CN113907049B

CN113907049B - 一种免疫强化的eamg小鼠模型的建立方法

Info

Publication number: CN113907049B
Application number: CN202111517803.0A
Authority: CN
Inventors: 张鹏; 路超; 杨照宇; 段舒宁; 宋世辉
Original assignee: Airport Hospital Of Tianjin Medical University General Hospital
Current assignee: Airport Hospital Of Tianjin Medical University General Hospital
Priority date: 2021-12-13
Filing date: 2021-12-13
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2041-12-13
Also published as: CN113907049A

Abstract

本发明提供了一种免疫强化的实验性自身免疫性重症肌无力（(Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis，EAMG）小鼠模型的建立方法，在AchR肽段免疫诱导成模的基础上，续惯注射胸腺瘤细胞系Thy0517刺激培养的树突状细胞，并辅以氢氧化铝佐剂，建立了该模型。本发明公开的免疫强化的EAMG小鼠模型，通过增强树突状细胞抗原呈递能力可使小鼠体内保持稳定的免疫强化状态，且成模周期从110±3天有效缩短为98±3天。同时，利用肌肉多模态检测验证该小鼠模型相关的特征性改变。为重症肌无力的探索研究提供了稳定的模型。

Description

一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及EAMG小鼠模型的建立方法，具体而言，涉及一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法。

背景技术

重症肌无力（Myasthenia gravis，MG）是一种自身免疫性疾病，其特征是机体产生自身抗体对神经肌肉接头处的不同靶标进行攻击，从而引起肌肉疲劳和虚弱。根据自身抗体的靶标，MG可分为以肌肉型乙酰胆碱受体（Acetylcholine receptor，AchR）为靶标的肌无力；由于自身抗体结合了肌肉特异性酪氨酸激酶导致的MG；自身抗体攻击凝集素受体低密度脂蛋白受体相关蛋白4后产生的肌无力；以 LRP4配体为靶标的自身抗体而导致的MG；不明原因或无法查明靶标的肌无力。其中，超过85%的重症肌无力患者发病都是由针对神经肌肉接头处的AChR抗体引起的。重症肌无力主要损害骨骼肌，随着临床与神经免疫研究的进展发现除了骨骼肌受累外，重症肌无力还可能累积其他肌群，但目前对肌无力背景下其他肌群的变化情况认识仍尚不深入。

实验性自身免疫性重症肌无力(Experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)小鼠是研究此类疾病经典的动物模型。通过建立实验性重症肌无力动物模型, 探讨发病机理及免疫治疗的方法, 有助于阐明自身免疫性疾病的发病机制,寻找探索自身免疫性疾病发病机制的新途径。由于在众多MG病例中，针对乙酰胆碱受体产生自身抗体激活补体系统引起神经肌肉接头处发生功能障碍并减少功能性的AchR从而发生MG的比例占据绝大多数，因此通过AChR免疫诱导的EAMG模型是最常见和最成熟的造模方式。传统的EAMG模型包括从加利福尼亚电鳐的电器官及眼镜蛇毒素中提取并纯化AchR蛋白作为免疫原对实验动物进行主动免疫造模，但由于加利福尼亚电鳐以及用于纯化的眼镜蛇神经毒素等原材料获取较为困难，因此该方法的应用受到了很大的局限。此外，国内外研究人员还发明了利用重组人AchR建立EAMG模型或使用人工合成AchR多肽主动免疫建立EAMG模型。其中较常见的是利用AchR多肽构建的小鼠或大鼠EAMG模型。该模型的构建主要通过将弗氏佐剂与人工合成的AchR多肽充分乳化后注入老鼠体内，佐剂中包含的AchR可使老鼠产生AchR自身免疫性抗体，在神经肌肉接头处形成大量IgG和补体沉积，诱发肌无力产生。虽然AchR肽段制备与注射技术相对简单且成熟，但由于注射AchR诱发的免疫反应为主动免疫，在动物体内须经T细胞抗原处理呈递再由B细胞生成抗体，这一过程相对较长同时也增加了成模不稳定性。本发明采用了C57BL/6小鼠，在注射人工合成AchR肽段-弗氏佐剂的基础上，续惯注射一种经优化的胸腺瘤细胞刺激的抗原提呈能力增高的树突状细胞，从而构建一种免疫强化的EAMG模型。高抗原提呈能力的树突状细胞的加入大大提高了AchR多肽经T、B细胞免疫反应刺激动物机体产生自免性抗体的效率，使成模时间更短且模型稳定, 有助于利用此模型进行进一步研究。此外，我们在注入树突状细胞的同时还添加了氢氧化铝佐剂，通过增强MHCⅡ类分子和CD80、CD86等共刺激分子的表达增强树突状细胞对抗原的摄取，改变抗原提呈的强度和作用时间，推动了EAMG模型的快速稳定建立。

建立EAMG动物模型后，对模型进行准确可靠的验证为确保后续相关研究的稳定进行至关重要。目前较常见的EAMG动物模型验证方法主要包括Lennon肌力分级、体重、抓力、倒网测试、AChR特异性抗体测量、肌电图等多种手段。Lennon肌力分级、抓力、倒网测试、球形征观察等虽操作便捷、直观易懂，但这些手段主要依靠操作者对结果的判读，主观性相对较强，在实际应用中常易受外界环境条件制约或干扰，缺乏更为准确客观性的依据。现有验证手段中的病理手段，如通过肌肉组织切片HE/免疫组化染色观察肌肉变化情况或自身免疫性抗体含量，虽然是目前行业内公认的金标准，但是这种方法需杀死动物取得生物学样本，验证手段不具备无创性、便捷性及可重复性，会对动物造成不可逆的伤害，无法连续监测并开展后续研究。现有技术中的肌电图是采用低频重复电刺激检查肌肉的电衰减反应，虽然可以反映一部分肌肉变化的情况，但这种方法主要聚焦于四肢的神经肌肉接头处，指标相对单一，无法反映心肌和胃肠道平滑肌的病理改变，更无法全面揭示免疫性多系统肌肉变化情况。

因此，本发明在AchR肽段免疫诱导成模的基础上，续惯注射胸腺瘤细胞系Thy0517刺激培养的树突状细胞，并辅以氢氧化铝佐剂，建立了一种免疫强化的EAMG小鼠模型，并利用肌肉多模态检测对该小鼠模型相关的特征性改变进行了充分验证。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服上述现有技术中存在的缺陷，提供一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法；

本发明的另一个目的在于通过肌肉多模态检测验证所建立的免疫强化的EAMG小鼠模型相关的特征性改变。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供了一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法，所述建立方法包括向造模用的小鼠注射AchR-弗氏完全佐剂溶液、AchR-弗氏不完全佐剂溶液，续惯注射制备好的树突状细胞（Dendritic Cell，DC）+氢氧化铝佐剂混悬液。该建立方法通过增强树突状细胞抗原呈递能力可使体内保持稳定的免疫强化状态，成模周期从110±3天有效缩短为98±3天，同时提高了成模稳定性。

在一些实施方案中，所述AchR-弗氏完全佐剂溶液是由弗氏完全佐剂（CFA）和AchR肽段溶液乳化合成；所述AchR-弗氏不完全佐剂溶液是由弗氏不完全佐剂（IFA）和AchR肽段溶液乳化合成；所述AchR肽段溶液中的溶质为AchRα亚基97-116肽段，溶剂为1×PBS溶液。树突状细胞经胸腺瘤细胞系Thy0517刺激培养，并以氢氧化铝佐剂强化树突状细胞功能。

