CN102220281A - 一种肝细胞与Kupffer细胞共培养体系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肝细胞与Kupffer细胞共培养体系及其应用，该共培养体系是在Millicell双层培养室中，在培养基上添加1～100ng/ml的LPS，在Millicell双层培养室的上层培养Kuffer细胞，在下层培养肝细胞；隔天更换一半新鲜的培养基，保持LPS的浓度。本发明提供的肝细胞与Kupffer细胞共培养体系，是在体外条件下，Kupffer细胞受到LPS的刺激之后，持续的分泌炎症细胞因子(如TNF-α)，肝细胞在此环境中，可产生大量的酶(如AST、ALT和GGT)，以此来模拟体内肝组织受到病毒感染之后，产生免疫/炎症应答，导致免疫反应为基础的肝损伤；并以药物对免疫因子分泌量及酶活性的影响，应用于抗免疫性肝损伤药物的筛选。

Description

一种肝细胞与Kupffer细胞共培养体系及其应用

技术领域

本发明属于细胞体外培养技术领域，特别涉及一种肝细胞与Kupffer细胞共培养体系，以其作为免疫性肝损伤模型应用于抗免疫性肝损伤药物的筛选。

背景技术

免疫性肝损伤通常由生物性因素等引起，常见的原因为病毒感染，如临床上乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等病毒的感染，其重要的特征是肝组织内大量的炎症细胞浸润，产生免疫/炎症应答，导致免疫反应为基础的肝损伤。病毒侵入肝细胞后，可与肝细胞DNA整合在一起，免疫细胞或抗病毒药物在杀灭病毒的同时，也会清除受感染的肝细胞，从而造成免疫性肝损伤。长期反复的肝损伤会导致疤痕状增生、肝纤维化、肝硬化、肝腹水、甚至肝癌等。免疫性肝损伤是肝纤维化、肝硬化乃至肝脏肿瘤等终末病变发生发展的重要因素之一，从正常、免疫性肝损伤到肝纤维化、肝硬化甚至到肝脏肿瘤的发生发展过程中，免疫性肝损伤是疾病发生的重要步骤，它决定了疾病的转归或发生发展。

肝细胞是肝脏的主要组成部分，参与肝脏的代谢和解毒。肝细胞本身表达低水平的TLR₄，保持肝脏免疫系统对LPS的低反应性，这样就可以移除体液中的内毒素。免疫性肝损伤的最主要的特征就是肝细胞的坏死。这种坏死不是局部的，而是弥漫性的。枯否细胞(Kupffer cells)是肝脏所包含的大量的固有巨噬细胞，这些细胞是由血液单核细胞发育而来的，主要集中在肝脏血窦内。Kupffer细胞第一时间接触肠道过来的毒素，引发肝脏炎症反应。Kupffer细胞表达TLR₄，对清除肝内毒素有重要作用。Kupffer细胞在细菌脂多糖(LPS)的刺激下可以产生许多炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细白介素8(IL-8)、诱导性一氧化氮合酶(iNOS)等，引起肝细胞的损伤和坏死，最终引起肝脏的炎症反应。

TNF-α是肝脏病理、生理过程的关键性促炎介质，是肝坏死较敏感的标志物。研究表明TNF-α与慢性肝病进展呈正相关，因此对慢性肝病患者动态观察TNF-α的变化，可作为判断肝脏炎症和(或)纤维化的程度变化的有效指标。

慢性乙型肝炎患者其血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶比值(ALT)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)明显增高，其增高程度与慢性乙肝严重程度呈正相关，通过此三项指标综合判断，可较准确地了解慢性乙肝病变程度及预后，AST、ALT、GGT、TNF-α等检测已越来越广泛被用于评估慢性乙肝的严重程度。

