CN102250834A - Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法 - Google Patents

Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102250834A
CN102250834A CN2010101782559A CN201010178255A CN102250834A CN 102250834 A CN102250834 A CN 102250834A CN 2010101782559 A CN2010101782559 A CN 2010101782559A CN 201010178255 A CN201010178255 A CN 201010178255A CN 102250834 A CN102250834 A CN 102250834A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cells
stroma
hscs
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010101782559A
Other languages
English (en)
Inventor
黄家学
侯士芳
王雪莲
张宇光
孟恒星
陈晓波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
XIEHE STEM CELL GENE ENGINEERING Co Ltd
Original Assignee
XIEHE STEM CELL GENE ENGINEERING Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by XIEHE STEM CELL GENE ENGINEERING Co Ltd filed Critical XIEHE STEM CELL GENE ENGINEERING Co Ltd
Priority to CN2010101782559A priority Critical patent/CN102250834A/zh
Publication of CN102250834A publication Critical patent/CN102250834A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法，包括以下步骤：(1)OP9-DL1细胞失去支持HSCs发育成为B细胞的能力；(2)OP9-DL1获得诱导HSCs发育成为T细胞的正常的程序。本发明OP9-DL1细胞体外共培养体系，可以诱导许多不同来源的祖细胞发育成为T细胞。到目前为止，我们已经可以高效的诱导或者说支持分化为T细胞的干细胞有小鼠胚胎肝细胞来源的HSCs，从骨髓来源的HSCs，末分化的ESCs，骨髓来源的淋巴祖细胞，胸腺来源的祖细胞和人Cord血米源的HSCs。

Description

Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法
技术领域
本发明涉及一种细胞共培养体系，尤其是一种简单有效的体外T细胞定向分化的体系，即Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法。
背景技术
人体对自身的病变细胞和病原体的清除由免疫系统来承担。免疫系统的细胞成分主要由B细胞、T细胞及树突状细胞等抗原递呈细胞来完成。T细胞分为细胞杀伤CD8T细胞和CD4助细胞。由于T细胞在自身免疫性疾病、病毒感染、肿瘤杀伤、细菌及真菌感染中的重要作用，T细胞及人工改造的抗原特异性细胞被用来治疗肿瘤、对特定病毒缺乏免疫力的病原体感染和针对自身的过度免疫反应。体外人工诱导功能性T细胞并赋于其抗原特异性是治疗自身免疫生疾病、久治不愈的感染性疾病的有效手段之一。
在一种简单的单层基质细胞的作用下，能够分化出T细胞的这种能力不仅有助于解决关于T细胞的产生需要分子间的相互作用的基础性问题，而且提供一个研究T细胞发育的新系统。在发现OP9-DL1细胞之前，研究T细胞的发育需要FTOCs。这种FTOCs虽然有效，但是很复杂而且效率相当低。因此，需要发明一种新的简单有效的体外T细胞分化体系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，设计了一个操作简便、效率高的OP9-DL1细胞体外共培养体系，体外获得T细胞。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法，包括以下步骤：(1)OP9-DL1细胞失去支持HSCs发育成为B细胞的能力；(2)OP9-DL1获得诱导HSCs发育成为T细胞的正常的程序。
具体地说，OP9-载体和小鼠Delta-like 1转导OP9细胞基质细胞系保存在添加了20％牛血清的改良培养基中；干细胞因子Flt3-L和IL-7的浓度依照R&D使用说明添加，祖细胞接种到平板的前一天，每个孔板中的基质细胞数要达到2×104；将祖细胞以不同的密度添加到不同孔板的基质细胞，确定产生最佳淋巴细胞的祖细胞添加浓度；培养一周后，用0.53m MEDTA/PBS，pH7.4来收集基质细胞和造血细胞，然后，3000-10000的造血细胞与基质细胞共同转接到新鲜的基质细胞进行传代培养；经过几周的分化观察后，用基质细胞通过VCAM-1抗体染色的方法被去除，而死亡细胞则通过7-aminoactinomycinD染色被去除，当造血细胞的得率达到95％，此培养条件和细胞密度可取。
本发明的有益效果是：OP9-DL1细胞体外共培养体系，可以诱导许多不同来源的祖细胞发育成为T细胞。到目前为止，我们已经可以高效的诱导或者说支持分化为T细胞的干细胞有小鼠胚胎肝细胞来源的HSCs，从骨髓来源的HSCs，未分化的ESCs，骨髓来源的淋巴祖细胞，胸腺来源的祖细胞和人Cord血来源的HSCs。
具体实施方式
小鼠胚胎：嵌入RAG-1/GFP基因的雄性小鼠与C57BL/6雌性小鼠交配产生的RAG-1/GFP胚胎。
OP9共培养：OP9-载体和小鼠Delta-like 1转导OP9细胞基质细胞系保存在添加了20％牛血清的改良培养基中。干细胞因子Flt3-L和IL-7的浓度依照R&D使用说明添加。祖细胞接种到平板的前一天，每个孔板中的基质细胞数要达到2×104。然后，将祖细胞以不同的密度添加到不同孔板的基质细胞，目的是为了确定产生最佳淋巴细胞的祖细胞添加浓度。培养一周后，用0.53m M EDTA/PBS(pH7.4)来收集基质细胞和造血细胞。然后，3000-10000的造血细胞与基质细胞共同转接到新鲜的基质细胞进行传代培养。经过几周的分化观察后，用基质细胞通过VCAM-1抗体染色的方法被去除，而死亡细胞则通过7-aminoactinomycinD染色被去除。当造血细胞的得率达到95％则认为此培养条件和细胞密度可取。
细胞分选：骨髓阴性细胞的获取和富集是通过与标记抗体的混合孵化，包括CD45RA，CD19，Gr-1，CD11b/Mac-1，Ter-119；然后通过MACS细胞分离系统分离阴性细胞部分。阳性细胞则被电子控出。
移植：移植前4小时，同类系LY5.1小鼠要经过单剂量960rad的照射。然后，105受体骨髓细胞与105Lin_c-Kit_Sca-1_分离细胞混合，注射到受体内。经过21-28天观察细胞注射和分化情况，并观察其致瘤性。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (2)

