CN114134112A - 用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学实验模型研究技术领域，针对“T细胞介导肝细胞损伤”的体外研究模型对自身免疫性肝炎研究的重要性，公开了一种用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒及方法。所述试剂盒包括：Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞、HL‑7702人肝细胞、T细胞/肝细胞共培养专用培养基、人CD3/CD28T细胞激活剂、细胞消化液、灭菌PBS溶液。所述方法是先将T细胞和肝细胞在专用培养基内进行共培养，建立“T细胞/肝细胞共培养体系”，然后通过T细胞激活物的诱导，活化T细胞，并通过T细胞表达细胞因子，引起肝细胞损伤，从而在体外部分模拟人类自身免疫性肝炎的发病过程。具有“一站式”、快捷、稳定的特点，并可以降低种属差异对后续实验结果的影响。

Description

用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于医学实验模型研究技术领域，具体为一种用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒及方法。

背景技术

自身免疫性肝炎是一种针对肝细胞的异常免疫反应导致的慢性进行性肝病，其特点是免疫球蛋白水平升高、自身抗肝抗原抗体的存在、形态学表现为界面型肝炎。自身免疫性肝炎患者会出现血清转氨酶升高、炎性细胞因子的异常表达，以及严重的肝坏死和细胞凋亡，如果不及时治疗，可能会发展为肝纤维化、肝功能衰竭等。本病的病因以及发病机制尚不清楚，目前认为是由于遗传易感性及环境诱发因素等共同作用引起的自身免疫耐受缺失，从而诱导产生以T细胞介导为主的针对肝脏抗原的免疫反应，造成肝脏组织的破坏及炎症的形成。

自身免疫性肝炎动物模型的研究已有较好的发展，但有关可以用于自身免疫性肝炎发病机制及治疗机制的细胞模型相对较少。尤其是可以快速、稳定、简便地体外模拟T细胞介导肝细胞损伤的病理生理过程的细胞模型，目前尚未见相关报道。这在一定程度上，阻碍了自身免疫肝炎发病机制及治疗机制的研究进展，如开展目的基因过表达或沉默研究等。因此，如能制备一款可以快速、稳定、一站式地建立“T细胞介导肝细胞损伤”的体外研究模型，将有助于自身免疫性肝炎的发病机制研究及开发有效的治疗药物。

发明内容

针对“T细胞介导肝细胞损伤”的体外研究模型对自身免疫性肝炎发病机制的研究及有效治疗药物开发的重要性，本发明提供了一种可用于快速建立人源性“T细胞介导肝细胞损伤”体外研究模型的试剂盒及方法。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

本发明提供一种用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒，包括：Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞、HL-7702人肝细胞、T细胞/肝细胞共培养专用培养基、人CD3/CD28T细胞激活剂、细胞消化液、灭菌PBS溶液。本试剂盒仅用于科学研究，不用于临床诊断或治疗。

进一步，所述T细胞/肝细胞共培养专用培养基由79％RPMI-1640(V/V％)、20％胎牛血清(V/V％)和1％100U/mL青链霉素双抗混合液(V/V％)组成，-20℃保存。

进一步，所述人CD3/CD28 T细胞激活剂的使用浓度为25μL/mL，储存条件为2-8℃。

进一步，所述细胞消化液为用所述T细胞/肝细胞共培养专用培养基配置的0.25％胰酶溶液(wt％)，-20℃保存。

进一步，所述灭菌PBS的质量百分比为5％，保存于-20℃。

本发明还提供一种基于上述试剂盒建立自身免疫性肝炎体外研究模型的方法，包括以下步骤：先将T细胞和肝细胞在专用培养基内进行共培养，建立“T细胞/肝细胞共培养体系”，然后通过T细胞激活物的诱导活化T细胞，以造成肝细胞损伤，从而建立了“T细胞介导肝细胞损伤”体外研究模型，即本发明所述的用于自身免疫性肝炎体外研究的模型，从而用于体外模拟自身免疫性肝炎的部分发病机制。T细胞激活物为由可结合CD3和CD28的可溶性抗体复合物组成的人CD3/CD28 T细胞激活剂，可以为T细胞激活提供所需的初级和共刺激信号，活化T细胞后，通过表达IFN-γ、TNF-α等细胞因子，引起肝细胞损伤。

