CN114600832B - 一种小鼠心衰模型及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提出了一种小鼠心衰模型及其制备方法，涉及生物医学领域，其中小鼠心衰模型的制备方法包括：将性成熟的雌性小鼠与雄性小鼠进行交配；将交配成功的雌鼠从妊娠初期开始置于一个密闭不透光的空间，控制光照明暗时间，进行慢性昼夜节律紊乱，直至分娩；待子代小鼠出生后，将子代小鼠放入正常昼夜节律环境培育；对培育的子代小鼠定期进行心脏功能分析，出现心衰特征的即为成功的小鼠心衰模型。该制备方法具有工艺简单、流程明确、所需试验条件少和后期数据稳定的特点，制备得到的小鼠心衰模型具有成活率高，获取时间短的优点。
Description
技术领域
本申请涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种小鼠心衰模型及其制备方法。
背景技术
目前国内外心衰模型动物中啮齿类(大、小鼠)占90％以上，是科研的主要试验对象。造模方式主要是手术、药物诱导和基因编辑三大类。手术类主要包括：冠状动脉左前降至结扎术(急性心肌梗死)模型和主动脉弓缩窄术模；药物诱导类主要包括：血管紧张素和异丙肾上腺素；基因编辑主要是指将科学研究中发现的：X-盒结合蛋白1(X-box bindingprotein 1,XBP1)(《Science》上发表的一篇文章)。
然而这些模型存在的缺点和局限性也十分明显。第一、手术类模型存在有创损伤，存在较大的死亡率。第二、由于试验人员熟练程度和操作方法不同会导致动物模型心梗程度各不相同，导致后期试验数据不稳定。第三、药物诱导动物模型毒副作用较强，易对试验动物肝肾造成损伤。第四、基因编辑动物模型，制作模型周期长，且费用较高。
发明内容
本申请的目的在于提供一种小鼠心衰模型的制备方法，此制备方法具有方法简单、流程明确以及造模条件稳定的特点。
本申请的另一目的在于提供一种小鼠心衰模型，其成活率高、心衰特征稳定。
本申请解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一方面，本申请实施例提供一种小鼠心衰模型的制备方法，其包括以下步骤：
步骤一：将性成熟的雌性小鼠与雄性小鼠进行交配；
步骤二：将交配成功的雌鼠从妊娠初期开始置于一个密闭不透光的空间，控制光照明暗时间，进行慢性昼夜节律紊乱，直至分娩；
步骤三：待子代小鼠出生后，将子代小鼠放入正常昼夜节律环境培育；
步骤四：对培育的子代小鼠定期进行心脏功能分析，出现心衰特征的即为成功的小鼠心衰模型。
另一方面，本申请实施例提供一种心衰小鼠模型，由上述的小鼠心衰模型的制备方法所获得的小鼠心衰模型。
相对于现有技术，本申请的实施例至少具有如下优点或有益效果：
1、本申请提供的小鼠心衰模型的制备方法通过影响妊娠期母体来探究胎源性心衰产生的原因，获得稳定的小鼠心衰模型。主要以慢性昼夜节律紊乱的方式进行试验，这对研究胚胎期昼夜节律紊乱对成年后造成的影响提供了新的试验方法。
2、因为进行慢性昼夜节律紊乱主要通过调节妊娠期的试验条件，子代培养的时候，以正常的培养环境，这不仅不会对试验动物造成有创伤害，还能大大提高了模型的成活率。
3、本申请造模条件主要是通过调节光照进行实现，其余环境条件控制一致，这种操作与试验人员的熟练程度与掌握方法无关，降低了造模的难度和系统误差，也避免了人为因素的致死。
4、通过本申请制备方法所获得的小鼠心衰模型后期试验数据结果稳定，重复性高。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请实施例中小鼠心衰模型的制备流程示意图；
图2为本申请实施例小鼠心衰模型制备对照图；
图3为本申请实施例正常小鼠与CCD模型小鼠心脏外形对照图；
图4为本申请实施例正常对照组左心室壁厚度超声示意图；
图5为本申请实施例CCD模型小鼠心室壁厚度超声示意图；
图6为本申请实施例左室舒张期内径(LVIDd)超声测定结果对照图；