在一些实施方案中，树突状细胞+氢氧化铝佐剂混悬液的制备方法为：将转染了Atg12质粒的胸腺瘤细胞系Thy0517与由THP-1细胞系刺激分化的工具树突状细胞共培养3-5天后，刺激培养后的树突状细胞重悬于无菌1*PBS溶液中，并加入氢氧化铝佐剂轻柔混匀，制得树突状细胞+氢氧化铝佐剂混悬液。

在一些实施方案中，续惯注射制备好的树突状细胞+氢氧化铝佐剂的具体步骤为：造模第67-70天，通过C57BL/6小鼠尾静脉注射树突状细胞-氢氧化铝佐剂混悬液150-200ul，该混悬液为无菌1*PBS混悬液包含树突状细胞5×10⁶个-5×10⁷个细胞/ml及氢氧化铝0.3—0.5mg/ml，此后连续3-4周于相同时间点注射该混悬液。

在一些实施方案中，，该建立方法还包括在造模后第98±3天对小鼠模型相关的骨骼肌、心肌和平滑肌的特征性改变进行验证。具体的，验证模型相关的骨骼肌特征性改变包括通过外周血免疫细胞亚群与其他指标的相关性分析以及骨骼肌组织病理免疫联合特染；验证模型相关的心肌特征性改变包括超声检查和心肌组织病理免疫联合特染；验证模型相关的平滑肌特征性改变包括腹部CT和胃肠组织病理免疫联合特染；所述组织病理免疫联合特染包括HE染色、Mason染色和RyR免疫抗体特染，还包括对小鼠模型进行多肌群组织的病理HE染色、Mason染色及组织特异性标志物RyR共表达的相关性分析。

进一步地，外周血免疫细胞亚群与其他指标的相关性分析，包括外周血免疫细胞Th17细胞及Treg细胞的流式细胞学检测，Th17/Treg比值的统计计算以及该比值在EAMG小鼠模型验证方面与其他指标的相关性分析；所述其他指标包括小鼠临床症状的分级、体重、抓力、反向测试时间、各频率刺激下的肌电传导衰减率及血清AchR抗体浓度。

进一步地，超声检查涉及观察记录心率、心输出量、左室收缩末期内径、左室舒张末期内径、左室室壁舒张末期厚度等心功能指标，计算左室短轴缩短率和射血分数。同时还包括使用15MHz高频超声探头检测小鼠模型肺部产生的垂直并起源于胸膜线的长彗星尾伪影，以此来验证模型相关的心肌特征性改变。

进一步地，腹部CT的具体步骤为通过对小鼠进行正侧位CT平扫，取正侧和侧位腹腔横径最大时所在层面，分别扫描读取正侧位该层面中胃肠胀气及腹腔截面的面积，分别计算正侧位胃肠胀气/腹腔截面面积的比值为V1、V2，结合各小鼠体重W，计算得到小鼠胃肠胀气指数p=V1*V2/W，通过测量小鼠模型建立前后胃肠胀气指数的变化反映模型相关的胃肠平滑肌特征性改变。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明所提供的免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法，基于AchR肽段+佐剂注射造模方法，再续惯注射了经特殊处理的树突状细胞（与转染了Atg12质粒的胸腺瘤细胞系Thy0517共培养后的工具树突状细胞），建立的模型是区别于传统造模的免疫强化的EAMG小鼠模型。传统的造模方法成模时间不稳定，受客观因素干扰性大，本模型其成模稳定性更高，免疫症状更重，多肌肉病理改变更显著，更有助于后续疾病机制探索和未来药物研究的开展。

（2）本发明所提供的免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法，建立免疫强化的EAMG小鼠模型过程中使用的氢氧化铝佐剂，能够与树突状细胞表面的脂类结合通过吞噬作用传递抗原，通过增强MHCⅡ类分子和CD80、CD86等共刺激分子的表达增强树突状细胞对抗原的摄取进一步发挥树突状细胞的抗原提呈潜力，同时还能够降低已被摄取抗原的降解率，增强机体免疫反应的强度和持久性。

（3）本发明所提供的免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法，在注射AchR肽段及弗氏佐剂造模的基础上，深入对比了续惯注射经特殊处理的树突状细胞（与转染了Atg12质粒的胸腺瘤细胞系Thy0517共培养后的工具树突状细胞）+氢氧化铝佐剂与未续惯注射上述合剂时，EAMG小鼠的外周血细胞免疫水平和各肌群病理免疫变化情况，进一步证实了续惯注射经特殊处理的树突状细胞+氢氧化铝佐剂在促进EAMG小鼠免疫强化方面发挥的重要促进作用。

（4）本发明对所提供的免疫强化的EAMG小鼠模型进行了骨骼肌、心肌、平滑肌三大肌群特征性改变的全面验证。同时关注了不同批次、不同条件、不同生长状况，尤其是造模所用的不同来源的药剂等导致的在验证过程中指标的较大波动性，本发明最大程度兼顾了造模小鼠上述各项客观条件的均衡性，使验证结果更加稳定可靠。此外还将外周血免疫细胞亚群与其他指标进行有机结合，构建近似相关系数，揭示了两种指标间存在的相关性和变化趋势。

（5）本发明所提供的免疫强化的EAMG小鼠模型通过超声检查及腹部CT检查等无创或微创的手段进行验证，不会对动物造成不可逆的伤害，有效确保了模型的完整性，可对小鼠模型进行连续性的研究。

（6）本发明在利用腹部CT正侧位平扫验证所提供的免疫强化的EAMG小鼠模型中，创新性地提出了胃肠胀气指数p的概念，有利于后续图像数据转换并进行不同小鼠的间的对比分析，兼顾了正侧位的情况同时考虑了体重对腹腔大小的影响因素，通过计算该指标可简洁直观地反映小鼠胃肠胀气的情况。

（7）本发明所提供的免疫强化的EAMG小鼠模型，对骨骼肌、心肌、平滑肌等多系统靶肌肉组织进行了免疫特染验证，同时结合组织HE及Mason染色，进行多肌群横向比较，尤其是免疫特异性标志物的共表达分析，更加直观地呈现了小鼠模型多肌群改变的一致性以及与自身抗原抗体反应的密切关联。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为建模所需的树突状细胞刺激在刺激分化发育的不同阶段的形态（其中A为THP-1工具细胞、B为由THP-1细胞刺激分化的成熟的树突状细胞、C为与转染了Atg12的胸腺瘤细胞Thy0517共培养后的成熟树突状细胞）；

图2为各组小鼠外周血Th17及Treg细胞的表达情况（其中A为对照组、B为造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组、C为造模组）；

图3为各组小鼠外周血Th17、Treg及Th17/Treg表达情况统计图（其中A为对照组、B为造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组、C为造模组，*代表P<0.05，**代表P<0.01）；

图4为对照组小鼠与造模组小鼠体重变化的对比（***代表P<0.001）；

图5为对照组小鼠与造模组小鼠抓力及反向测试的对比（**代表P<0.05，***代表P<0.001）；

图6为对照组小鼠（A）和造模组小鼠（B）的腓肠肌肌电图及其统计分析的结果；

图7为对照组小鼠和造模组小鼠在3、5、10Hz下的腓肠肌肌电图振幅衰减率（***代表P<0.001）；

图8为对照组和造模组小鼠的血清AchR抗体浓度标准曲线（标准曲线中R2>0.99）；

图9为对照组小鼠与造模组小鼠血清AchR浓度的对比柱状图（***代表P<0.001）

图10为对照组、造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组及造模组小鼠的骨骼肌组织切片HE染色结果（均取自200倍光镜下的视野）；

