CN111944755B - 一种增强树突状细胞抗原提呈能力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种增强树突状细胞抗原提呈能力的方法，包括如下步骤：(1)制备高自噬水平胸腺瘤细胞：1)复苏从液氮中保存胸腺瘤细胞系Thy0517 CGMCC No.9328，培养；2)从Thy0517中提取RNA并逆转录为cDNA，扩增Atg12基因片段并插入质粒载体pc3.1(+)中，得到重组质粒；将重组质粒转染得到高自噬水平胸腺瘤细胞；(2)高效培养成熟树突状细胞；(3)高自噬水平胸腺瘤细胞和成熟树突状细胞共培养，得到抗原提呈能力增强的树突状细胞。本发明所用Thy0517细胞，培养条件简单，易大量获取，作为细胞原材料更加方便。本方法步骤简单、技术难度低，成本低。

Description

一种增强树突状细胞抗原提呈能力的方法
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种增强树突状细胞抗原提呈能力的方法。
背景技术
胸腺作为中枢淋巴器官，与机体的很多免疫功能密切相关，胸腺的病变往往会导致人体出现免疫方面的异常。目前已有研究证实，胸腺瘤微环境可提高树突状细胞自噬，进而增强树突状细胞的抗原提呈能力，从而在重症肌无力等自身免疫性疾病的发生中发挥致病作用。因此，深入挖掘胸腺瘤合并重症肌无力患者的树突状细胞自噬调控机制并从中产生新的发现可为免疫相关治疗提供新的方法和思路。
目前国内外胸腺瘤相关免疫基础研究相比于其他肿瘤少很多，主要原因之一在于胸腺瘤细胞系培育困难，目前国内外报道的仅有5例，且持续用于开展研究的仅2例。一例为2012年来自美国印第安纳大学医学院的学者发表的AB型胸腺瘤细胞系IU-TAB-1，另一例即为本申请的发明人于2015年创立的人AB型胸腺瘤细胞系Thy0517，并于2014年申请专利并于2016年获得的专利权，专利号为ZL201410312866.6，此细胞系为国内罕见的可稳定传代的人胸腺瘤细胞系，稳定的胸腺瘤细胞系是开展胸腺及相关微环境研究的瓶颈，同时也是进行各项胸腺瘤及免疫相关细胞实验的基础，但是迄今为止利用胸腺瘤细胞系制备免疫模型并提高特殊的免疫细胞亚群功能的发明尚未见报道。
树突状细胞是具有独特功能的细胞，它可以将先天性和适应性免疫反应联系起来。特别是目前它们被认为是最有效的抗原提呈细胞。树突状细胞的自噬与抗原提呈能力密切相关，目前研究认为树突状细胞的自噬增强其抗原提成能力亦随之增强。但是树突状细胞的体外稳定培养具有较大的局限性和难度。目前国内外主流的方式主要有两种，一种是通过直接分离人外周血获得，但是这种方式采血量大、得率低、纯度较差，难以满足大规模体外实验的需求。另一种方法是通过其他细胞系间接刺激得到，但是所需刺激因子众多，受实验环境等因素影响各因子的比例难以把握，刺激结果往往不理想且稳定性较差。
现有的研究和技术提高树突状细胞的抗原提呈能力主要是通过两种方式。一种是通过直接突变多肽负载树突状细胞等抗原提呈细胞实现，另一种是将突变抗原导入树突状细胞。但是这些方法存在的缺点在于树突状细胞的抗原提呈能力提升有限而且效率较低。更为重要的是，直接对树突状细胞进行突变抗原负载或导入等操作时需在细胞膜上打孔，这样容易对细胞本身的结构完整性造成损害影响细胞状态，每次操作之后细胞往往会出现一定比例的死亡，不利于树突状细胞后续的进一步应用。还有报道指出可通过雷帕霉素刺激神经胶质细胞自噬，然后提取该细胞分泌的自噬小体，再利用提取的自噬小体刺激树突状细胞成熟从而增强树突状细胞对下游T细胞等的激活作用，但是细胞自噬小体的提取需超高速离心机，对设备的要求较高，且大量提取时自噬小体的纯度难以把控。
因此，本领域迫切需要对现有提升树突状细胞抗原提呈能力的方案进行进一步完善和优化，从而获得数量多、状态好、高得率的抗原提呈能力增强的树突状细胞。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷与不足，提供一种增强树突状细胞抗原提呈能力的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种增强树突状细胞抗原提呈能力的方法，包括如下步骤：