进一步，所述建立自身免疫性肝炎体外研究模型的方法，具体包括以下步骤：

将HL-7702人肝细胞按细胞数为5×10⁵个/孔的标准用100μL的T细胞/肝细胞共培养专用培养基无菌恒温培养至贴壁；

将Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞采用T细胞/肝细胞共培养专用培养基无菌恒温培养，进行常规传代、换液后，调整至5×10⁶个/mL备用；

在培养至已贴壁的HL-7702人肝细胞培养孔内，吸弃原有培养基，用灭菌的质量百分比为5％的PBS溶液洗2次后，每孔加入100μL已调整细胞浓度的Jurkat细胞悬液，继续共培养12h；

在上述共培养体系内，按2.5μL/孔的剂量加入人CD3/CD28 T细胞激活剂，继续培养12h，即获得自身免疫性肝炎体外研究模型。

进一步，所述人CD3/CD28 T细胞激活剂的浓度为25μL/mL。

进一步，所述HL-7702人肝细胞和Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞的培养条件为：37℃，5％CO₂，PH值7.2-7.4。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

(1)本试剂盒具备建立“T细胞介导肝细胞损伤”细胞模型的全部试剂，可以达到“一站式”建立的程度。

(2)本试剂盒采用人CD3/CD28 T细胞激活剂，可以为T细胞激活提供所必需的初级和共刺激信号，并可以确定激活剂的使用量，同时可以根据实验规模具体调整激活剂的使用量，与传统的单用anti-CD3和CD28抗体的方法比较，更为简便和稳定。

(3)本试剂盒诱导肝细胞损伤的方法耗时较短，仅用36小时即可有效地造成肝细胞出现明显的损伤，大大地缩减的模型建立的时间。

(4)本试剂盒均采用人类细胞，模型的建立更加符合人类自身免疫性肝炎的发生发展特征，在后续实验研究中可以降低种属差异对实验结果的影响。

(5)填补自身免疫性肝炎细胞模型建立研究的空白。

附图说明

图1为本发明实施例3的方法流程图。

图2为Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞未激活与激活后的比较图。

图3为Jurkat/HL-7702人肝细胞共培养后肝细胞损伤情况。

具体实施方式

下面结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

实施例1

一种用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒

试剂盒的组成：Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞、HL-7702人肝细胞、T细胞/肝细胞共培养专用培养基、人CD3/CD28 T细胞激活剂、细胞消化液、灭菌PBS溶液。

1)Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞

细胞描述：Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞。该株细胞是Jurkat-FHCRC细胞株(Jurkat细胞株的衍生)的一个克隆。Jurkat细胞株来源于一个14岁男孩的外周血。经佛波酯和外源凝集素或抗T3单克隆抗体(两种类型的诱导都需要)诱导后可产生大量IL-2。

细胞形态：淋巴母细胞，悬浮细胞。

培养条件：T细胞/肝细胞共培养专用培养基；37℃，5％CO₂，PH值7.2-7.4，无菌恒温培养。

规格：1×10⁶个/份，共2份，干冰或者活细胞寄送，液氮或-80℃保存。

细胞复苏(针对液氮冻存细胞)：

1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30min以上，超净台开启通风10min。

2.T细胞/肝细胞共培养专用培养37℃预热，移入细胞超净台前使用75％酒精擦拭消毒。

3.从液氮罐中取出细胞冻存管，立即置于37℃水浴中并快速摇动细胞冻存管，使其快速的融化。

4.在超净台中将冻存管中的细胞移入15mL离心管中，加入3mL新鲜细胞培养基后进行离心。800rpm,离心5min。

5.在离心等待时间里，在细胞培养瓶(25-cm²)中加入新鲜完全细胞培养基5mL。

6.离心结束后，弃掉上清，在细胞沉淀中加入1mL新鲜培养基后轻轻地吹打混匀，将细胞移出加入培养瓶中。轻轻地前后左右混匀后，置于细胞培养箱中，37℃，5％CO₂培养。