图11为对照组、造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组及造模组小鼠的骨骼肌组织切片Mason染色结果（均取自200倍光镜下的视野）；

图12为对照组、造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组及造模组小鼠的骨骼肌RyR抗体免疫组化染色结果（均取自200倍光镜下的视野）；

图13为对照组小鼠与造模组小鼠的心脏超声检查的结果（左为对照组小鼠，右为造模组小鼠；图中圈出的部分为心功能指标左室短轴缩短率FS与射血分数EF）；

图14为对照组小鼠与造模组小鼠肺部超声检查的结果（左为对照组小鼠；右为造模组小鼠，右图中箭头所指为造模组小鼠肺水肿后出现的特征性B线）；

图15为对照组、造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组及造模组小鼠的心肌组织切片HE染色结果（均取自200倍光镜下的视野）；

图16为对照组、造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组及造模组小鼠的心肌组织切片Mason染色结果（均取自200倍光镜下的视野）；

图17为对照组、造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组及造模组小鼠的心肌RyR抗体免疫组化染色结果（均取自200倍光镜下的视野）；

图18为对照组小鼠（A）与造模组小鼠（B）的正侧位腹部CT图像的结果；

图19为对照组、造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组及造模组小鼠的胃肠平滑肌组织切片HE染色结果（均取自200倍光镜下的视野）；

图20为对照组、造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组及造模组小鼠的胃肠平滑肌组织切片Mason染色结果（均取自200倍光镜下的视野）；

图21为对照组、造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组及造模组小鼠的胃肠平滑肌RyR抗体免疫组化染色结果（均取自200倍光镜下的视野）。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不是对本申请的范围的限定。根据优选实施方案的下列详细描述，本申请的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

为了进一步理解本发明，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一、建立模型

所需特殊细胞与试剂：

a、胸腺瘤细胞系Thy0517，保藏编号：CGMCC No.9328,于2014年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

b、人急性单核细胞白血病细胞THP-1购于国家实验细胞资源共享服务平台，细胞资源编号为3111C0001CCC000057。

c、AchRα亚基肽段干粉是商品，购自西安霖肽生物科技有限公司。

d、弗氏完全佐剂（CFA）是商品，购自美国Sigma-Aldrich公司，货号为Cat# F5881。

e、弗氏不完全佐剂（IFA）是商品，购自美国Sigma-Aldrich公司，货号为Cat#F5506。

f、氢氧化铝是商品，购自美国Thermo公司，货号为Cat# 77161。

g、C57BL/6小鼠是商品，购自南京实验动物研究所。

免疫强化的EAMG小鼠模型的建立（造模组）：

1.在造模第1天，进行第一次免疫注射，具体步骤包括：

(1)在无菌EP管中用1ml灭菌1*PBS稀释200mg纯化的肽段，本次配置混合液为10只造模动物的剂量。

(2)将1mL 肽段溶液吸入一个2ml注射器中，并连接注射器到乳化针头连接器的一端，驱散管路内空气。

(3)用移液枪头缓慢吹匀混合完全弗氏佐剂，吹匀过程中避免产生气泡，并将1ml的完全弗氏佐剂吸入到第二个2mL注射器中。排出空气并将注射器连接到乳化针头连接器的另一端，确保所有连接紧密。

(4)先通过连接器快速将肽段溶液推入含有完全弗氏佐剂的注射器中。然后将溶液从一个注射器向前再向后推入另一个注射器，该混合步骤在冰上进行，持续5分钟直到乳液变稠，并且当注射器保持垂直时乳剂中的小气泡不向上移动。

(5)用铝箔包裹注射器和乳化针头连接器，并在4°C环境下冷却30分钟，使乳液更加稠密。

(6)在双蒸水中稀释50mg/ml戊巴比妥钠至1:10,使用1ml注射器，腹腔注射65mg/kg戊巴比妥钠，麻醉小鼠，将麻醉好的小鼠放在恒温加热垫上以防止体温降低。将4°C环境下保存的乳液取出，转移至1mL注射器中，用酒精棉球清洁小鼠双侧肩部及背部两点，每个位点注射50μL乳液。观察小鼠状态，直至全部从麻醉中苏醒。

2.在造模第28至30天，进行第二次免疫注射，具体步骤包括：

(1)在无菌EP管中用0.5ml 灭菌1×PBS稀释200mg纯化的肽段，本次配置混合液为10只造模动物的剂量。

(2)将0.5mL 肽段溶液吸入一个2ml注射器中，并连接注射器到乳化针头连接器的一端，驱散管路内空气。

(3)用移液枪头缓慢吹匀混合不完全弗氏佐剂，吹匀过程中避免产生气泡，并将0.5ml的不完全弗氏佐剂吸入到第二个2mL注射器中。排出空气并将注射器连接到乳化针头连接器的另一端，确保所有连接紧密。

(4)先通过连接器快速将肽段溶液推入含有不完全弗氏佐剂的注射器中。然后将溶液从一个注射器向前再向后推入另一个注射器，该混合步骤在冰上进行，持续5分钟直到乳液变稠，并且当注射器保持垂直时乳剂中的小气泡不向上移动。

(6)在双蒸水中稀释50mg/ml戊巴比妥钠至1:10,使用1ml注射器，腹腔注射65mg/kg戊巴比妥钠，麻醉C57BL/6小鼠，将麻醉好的C57BL/6小鼠放在恒温加热垫上以防止体温降低。将4°C环境下保存的乳液取出，转移至1mL注射器中，用酒精棉球清洁C57BL/6小鼠尾根部、双侧肩部及腰背部，尾根部注射40μL乳液，两侧肩部及腰背部各注射20μL乳液。观察C57BL/6小鼠状态，直至全部从麻醉中苏醒。

3.在造模第56至60天，进行第三次免疫注射，具体步骤和注射乳液配制与第二次免疫注射一致。

4. 高抗原提呈能力的树突状细胞制备，具体步骤如下：

(1)所需材料：

1）胸腺瘤细胞系Thy0517，保藏编号：CGMCC No.9328，于2014年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

2）质粒载体pc3.1(+)通过商品渠道购买。

3）人急性单核细胞白血病细胞THP-1购于国家实验细胞资源共享服务平台，细胞资源编号为3111C0001CCC000057。

4）胎牛血清是商品，购自美国Clark生物公司，货号为Cat#FB25015。

5）青链霉素混合液(100×)是商品，购自美国Sigma-Aldrich公司，货号为Cat#10378016。

6）β-巯基还原剂是商品，购自中国索莱宝生物技术有限公司，货号为Cat#M8211。

7）1640基础培养基(RPMI 1640basic)是商品，购自美国Gibco公司，货号为Cat#12633012。

8）DMEM完全培养基：由终浓度0 .2ml/ml胎牛血清、终浓度15μl/ml青链霉素混合液(100×)；余量为DMEM高糖基础培养基组成。

9）DMEM高糖基础培养基是商品，购自美国Gibco公司，货号为Cat#11965092。

10）诱导树突状细胞成熟混合因子A由终浓度150±50ng/μL的12-0-十四烷酰基佛波醇-13-乙酸酯、终浓度60±20ng/μL的重组人抱细胞介素-4、终浓度40±10ng/μL的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和余量为浓度50mg/mL海藻糖PBS溶液组成，所述海藻糖PBS溶液的溶质是D-海藻糖，溶剂是pH=7的灭菌1×PBS。