(1)制备高自噬水平胸腺瘤细胞：
1)复苏从液氮中保存的胸腺瘤细胞系Thy0517保藏编号为CGMCC No.9328，进行细胞培养；
2)从胸腺瘤细胞系Thy0517中提取RNA并逆转录为cDNA，通过Atg12基因上、下游引物扩增Atg12基因片段并插入质粒载体pc3.1(+)中，得到重组质粒pc3.1(+)-Atg12；
所述Atg12基因上、下游引物分别用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述Atg12基因用SEQ ID NO.3所示；
3)将步骤2)获得的重组质粒pc3.1(+)-Atg12转染胸腺瘤细胞系Thy0517，得到高自噬水平胸腺瘤细胞；
(2)高效培养成熟树突状细胞：
1)复苏从液氮中保存的人急性单核细胞白血病细胞THP-1，在THP-1专用培养基培养，得到细胞达0.5×106个/ml-2×106个/ml的细胞悬液；
2)将所述人急性单核细胞白血病细胞THP-1细胞悬液铺入6孔板，每孔1-2ml，加入1.5-6μl诱导树突状细胞成熟混合因子A，混匀，培养36-48h；
3)各孔用1×PBS清洗细胞，再向各孔中加入新鲜的THP-1专用培养基1-2mL，和8-30μl诱导树突状细胞成熟混合因子B，混匀，培养12-36h，得到成熟树突状细胞；
(3)高自噬水平胸腺瘤细胞和成熟树突状细胞共培养：
将步骤(1)获得的高自噬水平胸腺瘤细胞接种于Transwell细胞培养板的上层培养室，将步骤(2)获得的成熟树突状细胞接种于Transwell细胞培养板的下层培养室，共培养1-3天，得到抗原提呈能力增强的树突状细胞。
诱导树突状细胞成熟混合因子A由终浓度150±50ng/μl的12-O-十四烷酰基佛波醇-13-乙酸酯、终浓度60±20ng/μl的重组人白细胞介素-4、终浓度40±10ng/μl的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和余量为浓度50mg/mL海藻糖PBS溶液组成，所述海藻糖PBS溶液的溶质是D-海藻糖，溶剂是pH＝7的灭菌1×PBS。
诱导树突状细胞成熟混合因子B由终浓度7±3ng/μl的细胞用脂多糖、终浓度7±3ng/μl的重组人白细胞介素-6，余量为浓度50mg/mL的海藻糖PBS溶液组成，所述海藻糖PBS溶液的溶质是D-海藻糖，溶剂是pH＝7的灭菌1×PBS。
THP-1专用培养基:由终浓度0.15-0.25ml/ml胎牛血清、终浓度10-20μl/ml青链霉素混合液(100×)、终浓度1-3ul/mlβ-巯基还原剂；余量为1640基础培养基组成。
本发明的优点：
(1)本发明中所使用的人胸腺瘤细胞系Thy0517细胞，培养条件简单，容易大量获取，用它作为细胞原材料更加方便。
(2)通过调整各刺激因子的配比与浓度，优化了现有THP-1刺激分化为成熟树突状细胞的培养条件，缩短了树突状细胞发育成熟的时间，提高了刺激转化效率，有利于树突状细胞的快速大量获取并用于后续操作。
(3)将自噬升高的胸腺瘤细胞作为刺激源，然后与树突状细胞经Transwell共培养提高其抗原提呈能力。这种共培养模式中对细胞的有创操作仅发生在Atg12基因转染胸腺瘤细胞的过程中，避免了以往对树突状细胞进行直接的干预和操作，可以有效保护树突状细胞的结构及功能完整性，减少操作过程中树突状细胞的人为损耗，节省了资源并提高了抗原提呈能力增强的树突状细胞的得率。
(4)相比于已报道的增强树突状细胞抗原提呈能力的方法，本方法整体的操作步骤更加简单、技术难度及复杂性相对更低，无需大型仪器设备，所用装置及耗材较容易购买，常规的分子生物学实验室均有条件实施，可有效节约人力及物力成本。
附图说明
图1为200倍光镜下胸腺瘤细胞Thy0517的形态。
图2为携带绿色荧光的Atg12基因重组质粒转染胸腺瘤细胞，在荧光显微镜下发出明显绿色荧光，证明转染成功。
图3为从THP-1细胞到刺激分化为成熟树突状细胞的各时间节点的形态特征(A：正常THP-1细胞；B：刺激后第二天的细胞；C：刺激后第三天的细胞；D：刺激后第四天的细胞；E：最终分化成的成熟树突状细胞)。