图7为本申请实施例左室收缩期内径(LVIDs)超声测定结果对照图；
图8为本申请实施例左室缩短分数(LVFS)超声测定结果对照图；
图9为本申请实施例左室缩短率(FS)超声测定结果对照图；
图10为本申请实施例左室射血分数(EF)超声测定结果对照图；
图11为本申请实施例B型利钠肽(BNP)的ELISA测定结果对照图；
图12为本申请实施例N端脑钠肽前体(NT-proBNP)的ELISA测定结果对照图；
图13为本申请实施例(C)肿瘤坏死因子α(TNF-α)的ELISA测定结果对照图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本申请。
一方面，本申请实施例提供一种小鼠心衰模型的制备方法，其包括以下步骤：
步骤一：将性成熟的雌性小鼠与雄性小鼠进行交配；
步骤二：将交配成功的雌鼠从妊娠初期开始置于一个密闭不透光的空间，人工控制光照明暗时间，进行慢性昼夜节律紊乱，直至分娩；
步骤三：待子代小鼠出生后，将子代小鼠放入正常昼夜节律环境培育；
步骤四：对培育的子代小鼠定期进行心脏功能分析，出现心衰特征的即为成功的小鼠心衰模型。
本申请提供的小鼠心衰模型的制备方法通过影响妊娠期母体来探究胎源性心衰产生的原因，本申请的试验为制备小鼠心衰模型提供了新的试验方法。通过人为制造胚胎期昼夜节律紊乱的条件不会对试验动物造成有创伤害，大大提高了模型的成活率。
而且慢性昼夜节律紊乱(Chronic Circadian Disturbance，CCD)也就是通过改变环境影响动物的内源性生物钟和环境光-暗循环之间的不同步状态，所需要的条件一致，与试验人员的熟练程度与操作方法无关，这样一来，后期试验数据结果也更为稳定，重复性高。
在本申请的一些实施例中，上述步骤一中的雌性小鼠交配年龄为8～10周龄，体重在18～22g。
本试验选用的C57BL/6小鼠，此种小鼠在8～10周龄，体重达到18～22g时的繁育能力最佳，在8周龄后繁殖能力可能降低，因此选择这个年龄段和体重的健康小鼠进行交配。
在本申请的一些实施例中，上述步骤一中的雌雄交配比例为2～3：1。
雌雄交配比例保证在2～3：1，能够提高雌鼠的受孕率。
在本申请的一些实施例中，上述交配成功的标志为雌鼠出现阴道阴栓，所述妊娠初期指观察到出现阴道阴栓的时间为起始时间。
通过观察阴道栓塞出现的时间可以快速判断交配成功与否，外部标志显著，试验人员可以结合这一特征快速判断。
在本申请的一些实施例中，上述定期为子代小鼠出生后4、6、8周龄。
通过多时间段的检测可以更加动态系统的了解子代小鼠心衰模型的建立情况。而小鼠在4～8周龄属于生长期，在此期间其生长速度猛增，对于心脏功能的要求也逐步增加，在此期间对小鼠心脏功能进行分析，能够得到更为全面的数据。
在本申请的一些实施例中，上述慢性昼夜节律紊乱的方法是：每2天将光照/黑暗周期延迟8小时，所述光照/黑暗的时间为12h：12h。
依据每2天规律性地改变光照/黑暗节律时间，可以逐步缓慢的打乱试验动物的生物钟，以达到我们预期的效果。
在本申请的一些实施例中，上述正常昼夜节律环境的条件为：温度25±2℃、空气相对湿度65±5％、开灯的时间为早上6点，关灯的时间为晚上6点，摄食和饮水自由。
从制备小鼠心衰模型地角度来讲，正常环境以恒温、湿度合适、光照规律的条件来培养慢性昼夜节律紊乱母本的子代，可以保证心衰小鼠模型的成活率；而从试验角度来讲，可以更好地展示来母本在妊娠期受到慢性昼夜节律紊乱能够导致子代出现心衰的情况。
在本申请的一些实施例中，上述心衰特征包括：显著的左心室扩张、室壁变薄和心尖钝化，快速性心律失常诱发率高。
在本申请地实施例中上述心衰特征可以是从表型可以进行判断的。心脏是动物血液循环维持的动力器官，它的收缩和舒张为血循环提供动力，在心脏收缩时可以将心脏内的血液泵到体循环，以及肺循环，而在心脏舒张时可以将外周的血液吸到心脏内。而左室是心脏最主要的动力源泉，左心室的收缩可以将血液泵到主动脉，也就是使体循环维持有效的血压，使周身最重要的脏器都有有效的血液供应。同时体循环的阻力很大，心脏为达到有效泵血，需要用力做工，所以左心室的室壁最为厚，而且肌肉最为丰富，起到有效收缩泵血的作用。而右心室相对要薄，因为右心室负责肺循环，而肺循环的阻力比较小，所以不需要很厚的心肌就可以将血液有效泵出。