ALT主要存在于肝细胞的胞质中，是肝损伤的一个很灵敏指标。急性肝炎时ALT升高最为显著，其次为慢性肝炎中度，可见，ALT只能反映肝细胞的完整性，ALT增高往往说明肝实质细胞的损伤，是急性肝炎早期最敏感的指标，但并非在任何肝病时都有明显改变，如爆发性肝炎病情恶化黄疽加深时，ALT反而急剧下降甚至正常，肝硬化失代偿或活动期ALT轻度增高，代偿期可正常，因此，血清ALT的测定对慢性肝病的转归预测价值不大。AST主要存在于线粒体，病变较轻的肝病时，ALT升高程度高于AST，AST/ALT＜1.0；重症肝炎时，AST、ALT增高，AST/ALT＞1.0；慢性肝炎，特别是肝硬化，AST、ALT也轻度增高，AST/ALT＞1.0。进行性肝功能损害常伴有AST/ALT比值增高，其与慢性乙肝的组织学分期和临床评定相关，可提示肝病临床类型，估计病情预后，目前已常规用于临床诊断，但是单一检测AST、ALT在评估慢性肝病的严重程度中诊断价值有限。

GGT在肝细胞内合成，局限于细胞浆及肝内胆管上皮中，从胆道排泄，血清中的GGT主要来自肝脏；由于肝实质受到挤压，可导致肝细胞的炎症，使肝细胞合成GGT增加，从而导致血清中GCT增高。正常血清中GGT含量较少，肝细胞浆中含量较高，故血清GGT活性测定对肝细胞损害有较高的诊断价值。在肝实质疾病时呈轻度增高，是肝胆疾病中阳性率最高的酶，有助于肝胆疾病的鉴别诊断。在部分慢性肝炎病例，ALT、AST已降至正常，而GGT仍异常，说明GGT检测还可以作为观察慢性活动性肝炎的一个指标，也是脂肪肝较敏感的生化指标。但GGT缺乏特异性，与ALT、AST等联合检测，有助于对肝病的鉴别诊断。

我国是病毒性乙型肝炎发病率最高的国家之一，据统计我国乙肝病毒携带者约有9300万人，其中1/3出现肝损害的临床表现，而对免疫性肝损伤的临床治疗还缺乏特效的药物，因此，抗免疫性肝损伤药物的快速筛选方法的研究，就尤为迫在眉梢。

目前常用的免疫性肝损伤模型有整体动物模型，如卡介苗、活菌与细菌脂多糖诱导的体内免疫性肝损伤模型、自体组织与福氏佐剂诱导的自身免疫性肝损伤模型、以及由细胞免疫导致的迟发型变态反应性肝损伤模型；体外模型如体外肝细胞免疫性损伤模型。

整体动物模型虽然可信度比较高，但是耗时较长，从开始造模到实验结束一般需要1～2个月的时间；体外肝细胞免疫性损伤模型均采用单种细胞，很难模拟体内复杂的生理、病理状态。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种肝细胞与Kupffer细胞共培养体系及其应用，该共培养体系能够作为包含免疫因子影响下的免疫性肝损伤模型，用于抗免疫性肝损伤药物的筛选。

本发明是通过以下技术方案来实现：

在Millicell双层培养室中添加培养基和1～100ng/mL的LPS，在上层培养Kuffer细胞，在下层培养肝细胞；在培养箱中37℃、5％CO2静置培养，隔天更换一半新鲜的培养基，并保持LPS的浓度。

所述的培养基为含有体积分数10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，添加的LPS的浓度为5ng/mL。

所述的肝细胞的培养浓度为1～10×10⁵个/mL，Kuffer细胞的培养浓度为1～10×10⁵个/mL。

所述的肝细胞是通过将体外传代培养2～3的肝细胞制成细胞悬液接种于Millicell双层培养室的下层。

所述的Kuffer细胞是通过将体外单层培养的Kupffer细胞成细胞悬液接种于Millicell双层培养室的上层。

所述的Millicell双层培养室在上层与下层之间设置的半透膜的孔径为8μm。

所述的肝细胞与Kupffer细胞共培养体系应用于抗免疫性肝损伤药物的筛选。

所述的应用于抗免疫性肝损伤药物的筛选，是筛选能够降低肝细胞与Kupffer细胞共培养体系中AST、ALT、GGT、TNF-α的活性及免疫因子分泌量的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的肝细胞与Kupffer细胞共培养体系，是在Millicell双层培养系统中，Kupffer细胞贴壁培养在上层培养室的半透膜上，肝细胞贴壁培养在下层培养室的底面上；所添加的LPS既不影响两种细胞的增殖，又可以在更换培养基之后刺激Kupffer细胞和肝细胞不断的产生的酶的活性(AST、ALT、GGT)及免疫因子(TNF-α)。