图4为利用流式细胞术分析各树突状细胞表面标志物在THP-1细胞上的表达(A：CD11c在THP-1细胞上的表达；B：HLA-DR在THP-1细胞上的表达；C：CD80在THP-1细胞上的表达；D：CD83在THP-1细胞上的表达；E：CD86在THP-1细胞上的表达)。
图5为利用流式细胞术分析各树突状细胞表面标志物在经THP-1细胞刺激分化成熟后的树突状细胞上的表达(A：CD11c在刺激分化成熟后的树突状细胞上的表达；B：HLA-DR在刺激分化成熟后的树突状细胞上的表达；C：CD80在刺激分化成熟后的树突状细胞上的表达；D：CD83在刺激分化成熟后的树突状细胞上的表达；E：CD86在刺激分化成熟后的树突状细胞上的表达)。
图6为THP-1细胞与刺激分化成熟后的树突状细胞的各树突状细胞表面标志物的平均流式荧光强度值比较。
图7为胸腺瘤细胞Thy0517与经THP-1细胞刺激分化成熟后的树突状细胞共培养的装置示意图(A：Transwell上层培养室；B：DMEM完全培养基；C：Transwell下层培养室；D：聚酯(PET)膜；E：胸腺瘤细胞Thy0517；F：THP-1专用培养基；G：经THP-1细胞刺激分化成熟后的树突状细胞)。
图8为利用流式细胞术分析共培养前后树突状细胞的表面标志物和主要抗原提呈能力指标变化情况(A-C：分别表示抗原提呈能力指标CD80、CD83和CD86在共培养前后的树突状细胞上的表达；D-E：分别表示树突状细胞的表面标志物指标HLA-D和CD11c在共培养前后的树突状细胞上的表达。)。
图9为共培养前后树突状细胞的表面标志物和主要抗原提呈能力指标的平均流式荧光强度值比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
胸腺瘤细胞系Thy0517，保藏编号：CGMCC No.9328,于2014年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，
质粒载体pc3.1(+)是商品。
人急性单核细胞白血病细胞THP-1购于国家实验细胞资源共享服务平台，细胞资源编号为3111C0001CCC000057。
胎牛血清是商品，购自美国Clark生物公司，货号为Cat#FB25015。
青链霉素混合液(100×)是商品，购自美国Sigma-Aldrich公司，货号为Cat#10378016。
β-巯基还原剂是商品，购自中国索莱宝生物技术有限公司，货号为Cat#M8211。
1640基础培养基(RPMI 1640basic)是商品，购自美国Gibco公司，货号为Cat#12633012。
DMEM完全培养基：由终浓度0.2ml/ml胎牛血清、终浓度15μl/ml青链霉素混合液(100×)；余量为DMEM高糖基础培养基组成。
DMEM高糖基础培养基是商品，购自美国Gibco公司，货号为Cat#11965092。
实施例1
诱导树突状细胞成熟混合因子A由终浓度150ng/μl的12-O-十四烷酰基佛波醇-13-乙酸酯、终浓度60ng/μl的重组人白细胞介素-4、终浓度40ng/μl的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和余量为浓度50mg/mL海藻糖PBS溶液组成，所述海藻糖PBS溶液的溶质是D-海藻糖，溶剂是pH＝7的灭菌1×PBS。
实施例2
诱导树突状细胞成熟混合因子A由终浓度100ng/μl的12-O-十四烷酰基佛波醇-13-乙酸酯、终浓度40ng/μl的重组人白细胞介素-4、终浓度30ng/μl的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和余量为浓度50mg/mL海藻糖PBS溶液组成，所述海藻糖PBS溶液的溶质是D-海藻糖，溶剂是pH＝7的灭菌1×PBS。
实施例3
诱导树突状细胞成熟混合因子A由终浓度200ng/μl的12-O-十四烷酰基佛波醇-13-乙酸酯、终浓度80ng/μl的重组人白细胞介素-4、终浓度50ng/μl的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和余量为浓度50mg/mL海藻糖PBS溶液组成，所述海藻糖PBS溶液的溶质是D-海藻糖，溶剂是pH＝7的灭菌1×PBS。
实施例4