11）诱导树突状细胞成熟混合因子B由终浓度7±3ng/μL的细胞用脂多糖、终浓度7±3ng/μL的重组人抱细胞介素-6和余量为浓度50mg/mL海藻糖PBS溶液组成，所述海藻糖PBS溶液的溶质是D-海藻糖，溶剂是pH=7的灭菌1×PBS。

12）THP-1专用培养基：由终浓度0.15-0.25mL/mL胎牛血清、终浓度10-20ng/μL青链霉素混合液（100×）、终浓度1-3μL/mL β-巯基还原剂，余量为1640基础培养基组成。

（2）树突状细胞预处理，步骤如下：

1) 制备高自噬水平胸腺瘤细胞：

a、在37℃恒温水浴锅中复苏从液氮中保存的胸腺瘤细胞系Thy0517 CGMCCNo.9328（简称Thy0517），并将细胞移入细胞培养瓶中的DMEM完全培养基培养，将培养瓶放入37℃且内含5％CO2的细胞恒温培养箱中培养，24h后观察细胞生长状况并弃去原有的细胞培养基，用1×PBS清洗细胞3次（pH＝7，后面出现的1×PBS均为pH＝7的溶液），再加入新的DMEM完全培养基，继续培养即可；

b、从Thy0517中提取RNA并逆转录为cDNA，通过Atg12基因上、下游引物扩增Atg12基因片段并插入质粒载体pc3.1(+)中，得到重组质粒pc3.1(+)-Atg12；

c、将步骤2)获得的重组质粒pc3.1(+)-Atg12转染Thy0517，得到高自噬水平胸腺瘤细胞；

2)高效培养成熟树突状细胞：

a、复苏在37℃恒温水浴锅中将从液氮中保存的人急性单核细胞白血病细胞THP-1，并将细胞移入盛有THP-1专用培养基的细胞瓶中培养，在37℃且内含5％CO2的细胞恒温培养箱中，当细胞达1×10⁶个/ml细胞悬液时开始刺激分化；

b、将所述人急性单核细胞白血病细胞THP-1细胞悬液铺入6孔板，每孔1.5ml，加入3μl诱导树突状细胞成熟混合因子A，混匀，培养42h；

c、各孔用1×PBS清洗细胞3次，再向各孔中加入新鲜的THP-1专用培养基1.5mL，和20μl诱导树突状细胞成熟混合因子B，混匀，恒温培养箱中继续培养24h，得到成熟树突状细胞；

3)高自噬水平胸腺瘤细胞和成熟树突状细胞共培养：

将1）中得到的高自噬水平胸腺瘤细胞接种与Transwell细胞培养板的上层培养室，将2）中获得的成熟树突状细胞接种与Transwell细胞培养板的下层培养室，共培养1-3天，得到抗原提呈能力增强的树突状细胞（如图1所示）。

（3）尾静脉注射预处理的树突状细胞，步骤如下：

细胞计数，将刺激好的树突状细胞用无菌1×PBS溶液均匀悬浮，调整细胞个数为5×10⁶个-5×10⁷个/ml，同时在溶液中加入氢氧化铝0.4mg/ml混匀。经尾静脉向C57BL/6小鼠注射150-200ul。在第67-70天开始连续注射3-4周，每周相同时间点完成注射。观察C57BL/6小鼠至第一次免疫注射后98±3天，动物模型制备成功。

在造模过程中也发现了由于小鼠个体状况、饲养环境、批次、种系，尤其是造模过程中使用的不同来源的药剂等客观条件差异，会造成小鼠成模时间跨度较大及成模后肌无力症状不稳定，因此在本发明在建立的模型时最大程度地平衡各项客观因素，克服由此产生的干扰性，构建免疫强化的EAMG模型，使得成模稳定性更高，免疫症状更重，多系统肌肉变化更显著，同时兼顾成模时间相对较短。

造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组小鼠模型的建立：

与造模组同条件饲养，步骤1-3与造模组相同；

造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组小鼠未续惯注射树突状细胞和氢氧化铝佐剂，其他与造模组保持一致。

对照组小鼠：

与造模组同条件饲养，步骤1-2与造模组相同；

3：对照组C57BL/6小鼠注射的混合液不含肽段，其他与造模组保持一致。

4：步骤（1）-（2）与造模组相同；步骤（3）中，对照组注射相同体积无菌1×PBS溶液。

二、验证模型相关的特征性骨骼肌改变

1、外周血免疫细胞亚群与其他指标的相关性分析：

（1）流式细胞学对造模组、造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组及对照组小鼠外周血T细胞亚群检测；

1）分别取各组小鼠EDTA 抗凝血 250μl，加到 1.5ml EP 管中（提前做好分组标记），再加 250μl 1640 培养基，1μl 淋巴细胞刺激剂，混匀，置于 37℃ 5%CO2 细胞培养箱中刺激 4h。

2）刺激后的血取 250μl 至 1.5ml EP 管中（测量Treg直接取 EDTA 抗凝血 250μl，加到 1.5ml EP 管中，并做好标记，无需刺激，直接进行这一步），分别加入相应的表面抗体各 2μl（Th17 加 CD4，Treg 加 CD4、CD25），混匀，室温避光孵育 20min。

3）加 1ml 1×红细胞裂解液，室温避光孵育 10min，2500r，离心 5min，弃上清。

4）加 Foxp3 打孔剂（浓缩液：稀释液 1:3）1ml，混匀，室温避光孵育 30min，2500r，离心 5min，弃上清。

5）加 1×Buffer 1ml（用 ddH2O 稀释，10×Buffer：ddH2O 1:9），混匀，室温避光孵育 20min，2500r，离心 5min，弃上清，EP 管底部留下约 50-100μl混合液。

6）分别加入相应的胞内抗体各 2μl（Th17 加 IL-17A，Treg 加 Foxp3），混匀，室温避光孵育 1h。

7）加 1×PBS 1ml，混匀，2500r，离心 5min，弃上清。

8）加 1×PBS 300μl，混匀，上机。对造模组及对照组小鼠外周血 Th17/Treg 流式检测。流式细胞术通过FSC、SSC划定淋巴细胞群确定为R1门，从R1门中标记CD4及IL-17，确定为CD4+IL-17+的双阳性Th17细胞。通过FSC、SSC划定淋巴细胞群确定为R1门，从R1门中标记CD4+、CD25+为双阳细胞，确定为R2门，从R1和R2门中标记Foxp3,选定CD4+CD25+Foxp3+三阳细胞为Treg细胞。

结果显示，与对照组相比，造模组、造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组小鼠均出现了外周血 Th17 升高，Treg 降低，Th17/Treg 升高的表现。而进一步分析发现，造模组外周血 Th17/Treg明显高于对照组和造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组，说明转染了Atg12的胸腺瘤Thy0517细胞诱导的THP-1后分化的DC抗原提呈能力增强，可促进小鼠外周血CD4+T细胞进一步向Th17分化，抑制其向Treg分化，而导致Th17/Treg失衡相比未注射DC+氢氧化铝佐剂更加严重。差异具有统计学意义（如图2、3所示）。

表1. 三组小鼠外周血Th17、Treg水平

	对照组（10只）	造模（未注射DC+氢氧化铝佐剂）组（10只）	造模组（10只）	P值
					Th17（%）	3.15±0.62	3.55±1.03	4.55±0.97	0.0048
Treg（%）	1.54±0.32	1.66±0.46	0.85±0.27	<0.001
					Th17/Treg	2.05±0.45	2.14±0.72	5.35±0.66	<0.001