本发明提供的肝细胞与Kupffer细胞共培养体系，是在体外条件下，Kupffer细胞和肝细胞受到LPS的刺激之后，产生酶(AST、ALT、GGT)及免疫因子(TNF-α)，以此来模拟肝细胞受到病毒感染之后，产生免疫/炎症应答，导致免疫反应为基础的肝损伤；并以药物对免疫因子分泌量的影响，应用于抗免疫性肝损伤药物的筛选。

本发明提供的肝细胞与Kupffer细胞共培养体系作为筛选模型，与整体动物模型相比，具有快速培养的优点还能兼具免疫刺激的特性；与单种细胞的免疫性损伤模型相比，在保持快速培养的基础上(所添加的LPS不影响细胞增殖)，又模拟了体内免疫因子对肝细胞的刺激。

以本发明提供的肝细胞与Kupffer细胞共培养体系作为筛选模型，对部分中药材进行的初步筛选，结果表明，淫羊藿醇提物、党参醇提物、白芍总皂苷、丹参脂溶部分、白术脂溶部分、人参总皂苷等均可显著降低模型中AST、ALT、GGT、TNF-α等酶活性及免疫因子分泌量，所述药物包含的有效组份可以作为抗免疫肝损伤药物的备选，这也与现有技术指出的淫羊藿醇提物、党参醇提物、白芍总皂苷、丹参脂溶部分、白术脂溶部分、人参总皂苷等对免疫肝损伤有较好的保护及治疗作用相一致。

附图说明

图1为原代培养的小鼠肝细胞形态观察图(×300)；

图2为原代培养的小鼠肝内枯否细胞形态观察图(×300)；

图3为枯否细胞的迁移及其对肝细胞增殖的影响分析图(Mean±SD，n＝5)；

图4为肝细胞的迁移及其对枯否细胞增殖的影响分析图(Mean±SD，n＝5)；

图5为不同浓度LPS对肝细胞增殖的影响的曲线图(Mean±SD，n＝5)，横坐标为LPS的浓度，纵坐标为肝细胞增殖率；

图6为不同浓度LPS对枯否细胞增殖的影响的曲线图(Mean±SD，n＝5)，横坐标为LPS的浓度，纵坐标为枯否细胞增殖率；

图7为不同浓度LPS对枯否细胞分泌TNF-α的影响曲线图(Mean±SD，n＝5)，横坐标为时间的浓度，纵坐标为TNF-α的浓度；

图8为肝细胞与Kupffer细胞在Millicell双层培养室中共培养的示意图；其中1为Millicell双层培养室的上层，2为Millicell双层培养室的下层。

图9a～图9c为不同浓度LPS对共培养模型中AST、ALT、GGT的影响(Mean±SD，n＝5)。

具体实施方式

下面结合肝细胞的分离纯化、Kupffer细胞的分离纯化、LPS添加浓度的选择、共培养体系的构建，以及对药物的初步筛选对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、肝细胞的分离纯化

选用正常的BALB/C小鼠，用水合氯醛(3.5％，1mL/100g，ip)麻醉后固定体位、消毒胸腹部皮肤，打开腹膜，游离门静脉和下腔静脉后，距肝门约1cm处插入22号导管行门静脉插管，下腔静脉插入固定另一导管备用。37℃预温D-Hanks’液以25mL/min流速灌注，数分钟后可见肝脏膨大，颜色均匀苍白。剪开下腔静脉放出积血积液，门静脉换用含0.025％IV型胶原酶的Hanks液迅速灌约10min。待肝脏韧性消失，压迫下陷不易恢复时切断肝周韧带，剪下肝脏，置于4℃预冷的PBS中；划开肝被膜，用玻璃分针轻轻梳理肝脏，以促使细胞分散。收集细胞悬液置于400目尼龙网上过滤，滤液即为肝脏细胞悬液.用4℃的PBS洗涤肝脏细胞3次，将细胞悬液铺于60％Percoll液面上，4℃，200g离心15min，收集沉淀，即得到分离纯化的肝细胞，加入含10％胎牛血清(10％FCS)的RPMI-1640培养液。置37℃、5％CO₂培养箱内培养，每24小时更换培养基。原代培养的小鼠肝细胞形态观察结果如图1所示。采用0.25％胰酶消化3～5min后进行细胞传代。