细胞传代：

1.取细胞计数(详见细胞冻存部分)，当细胞密度达到3.0×10⁶/mL左右时需要进行传代。

2.细胞实验室进行常规消毒，T细胞/肝细胞共培养专用培养37℃预热。

3.在超净台中加适量预热好的培养基到无菌摇瓶中，以细胞终密度为4×10⁵/mL接种细胞(也可1000rpm，5min离心后弃上清，用预热好的培养基重悬并调整细胞密度为4×10⁵/mL)于25mL细胞培养瓶中；

4.置于37℃，5％CO₂的培养箱中静置培养。

细胞冻存：

1.细胞实验室进行常规消毒，细胞培养基37℃预热。

2.细胞计数：

(1)洗净晾干血球计数板和盖玻片，将盖玻片完全覆盖计数区；

(2)充分混匀细胞，取少量(0.1-0.5mL)细胞悬液与等体积的染色液台盼蓝混合，移液器吹吸混合均匀，用移液器取20μL混合液从盖玻片两端(与中间凹槽平行的两端)分别打入细胞，以细胞悬液刚好浸湿盖玻片为佳；

(3)显微镜下，数四个计数区的总细胞数，无活性细胞染成蓝色，活细胞不被染色；

(4)细胞密度＝细胞总数/4×10000×2；

(5)细胞活性＝活细胞数/细胞总数×100％。

备注：细胞密度高时，可调整细胞悬液和台盼蓝的比例，计数时乘以相应的稀释倍数即可。

3.超净台内将细胞移入离心管中进行离心，800rpm，离心5min。

4.弃掉上清，在细胞沉淀中加入冻存液(1640+20％FBS+10％DMSO)，调整细胞密度为1-3×10⁶个/mL。

5.取1.0-1.5mL细胞悬液移入细胞冻存管中。

6.将装有细胞的冻存管放入冻存盒内，置于-80℃冰箱中过夜，之后可取出并保存于液氮中。若没有冻存盒，可以按照如下程序降温操作：4℃放置半小时，-20℃中放置2h,之后置于-80℃冰箱中过夜，最后取出置于液氮中保存。

2)HL-7702人肝细胞

细胞描述：人肝正常细胞。

细胞形态：贴壁生长。

培养条件：T细胞/肝细胞共培养专用培养基，37℃，5％CO₂，PH值7.2-7.4，无菌恒温培养。

规格：1×10⁶个/份，共2份，干冰或者活细胞寄送，液氮或-80℃保存。

细胞接收后的处理：干冰运输，收到细胞后推荐直接复苏1管，另一管放入-80度冰箱保存过夜后转入液氮，细胞直接转入液氮暂存可能导致细胞复苏率降低。

复苏细胞：75％酒精消毒瓶身后放培养箱中静置4-6h后，在显微镜下确认细胞状态并拍照100倍和200倍的照片，若有贴壁细胞脱落，可收集上清离心，1000rpm离心5min，离心后弃去上清，用T细胞/肝细胞共培养专用培养重悬后加入T25培养瓶或60mm皿中，补加适量培养基，T25培养瓶加6-8mL培养基。

细胞培养：

1.细胞传代：细胞密度达到80-90％时即可传代

(1)弃去培养上清，用灭菌PBS清洗1-2次；

(2)加入1～2mL 0.25％胰酶(T25瓶)，使胰酶覆盖整个瓶或皿底细胞，盖好放入培养箱消化；

(2)细胞消化0.5-2min(具体时间根据镜下形态判断，难消化细胞可适当延长消化时间)，显微镜下观察细胞，细胞回缩，即将脱壁而未脱壁时(可用枪轻轻吹打确认细胞是否脱壁)，加入T细胞/肝细胞共培养专用培养基终止消化(若消化过度可能会对细胞存活率产生较大影响)；