诱导树突状细胞成熟混合因子B由终浓度7ng/μl的细胞用脂多糖、终浓度7ng/μl的重组人白细胞介素-6，余量为浓度50mg/mL的海藻糖PBS溶液组成，所述海藻糖PBS溶液的溶质是D-海藻糖，溶剂是pH＝7的灭菌1×PBS。
实施例5
诱导树突状细胞成熟混合因子B由终浓度4ng/μl的细胞用脂多糖、终浓度4ng/μl的重组人白细胞介素-6，余量为浓度50mg/mL的海藻糖PBS溶液组成，所述海藻糖PBS溶液的溶质是D-海藻糖，溶剂是pH＝7的灭菌1×PBS。
实施例6
诱导树突状细胞成熟混合因子B由终浓度10ng/μl的细胞用脂多糖、终浓度10ng/μl的重组人白细胞介素-6，余量为浓度50mg/mL的海藻糖PBS溶液组成，所述海藻糖PBS溶液的溶质是D-海藻糖，溶剂是pH＝7的灭菌1×PBS。
实施例7
THP-1专用培养基:由终浓度0.2ml/ml胎牛血清、终浓度5μl/ml青链霉素混合液(100×)、终浓度3ul/mlβ-巯基还原剂；余量为1640基础培养基组成。
实施例8
THP-1专用培养基:由终浓度0.15ml/ml胎牛血清、终浓度10μl/ml青链霉素混合液(100×)、终浓度1ul/mlβ-巯基还原剂；余量为1640基础培养基组成。
实施例9
THP-1专用培养基:由终浓度0.25ml/ml胎牛血清、终浓度20μl/ml青链霉素混合液(100×)、终浓度3ul/mlβ-巯基还原剂；余量为1640基础培养基组成。
实施例10
一种增强树突状细胞抗原提呈能力的方法，包括如下步骤：
(1)制备高自噬水平胸腺瘤细胞：
1)在37℃恒温水浴锅中复苏从液氮中保存的胸腺瘤细胞系Thy0517 CGMCCNo.9328(简称Thy0517)，并将细胞移入细胞培养瓶中的DMEM完全培养基培养(如图1所示)，将培养瓶放入37℃且内含5％CO2的细胞恒温培养箱中培养，24h后观察细胞生长状况并弃去原有的细胞培养基，用1×PBS清洗细胞3次(pH＝7，后面出现的1×PBS均为pH＝7的溶液)，再加入新的DMEM完全培养基，继续培养即可；
2)从Thy0517中提取RNA并逆转录为cDNA，通过Atg12基因上、下游引物扩增Atg12基因片段并插入质粒载体pc3.1(+)中，得到重组质粒pc3.1(+)-Atg12；
Atg12基因上游引物如SEQ ID NO.1所示；
下游引物如SEQ ID NO.2所示；
所述Atg12基因如SEQ ID NO.3所示；
3)将步骤2)获得的重组质粒pc3.1(+)-Atg12转染Thy0517，得到高自噬水平胸腺瘤细胞；转染过程如下：
a.当在显微镜下观察到Thy0517铺满培养瓶底时，弃去原有的细胞培养基，用1×PBS清洗细胞3次，再向细胞培养瓶内加入胰蛋白酶-EDTA消化液2ml，5min后弃去胰蛋白酶-EDTA消化液，加入新的DMEM完全培养基12ml终止消化并进行细胞计数。
b.准备一个细胞计数板和盖玻片，取需要计数的Thy0517细胞并进行稀释。用移液枪取10细胞稀释液，沿盖玻片边缘加入细胞计数板中，在倒置显微镜下用细胞计数器计数四角大格内的细胞，利用公式计算原有细胞总数＝(四角大格细胞总数/4)×104×稀释倍数×培养基体积。
c.将计数后的Thy0517悬液按照每孔1×106个/ml的比例加入六孔板中，每孔体积约为2ml，生长2天后使细胞密度达到80％左右。转染当天，将六孔板内的细胞培养液换为Opti-MEM培养基。Opti-MEM培养基为商品，购自美国Gibco公司，货号为Cat#31985070。
d.准备数个无菌1.5ml离心管，每管中加入5μl Lipofectamine 3000，再加120μlOpti-MEM培养基稀释，充分震荡混匀，室温静置5min。e.计算5μg带绿色荧光的Atg12基因重组质粒对应的溶液体积，按照2μl/μg DNA的比例加入P3000溶液，再加入Opti-MEM培养基至总体积125μl并充分混匀。按照体积1：1的比例将稀释的Lipofectamine 3000溶液分别加入到DNA混合液中，混匀后室温静置避光孵育15min。将混合液加入到六孔板细胞中，轻轻摇晃六孔板转染试剂充分混匀，放入恒温箱内培养6h后更换为细胞正常生长所需的DEME完全培养基。f.荧光显微镜下观察(7)中所得细胞，可见绿色荧光，阴性对照无此荧光，直观的反映了重组质粒pc3.1(+)-Atg12已成功转染进入胸腺瘤细胞Thy0517内(如图2所示)，得到高自噬水平胸腺瘤细胞；
