JP2013526839A - 幹細胞免疫変調の使用方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図1
Description
本願は、2009年12月8日出願の特許文献1「幹細胞エデュケーター及び臨床応用」及び2009年12月8日出願の特許文献2「幹細胞の免疫変調及びその分子機構」の恩典を主張するものであり、参照によりこれらの開示の全内容を本明細書に組み入れる。本願はまた、2008年4月7日出願の特許文献3「ヒト臍帯血由来胚様幹細胞の単離」の一部継続出願であり、これも同様に参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。
本発明に用いられる用語は一般に、分子生物学の熟練者により一般に認識されている定義を遵守するものとする。以下に挙げるようないくつかの例外を本発明の範囲内でさらに定義した。
differentiation)」または「多能性(pluripotent)」とは、限定されるものではないが、細胞が、Oct−4、Nanog及びSox−2などの1以上の多能性マーカーについて陽性であること、及びこの細胞が、適当な増殖因子によるなどの適当な刺激の際に、哺乳動物身体のおよそ260の細胞種の少なくともサブセットに分化する能力を有することを指す。
本発明は、胚臍帯血または末梢血から単離された幹細胞集団の使用を開示する。それらは本明細書では臍帯血幹細胞(CB−SC)または末梢血幹細胞(PB−SC)と呼ぶ。本明細書において「臍帯血(umbilical cord blood)」及び「臍帯血(cord blood)」は互換的である。
幹細胞に基づく療法に好適であるべき幹細胞の重要な特徴の1つは、その増殖能である。本明細書において「増殖能」とは、細胞が、限定されるものではないが、Nanogなどの1以上の自己再生マーカーを発現し、かつ、細胞が増殖可能であることを指す。好ましくは、細胞は無限に増殖し得る。本開示において「増殖する」によって意味されるのは、細胞を培養した際に、細胞が増殖し、数を増すことができることである。「増殖する」及び「拡張する」は本明細書において互換的に用いられる。
糖尿病は主要な健康問題である。インスリン産生細胞の欠如が、1型及び2型双方の糖尿病の重大な問題である。幹細胞由来インスリン産生細胞は、合理的な治療ツールとなり得る。この療法の成功の鍵は、倫理的問題と免疫拒絶が無く、入手、選択、培養、拡張及び分化が容易な細胞を特定する必然性である。胚幹細胞と成体幹細胞は双方とも臨床治療薬の潜在的供給源として役立ち得る。しかし、同種の胚幹細胞を適用する場合であっても、免疫系は、ヒト身体の免疫監視のために、外来細胞を認識して攻撃する。従って、自己幹細胞の適用は、潜在的に魅力的な戦略となる。ヒト骨髄及び末梢血が、CD34+造血幹細胞、間葉系幹細胞及び単球由来幹細胞を含む自己幹細胞の作製の有用な供給源となることを示す証拠が増えてきている。
図1は、被験体2から血液を抜き取るための流体コンジット12、ならびにアフェレーシス装置14、幹細胞リアクタ16及び流体リターンコンジット18を備えた、自己免疫障害の処置のための本発明のシステム10を示す。使用時には、血液は、例えば血液ポンプを用いて流体コンジット12を経て被験体から抜き取られ、アフェレーシス装置14により、血液からリンパ球を分離する処置が施される。この血液は、流体リターンコンジット18を経て患者に戻すことができる。分離されたリンパ球は幹細胞リアクタ(「幹細胞エデュケーター」)16へ送られ、そこで、リンパ球集団の一部が、リアクタ16内の幹細胞と相互作用することにより改質される。好ましい一実施形態では、幹細胞はTreg細胞を活性化し、これをリアクタ16から取り出し、例えば流体リターンコンジット18を経て被験体へ戻すことができる。
方法及び材料
5〜6週齢の雌NOD/LtJマウスをJackson Laboratories(Bar Harbor、ME)から購入し、シカゴのイリノイ大学にて病原体不在条件下で維持した。午前9〜11時の間に非空腹時条件下でAscensia ELITE グルコメーター(Bayer Corporation、Elkhart、IN)を用いて血糖値をモニタリングした。体重減少、多尿、及び少なくとも連続2日間にわたる非空腹時血糖値>250mg/dLにより確認された自然発症自己免疫性糖尿病を有する雌糖尿病NOD/LtJマウス(24〜28週齢)を、シカゴのイリノイ大学の動物実験委員会(Animal Care Committee)(ACC)により認可されたプロトコールに従い、処置に用いた。