注：结果用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05具有统计学意义

（2）小鼠临床症状分级：通过反复地将小鼠放在笼子的顶部网格上，反复拖拽它们（使尾巴的底部悬浮）来锻炼小鼠（20 次），然后允许他们自由爬行，并按以下方式评估和评估他们的肌肉无力：0 级，正常的肌肉力量，即使运动后也没有肌肉无力；1 级，休息时正常，但运动后虚弱，下巴在地板上，无法抬起头，弯腰弓背，活动能力下降；2 级，休息无力，出现 1 级症状；3 级，严重无力，脱水，瘫痪（四肢瘫痪），体重减轻；4 级，发现死在笼子里。

观察结果发现，造模组小鼠在注射第4次注射树突状细胞-氢氧化铝佐剂混悬液后10天左右陆续出现典型的弓背状表现，活动能力减弱，行走不稳定，进食减少，其中2只小鼠出现活动后虚弱无力，呈弓背状，4只小鼠出现休息时无力，并且呈弓背状，9只小鼠严重无力，进食减少，体重明显减轻，对照组小鼠临床分级均为 0 级。所有小鼠均未死亡。

表2.两组小鼠临床症状分级

等级	造模组（只）	对照组（只）
			0级	0	15
1级	2	0
			2级	4	0
3级	9	0
			4级	0	0

注：造模组小鼠1级2只，2级 4只，3级9只，无死亡小鼠。

（3）体重：体重的测量为 EAMG 的诱导提供有用的参数评估。 6–9周龄的小鼠通常体重增加，与对照组小鼠相比，肌无力小鼠可能会停止增重，或减重。造模前及第一次免疫后每周 2 次称重，记录小鼠体重变化。

结果造模组小鼠体重明显低于对照组，差异具有统计学意义（如图4所示）。

表3.两组小鼠体重对比

	对照组（10只）	造模组（10只）
			体重（g）	23.3±0.7	16.3±1.1

注：结果用均数±标准差（x±s）表示，样本比较采用独立样本 T 检验 P<0.001

（4）抓力与反向测试：为了客观地测量肌肉力量，首先在笼子顶部的栅格上用 20次爪握法锻炼小鼠（与临床评分相同）。然后 YLS-13A 大小鼠抓力测定仪（济南益延科技发展有限公司)）测小鼠抓力。同时用力拉动小鼠的尾巴直到其失去对网格的抓力，记录施加在测定仪上的最大力。由同一位研究人员进行测试，以确保抗拉强度的一致性。将小鼠放在笼子顶部网格中央，然后启动秒表。立即将网格旋转到倒置位置，记录小鼠掉落的时间，600s 为终点。比较记录时间在三组之间的统计学意义

结果发现造模组小鼠抓力及反向测试时间明显少于对照组，差异具有统计学意义（如图5所示）。

表4. 两组小鼠抓力及反向测试时间统计表

	对照组（10只）	造模组（10只）
			抓力（g）	196.0±8.6	142.3±6.3
反向时间（s）	200±42	56±31

注：结果用均数±标准差（x±s）表示，样本比较采用独立样本 T 检验：抓力 P=0.002，反向时间 P<0.001

（5）肌电图检查；

1）小动物麻醉机以异氟烷浓度为 1.5%，气流速度为 1.5L/min麻醉小鼠，固定；

2）电极安装，将带有凝胶的电极放在鼠的胸部，将刺激（正极）电极插入坐骨切迹以刺激坐骨神经，将记录电极插入同一腿腓肠肌，将参比电极插入腓肠肌肌腱。刺激电极传递电刺激；记录电极和参考电极记录腓肠肌的复合肌肉动作电位；

3）电极刺激，分别用一组 10 个 3-Hz、5-Hz、10-Hz 的超长刺激刺激坐骨神经，同时记录诱发的复合肌肉动作反应；

4）肌电图评估，比较第一诱发电位和第五诱发电位来评估对重复刺激的反应。如果第五个诱发动作电位与第一个诱发动作电位相比，振幅下降≥10%，则对超最大刺激有显著的正下降反应，提示肌电图阳性；用肌电图仪对造模组、对照组小鼠腓肠肌进行肌电图检测（如图6所示）；在3、5、10Hz刺激下，造模组小鼠表现出神经肌肉电传导衰减阳性，不同频率下造模组与对照组衰减率进行组间比较，均有明显统计学差异。以上结果显示造模组小鼠肌电图阳性，说明 EAMG 小鼠存在神经肌肉接头电信号传递异常（如图7所示）。

表5. 两组小鼠肌电图不同频率衰减率

频率（Hz）	对照组（10只）	造模组（10只）
			3	0.5±0.3	11.2±1.1
5	0.6±0.2	13.5±0.9
			10	0.9±0.3	14.6±1.0

注：结果用均数±标准差（x±s）表示，样本比较采用独立样本 T 检验：3、5、10Hz均为P<0.001。

（6）血清 AchR 浓度测定；

1）对待测小鼠进行摘眼球取血，小鼠采血量0.6-1ml；左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出；用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用 1.5ml EP 管接住流出的血液；

2）室温下静置 30min 后,1500rpm 离心 15 分钟，取上清，-20℃冰箱保存备用（避免反复冻融）；

3）从铝箔袋中取出所需板条室温静置 20min，剩余板条用自封袋密封放回 4℃（应密封保存，4℃保存应小于 1 周，-20℃保存不应超过一个月，-80℃保存不应超过 2 个月）。

4）设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μl；

5）待测样本孔中先加样品稀释液 40μl，然后再加待测样品 10μl；加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；空白对照孔不加样品及酶标试剂；

6）除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育 60min。；

7）小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液（350μl），静置 1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次。

8）每孔加入显色剂 A、B 各 50μl，轻微震荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min。

9）每孔加入终止液 50μl 终止反应（此时蓝色立即转为黄色），15min内，在 450nm波长处测定各孔的吸光度（OD 值）。

10）验证结果计算：以所测标准品的 OD 值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的 OD 值代入方程，计算出样品的浓度。

11）对造模小鼠和对照小鼠血清 AchR 浓度结果进行统计学分析。建立AchR 浓度标准曲线，根据标准曲线获取对照组、造模组小鼠血清 AchR 浓度（如图8所示）。

结果显示以对照组作为参照，造模组小鼠血清 AchR 抗体为阳性，阳性率 100%。造模组小鼠血清 AchR 浓度较对照组显著升高，差异具有统计学意义（如图9所示）。

表6. 各组小鼠血清 AchR 浓度

	对照组（10只）	造模组（10只）
			血清 AchR 浓度（ng/ml）	12.75±1.00	20.57±1.93

（7）相关性分析：绘制外周血免疫细胞亚群与其他指标的相关性分析表，横栏项目为对照组与造模组外周血免疫细胞学指标Th17/Treg值的平均值，纵栏项目依次为两组小鼠临床症状分级、体重、抓力、反向测试时间、肌电图检查、血清AchR抗体浓度测定结果的平均值，再依次计算两组小鼠Th17/Treg值的均数与纵栏各项目均数的近似相关系数k。