当左心室为了泵血工作扩张的同时，其室壁需要维持相应的厚度，起到有效收缩泵血的作用，而室壁变薄和心尖钝化，降低了心室收缩的弹性，导致心功能减弱，出现心衰。
在本申请的一些实施例中，上述心衰特征还包括：心脏质量/体重的比值相对正常组显著下降，心衰生化检测标志物相对正常组显著升高。
将上述左心室扩张、室壁变薄和心尖钝化与心脏质量/体重的比值相对正常组显著下降这一点进行结合分析，对于判断小鼠心衰模型建立的成功与否会更可靠。除此之外，结合其他设备仪器对心脏心电图、超声观测的心室活动情况以及解剖后所检测的与心衰相关蛋白表达水平情况可以更系统的评判小鼠心衰模型所达到的病理程度。
另一方面，本申请实施例提供一种由上述的小鼠心衰模型的制备方法所获得的小鼠心衰模型。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
本实施例提供一种小鼠心衰模型及其制备方法。
本申请实施例提供的动物心力衰竭模型的构建方法如下：
1、试验动物
C57BL/6雌性小鼠和雄性小鼠，周龄为8周，体重18-22g，小鼠种源购买于成都达硕公司，于西南医科大学动物试验中心饲养。
2、试验材料
Vevo 3100小动物超声仪，日本FUJIFILM生产。
异氟烷，中国瑞沃德公司生产。超声耦合剂，上海恒瑞制药有限公司生产。
5424R型低温离心机，德国Eppendorf生产。
BL-420S生物信号采集与分析系统，中国泰盟公司生产。
3、试验方法
如图1所示，展示了动物模型建立的步骤：
(1)将正常8周龄雌性小鼠与年龄匹配的雄性小鼠按2：1的比例进行交配。第二天早晨8点观察交配的雌鼠阴道栓塞，出现阴道栓子认为交配成功；
(2)将交配成功的雌鼠随机分为两组，即正常对照组和模型组；
(3)模型组妊娠母鼠从妊娠第0天(即发现阴道栓塞之日)至分娩期间置于一个密闭不透光的空间，人为控制明暗时间，每2天将12：12光照/黑暗周期延迟8小时，进行慢性昼夜节律紊乱(Chronic Circadian Disturbance，CCD)。正常对照组在整个妊娠期维持在正常昼夜节律无应激条件下。保证两组小鼠生活在条件为恒温(25±2℃)、空气相对湿度(65±5％)的隔离房间内，摄食和饮水自由。
(4)待子代小鼠出生后，将正常对照组(NS)和模型组小鼠(CCD)放入正常昼夜节律环境饲养(12小时光照-12小时黑暗，开灯时间—关灯时间：早上6点—晚上6点)。
4、试验分组
正常对照组子代雄性(NS-M)、正常对照组子代雌性(NS-F)、模型组子代雄性(CCD-M)、模型组子代雌性(CCD-F)。
5、心脏超声检测
各组小鼠在出生后4周、6周、8周时，使用日本FUJIFILM公司Vevo 3100超声诊断仪和30MHz高频探头进行小鼠的心脏超声检测心脏功能，具体步骤如下：
(1)使用异氟烷麻醉，使小鼠肌力下降，达浅表麻醉状态，以避免检测过程中躁动而影响结果。
(2)小鼠仰卧位，固定于Vevo 3100高频超声系统自带的加热板上，以保持体温的恒定。用脱毛膏去心前区毛。
(3)涂适量超声胶于心前区，待小鼠心律稳定在500beats/min左右时，用FUJIFILMVevo 3100超声仪中央频率为30mHz的探头在动物胸壁上开始采集左心室长短轴切面，记录心电图，测量心律(HR)。
(4)记录M-Mode图像。
(5)取胸骨旁左室长轴切面，在二尖瓣腱索水平获得M型切面图像。
(6)采用超声心动诊断仪测量左室舒张期内径(LVIDd)、左室收缩期内径(LVIDs)、缩短分数(LVFS％)，左室缩短率(FS)，左室射血分数(EF)，同时记录心电图(ECG)和心率(HR)等指标。