ヒト臍帯血(60〜120ml/単位/バッグ)をLife−Source Blood Services(Glenview、IL)を購入した。これらは健康なドナーから得られたものであった。本発明者らの研究に用いる臍帯血については、それらが商業的に入手可能なものであるため、本大学からの倫理的認可及びドナーの同意サインの必要はない。ヒト臍帯血由来幹細胞(CB−SC)は従前に記載されているように作製した。簡単に述べれば、臍帯血単核細胞を150×15mmのペトリ皿(Becton Dickinson Labware、Franklin Lakes、NJ、組織培養処置を施されていないペトリ皿)に、1×106細胞/ml、7%ウシ胎仔血清(Invitrogen、Carlsbad、CA)を添加したRPMI 1640培地中、25ml/ペトリ皿で播種し、37℃、8%CO2中でインキュベートした。2〜3週間後、80〜90%の集密度で増殖しているCB−SCを、全ての非接着臍帯単核細胞を除去した後のマウスリンパ球と同時培養した。同時培養のために、6〜8週齢のNODマウス脾臓からマウスリンパ球を単離し、7%ウシ胎仔血清(Invitrogen)を添加した25ml RPMI 1640培地を含有する150×15mmペトリ皿中、CB−SC:リンパ球 1:10の比率でCB−SC上に播種し、8%CO2のインキュベータにて37℃でインキュベートした。2〜4日間同時培養した後、CB−SCの混入が最小の実験とするために懸濁しているリンパ球を回収した(浮遊細胞の1%未満がCB−SCマーカーヒト白血球共通抗原CD45陽性であった)。CB−SCは培養皿に強固に付着し、大きな丸い形態を示すことから、CB−SCからリンパ球を識別すること、及びそれらを回収することは容易である。対照実験では、リンパ球は、CB−SCを含まないこと以外は同一の増殖条件で培養した。
フロー解析及び細胞選別を従前に記載されているように行った。フロー解析のため、細胞を、2.5%ウマ血清(Vector Laboratories)を含有する培地で希釈したラット抗マウスCD16モノクローナル抗体(eBioscience、サンディエゴ、CA)とともに4℃で15分間インキュベートして、Fc受容体を遮断し、非特異的染色を妨げた。細胞を、Alex Fluor(登録商標)647コンジュゲートCD3、FITCもしくはフィコエリトリン(PE)コンジュゲートCD4、FITCコンジュゲートCD25、及び/またはフィコエリトリン−Cy7(PE−Cy7)コンジュゲートCD62Lを含む抗マウスモノクローナル抗体(eBioscience)とともに4℃で45分間インキュベートし、その後PBSで洗浄した後にフロー解析を行った。アイソタイプ適合ラット抗マウスIgG抗体(eBioscience)を陰性対照とした。染色後、細胞をCyAn ADP(DakoCytomation)を用いて分析した。細胞内サイトカイン染色のため、細胞をまず細胞表面抗原に関して染色し(例えば、PEコンジュゲートCD4、FITCコンジュゲートCD25、及びPE−Cy7コンジュゲートCD62L)、その後、BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilizationキット(BD Biosciences、サンホゼ、CA)を用いて調製した。次に、細胞を、FITCコンジュゲートIL−4、Alexa Fluor(登録商標)647コンジュゲートIL−10、Alexa Fluor(登録商標)647コンジュゲートIL−12、パシフィックブルーコンジュゲートIFN−γ(eBioscience)、ビオチン化抗TGF−β1 Ab(カタログ番号BAF240、R & D Systems、ミネアポリス、MN)を含む抗体の種々の組合せで染色した。TGF−β1染色のため、細胞をストレプトアビジン コンジュゲートFITC(Vector Laboratories)で再染色した。Alexa Fluor 647コンジュゲート抗Foxp3はeBioscienceから購入した。種々の細胞集団を単離するための細胞選別では、CB−SC同時培養リンパ球及び対照マウスリンパ球、または新たに単離したマウス脾細胞をまずCD16 AbとインキュベートしてFc受容体結合を遮断し、次に、FITCコンジュゲートCD4及びPE−Cy7コンジュゲートCD62Lなどの抗体の種々の組合せとともに4℃で45分間インキュベートし、MoFlo(DakoCytomation)を用いて細胞選別を行った。集団の純度(>98%)を確認した後、CD4+CD62L+ Tregを回収し、種々のin vitro及びin vivo実験に用いた。