结果表明，两组小鼠Th17/Treg值的均数与临床症状分级的近似相关系数k1=2.13；两组小鼠Th17/Treg值的均数与体重均数的近似相关系数k2=-6.03；两组小鼠Th17/Treg值的均数与抓力均数的近似相关系数k3=-46.29；两组小鼠Th17/Treg值的均数与反向测试时间均数的近似相关系数k4=-124.14；两组小鼠Th17/Treg值的均数与3Hz刺激下肌电传导衰减率均数的近似相关系数k5=9.22；两组小鼠Th17/Treg值的均数与5Hz刺激下肌电传导衰减率均数的近似相关系数k6=11.12；两组小鼠Th17/Treg值的均数与10Hz刺激下肌电传导衰减率均数的近似相关系数k7=11.81；两组小鼠Th17/Treg值的均数与血清AchR抗体浓度均数的近似相关系数k8=6.74。

根据各k值的正负性可以看出，随着免疫强化的EAMG小鼠模型建立完成，Th17/Treg的值升高提示免疫亢进，同时体重、抓力、反向测试时间均减低，与Th17/Treg的值呈负相关；而小鼠临床症状分级、肌电图各频率激下肌电传导衰减率及血清AchR抗体浓度则与Th17/Treg的值呈正相关。在建立的免疫强化的EAMG小鼠模型中外周血免疫细胞学指标Th17/Treg的值与其他指标是具有相关性的。

表7. 外周血免疫细胞亚群与其他指标的相关性分析表

注：结果用均数±标准差（x±s）表示，样本比较采用独立样本T检验P<0.001

2、验证模型相关的骨骼肌特征性病理免疫联合特染：

（1）骨骼肌HE染色：

1）骨骼肌病理切片的准备；

a.取骨骼肌用4%多聚甲醛固定24小时后，取出组织放入包埋盒，做好标记；

b.梯度乙醇脱水：70%酒精（30min）→80%酒精（30min）→90%酒精（30min）→90%酒精（30min）→100%酒精（30min）→100%酒精（30min）；

c.石蜡包埋：包埋盒浸入软蜡中60℃恒温箱中过夜，组织常规石蜡包埋；

d.蜡块连续切片，切片厚度为5um；

2）HE染色：

a.烤片：将骨骼肌病理切片置于60℃恒温箱中烘烤2小时；

b.水化：将切片依次放入二甲苯Ⅰ（10min）→二甲苯Ⅱ（10min）→100%酒精Ⅰ（5min）→100%酒精Ⅱ（5min）→90%酒精（3min）→80%酒精（3min）→70%酒精（3min）→60%酒精（3min）→蒸馏水（3min）；

c.染色：苏木素染色10min→蒸馏水冲洗1min→1%盐酸乙醇分化10秒→蒸馏水冲洗1min→0.2%的氨水30秒→水洗1min→伊红染色5min→水洗1min；

d. 脱水：60%酒精（3min）→70%酒精（3min）→80%酒精（3min）→90%酒精（3min）→100%酒精Ⅰ（5min）→100%酒精Ⅱ（5min）；

e.封片观察：对照组小鼠骨骼肌纤维呈多边形，形态规则，边界清晰，排列紧密，肌细胞核均匀分布于完整的肌膜下，没有核固缩，未见充血、水肿等病理性改变；而造模组小鼠肌纤维形状不规则，边界不清，肌细胞形态变圆，可见部分肌纤维溶解。以上结果说明重症肌无力小鼠存在肌纤维结构的破坏，导致肌肉无力。同时造模组和造模（未注射DC+氢氧化铝）组相比，造模组变化程度更大，骨骼肌病理改变更重（如图10所示）。

（2）骨骼肌Mason染色：

1）将小鼠麻醉取血后使用颈椎脱臼法处死，留取小鼠骨骼肌组织；

2）固定、脱水、浸蜡、包埋及切片脱蜡至蒸馏水等步骤同HE染色；

3）脱蜡冲洗后放置在苏木素的染液中浸染5-10分钟后，然后使用自来水对切片进行冲洗；

4）使用盐酸酒精进行分色10秒钟，再用自来水进行冲洗；

5）使用2%的碳酸氢钠溶液对切片进行反蓝10秒钟，再用蒸馏水冲洗；

6）置于丽春红酸性品红液中染 5～8 分钟后蒸馏水冲洗；

7）置于1% 磷钼酸中染 1～3 分钟；

8）不用水洗直接入苯胺蓝液或亮绿液 5 分钟 (如染色效果不佳, 可在冰醋酸内脱色后重染)；

9）用自来水速洗后置 60℃ 温箱中烘干，再使用二甲苯对切片进行透明，最后滴加中性树脂来封片；

10）将制好的切片置于光学显微镜下，观察小鼠骨骼肌组织变化（如图11所示）。与对照组相比，造模（未注射DC+氢氧化铝）组和造模组均可见骨骼肌束间产生裂隙，细胞排列出现紊乱，部分区域出现肌肉纤维化。同时造模组相比于造模（未注射DC+氢氧化铝）组肌间裂隙更大，纤维化表现更重，表明续惯注射DC+氢氧化铝后在造模过程中发挥了免疫强化作用。

（3）骨骼肌组织RyR抗体免疫特染：

1）烤片：选取各组所需的玻片标本，在玻片赠正面各项关键信息。将玻片插入玻片架中，操作开始前于65℃烤箱内烘烤20min。

2）脱蜡：将烤好的玻片依次浸入二甲苯溶液A 15min-二甲苯溶液B 15min-无水乙醇溶液A 3min-无水乙醇溶液B 3min-95%乙醇溶液3min-75%乙醇溶液3min-50%乙醇溶液3min-1×PBS缓冲溶液A 5min-1×PBS缓冲溶液B 5min-1×PBS缓冲溶液C 5min，完成脱蜡。

3）抗原修复：向高压锅中加入1500ml Tris-EDTA抗原修复液，使用电磁炉加热至沸腾后放入已脱蜡的玻片，盖紧锅盖，待排气阀开始排气后高温高压继续加热3min。待自然冷却至室温后，用自来水冲洗玻片约3min。

4）一抗孵育：用滤纸吸干标本周围的液体，用免疫组化笔在玻片上圈出组织轮廓，在组织表面滴加约100µl内源性过氧化物酶阻断剂以消除过氧化物酶活性，室温反应10min。1×PBS缓冲溶液冲洗3次，每次3min。再滴加约100µl封闭用正常山羊血清工作液封闭，室温反应15min。倾去血清（勿洗），直接在组织标本上滴加配好的一抗工作液约100µl，将标本放入免疫组化湿盒中，于4℃冰箱内过夜孵育。本部分实验使用的抗体RyR浓度为1：2000。

5）二抗孵育：1×PBS缓冲溶液冲洗3次，每次3min。擦干后在标本上滴加生物素标记山羊抗兔IgG聚合物约100µl，室温反应15min。

6）DAB显色：重PBS缓冲溶液的冲洗步骤。擦干后在标本上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液约100µl，室温反应15min。PBS冲洗后在标本上滴加约100µlDAB工作液，时刻在显微镜下观察显色情况，当出现较明显棕色沉淀物时及时用自来水冲洗10min终止反应。显色时间一般为室温3min左右。

7）复染及反蓝：向玻片上的标本滴加苏木素约100µl，室温反应4min。用自来水冲洗10min后将玻片放入0.2%盐酸酒精中分化约3-5s，再用自来水冲洗1min，将将玻片放入1%氨水中反蓝3min，最后用自来水冲洗10min完成此步骤。

8）脱水与封片：从50%乙醇溶液开始，逆着脱蜡的顺序，依次在各溶液中浸泡标本，每种液体中浸泡3min。最后从二甲苯中取出玻片，通风橱内晾干，使用中性树胶封片，每个中央滴加20µl，用盖玻片小心地盖在组织上方，避免出现气泡，将玻片自然风干，放如标本盒中常温保存。