1.一种Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)OP9-DL1细胞失去支持HSCs发育成为B细胞的能力；(2)OP9-DL1获得诱导HSCs发育成为T细胞的正常的程序。
2.根据权利要求1所述的Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：OP9-载体和小鼠Delta-like 1转导OP9细胞基质细胞系保存在添加了20％牛血清的改良培养基中；干细胞因子Flt3-L和IL-7的浓度依照R&D使用说明添加，祖细胞接种到平板的前一天，每个孔板中的基质细胞数要达到2×104；将祖细胞以不同的密度添加到不同孔板的基质细胞，确定产生最佳淋巴细胞的祖细胞添加浓度；培养一周后，用0.53m M EDTA/PBS，pH7.4来收集基质细胞和造血细胞，然后，3000-10000的造血细胞与基质细胞共同转接到新鲜的基质细胞进行传代培养；经过几周的分化观察后，用基质细胞通过VCAM-1抗体染色的方法被去除，而死亡细胞则通过7-aminoactinomycinD染色被去除，当造血细胞的得率达到95％，此培养条件和细胞密度可取。
CN2010101782559A 2010-05-21 2010-05-21 Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法 Pending CN102250834A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2010101782559A CN102250834A (zh) 2010-05-21 2010-05-21 Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2010101782559A CN102250834A (zh) 2010-05-21 2010-05-21 Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102250834A true CN102250834A (zh) 2011-11-23

Family

ID=44978405

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010101782559A Pending CN102250834A (zh) 2010-05-21 2010-05-21 Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102250834A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114134112A (zh) * 2021-11-15 2022-03-04 山西中医药大学 用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒及方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008101272A1 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 Women's And Children's Health Research Institute Inc Method for obtaining treg-cells
WO2010051634A1 (en) * 2008-11-07 2010-05-14 Sunnybrook Health Sciences Centre Human progenitor t-cells