采用台盘兰染色法测定小鼠肝细胞的存活率为96±3％，结果表明，其细胞存活率满足体外培养的要求。

2.小鼠肝内Kupffer细胞的分离纯化

选用正常或经BCG致敏12d后的BALB/C小鼠，戊巴比妥钠皮下注射麻醉BALB/C鼠，无菌取肝，D-Hank’s缓冲液冲洗去血，除去胆囊及非肝组织，置消毒的小玻璃瓶中用眼科剪刀剪碎，肝组织块剪成1mm³大小。每克肝组织加10mL 0.05％链霉蛋白酶E溶液，轻轻吹打消化10min。200目不锈钢筛网滤过，100×g离心10min，弃上清，D-Hank’s缓冲液清洗2遍，30％～70％Percoll分离液梯度离心15min(1000×g)，取中间层，RPMI-1640液清洗2遍，10％FCS培养于玻璃培养瓶，4h后，用RPMI-1640轻轻冲洗3次去除非贴壁细胞，贴壁细胞即为分离纯化的Kupffer细胞。原代培养的小鼠肝内Kupffer细胞形态观察结果如图2所示。

采用台盘兰染色法测定小鼠肝内Kupffer细胞的存活率为98±3％，结果表明，其细胞存活率满足要求。

3、细胞相互间增殖和迁移的影响

3.1肝细胞和Kupffer细胞的Millicell小室共培养

取第2～3代的肝细胞和Kupffer细胞，用0.25％胰酶消化后，在不同的Millicell(中间半透膜的微孔直径为8μm)下室内加入500μL密度分别为1×10⁶，1×10⁵，1×10⁴个/mL的肝细胞，待其贴壁后将500μL Kupffer细胞以1×10⁵个/mL密度，加入到用Millicell上层小室。所用培养基均为含10％FCS的RPMI-1640培养液，隔天换液，每次换上下室各一半溶液。另外，以相同的密度将肝细胞另外置入24孔培养板单独同步培养作为对照组。

同样的培养条件下，在微孔直径为8μm的Millicell下室内加入500μL密度分别为1×10⁶，1×10⁵，1×10⁴个/mL的Kupffer细胞，待其贴壁后将500μL肝细胞以1×10⁵个/mL密度，加入到用Millicell上层小室。隔天换液，每次换上下室各一半溶液。以相同的密度将Kupffer细胞另外置入24孔培养板单独同步培养作为对照组。

3.2细胞增殖和迁移的相互影响

共培养7d后，取出上层小室，擦去Millicell滤膜上表面的细胞，吉姆萨染色，随机计数滤膜下表面5个视野的细胞数目。

下室及对照组孔板每孔加入MTT溶液(5mg/mL)80μL，37℃继续孵育4h，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入500μL DMSO，振动10～15min，使结晶物充分溶解，30min后，分别吸取150μL至96孔酶标板，全自动酶标仪490nm处测定各孔吸光值，记录结果。

各个浓度组别与对照组比较，判断在共培养模型中，Kupffer细胞与肝细胞之间增殖和迁移的相互影响。

与单独培养的对照组比较，Millicell小室共培养模型中，Kupffer细胞(1×10⁵个/mL)对不同浓度的肝细胞的增殖没有显著的影响。组内比较，不同浓度的肝细胞对Kupffer细胞的迁移也没有显著的影响。具体比较如图3所示的枯否细胞的迁移及其对肝细胞增殖的影响分析图。