(7)对于不同个体，Vevo 3100均设置为相同参数。每个测量指标均选取三个不同的心动周期后取平均值得到。
6、小鼠体表心电图记录
各组小鼠在出生后8周时，使用中国泰盟公司的BL-420S生物信号采集与分析系统采集小鼠体表心电图的变化。
(1)动物麻醉
各组8周龄的子代小鼠，腹腔注射1％戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，取仰卧位固定于动物试验操作台上。
(2)记录心电图具体操作如下：
a.将五导联心电导线分别连接插入小鼠四肢皮下的针灸针，接顺序为：红色电极-右上肢、黄色电极-左上肢、绿色电极-左下肢、黑色电极-右下肢、白色电极-左胸近心脏处。
b.打开BL-420S仪器和采集系统，选择“心电”记录。
c.在软件界面调节参数，使ECG波型为正常规范波形。
d.待记录稳定10min后，通过小鼠腹腔注射不同剂量经生理盐水稀释的异丙肾上腺素，持续记录60min左右，实时观察心电变化。
7、标本取材及处理：经1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，剂量为50mg/kg。麻醉后，采用眼球取血。每只小鼠约可采集400-700μL血液。静置于EP管中，4℃放置12小时待血液凝固后，进行低温离心，4℃，2500rpm/min，离心20min。小心吸取上层血清，并转移至新的1.5mLEP管中，-80℃保存待用。取血后迅速开胸取出心脏，滤纸吸干心脏并称重。
8、用ELISA法检测血清中B型利钠肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)、N端脑钠肽前体(NT-proBNP)和α型肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)。
9、统计学方法分析：
测量数据结果分析和统计图表使用GraphPad Prism 9.0(Version 2.0)进行制作，以平均值±标准差(Mean±SD)表示，学生t检验或曼-惠特尼检验(每组n＝3或4个)用于比较两组。在分析超过两组数据时，采用了单向方差分析和克鲁斯卡尔-沃利斯检验。采用双向方差分析分析两组和≥2个时间点/处理。在使用参数统计量之前，我们使用了夏皮罗-威尔克检验，确保了数据是正态分布的。采用χ2检验分析各组间心律失常事件发生的频率。生存分布的比较采用log-rank(Mantel-Cox)检验。对于所有检验，P＜0.05被认为具有统计学意义。
10、试验结果：
(1)如图2所示，CCD诱导自发心力衰竭模型小鼠心脏我们在“慢性节律紊乱”小鼠模型上发现了显著的左心室扩张、室壁变薄和心尖钝化。
(2)CCD诱导自发心力衰竭模型小鼠心脏高频超声变化：如图3和图4所示，图中所示为代表性小鼠左心室短轴代表性B型超声心动图。图3为对照组，图4为CCD组。两图比较可以很清晰的看到，图4中左心室室前、后壁明显比图3厚，而心腔直径则明显宽大。因此，图4较典型的心衰样左心室超声心动图。
超声心动检测发现，模型小鼠左心室壁变薄14.4％(图5)，收缩末期容量增加15.75％(图6)，左心室直径增加11.85％(图7)，心脏短轴缩短率减少14.22％(图8)以及射血分数显著降低(图9)。
(3)为进一步明确模型小鼠的心功能变化情况，我们利用心脏β-肾上腺素受体非选择性激动剂：异丙肾上腺素(isoprenaline，ISO)，诱发小鼠快速性心律失常。其中心室活动情况简称：室性期前收缩(PVC)，房室传导阻滞(AVB)，室性心动过速(VT)，心室纤颤(VF)。
结果发现，不同剂量ISO均可诱发模型小鼠出现快速性心律失常，且生存率与剂量大小成反比(表1)。
在大剂量ISO(100μg/kg)腹腔注射(intraperitoneal injection，i.p.)后，模型小鼠生存率仅为35.29％，而正常对照组则为82.35％。快速性心律失常诱导发生率增加了48％。
表1.试验组中不同剂量异丙肾上腺素诱导心律失常的情况