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008101272A1 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 Women's And Children's Health Research Institute Inc Method for obtaining treg-cells
WO2010051634A1 (en) * 2008-11-07 2010-05-14 Sunnybrook Health Sciences Centre Human progenitor t-cells

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Immunity》 20051231 Yoshihiro Baba et al. Constitutively active beta-catenin confers multi-lineage differentiation potential on lymphoid and myeloid progenitors 599-609 1-2 第23卷, 第6期 *
HONGFANG WANG ET AL.: "Distinct roles of IL-7 and stem cell factor in the OP9-DL1 T-cell differentiation culture system", 《EXPERIMENTAL HEMATOLOGY》 *
JIAXUE HUANG ET AL.: "Propensity of Adult Lymphoid Progenitors to Progress to DN2/3 Stage Thymocytes with Notch Receptor Ligation", 《J IMMUNOL.》 *
RENE´ E DE POOTER ET AL.: "T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach", 《CURRENT OPINION IN IMMUNOLOGY》 *
THOMAS M. SCHMITT ET AL.: "Induction of T Cell Development from Hematopoietic Progenitor Cells by Delta-like-1 In Vitro", 《IMMUNITY》 *
YOSHIHIRO BABA ET AL.: "Constitutively active β-catenin confers multi-lineage differentiation potential on lymphoid and myeloid progenitors", 《IMMUNITY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114134112A (zh) * 2021-11-15 2022-03-04 山西中医药大学 用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒及方法
CN114134112B (zh) * 2021-11-15 2024-04-19 山西中医药大学 用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhao et al. Comparison of the characteristics of macrophages derived from murine spleen, peritoneal cavity, and bone marrow
Tajima et al. Restoration of thymus function with bioengineered thymus organoids
CN102137925B (zh) 同时诱导CTL和γδT细胞的方法
Murphy et al. TNF‐α/IL‐1β—licensed mesenchymal stromal cells promote corneal allograft survival via myeloid cell‐mediated induction of Foxp3+ regulatory T cells in the lung
CN102292435B (zh) 牙齿相关干细胞的新用途
Awong et al. Human CD8 T cells generated in vitro from hematopoietic stem cells are functionally mature
CN108893443A (zh) 一种细胞因子诱导脐带血自然杀伤细胞的高效扩增方法
JP2013526839A (ja) 幹細胞免疫変調の使用方法及び装置
Sandhaanam et al. Mesenchymal stem cells (MSC): identification, proliferation and differentiation
Kadereit et al. In vitro immunogenicity of undifferentiated pluripotent stem cells (PSC) and derived lineages
JP2013507945A (ja) 免疫調節活性を有する細胞集団、その製造方法及び使用
MX2011000993A (es) Metodo para separar celulas madre activas de celulas madre humanas y celulas madre altamente activas separadas por el mismo.
CN1778905A (zh) 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法及其应用
CN102861107B (zh) Dc-cik细胞治疗组合物
CN105838674A (zh) 一种免疫抑制剂诱导调节性cd8+t细胞体外扩增的方法
CN107864627A (zh) 包含粘附基质细胞的方法和组合物
CN104762261A (zh) 一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法
US8969079B2 (en) Method for inducing human blood-born hematospheres through aggregate culture and expanding blood adult stem cells and progenitor cells, and stem cell prepared by the same
CN114402065A (zh) 低密度细胞培养
KR20220024422A (ko) 정제된 이중 음성 t 세포 및 이의 제조와 응용
CN102250834A (zh) Delta1转导的OP9细胞共培养体系的方法
US20150353897A1 (en) Method of generating multilineage potential cells
CN112553157B (zh) 一种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法
CN105219717A (zh) 一种一型极化树突状细胞及其诱导方法和应用
WO2023143637A1 (zh) 一种实用型类脑微器官的构建与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20111123