与单独培养的对照组比较，共培养模型中，肝细胞(1×10⁵个/mL)对不同浓度的Kuffer细胞的增殖没有显著的影响。组内比较，不同浓度的Kuffer细胞对肝细胞的迁移也没有显著的影响。具体比较如图4所示的肝细胞的迁移及其对枯否细胞增殖的影响分析图。

因此，在肝细胞与Kupffer细胞的Millicell小室共培养时，肝细胞和Kuffer细胞的浓度均可采用1×10⁵个/mL，两种细胞彼此之间不影响细胞的增殖和细胞的迁移。

4、采用MTT法检测不同浓度LPS对肝细胞增殖的影响

用胰蛋白酶溶液消化单层培养的肝细胞，然后用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基配成单个细胞悬液，以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板中，每孔体积200μL。37℃培养24h后，吸弃培养液；然后加入含有10％胎牛血清及不同浓度LPS(1～10⁴ng/mL的梯度浓度)的RPMI-1640培养基200μL，对照组加入等量的助溶剂DMSO；37℃培养48h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL；37℃继续孵育4h，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μL DMSO，振动10～15min，使结晶物充分溶解，30min后，全自动酶标仪490nm处测定各孔吸光值，记录结果。各组与对照组比较，判断LPS对肝细胞增殖的影响。

MTT增殖实验结果如图5所示，其中横坐标为LPS的含量，纵坐标为增加率，在浓度为1～50ng/mL的浓度范围内，LPS对肝细胞的没有显著的作用，但是随着浓度的增加，LPS对肝细胞增殖有一定的抑制作用，与空白对照组相比有显著性差异。

5、采用MTT法检测不同浓度LPS对Kupffer细胞增殖的影响，并检测LPS对Kupffer细胞分泌TNF-α的影响

用含0.02％EDTA的胰蛋白酶溶液消化单层培养的Kupffer细胞，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基配成单个细胞悬液，以1×10⁵个/mL的密度接种于24孔板中，每孔体积500μL。37℃培养24h后，吸弃培养液，然后加入含有10％胎牛血清及不同浓度LPS(1～10⁴ng/mL的梯度浓度)的RPMI-1640培养基1mL，对照组加入等量的助溶剂DMSO；37℃培养11d，培养期间隔天换液，收集被替换的培养基。另设置LPS(5ng/mL)附加实验组，除换液方法不一样以外(隔天换培养基一半，收集被替换的培养基)，其它操作相同。

在培养11d之后，MTT法检测不同浓度LPS对Kupffer细胞增殖的影响；取隔天替换的培养基，ELISA法检测培养上清液中前炎症因子TNF-α的含量，按照试剂盒的使用说明进行操作。

MTT增殖实验结果如图6所示，其中横坐标为LPS的含量，纵坐标为增加率；在浓度为1～100ng/mL的浓度范围内，LPS对Kupffer细胞增殖没有显著的作用，但是随着浓度的增加，LPS对Kupffer细胞增殖有一定的抑制作用，但与空白对照组相比，没有显著性差异。

采用ELISA法测定培养上清液中TNF-α的含量，结果如图7所示的不同LPS的添加量在2～12天培养上清液中TNF-α的含量分析；静息状态下，Kupffer细胞分泌较少量的TNF-α(85.7～69.2pg/mL)，10μg/mL的LPS能显著刺激Kupffer细胞TNF-α的分泌(589.6±29.7pg/mL)，随着时间的增加，其分泌量迅速减少，在d11时，其分泌量仅为65.9±8.5pg/mL。5ng/mL的LPS刺激Kupffer细胞TNF-α的分泌量在212.4～86.8pg/mL之间，随着时间的增加，其分泌量逐渐减少。而附加组(5ng/mL的LPS，隔天换一半的培养基)在d3～d11间，其细胞上清液中一直保持较高浓度的、较稳定量的TNF-α(207.3～116.8pg/mL)。