(2)高效培养成熟树突状细胞
1)复苏在37℃恒温水浴锅中将从液氮中保存的人急性单核细胞白血病细胞THP-1，并将细胞移入盛有THP-1专用培养基(实施例7制备)的细胞瓶中培养，在37℃且内含5％CO2的细胞恒温培养箱中，当细胞达1×106个/ml细胞悬液时开始刺激分化；
2)将所述人急性单核细胞白血病细胞THP-1细胞悬液铺入6孔板，每孔1.5ml，加入3μl诱导树突状细胞成熟混合因子A(实施例1制备)，混匀，培养42h；
3)各孔用1×PBS清洗细胞3次，再向各孔中加入新鲜的THP-1专用培养基1.5mL，和20μl诱导树突状细胞成熟混合因子B(实施例4制备)，混匀，恒温培养箱中继续培养24h，得到成熟树突状细胞；
通过流式细胞术鉴定树突状细胞表型；
如图3所示，THP-1细胞正常生长时呈球形或椭球型，颗粒饱满，具有较好的折光性，光镜下可见亮而圆润的细胞散在悬浮于细胞培养液中，当细胞过多或老化时则较多的团块状悬浮，有的细胞颗粒萎缩变暗。向生长良好且数量适中的THP-1细胞培养液中加入诱导树突状细胞成熟混合因子A后的第二天观察，可发现细胞开始成团且悬浮性减弱，贴近培养皿底部。第三天可见细胞基本全部贴壁，且伸出细小伪足，悬浮细胞的形态逐渐消失，贴壁细胞的形态逐步呈现，细胞核隐约可见，当加入诱导树突状细胞成熟混合因子B后24h观察可见细胞已牢固贴壁，伸出大而长的伪足样结构，胞核明显，细胞体积大而扁平，具备典型树突状细胞的形态学特征。
本实施例中描述的流式鉴定过程如下：
a,用胰蛋白酶-EDTA消化液将树突状细胞完全细胞消化下来并集入离心管中离心(3000rpm，5min)，弃去上清，加入1×PBS重悬。重复用1×PBS清洗一次并调整细胞浓度为1×107个/ml。
b.设置“THP-1细胞”和“刺激分化成熟的树突状细胞”2组进行流式检测，同时各组分别设置同型对照。使用的流式抗体分别为德国美天旎公司购买的CD80-PE(货号为Cat#130117683)2μl、CD86-FITC(货号为Cat#130116159)2μl、CD83-APC(货号为Cat#130094186)5μl、CD11c-PE(货号为Cat#130113580)2μl、HLA-DR-PerCP(货号为Cat#130113404)2μl,轻轻混匀，常温避光孵育20min，再用1×PBS清洗2次，300μl 1×PBS重悬细胞后上机检测。如图4所示，分析各树突状细胞表面标志物在THP-1细胞上的表达情况，各指标阳性的细胞占细胞总量分别为CD11c 24.93％、HLA-DR 32.24％、CD800.17％、CD830.43％、CD860.73％；如图5所示，分析各树突状细胞表面标志物在经THP-1细胞刺激分化成熟后的树突状细胞上的表达情况，各指标阳性的细胞占细胞总量分别为CD11c 86.03％、HLA-DR 81.37％、CD8092.12％、CD8380.40％、CD8692.86％；
c.使用BD CellQuestTM Pro(V6.1)软件进行流式数据的分析。如图6所示，刺激分化成熟的树突状细胞与THP-1细胞相比CD11c、HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表达量均有显著升高(P<0.001)，其中与抗原提呈能力密切相关的指标CD80、CD83、CD86的表达在树突状细胞明显增强((P<0.001)。
(3)高自噬水平胸腺瘤细胞和成熟树突状细胞共培养：
将步骤(1)获得的高自噬水平胸腺瘤细胞接种于Transwell细胞培养板的上层培养室，将步骤(2)获得的成熟树突状细胞接种于Transwell细胞培养板的层培养室(如图7所示)，共培养2天，得到抗原提呈能力增强的树突状细胞。
将抗原提呈能力增强的树突状细胞与未经共培养的树突状细胞进行流式细胞学表面提呈抗原分析。
本实施例中描述的流式鉴定过程如下：
1)用胰蛋白酶-EDTA消化液将树突状细胞完全细胞消化下来并集入离心管中离心(3000rpm，5min)，弃去上清，用1×PBS清洗3次，最后用1×PBS重悬细胞并调整细胞浓度为1×107个/ml。