注：♂，雄性小鼠。♀，雌性小鼠。*表示P＜0.05,差异显著，**表示P＜0.01，差异极显著，与同性别的对照组进行对比(卡方检验)。
(4)CCD诱导自发心力衰竭模型小鼠心脏质量/体重的变化情况(HW/BW)。
图10结果显示CCD组与对照组比较HW/BW显著降低，统计学差异(P＜0.01)。
(5)CCD诱导心力衰竭模型小鼠血清心衰标志物变化。
图11结果显示，CCD组的BNP与对照组比较无统计学差异(P＞0.05)。图12结果显示，CCD组的NT-proBNP与对照组比较显著增加(P＜0.0001)。图13结果显示，CCD组的TNF-α显著增加(P＜0.0001)。
总的说来，在本实施例中心衰模型的建立存在性别差异，通过妊娠期慢性昼夜节律紊乱得到的子代雄性小鼠能够同时满足上述所有心衰检测指标条件，但子代雌性小鼠的差异与正常对照组相比差异并不显著。
本实施例中通过妊娠期慢性昼夜节律紊乱得到的子代雄性小鼠有以下表现：出现显著的左心室扩张，室壁变薄，和心尖钝化；左心室壁变薄，收缩末期容量增加，左心室直径增加，心脏短轴缩短率减少以及射血分数显著降低；在大剂量ISO(100μg/kg)腹腔注射后，模型小鼠生存率仅为35.29％，快速性心律失常诱导发生率增加了48％；模型小鼠组的心脏质量/体重在5mg/g，与对照组比较显著降低；而且酶联免疫吸附剂测定结果显示NT-proBNP和TNF-α这两种与心衰密切相关的标志物蛋白水平相对正常控制组比较显著增加，以上这些结果显示了慢性心力衰竭的动物模型建模成功。
综上所述，本申请提供的小鼠心衰模型的制备方法通过影响妊娠期母体来探究胎源性心衰产生的原因，本申请的试验为制备小鼠心衰模型提供了新的试验方法。通过人为制造胚胎期昼夜节律紊乱的条件不会对试验动物造成有创伤害，大大提高了模型的成活率。
而且慢性昼夜节律紊乱也就是通过改变外部环境条件来影响动物的内源性生物钟和环境光-暗循环之间的不同步状态，试验所需要的条件一致，与试验人员的熟练程度与操作方法无关，这样一来，后期试验数据结果也更为稳定，重复性高。
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
Claims (6)
1.一种小鼠心衰模型的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤一：将性成熟的雌性小鼠与雄性小鼠进行交配；
步骤二：将交配成功的雌鼠从妊娠初期开始置于一个密闭不透光的空间，控制光照明暗时间，进行慢性昼夜节律紊乱，直至分娩，所述慢性昼夜节律紊乱的方法是：每2天将光照/黑暗周期延迟8小时，所述光照/黑暗的时间为12h：12h；
步骤三：待子代小鼠出生后，将子代小鼠放入正常昼夜节律环境培育，所述正常昼夜节律环境的条件为：温度25±2℃、空气相对湿度65±5%、开灯的时间为早上6点，关灯的时间为晚上6点，摄食和饮水自由；
步骤四：对培育的子代小鼠定期进行心脏功能分析，出现心衰特征的即为成功的小鼠心衰模型，所述心衰特征包括：显著的左心室扩张、室壁变薄和心尖钝化，快速性心律失常诱发率高。
2.根据权利要求1所述的小鼠心衰模型的制备方法，其特征在于，所述步骤一中的雌性小鼠交配年龄为8～10周龄，体重在18～22g。
3.根据权利要求1所述的小鼠心衰模型的制备方法，其特征在于，所述步骤一中的雌雄交配比例为2～3：1。
4.根据权利要求1所述的小鼠心衰模型的制备方法，其特征在于，所述交配成功的标志为雌鼠出现阴道阴栓，所述妊娠初期指观察到出现阴道阴栓的时间为起始时间。
5.根据权利要求1所述的小鼠心衰模型的制备方法，其特征在于，所述定期为子代小鼠出生后4、6、8周龄。
6.根据权利要求1所述的小鼠心衰模型的制备方法，其特征在于，所述心衰特征还包括：心脏质量/体重的比值相对正常组显著下降，心衰生化检测标志物相对正常组显著升高。
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