(4)将细胞悬液1000rpm左右条件下离心4min，弃上清；

(5)加1-2mL T细胞/肝细胞共培养专用培养基吹匀重悬后按照1:2比例加入2个T25培养瓶或60mm皿中，补加适量培养基，T25培养瓶加6-8mL培养基；注：第一次传代推荐1：2传代，后续可根据细胞生长以及客户需求自行确定。

2.细胞复苏

(1)将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5mL培养基混匀；

(2)在1000rpm左右条件下离心4min，弃上清，加1-2mL新鲜完全培养基吹匀，将细胞悬液加入T25培养瓶或者60mm培养皿中，补加适量培养基，T25培养瓶加6-8mL培养基。

3.细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存

(1)弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入2mL0.25％胰酶(T25瓶)，使胰酶覆盖整个瓶或皿底细胞，盖好放入培养箱消化；

(2)细胞消化0.5-2min(具体时间根据镜下形态判断)，显微镜下观察细胞，细胞回缩，即将脱壁而未脱壁时(可用枪轻轻吹打确认细胞是否脱壁)，加入培养基终止消化(若消化过度可能会对细胞存活率产生较大影响)；

(3)将细胞悬液1000rpm左右条件下离心4min，弃上清，加入配制好的10％DMSO冻存培养液重悬细胞，冻存液的添加量按细胞最终浓度为1～10×10⁶/mL添加；备注：DMSO原液需自备，使用T细胞/肝细胞共培养专用培养基配制。

(4)将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

3)T细胞/肝细胞共培养专用培养基

主要成分：79％(V/V％)RPMI-1640，20％(V/V％)胎牛血清，1％(V/V％)的100U/mL青链霉素双抗混合液。

产品规格：200mL/份，共1份。

贮存条件：-20℃保存(分装后，小剂量4℃保存不超过2周)。

4)人CD3/CD28 T细胞激活剂

主要成分：人CD3/CD28 T细胞激活剂(由可结合CD3和CD28的可溶性抗体复合物组成，可以为T细胞激活提供所需的初级和共刺激信号)。

产品规格：2mL/份，共1份。

使用条件：25μL/mL，孵育12h。

贮存条件：2-8℃保存。

5)细胞消化液

主要成分：0.25％(wt％)胰酶溶液(T细胞/肝细胞共培养专用培养基配置)。

产品规格：100mL/份，共1份。

贮存条件：-20℃保存(分装后，小剂量4℃保存不超过2周)。

6)灭菌PBS溶液：

主要成分：灭菌的5％(wt％)PBS溶液。

产品规格：200mL/份，共1份。

贮存条件：-20℃保存(分装后，小剂量4℃保存不超过2周)。

实施例2

一种建立自身免疫性肝炎体外研究模型的方法，包括以下步骤：

将HL-7702人肝细胞按细胞数为5×10⁵个/孔的标准用100μL的T细胞/肝细胞共培养专用培养基在37℃，5％CO₂，PH值7.2-7.4的条件下无菌恒温培养至贴壁；

将Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞采用T细胞/肝细胞共培养专用培养基无菌恒温培养至贴壁(37℃，5％CO₂，PH值7.2-7.4)，进行常规传代、换液后，调整至5×10⁶个/mL备用；

在HL-7702人肝细胞已贴壁的培养孔内，吸弃原有培养基，用灭菌的5％PBS溶液洗2次后，每孔加入100μL已调整细胞浓度的Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞悬液，继续共培养12h；

在上述共培养体系内，按2.5μL/孔的剂量加入人CD3/CD28 T细胞激活剂，继续培养12h，即获得自身免疫性肝炎体外研究模型。

实施例3

自身免疫性肝炎体外研究模型的建立(以96孔板为例)及用于自身免疫性肝炎的体外研究：

1)HL-7702人肝细胞按细胞数为5×10⁵个/孔的标准接种于96孔板，加入100μL T细胞/肝细胞共培养专用培养基，37℃，5％CO₂，PH值7.2-7.4，无菌恒温培养12h。