2)设置“树突状细胞”和“与Atg12转染的Thy0517共培养后的树突状细胞”2组进行流式检测，同时设置同型对照。使用的流式抗体分别为BD公司购买的CD80-PE 2μl、CD86-FITC2μl、CD83-APC 5μl、CD11c-PE 2μl、HLA-DR-PerCP 2μl,轻轻混匀，常温避光孵育20min，再用1×PBS清洗2次，300μl 1×PBS重悬细胞后上机检测。
3)使用BD CellQuestTM Pro(V6.1)软件进行流式数据的分析。如图8和图9所示，两组树突状细胞的特征指标CD11c和HLA-DR没有差异(P>0.05)，表明两组细胞均为树突状细胞且数量上几乎没有差异。但是共培养后树突状细胞的抗原提呈相关指标CD80、CD83和CD86的表达明显增强，差异具有统计学意义(P<0.01)。可见经与Atg12转染的Thy0517共培养后的，树突状细胞的抗原提呈能力较共培养前显著增强。
实施例11
一种增强树突状细胞抗原提呈能力的方法，包括如下步骤：
(1)制备高自噬水平胸腺瘤细胞：
同实施例10步骤(1)；
(2)高效培养成熟树突状细胞：
1)复苏在37℃恒温水浴锅中将从液氮中保存的人急性单核细胞白血病细胞THP-1，并将细胞移入盛有THP-1专用培养基(实施例8制备)的细胞瓶中培养，在37℃且内含5％CO2的细胞恒温培养箱中，当细胞达0.5×106个/ml细胞悬液时开始刺激分化；
2)将所述人急性单核细胞白血病细胞THP-1细胞悬液铺入6孔板，每孔1ml，加入1.5μl诱导树突状细胞成熟混合因子A(实施例2制备)，混匀，培养36h；
3)各孔用1×PBS清洗细胞2次，再向各孔中加入新鲜的THP-1专用培养基1mL，和8μl诱导树突状细胞成熟混合因子B(实施例5制备)，混匀，恒温培养箱中继续培养12h，得到成熟树突状细胞；
(3)高自噬水平胸腺瘤细胞和成熟树突状细胞共培养：
将步骤(1)获得的高自噬水平胸腺瘤细胞接种于Transwell细胞培养板的上层培养室，将步骤(2)获得的成熟树突状细胞接种于Transwell细胞培养板的下层培养室，共培养1天，得到抗原提呈能力增强的树突状细胞。
实施例12
一种增强树突状细胞抗原提呈能力的方法，包括如下步骤：
(1)制备高自噬水平胸腺瘤细胞：
同实施例10步骤(1)；
(2)高效培养成熟树突状细胞：
1)复苏在37℃恒温水浴锅中将从液氮中保存的人急性单核细胞白血病细胞THP-1，并将细胞移入盛有THP-1专用培养基(实施例9制备)的细胞瓶中培养，在37℃且内含5％CO2的细胞恒温培养箱中，当细胞达2×106个/ml细胞悬液时开始刺激分化；
2)将所述人急性单核细胞白血病细胞THP-1细胞悬液铺入6孔板，每孔2ml，加入6μl诱导树突状细胞成熟混合因子A(实施例3制备)，混匀，培养48h；
3)各孔用1×PBS清洗细胞3次，再向各孔中加入新鲜的THP-1专用培养基2mL，和30μl诱导树突状细胞成熟混合因子B(实施例6制备)，混匀，恒温培养箱中继续培养36h，得到成熟树突状细胞；
(3)高自噬水平胸腺瘤细胞和成熟树突状细胞共培养：
将步骤(1)获得的高自噬水平胸腺瘤细胞接种于Transwell细胞培养板的上层培养室，将步骤(2)获得的成熟树突状细胞接种于Transwell细胞培养板的下层培养室，共培养3天，得到抗原提呈能力增强的树突状细胞。
实施例11和实施例12制备的一种增强树突状细胞抗原提呈能力与实施例10相似。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 天津医科大学总医院
<120> 一种增强树突状细胞抗原提呈能力的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgggatcccg atggcggagg agccgcagtc 30
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggaattccg tcatccccac gcctgagact tg 32
<210> 3
<211> 423
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