9）标本观察与统计：于正置光学显微镜下观察并连接电脑软件采集图像（如图12所示）。与对照组相比，造模（未注射DC+氢氧化铝）组和造模组中自身免疫相关抗体RyR的表达水平升高，表明骨骼肌受到免疫攻击，发生了免疫性浸润。同时造模（未注射DC+氢氧化铝）组和造模组相比，续惯注射DC及氢氧化铝佐剂后RyR的表达水平进一步提升，骨骼肌改变程度受外源性注射DC及氢氧化铝佐剂影响后更加明显。

三、验证模型相关的心肌特征性改变

1、超声检查：

1）待测小鼠从饲养室取出后放置于安静室温环境内；

2）记录小鼠信息，对待测小鼠进行称重；

3）操作前麻醉将小鼠仰卧位固定于小动物麻醉机的麻醉诱导盒中，接Tabletop动物麻醉机，调节异氟烷浓度为 1.5%，气流速度为 1.5L/min，进行持续麻醉，减少小鼠活动；加热毯温度调节为 37℃，包裹于麻醉诱导盒外部，维持小鼠体温。

4）麻醉满意后，小鼠胸部及上腹部脱毛，固定小鼠四肢呈仰卧位于超声操作台上，接麻醉面罩,调节异氟烷浓度为1.5%，气流速度为1.0L/min持续麻醉小鼠，应用高频小动物超声机进行心脏B超检查。

5）左胸前涂少量温热耦合剂，将探头置于左胸前，并指向心底部，调整探头角度，获得左室长轴切面。在左室长轴切面，将M型取样线置于主动脉根部，二尖瓣等位置，获得M型曲线，并进行测量。顺时针转动探头 90°，获得左室短轴切面。在彩色多普勒血流显像下，记录二尖瓣口M型彩色多普勒图像（如图13所示）。

6）观察记录超声心动指标：心率、心输出量、左室收缩末期内径、左室舒张末期内径、左室室壁舒张末期厚度等，计算左室短轴缩短率和射血分数，用统计学方法进行分析比较。

7）使用超声设备及15MHz高频超声探头对小鼠肺部进行B型超声检测，获取影像学结果。结果显示造模组小鼠可见垂直并起源于胸膜线的长彗星尾伪影的B线，而该征象未在对照组小鼠中发现，提示免疫强化的EAMG小鼠肺内产生了肺水肿（如图14所示）。

8）超声结束后，待动物苏醒，返回临时饲养间。注意观察饮食恢复情况。

2、验证模型相关的心肌特征性组织病理免疫联合特染：

（1）心肌HE染色：

1）取材：将小鼠麻醉取血后使用颈椎脱臼法处死，打开腹腔，留取小鼠心肌组织；

2）固定：将取下的小鼠心肌组织放置在10%的福尔马林溶液中浸泡过夜；

3）脱水透明：将经过福尔马林溶液固定好的小鼠心肌组织标本使用流动水进行冲洗4小时，再将小鼠的心肌组织放置在70%的乙醇中2小时，再放置在80%的乙醇中浸泡过夜，然后调换至90%的乙醇中2小时，再放置在无水乙醇中1小时，取出后放置在新的无水乙醇中1小时，然后再放置于二甲苯中15分钟，最后取出再放在新的二甲苯15分钟；

4）浸蜡：调节恒温箱温度，使其高于石蜡的熔点3摄氏度，然后将经过脱水的小鼠肺组织完全的浸过石蜡，再放置于恒温箱中4个小时；

5）包埋组织：对将要进行包埋的组织进行处理，把浸过石蜡的组织块移入融化有硬蜡的包埋器之内，等待蜡块的冷却以及固定；

6）切片和展片：用石蜡切片机把浸蜡包埋过的组织块切成厚度约为5μm的薄片。再把蒸馏水滴在准备好的载玻片之上，把切好的切片平铺在水滴之上，载玻片应放置在酒精灯下进行加热，等待切片完全展平之后再将载玻片进行倾斜，除掉多余的水份，同时并摆正载玻片。将展好后的切片放置在64℃的恒温箱中烘烤4个小时，取出后备用；

7）染色以及封片：将展后的切片放置在64℃的恒温箱中烘烤30分钟，然后放在二甲苯中30分钟，拿出后放在新的二甲苯中30min来进行脱蜡；然后放置在无水乙醇中10分钟，拿出后放在新的无水乙醇中10分钟，然后放在95%的乙醇中10分钟，然后放在90%的乙醇中10分钟，80%的乙醇中10分钟，70%的乙醇中10分钟，进行脱水处理；使用蒸馏水浸洗切片3分钟，放置在苏木素的染液中浸染3分钟后，然后使用自来水对切片进行冲洗，接下来使用盐酸酒精进行分色10秒钟，再用自来水进行冲洗；然后使用2%的碳酸氢钠溶液对切片进行反蓝10秒钟，再用自来水进行冲洗；然后置于1%的伊红溶液中浸染2分钟，再使用自来水进行冲洗；放置在95%的酒精中进行脱水处理，再使用二甲苯对切片进行透明，最后滴加中性树脂来封片；

8）观察：将制好的切片置于光学显微镜下，观察小鼠心肌组织的病理改变（如图15所示）。与对照组相比，造模（未注射DC+氢氧化铝）组和造模组均可见心肌细胞排列疏松，部分细胞形态欠规整，细胞颗粒饱满度下降，细胞间隙增大，有的细胞呈现萎缩和老化。而造模组和造模（未注射DC+氢氧化铝）组相比，造模组变化程度更大，心肌病理变化更重。

（2）心肌Mason染色：脱颈法处死小鼠，留取小鼠心肌组织，行Mason染色，具体方法同实骨骼肌Mason染色。将制好的切片置于光学显微镜下，观察小鼠心肌组织变化（如图16所示）。与对照组相比，造模（未注射DC+氢氧化铝）组和造模组均可见心肌细胞间产生裂隙，细胞排列出现紊乱，部分区域出现心肌纤维化。同时造模组相比于造模（未注射DC+氢氧化铝）组心肌间裂隙更大，纤维化表现更重。

（3）心肌组织RyR抗体免疫特染：取小鼠心肌制作石蜡切片，行心肌组织RyR抗体免疫特染，具体方法同上述骨骼肌组织RyR抗体免疫特染，观察统计两组小鼠心肌组织的抗体表达情况（如图17所示）。与对照组相比，造模（未注射DC+氢氧化铝）组和造模组在出现上述HE及Mason染色发生的病理表现的同时，还表现出明显的自身免疫相关抗体RyR的表达水平逐渐升高。同时造模（未注射DC+氢氧化铝）组和造模组相比，续惯注射DC及氢氧化铝佐剂后心肌的RyR表达水平进一步提升，表明免疫性变化进一步加重。

四、验证模型相关的平滑肌特征性改变：

1、腹部CT分析胃肠胀气情况：

2）建立免疫强化的EAMG小鼠模型，同时饲养空白对照组小鼠；

3）依次称量各待测小鼠体重W并统计后，将小鼠置于小动物麻醉机中，使用异氟烷进行诱导麻醉5min；

4）诱导麻醉后的小鼠放入小动物CT设备，进行正侧位CT扫描；

5）扫描结束后，得到CT图像，将小鼠取出，放于正常环境中等待复苏；

6）取所得的正位CT图像中腹腔横径最大时所在的层面用于分析，使用软件ImageJ进行分析，计算该层面中胃肠胀气/腹腔截面面积的比值，记为V1；利用相同方法得到侧位CT图像中胃肠胀气/腹腔截面面积的比值，记为V2。

