa gagtgatgct gtctcacaca caggaaacta cacttgtgaa gtaacagaat 420

taaccagaga aggtgaaacg atcatcgagc taaaatatcg tgttgtttca tggttttctc 480

caaatgaaaa tattcttatt gttattttcc caatttttgc tatactcctg ttctggggac 540

agtttggtat taaaacactt aaatatagat ccggtggtat ggatgagaaa acaattgctt 600

tacttgttgc tggactagtg atcactgtca ttgtcattgt tggagccatt cttttcgtcc 660

caggtgaata ttcattaaag aatgctactg gccttggttt aattgtgact tctacaggga 720

tattaatatt acttcactac tatgtgttta gtacagcgat tggattaacc tccttcgtca 780

ttgccatatt ggttattcag gtgatagcct atatcctcgc tgtggttgga ctgagtctct 840

gtattgcggc gtgtatacca atgcatggcc ctcttctgat ttcaggtttg agtatcttag 900

ctctagcaca attacttgga ctagtttata tgaaatttgt ggcttccaat cagaagacta 960

tacaacctcc tggaataact gcccaacttt cttgtacaaa gttggcatta taagaaagca 1020

ttgcttatca atttgttgca acgaac 1046

<210> 16

<211> 1273

<212> DNA

<213> 人工序列(CD47胞外-4)

<400> 16

tgcctgtgac gcgcggcggc ggtcggtcct gcctgtaacg gcggcggcgg ctgctgctcc 60

agacacctgc ggcggcggcg gcgaccccgc ggcgggcgcg gagatgtggc ccctggtagc 120

ggcgctgttg ctgggctcgg cgtgctgcgg atcagctcag ctactattta ataaaacaaa 180

atctgtagaa ttcacgtttt gtaatgacac tgtcgtcatt ccatgctttg ttactaatat 240

ggaggcacaa aacactactg aagtatacgt aaagtggaaa tttaaaggaa gagatattta 300

cacctttgat ggagctctaa acaagtccac tgtccccact gactttagta gtgcaaaaat 360

tgaagtctca caattactaa aaggagatgc ctctttgaag atggataaga gtgatgctgt 420

ctcacacaca ggaaactaca cttgtgaagt aacagaatta accagagaag gtgaaacgat 480

catcgagcta aaatatcgtg ttgtttcatg gttttctcca aatgaaaata ttcttattgt 540

tattttccca atttttgcta tactcctgtt ctggggacag tttggtatta aaacacttaa 600

atatagatcc ggtggtatgg atgagaaaac aattgcttta cttgttgctg gactagtgat 660

cactgtcatt gtcattgttg gagccattct tttcgtccca ggtgaatatt cattaaagaa 720

tgctactggc cttggtttaa ttgtgacttc tacagggata ttaatattac ttcactacta 780

tgtgtttagt acagcgattg gattaacctc cttcgtcatt gccatattgg ttattcaggt 840

gatagcctat atcctcgctg tggttggact gagtctctgt attgcggcgt gtataccaat 900

gcatggccct cttctgattt caggtttgag tatcttagct ctagcacaat tacttggact 960

agtttatatg aaatttgtgg cttccaatca gaagactata caacctccta ggaataactg 1020

aagtgaagtg atggactccg atttggagag tagtaagacg tgaaaggaat acacttgtgt 1080

ttaagcacca tggccttgat gattcactgt tggggagaag aaacaagaaa agtaactggt 1140

tgtcacctat gagaccctta cgtgattgtt agttaagttt ttattcaaag cagctgtaat 1200

ttagttaata aaataattat gatctatgtt gtttgcccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260

aaaaaaaaaa aaa 1273

<210> 17

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列(AAVS1-L)