备注：以细胞贴壁为标准，适当调整培养时间。

2)Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞采用T细胞/肝细胞共培养专用培养基，37℃，5％CO₂，PH值7.2-7.4，无菌恒温培养，按实施例1中的方法进行常规传代、换液后，调整至5×10⁶个/mL备用。

3)在HL-7702人肝细胞已贴壁的培养孔内，吸弃原有培养基，用无菌PBS溶液洗2次后，每孔加入已调整细胞浓度的Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞悬液100μL，继续共培养12h。

4)在上述共培养体系内，按2.5μL/孔的剂量加入人CD3/CD28 T细胞激活剂，继续培养12h。

5)分离共培养体系内的培养液，2500rpm离心5min，上清液用于检测转氨酶(包括ALT和AST)，细胞沉淀用于观察T细胞激活情况。

6)使用无菌PBS溶液洗贴壁细胞2次后，加入细胞消化液100μL，消化贴壁的HL-7702人肝细胞。细胞消化0.5-2min(具体时间根据镜下形态判断，难消化细胞可适当延长消化时间)，显微镜下观察细胞，细胞回缩，即将脱壁而未脱壁时(可用枪轻轻吹打确认细胞是否脱壁)，T细胞/肝细胞共培养专用培养基中止消化。2500rpm离心5min，细胞沉淀用于观察肝细胞凋亡情况。

图2为Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞未激活与激活后的比较。可见Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞被激活后，细胞体积变大，并出现抱团现象，表明细胞活性增强，细胞因子表达升高。

图3为Jurkat/HL-7702人肝细胞共培养后肝细胞损伤情况。可见加入CD3/CD28激活剂后，肝细胞损伤标记物ALT和AST显著升高。

Claims (7)

1.一种用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒，其特征在于，包括：Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞、HL-7702人肝细胞、T细胞/肝细胞共培养专用培养基、人CD3/CD28 T细胞激活剂、细胞消化液、灭菌PBS溶液。

2.根据权利要求1所述的用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒，其特征在于，所述T细胞/肝细胞共培养专用培养基由体积百分比为79％的RPMI-1640、体积百分比为20％的胎牛血清和体积百分比为1％的100U/mL青链霉素双抗混合液组成，-20℃保存。

3.根据权利要求1所述的用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒，其特征在于，所述人CD3/CD28 T细胞激活剂的使用浓度为25μL/mL，储存条件为2-8℃；所述细胞消化液为用所述T细胞/肝细胞共培养专用培养基配制的质量百分比为0.25％的胰酶溶液，-20℃保存；所述灭菌PBS的质量百分比为5％，-20℃保存。

4.一种基于权利要求1-3任一项所述的试剂盒建立自身免疫性肝炎体外研究模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：先将T细胞和肝细胞在专用培养基内进行共培养，建立“T细胞/肝细胞共培养体系”，然后通过T细胞激活物的诱导，活化T细胞，建立了用于自身免疫性肝炎体外研究的模型。

5.根据权利要求4所述的建立自身免疫性肝炎体外研究模型的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

将HL-7702人肝细胞按细胞数为5×10⁵个/孔的标准用100μL的T细胞/肝细胞共培养专用培养基无菌恒温培养至贴壁；

将Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞采用T细胞/肝细胞共培养专用培养基无菌恒温培养至贴壁，进行常规传代、换液后，调整至5×10⁶个/mL备用；

在培养至已贴壁的HL-7702人肝细胞培养孔内，吸弃原有培养基，用灭菌的质量百分比为5％的PBS溶液洗2次后，每孔加入100μL已调整细胞浓度的Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞悬液，继续共培养12h；

在上述共培养体系内，按2.5μL/孔的剂量加入人CD3/CD28 T细胞激活剂，继续培养12h，即获得自身免疫性肝炎体外研究模型。

6.根据权利要求5所述的建立自身免疫性肝炎体外研究模型的方法，其特征在于，所述人CD3/CD28 T细胞激活剂的浓度为25μL/mL。

7.根据权利要求5所述的建立自身免疫性肝炎体外研究模型的方法，其特征在于，所述HL-7702人肝细胞和Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞的培养条件为：37℃，5％CO₂，PH值7.2-7.4。

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