6、肝细胞和Kupffer细胞共培养模型的建立以及不同浓度LPS对共培养模型中AST、ALT、GGT的影响

根据以上细胞增殖及迁移实验和ELISA的实验结果，建立如图8所示的肝细胞和Kupffer细胞在Millicell小室的共培养模型：

在Millicell双层培养室中添加培养基和5～50ng/mL的LPS，在上层培养小室1中培养Kuffer细胞，在下层培养小室2中培养肝细胞；在培养箱中37℃、5％CO₂静置培养，隔天更换一半新鲜的培养基，并保持LPS的浓度。

用含0.02％EDTA的胰蛋白酶溶液消化单层培养的Kupffer细胞，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基配成单个细胞悬液，以1×10⁵个/mL的密度接种于24孔板中，每孔体积500μL。37℃培养24h后，吸弃培养液，然后加入含有10％胎牛血清及不同浓度LPS(1～10⁴ng/mL的梯度浓度)的RPMI-1640培养基1mL，对照组加入等量的助溶剂DMSO；37℃培养11d，培养期间隔天换液，收集被替换的培养基。另设置LPS(5ng/mL)附加实验组，除换液方法不一样以外(隔天换培养基一半，收集被替换的培养基)，其它操作相同。

取隔天替换的培养基，采用试剂盒检测共培养上清液中AST、ALT和GGT的含量，具体按照试剂盒的使用说明进行操作。不同浓度的LPS在2～12天对AST、ALT和GGT的含量的变化影响分别如图9a、图9b、图9c所示。不同浓度的LPS对肝细胞的增殖均没有显著的影响，各实验组中不同浓度的LPS均可引起共培养模型中AST、ALT和GGT的含量的升高，当LPS的浓度大于100ng/mL时，细胞产生了大量的酶，但是随着时间的增加，细胞上清液中酶的活性显著降低。

综合考虑LPS对三种酶活性的影响，确定添加LPS的浓度为5ng/mL。共培养模型的培养基添加为：含有5ng/mL的LPS、10％FCS的RPMI-1640培养液作为培养基，5％CO₂培养箱37℃静置培养，隔天更换一半培养基。在这种环境下，共培养模型能够持续的分泌TNF-α等炎症细胞因子并产生AST、ALT和GGT等酶，在共培养上清液中能一直保持较高浓度的、较稳定量的TNF-α，并保持AST、ALT和GGT等酶的活性。从而更好地模拟肝脏受到病毒感染之后，产生免疫/炎症应答，导致免疫反应为基础的肝损伤。

建立共培养模型的具体操作过程为：在Millicell双层培养室的上层培养Kuffer细胞(培养浓度为10⁵个/mL)，在下层培养肝细胞(培养浓度为10⁵个/mL)；以10％FCS的RPMI-1640培养液作为培养基，于实验的第3天开始更换含有5ng/mL的LPS、10％FCS的RPMI-1640培养液作为培养基，5％CO₂培养箱37℃静置培养，隔天更换一半培养基，更换的培养基中含有10％FCS和5ng/mL LPS的RPMI-1640培养液。

7、采用共培养模型对秦巴山区的部分中药材进行的初步筛选

部分中药材的处理方法及过程如下。

淫羊藿：8倍量75％乙醇加热回流提取3次，每次3h，合并提取液，回收乙醇得醇提物；

党参：8倍量75％乙醇加热回流提取3次，每次3h，合并提取液，回收乙醇得醇提物；

白芍：10倍量70％乙醇加热回流提取2次，每次2h，合并提取液，过滤，滤液通过D101大孔吸附树脂，先用0.5％氨水洗柱，再用水洗至中性，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20～1.25，得浸膏，浸膏于70℃减压干燥，即得白芍总皂苷(其中芍药苷的含量约为31.0％)；

丹参：丹参药材中加入7倍体积95％乙醇提取2次，每次提取2d，合并上清液、减压浓缩，干燥，得到丹参脂溶部分。

白术：取粒度为80目的白术(炒)粉末，置索氏提取器中，加入3倍量的石油醚，于水浴锅上回流提取2次，每次提取12h，合并提取液过滤，旋转蒸发仪浓缩至干，得白术脂溶部分。