<400> 17

cattctctcc cctgggcctg tgccgctttc tgtctgcagc ttgtggcctg ggtcacctct 60

acggctggcc cagatccttc cctgccgcct ccttcaggtt ccgtcttcct ccactccctc 120

ttccccttgc tctctgctgt gttgctgccc aaggatgctc tttccggagc acttccttct 180

cggcgctgca ccacgtgatg tcctctgagc ggatcctccc cgtgtctggg tcctctccgg 240

gcatctctcc tccctcaccc aaccccatgc cgtcttcact cgctgggttc ccttttcctt 300

ctccttctgg ggcctgtgcc atctctcgtt tcttaggatg gccttctccg acggatgtct 360

cccttgcgtc ccgcctcccc ttcttgtagg cctgcatcat caccgttttt ctggacaacc 420

ccaaagtacc ccgtctccct ggctttagcc acctctccat cctcttgctt tctttgcctg 480

gacaccccgt tctcctgtgg attcgggtca cctctcactc ctttcatttg ggcagctccc 540

ctacccccct tacctctcta gtctgtgcta gctcttccag ccccctgtca tggcatcttc 600

caggggtccg agagctcagc tagtcttctt cctccaaccc gggcccctat gtccacttca 660

ggacagcatg tttgctgcct ccagggatcc tgtgtccccg agctgggacc accttatatt 720

cccagggccg gttaatgtgg ctctggttct gggtactttt atctgtcccc tccaccccac 780

agtggggcca ctagggacag 800

<210> 18

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列(AAVS1-R)

<400> 18

gattggtgac agaaaagccc catccttagg cctcctcctt cctagtctcc tgatattggg 60

tctaaccccc acctcctgtt aggcagattc cttatctggt gacacacccc catttcctgg 120

agccatctct ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta cgatggagcc agagaggatc 180

ctgggaggga gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt 240

tctcagtggc caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggccgtc 300

tggtgcgttt cactgatcct ggtgctgcag cttccttaca cttcccaaga ggagaagcag 360

tttggaaaaa caaaatcaga ataagttggt cctgagttct aactttggct cttcaccttt 420

ctagtcccca atttatattg ttcctccgtg cgtcagtttt acctgtgaga taaggccagt 480

agccagcccc gtcctggcag ggctgtggtg aggagggggg tgtccgtgtg gaaaactccc 540

tttgtgagaa tggtgcgtcc taggtgttca ccaggtcgtg gccgcctcta ctccctttct 600

ctttctccat ccttctttcc ttaaagagtc cccagtgcta tctgggacat attcctccgc 660

ccagagcagg gtcccgcttc cctaaggccc tgctctgggc ttctgggttt gagtccttgg 720

caagcccagg agaggcgctc aggcttccct gtcccccttc ctcgtccacc atctcatgcc 780

cctggctctc ctgccccttc 800

<210> 19

<211> 7505

<212> DNA

<213> 人工序列(AAVS1-CD47-1)

<400> 19

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ccattctctc ccctgggcct 420

gtgccgcttt ctgtctgcag cttgtggcct gggtcacctc tacggctggc ccagatcctt 480

ccctgccgcc tccttcaggt tccgtcttcc tccactccct cttccccttg ctctctgctg 540

tgttgctgcc caaggatgct ctttccggag cacttccttc tcggcgctgc accacgtgat 600

gtcctctgag cggatcctcc ccgtgtctgg gtcctctccg ggcatctctc ctccctcacc 660

caaccccatg ccgtcttcac tcgctgggtt cccttttcct tctccttctg gggcctgtgc 720

catctctcgt ttcttaggat ggccttctcc gacggatgtc tcccttgcgt cccgcctccc 780

cttcttgtag gcctgcatca tcaccgtttt tctggacaac cccaaagtac cccgtctccc 840

tggctttagc cacctctcca tcctcttgct ttctttgcct ggacaccccg ttctcctgtg 900

gattcgggtc acctctcact cctttcattt gggcagctcc cctacccccc ttacctctct 960

agtctgtgct agctcttcca gccccctgtc atggcatctt ccaggggtcc gagagctcag 1020

ctagtcttct tcctccaacc cgggccccta tgtccacttc aggacagcat gtttgctgcc 1080

tccagggatc ctgtgtcccc gagctgggac caccttatat tcccagggcc ggttaatgtg 1140

gctctggttc tgggtacttt tatctgtccc ctccacccca cagtggggcc actagggaca 1200

gggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 1260

gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag 1320

tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 1380

agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc 1440

cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat 1500

tacttccacc tggctccagt acgtgattct tgatcccgag ctggagccag gggcgggcct 1560

tgcgctttag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg cctggcctgg gcgctggggc 1620

cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta 1680

gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga tagtcttgta 1740

aatgcgggcc aggatctgca cactggtatt tcggtttttg ggcccgcggc cggcgacggg 1800

gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc tgcgagcgcg gccaccgaga 1860

atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg tgcctggcct cgcgccgccg 1920

tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg caccagttgc gtgagcggaa 1980

agatggccgc ttcccggccc tgctccaggg ggctcaaaat ggaggacgcg gcgctcggga 2040

gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct ttccgtcctc agccgtcgct 2100

tcatgtgact ccacggagta ccgggcgccg tccaggcacc tcgattagtt ctggagcttt 2160

tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg cgatggagtt tccccacact 2220

gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga tgtaattctc gttggaattt 2280

gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt 2340

tttcttccat ttcaggtgtc gtgaacacgt ggtcgcggcc atctagagcc accatgtggc 2400

ccctggtagc ggcgctgttg ctgggctcgg cgtgctgcgg atcagctcag ctactattta 2460

ataaaacaaa atctgtagaa ttcacgtttt gtaatgacac tgtcgtcatt ccatgctttg 2520

ttactaatat ggaggcacaa aacactactg aagtatacgt aaagtggaaa tttaaaggaa 2580

gagatattta cacctttgat ggagctctaa acaagtccac tgtccccact gactttagta 2640

gtgcaaaaat tgaagtctca caattactaa aaggagatgc ctctttgaag atggataaga 2700

gtgatgctgt ctcacacaca ggaaactaca cttgtgaagt aacagaatta accagagaag 2760

gtgaaacgat catcgagcta aaatatcgtg ttgtttcatg gttttctcca aatgaaaata 2820

ttcttattgt tattttccca atttttgcta tactcctgtt ctggggacag tttggtatta 2880

aaacacttaa atatagatcc ggtggtatgg atgagaaaac aattgcttta cttgttgctg 2940

gactagtgat cactgtcatt gtcattgttg gagccattct tttcgtccca ggtgaatatt 3000

cattaaagaa tgctactggc cttggtttaa ttgtgacttc tacagggata ttaatattac 3060

ttcactacta tgtgtttagt acagcgattg gattaacctc cttcgtcatt gccatattgg 3120

ttattcaggt gatagcctat atcctcgctg tggttggact gagtctctgt attgcggcgt 3180

gtataccaat gcatggccct cttctgattt caggtttgag tatcttagct ctagcacaat 3240

tacttggact agtttatatg aaatttgtgg cttccaatca gaagactata caacctccta 3300

ggaaagctgt agaggaaccc cttaatgcat tcaaagaatc aaaaggaatg atgaatgatg 3360

aataagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat cccggcccta 3420

tgggatcggc cattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga 3480

ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc 3540

ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga 3600

atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg 3660

cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc 3720

cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg 3780

atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga 3840

aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc 3900

tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca 3960

tgcccgacgg cgatgatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg 4020

tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct 4080

atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg 4140

accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc 4200

gccttcttga cgagttcttc tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag 4260

aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac 4320

cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt 4380

tcagggggag gtgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtatggc 4440

tgattatgat ccggctgcct cgcgcgattg gtgacagaaa agccccatcc ttaggcctcc 4500

tccttcctag tctcctgata ttgggtctaa cccccacctc ctgttaggca gattccttat 4560

ctggtgacac acccccattt cctggagcca tctctctcct tgccagaacc tctaaggttt 4620

gcttacgatg gagccagaga ggatcctggg agggagagct tggcaggggg tgggagggaa 4680

gggggggatg cgtgacctgc ccggttctca gtggccaccc tgcgctaccc tctcccagaa 4740

cctgagctgc tctgacgcgg ccgtctggtg cgtttcactg atcctggtgc tgcagcttcc 4800

ttacacttcc caagaggaga agcagtttgg aaaaacaaaa tcagaataag ttggtcctga 4860

gttctaactt tggctcttca cctttctagt ccccaattta tattgttcct ccgtgcgtca 4920

gttttacctg tgagataagg ccagtagcca gccccgtcct ggcagggctg tggtgaggag 4980

gggggtgtcc gtgtggaaaa ctccctttgt gagaatggtg cgtcctaggt gttcaccagg 5040

tcgtggccgc ctctactccc tttctctttc tccatccttc tttccttaaa gagtccccag 5100

tgctatctgg gacatattcc tccgcccaga gcagggtccc gcttccctaa ggccctgctc 5160

tgggcttctg ggtttgagtc cttggcaagc ccaggagagg cgctcaggct tccctgtccc 5220

ccttcctcgt ccaccatctc atgcccctgg ctctcctgcc ccttcaagct tggcgtaatc 5280

atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 5340

agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 5400

tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 5460

aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 5520

cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 5580

ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 5640

ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 5700

cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 5760

actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 5820

cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 5880

tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 5940

gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 6000

caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 6060

agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 6120

tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 6180

tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 6240

gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 6300

gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 6360

aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 6420

atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 6480

gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 6540

acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgaggcc cacgctcacc 6600

ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 6660

tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 6720

ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 6780

ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 6840

atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 6900

taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 6960

catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 7020

atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 7080

acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 7140

aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 7200

ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 7260

cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 7320

atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 7380

ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 7440

ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt 7500

tcgtc 7505

<210> 20

<211> 4864

<212> DNA

<213> 人工序列(AAVS1-CD47-2)

<400> 20

cattctctcc cctgggcctg tgccgctttc tgtctgcagc ttgtggcctg ggtcacctct 60

acggctggcc cagatccttc cctgccgcct ccttcaggtt ccgtcttcct ccactccctc 120

ttccccttgc tctctgctgt gttgctgccc aaggatgctc tttccggagc acttccttct 180

cggcgctgca ccacgtgatg tcctctgagc ggatcctccc cgtgtctggg tcctctccgg 240

gcatctctcc tccctcaccc aaccccatgc cgtcttcact cgctgggttc ccttttcctt 300

ctccttctgg ggcctgtgcc atctctcgtt tcttaggatg gccttctccg acggatgtct 360

cccttgcgtc ccgcctcccc ttcttgtagg cctgcatcat caccgttttt ctggacaacc 420

ccaaagtacc ccgtctccct ggctttagcc acctctccat cctcttgctt tctttgcctg 480

gacaccccgt tctcctgtgg attcgggtca cctctcactc ctttcatttg ggcagctccc 540

ctacccccct tacctctcta gtctgtgcta gctcttccag ccccctgtca tggcatcttc 600

caggggtccg agagctcagc tagtcttctt cctccaaccc gggcccctat gtccacttca 660

ggacagcatg tttgctgcct ccagggatcc tgtgtccccg agctgggacc accttatatt 720

cccagggccg gttaatgtgg ctctggttct gggtactttt atctgtcccc tccaccccac 780

agtggggcca ctagggacag ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca 840

cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc 900

gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg 960

gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg 1020

ccagaacaca ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg 1080

gcccttgcgt gccttgaatt acttccacct ggctccagta cgtgattctt gatcccgagc 1140

tggagccagg ggcgggcctt gcgctttagg agccccttcg cctcgtgctt gagttgaggc 1200

ctggcctggg cgctggggcc gccgcgtgcg aatctggtgg caccttcgcg cctgtctcgc 1260

tgctttcgat aagtctctag ccatttaaaa tttttgatga cctgctgcga cgcttttttt 1320

ctggcaagat agtcttgtaa atgcgggcca ggatctgcac actggtattt cggtttttgg 1380

gcccgcggcc ggcgacgggg cccgtgcgtc ccagcgcaca tgttcggcga ggcggggcct 1440

gcgagcgcgg ccaccgagaa tcggacgggg gtagtctcaa gctggccggc ctgctctggt 1500

gcctggcctc gcgccgccgt gtatcgcccc gccctgggcg gcaaggctgg cccggtcggc 1560

accagttgcg tgagcggaaa gatggccgct tcccggccct gctccagggg gctcaaaatg 1620

gaggacgcgg cgctcgggag agcgggcggg tgagtcaccc acacaaagga aaagggcctt 1680

tccgtcctca gccgtcgctt catgtgactc cacggagtac cgggcgccgt ccaggcacct 1740

cgattagttc tggagctttt ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc 1800

gatggagttt ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat 1860

gtaattctcg ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca 1920

gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcaggtgtcg tgaacacgtg gtcgcggcca 1980

tctagagcca ccatgtggcc cctggtagcg gcgctgttgc tgggctcggc gtgctgcgga 2040

tcagctcagc tactatttaa taaaacaaaa tctgtagaat tcacgttttg taatgacact 2100

gtcgtcattc catgctttgt tactaatatg gaggcacaaa acactactga agtatacgta 2160

aagtggaaat ttaaaggaag agatatttac acctttgatg gagctctaaa caagtccact 2220

gtccccactg actttagtag tgcaaaaatt gaagtctcac aattactaaa aggagatgcc 2280

tctttgaaga tggataagag tgatgctgtc tcacacacag gaaactacac ttgtgaagta 2340

acagaattaa ccagagaagg tgaaacgatc atcgagctaa aatatcgtgt tgtttcatgg 2400

ttttctccaa atgaaaatat tcttattgtt attttcccaa tttttgctat actcctgttc 2460

tggggacagt ttggtattaa aacacttaaa tatagatccg gtggtatgga tgagaaaaca 2520

attgctttac ttgttgctgg actagtgatc actgtcattg tcattgttgg agccattctt 2580

ttcgtcccag gtgaatattc attaaagaat gctactggcc ttggtttaat tgtgacttct 2640

acagggatat taatattact tcactactat gtgtttagta cagcgattgg attaacctcc 2700

ttcgtcattg ccatattggt tattcaggtg atagcctata tcctcgctgt ggttggactg 2760

agtctctgta ttgcggcgtg tataccaatg catggccctc ttctgatttc aggtttgagt 2820

atcttagctc tagcacaatt acttggacta gtttatatga aatttgtggc ttccaatcag 2880

aagactatac aacctcctag gaaagctgta gaggaacccc ttaatgcatt caaagaatca 2940

aaaggaatga tgaatgatga ataagagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg 3000

gaggagaatc ccggccctat gggatcggcc attgaacaag atggattgca cgcaggttct 3060

ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc 3120

tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc 3180

gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc 3240

acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg 3300

ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag 3360

aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 3420

ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt 3480

cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc 3540

gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gatgatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 3600

tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 3660

ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 3720

cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg 3780

cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gataagatac attgatgagt 3840

ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg 3900

ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca 3960

ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc 4020

tctacaaatg tggtatggct gattatgatc cggctgcctc gcgcgattgg tgacagaaaa 4080

gccccatcct taggcctcct ccttcctagt ctcctgatat tgggtctaac ccccacctcc 4140

tgttaggcag attccttatc tggtgacaca cccccatttc ctggagccat ctctctcctt 4200

gccagaacct ctaaggtttg cttacgatgg agccagagag gatcctggga gggagagctt 4260

ggcagggggt gggagggaag ggggggatgc gtgacctgcc cggttctcag tggccaccct 4320

gcgctaccct ctcccagaac ctgagctgct ctgacgcggc cgtctggtgc gtttcactga 4380

tcctggtgct gcagcttcct tacacttccc aagaggagaa gcagtttgga aaaacaaaat 4440

cagaataagt tggtcctgag ttctaacttt ggctcttcac ctttctagtc cccaatttat 4500

attgttcctc cgtgcgtcag ttttacctgt gagataaggc cagtagccag ccccgtcctg 4560

gcagggctgt ggtgaggagg ggggtgtccg tgtggaaaac tccctttgtg agaatggtgc 4620

gtcctaggtg ttcaccaggt cgtggccgcc tctactccct ttctctttct ccatccttct 4680

ttccttaaag agtccccagt gctatctggg acatattcct ccgcccagag cagggtcccg 4740

cttccctaag gccctgctct gggcttctgg gtttgagtcc ttggcaagcc caggagaggc 4800

gctcaggctt ccctgtcccc cttcctcgtc caccatctca tgcccctggc tctcctgccc 4860

cttc 4864

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(AAVS1-sgRNA-1)

<400> 21

ggggccacta gggacaggat 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(AAVS1-sgRNA-2)

<400> 22

gggaccacct tatattccca 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(AAVS1-sgRNA-3)

<400> 23

taaggaatct gcctaacagg 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(AAVS1-sgRNA-4)

<400> 24

ccatcctaag aaacgagaga 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(AAVS1-sgRNA-5)

<400> 25

ccggagagga cccagacacg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(AAVS1-sgRNA-6)

<400> 26

ttctgggaga gggtagcgca 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(B2M Primer F)

<400> 27

ggagaaaccc tgcagggaat 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(B2M Primer R)

<400> 28

tctaagggaa gcagagccgc 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(CIITA Primer F)

<400> 29

caccctgtga ggtgactgag 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(CIITA Primer R)

<400> 30

tgcaaacttg ggtaggtcgt 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(CD47 Primer F)

<400> 31

ccactgtccc cactgacttt 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(CD47 Primer R)

<400> 32

agctcgatga tcgtttcacc 20

<210> 33

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(SA2A)

<400> 33

ctgacctctt ctcttcctcc cacagggcct cgagagatct ggcagcggag agggcagagg 60

aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc cct 103

Claims

1.一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法，其特征在于，包括使用CRISPR系统，对iPSC细胞的基因组同时进行如下编辑：

iii）向细胞中导入含有Cas9蛋白和靶向AAVS1位点并插入编码CD47蛋白胞外段的多核酸序列sgRNA的质粒；其中，编码CD47蛋白胞外段的多核苷酸序列为：SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16；靶向AAVS1位点并插入编码CD47蛋白的sgRNA序列为：SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ IDNO:26；

其中，以上三种基因的编辑仅使用一步式电转染操作实现。

2.根据权利要求1所述的一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法，其特征在于，采用一步式电转染过程中，iPSC细胞用量为1×10⁶-1×10⁷个细胞，各质粒用量分别为0.5ug-5ug。

3.根据权利要求1所述的一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法，其特征在于，三种基因的编辑仅通过一次克隆挑选和鉴定操作实现。

4.根据权利要求1所述的一种低免疫原性iPSC细胞的制备方法，其特征在于，在编码CD47蛋白胞外段的多核苷酸序列前添加提高mRNA表达量或提高mRNA剪接效率的DNA元件，DNA元件为剪接受体位点和2A肽序列，序列为：SEQ ID NO:33。

5.一种低免疫原性iPSC细胞，其特征在于，该低免疫原性iPSC细胞通过如权利要求1-4任一项所述的方法产生。

6.根据权利要求5所述的低免疫原性iPSC细胞，其特征在于，所述低免疫原性iPSC细胞具有分化为NK细胞、巨噬细胞、T细胞、心肌细胞、内皮细胞、神经祖细胞、神经元细胞、间充质干细胞、肺部细胞以及肝脏细胞的能力。

7.一种低免疫原性iPSC细胞的组合物，其特征在于，包含低免疫原性iPSC细胞，所述低免疫原性iPSC细胞是基于权利要求1-4任一项所述的方法获得。