atggcggagg agccgcagtc tgtgttgcag cttcctactt caattgctgc tggaggggaa 60
ggacttacgg atgtctcccc agaaacaacc accccggagc ccccgtcttc cgctgcagtt 120
tccccgggaa cagaggaacc tgctggcgac accaagaaaa aaattgacat tttgctaaag 180
gctgtgggag acactcctat tatgaaaaca aagaagtggg cagtagagcg aacacgaacc 240
atccaaggac tcattgactt catcaaaaag tttcttaaac ttgtggcctc agaacagttg 300
tttatttatg tgaatcagtc ctttgctcct tccccagacc aagaagttgg aactctctat 360
gagtgttttg gcagtgatgg taaactggtt ttacattact gcaagtctca ggcgtgggga 420
tga 423

Claims (1)

1.一种增强树突状细胞抗原提呈能力的方法，其特征是包括如下步骤：
（1） 制备高自噬水平胸腺瘤细胞：
1）复苏从液氮中保存的胸腺瘤细胞系Thy0517 保藏编号为CGMCC No.9328，进行细胞培养；
2）从胸腺瘤细胞系Thy0517中提取RNA并逆转录为cDNA，通过Atg12基因上、下游引物扩增Atg12基因片段并插入质粒载体pc3.1（+）中，得到重组质粒pc3.1（+）-Atg12；
所述Atg12基因上、下游引物分别用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述Atg12基因用SEQ ID NO.3所示；
3）将步骤2）获得的重组质粒pc3.1（+）-Atg12转染胸腺瘤细胞系Thy0517，得到高自噬水平胸腺瘤细胞；
（2）高效培养成熟树突状细胞
1）复苏从液氮中保存的人急性单核细胞白血病细胞THP-1，在THP-1专用培养基培养，得到细胞达0.5×106个/ml-2×106个/ml的细胞悬液；
2）将所述人急性单核细胞白血病细胞THP-1细胞悬液铺入6孔板，每孔1-2ml，加入1.5-6µl诱导树突状细胞成熟混合因子A，混匀，培养36-48h；
3）各孔用1×PBS清洗细胞，再向各孔中加入新鲜的THP-1专用培养基1-2mL，和8-30µl诱导树突状细胞成熟混合因子B，混匀，培养12-36h，得到成熟树突状细胞；
（3）高自噬水平胸腺瘤细胞和成熟树突状细胞共培养
将步骤（1）获得的高自噬水平胸腺瘤细胞接种于Transwell细胞培养板的上层培养室，将步骤（2）获得的成熟树突状细胞接种于Transwell细胞培养板的下层培养室，共培养1-3天，得到抗原提呈能力增强的树突状细胞；
所述诱导树突状细胞成熟混合因子A由终浓度150±50ng/µl的12-O-十四烷酰基佛波醇-13-乙酸酯、终浓度60±20ng/µl的重组人白细胞介素-4、终浓度40±10ng/µl的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和余量为浓度50 mg/mL海藻糖PBS溶液组成，所述海藻糖PBS溶液的溶质是D-海藻糖，溶剂是pH=7的灭菌1×PBS；
所述诱导树突状细胞成熟混合因子B由终浓度7±3ng/µl的细胞用脂多糖、终浓度7±3ng/µl的重组人白细胞介素-6，余量为浓度50 mg/mL的海藻糖PBS溶液组成，所述海藻糖PBS溶液的溶质是D-海藻糖，溶剂是pH=7的灭菌1×PBS。
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探究树突状细胞自噬在胸腺瘤合并MG组织及Thy0517共培养下的表达作用;厉辛野;《中国优秀硕士论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20190215(第02期);E072-574 *
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