7）计算小鼠胃肠胀气指数p，公式为p=V1*V2/W，胃肠胀气指数越大表明小鼠受肌无力影响肠胀气呈增多趋势。

结果显示免疫强化的EAMG小鼠模型正侧位CT下均可见明显胃肠胀气，空白对照组小鼠正侧位CT下未发现明确胃肠积气。免疫强化的EAMG造模组小鼠平均胃肠胀气指数p=26.06±3.83，空白对照组小鼠平均胃肠胀气指数p=1.37±2.96，免疫强化的EAMG造模组小鼠的平均胃肠胀气指数明显大于空白对照组小鼠组，表明小鼠胃肠平滑肌受累发生肌无力，胃肠道功能受损，肠胀气难以及时有效排出，呈增多趋势（如图18所示）。

2、验证模型相关的胃肠平滑肌特征性组织病理免疫联合特染：

（1）胃肠组织HE染色：脱颈法处死小鼠，留取小鼠胃肠道组织，行HE染色，具体方法同实骨骼肌HE染色。HE染色显示，与对照组相比，造模（未注射DC+氢氧化铝）组和造模组均可见胃肠平滑肌细胞层逐渐压缩变薄，肌层细胞排列紊乱，细胞颗粒饱满度下降，有的细胞呈现出萎缩和老化。同时造模组和造模（未注射DC+氢氧化铝）组相比，造模组病理变化程度更显著（如图19所示）。

（2）胃肠平滑肌Mason染色：脱颈法处死小鼠，留取小鼠胃肠道组织，行Mason染色，具体方法同实骨骼肌Mason染色。将制好的切片置于光学显微镜下，观察小鼠胃肠平滑肌变化（如图20所示）。与对照组相比，造模（未注射DC+氢氧化铝）组和造模组均可见肌层细胞间压缩变薄，肌肉纤维化导致肌层弹性和收缩力下降。同时造模组相比于造模（未注射DC+氢氧化铝）组胃肠平滑肌变薄更甚，纤维化表现更重。

（3）胃肠平滑肌组织RyR抗体免疫特染：取小鼠胃肠平滑肌制作石蜡切片，行胃肠平滑肌组织RyR抗体免疫特染，具体方法同上述骨骼肌组织RyR抗体免疫特染，观察统计两组小鼠平滑肌组织的抗体表达情况（如图21所示）。与对照组相比，造模（未注射DC+氢氧化铝）组和造模组的自身免疫相关抗体RyR的染色逐渐加深，染色区域逐渐增大。同时造模（未注射DC+氢氧化铝）组和造模组相比，续惯注射DC及氢氧化铝佐剂后胃肠平滑肌的RyR表达水平又出现了进一步提升，免疫性病理变化程度和范围进一步扩大。

五、模型相关的多肌群组织病理及特异性免疫标志物共表达的相关性分析

横向分析比较对照组、造模（未注射DC+氢氧化铝）组和造模组的骨骼肌、心肌、胃肠平滑肌三大肌群在病理（HE、Mason）及特异性免疫标志物RyR表达方面所呈现的变化趋势，可见随着造模的建立，三大肌群病理改变也呈现明显加重，肌间出现裂隙，肌肉排列紊乱，肌层萎缩，同时特异性免疫标志物RyR的染色程度加深，出现免疫抗体浸润，病理和免疫的变化表现出了一致性和密切的相关性。同时造模组和造模（未注射DC+氢氧化铝）组的深入比较也再次验证了续惯注射DC和氢氧化铝佐剂所发挥的增强免疫作用，使多系统靶肌肉的免疫变化更加显著。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法，其特征在于，所述建立方法包括向造模用的小鼠注射AchR-弗氏完全佐剂溶液、AchR-弗氏不完全佐剂溶液，续惯注射制备好的树突状细胞+氢氧化铝佐剂混悬液；树突状细胞经胸腺瘤细胞系Thy0517刺激培养，并以氢氧化铝佐剂强化树突状细胞功能，

树突状细胞+氢氧化铝佐剂混悬液的制备方法为：将转染了Atg12质粒的胸腺瘤细胞系Thy0517与由THP-1细胞系刺激分化的工具树突状细胞共培养3-5天；

刺激培养后的树突状细胞重悬于无菌1*PBS溶液中，并加入氢氧化铝佐剂轻柔混匀，制得树突状细胞+氢氧化铝佐剂混悬液。

2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述AchR-弗氏完全佐剂溶液是由弗氏完全佐剂和AchR肽段溶液乳化合成；

所述AchR-弗氏不完全佐剂溶液是由弗氏不完全佐剂和AchR肽段溶液乳化合成；

所述AchR肽段溶液中的溶质为AchRα亚基97-116肽段，溶剂为1*PBS溶液。

3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，树突状细胞+氢氧化铝佐剂混悬液中，包含树突状细胞5×10⁶～5×10⁷个细胞/ml及氢氧化铝0.3—0.5mg/ml。

4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，续惯注射制备好的树突状细胞+氢氧化铝佐剂的具体步骤为：造模第67-70天，通过C57BL/6小鼠尾静脉注射树突状细胞+氢氧化铝佐剂混悬液150-200ul，此后连续3-4周于相同时间点注射该混悬液。

5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，在造模后第98±3天验证小鼠模型相关的骨骼肌、心肌和平滑肌的特征性改变；

包括通过外周血免疫细胞亚群与其他指标的相关性分析以及组织病理免疫联合特染验证模型相关的骨骼肌特征性改变，所述其他指标包括小鼠临床症状分级、体重、抓力、反向测试时间、各频率刺激下肌电传导衰减率及血清AchR抗体浓度；

包括利用超声检查和组织病理免疫联合特染验证模型相关的心肌特征性改变；

包括利用腹部CT和组织病理免疫联合特染验证模型相关的平滑肌特征性改变；

所述病理免疫联合特染包括HE染色、Mason染色和RyR免疫抗体特染；还包括对小鼠模型进行多肌群组织病理HE染色、Mason染色及组织特异性标志物RyR共表达的相关性分析。

6.根据权利要求5所述的建立方法，其特征在于，通过外周血免疫细胞亚群与其他指标的相关性分析，包括外周血免疫细胞Th17细胞及Treg细胞的流式细胞学检测，Th17/Treg比值的统计计算以及该比值与其他指标的相关性分析来验证模型相关的骨骼肌特征性改变，所述其他指标包括小鼠临床症状分级、体重、抓力、反向测试时间、各频率刺激下肌电传导衰减率及血清AchR抗体浓度。

7.根据权利要求5所述的建立方法，其特征在于，通过心脏超声检查观察记录心率、心输出量、左室收缩末期内径、左室舒张末期内径及左室室壁舒张末期厚度，计算左室短轴缩短率和射血分数，还包括使用15MHz高频超声探头检测小鼠模型肺部产生的垂直并起源于胸膜线的长彗星尾伪影，以此来验证模型相关的心肌特征性改变。

8.根据权利要求5所述的建立方法，其特征在于，通过对小鼠进行正侧位腹部CT平扫，取正侧和侧位腹腔横径最大时所在层面，分别扫描读取正侧位该层面中胃肠胀气及腹腔截面的面积，分别计算正侧位胃肠胀气/腹腔截面面积的比值为V1、V2，结合各小鼠体重W，计算得到小鼠胃肠胀气指数p=V1*V2/W来验证模型相关的胃肠平滑肌特征性改变。