人参：人参药材加入20倍体积70％乙醇，水浴回流提取2次，提取温度为70℃，提取时间为3h，合并两次提取液，离心、过滤、浓缩，加入95％乙醇置于4℃2h，离心、过滤、回收乙醇、用乙醚萃取脱脂，水层用水饱和正丁醇反复萃取，正丁醇层减压回收正丁醇，冷冻干燥得人参总皂苷。

取上述各样品以适量二甲基亚砜助溶，用RPMI-1640培养基稀释成浓度分别为1mg/mL的溶液，0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，得样品溶液。对照组加入等量的助溶剂DMSO。

采用共培养模型，37℃培养2d后，吸弃上下小室的培养液，上、下室同时加入分别含有10％小牛血清、5ng/mL LPS及不同浓度的样品(1～100μg/mL，DMSO助溶)的RPMI-1640培养液500μL，阳性对照组为联苯双酯(10μg/mL，DMSO助溶)，阴性对照组加入等量的助溶剂DMSO。隔天换液，吸弃上、下室各一半溶液，并加入各组含药培养基。于培养的第11天观察细胞形态变化，吸取上、下小室的培养液，分别测定培养液中TNF-α、AST、ALT、GGT等酶的活性及细胞因子的量。TNF-α的测定采用ELASA试剂盒，AST、ALT及GGT的活性均按试剂盒操作说明书测定。实验结果如表1所示。

表1中药提取物对共培养模型中细胞因子和酶活性的影响(Mean±SD，n＝5)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

实验结果表明，淫羊藿醇提物、党参醇提物、白芍总皂苷、丹参脂溶部分、白术脂溶部分、人参总皂苷等均可显著降低共培养模型中TNF-α、AST、ALT、GGT等酶的活性及细胞因子分泌的量，提示该组分类似于阳性药联苯双酯，具有抗免疫性肝损伤的作用。

而现有的小鼠体内免疫性肝损伤药理学相关研究文献证明，淫羊藿醇提物、党参醇提物、白芍总皂苷、丹参脂溶部分、白术脂溶部分、人参总皂苷等对免疫肝损伤有较好的保护及治疗作用，这与本发明的药物筛选结果相一致。因此，更进一步可以将所选药材的具体的活性成分同样采用此共培养模型进行跟踪筛选，以酶活性及细胞因子分泌量的降低为指标进行更详细的筛选。

Claims (8)

1.一种肝细胞与Kupffer细胞共培养体系，其特征在于，在Millicell双层培养室中添加培养基和1～100ng/mL的LPS，在上层培养Kuffer细胞，在下层培养肝细胞；在培养箱中37℃、5％CO₂静置培养，隔天更换一半新鲜的培养基，并保持LPS的浓度。

2.如权利要求1所述的肝细胞与Kupffer细胞共培养体系，其特征在于，所述的培养基为含有体积分数10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，添加的LPS的浓度为5ng/mL。

3.如权利要求1所述的肝细胞与Kupffer细胞共培养体系，其特征在于，所述的肝细胞的培养浓度为1×10⁵个/mL，Kuffer细胞的培养浓度为1×10⁵个/mL。

4.如权利要求1所述的肝细胞与Kupffer细胞共培养体系，其特征在于，所述的肝细胞是通过将体外传代培养2～3的肝细胞制成细胞悬液接种于Millicell双层培养室的下层。

5.如权利要求1所述的肝细胞与Kupffer细胞共培养体系，其特征在于，所述的Kuffer细胞是通过将体外单层培养的Kupffer细胞成细胞悬液接种于Millicell双层培养室的上层。

6.如权利要求1所述的肝细胞与Kupffer细胞共培养体系，其特征在于，所述的Millicell双层培养室在上层与下层之间设置的半透膜的孔径为8μm。

7.权利要求1所述的肝细胞与Kupffer细胞共培养体系应用于抗免疫性肝损伤药物的筛选。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的抗免疫性肝损伤药物的筛选，是筛选能够降低肝细胞与Kupffer细胞共培养体系中AST、ALT、GGT、TNF-α的活性及免疫因子分泌量的药物。

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