種々のmRNAの発現を定量的リアルタイムPCRにより分析した。全RNAを、Qiagenキット(バレンシア、CA)を用いて抽出した。QuantiTect逆転写キットを製造者の説明書(Qiangen、バレンシア、CA)に従って用い、全RNAから第一鎖cDNAを合成した。各サンプルに対してABI Prism 7900HT FastリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems、CA)を用い、以下の条件下:95℃15分、その後、95℃15分を40回、そして60℃60分で、各遺伝子に関してバリデートされた遺伝子特異的RT2 PCRプライマーセット(SuperArray、フレデリック、MD)を用い、リアルタイムPCRを3反復で行った。内部対照としてのβアクチンに対する各遺伝子の発現レベルを測定した。リアルタイムPCアレイのため、マウスTh1−Th2−Th3 PCRアレイキットを製造者の説明書に従って用いた。これらのデータを、製造者(SuperArray)により提供されている、ウェブに基づくPCRアレイデータ分析ソフトウエアを用いて分析した。
確立された糖尿病NODマウスを処置するため、6〜8週齢の雌NODマウスから単離された脾臓リンパ球を上記のようにCB−SCと同時培養した。2〜4日間同時培養した後、浮遊しているリンパ球を上記のように細胞選別のために回収した。精製CD4+CD62L+ Treg(mCD4CD62L Treg、3×106細胞)を初回用量として100μlPBS/マウス(i.p.、膵臓付近)にて顕性糖尿病NODマウスに腹腔内投与した後、1週間後に100μlPBS/マウス(i.p.、膵臓付近)中、200万の細胞の第2用量を投与した。同容量のPBSを注射した糖尿病マウスを1つの対照とした。CB−SCの不在下でのin vitro培養後のリンパ球生存力の著しい低下のため、CB−SCと同時培養しなかった新しく単離したマウス脾臓リンパ球から選別したCD4+CD62L+ Treg(対照CD4CD62L Treg)をさらなる対照とした。実験が終わるまで、血糖値及び体重を週に2回モニタリングした。処置の開始から3週間後、下記のように糖負荷試験を行った(各群n=3)。処置の開始後7週間目に、重篤な高血糖症(>600mg/dL)及び体重減少(>20%)のために対照マウスを病理目的で犠牲にした。mCD4CD62L Tregで処置した後に糖尿病を示さないマウスも組織学検査のために犠牲にした。インスリンを測定するために、血液サンプルを尾静脈から採取した。超高感度マウスインスリン酵素結合免疫吸着アッセイ(EIA)キット(Alpco Diagnosis、NH)を製造者のプロトコールに従って用い、血中インスリンレベルを測定した。アッセイ感度は0.019ng/mlである。
マウスを一晩(12時間)絶食させ、体重を測定し、グルコースボーラス(2mg/g体重)を腹腔内注射した。次に、グルコース投与後0、10、20、30、45、60、90及び120分時点で尾静脈から採血した。上記のように、全尾静脈血からグルコースレベルを測定した。
膵臓を10%ホルムアルデヒド中で固定し、処置し、パラフィンに包埋した。5μM厚の連続切片を作製した。従前に記載されている方法に軽微な変更を加えて、免疫染色を行った。非特異的染色を遮断するため、切片を2.5%ウマ血清(Vactor Laboratories)を含有するバッファ中、室温で20分インキュベートした。一次抗体としては、モルモットポリクローナル抗インスリンAb(DakoCytomation、カーピンテリア、CA)、マウス抗グルカゴンmAb(Sigma)、マウス抗TGF−β1 mAb(カタログ番号MAB240、潜在型のTGF−β1と25%の交差反応性、TGF−β2とは交差反応性無し、TGF−β3及びTGF−β5と交差反応性<2%、R & D Systems)、マウス抗SMAD4 mAb(Santa Cruz Biotechnology、サンタクルス、CA)、ウサギ抗Ki67 mAb及びラット抗マクロファージマーカーF4/80 mAb(Novus Biologicals、リトルトン、CO)ならびにハムスター抗マウス樹状細胞マーカーCD11c(BD Phanningen)が含まれていた。二次Abとしては、テキサスレッドコンジュゲートAfFiniPureロバ抗モルモットIgG、ローダミンコンジュゲートAffiniPureロバ抗ウサギIgG、AMCA AffiniPureロバ抗ウサギIgG、FITCコンジュゲートAffiniPureロバ抗マウスIgG、及びCy5コンジュゲートAffiniPureロバ抗マウスIgG、AMCA AffiniPureロバ抗アルメニアハムスターIgG、及びCy5コンジュゲートAffiniPureロバ抗ラットIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories、ウエストグローブ、PA)を含んだ。非蛍光染色のため、一次抗体ともにインキュベートした後、細胞をABCキット(Vector Laboratories、バーリンゲーム、CA)を含んだ。ビオチン化ウマ抗ウサギAb及びビオチン化ヤギ抗モルモットAbはVactor Laboratories(バーリンゲーム、CA)から購入した。アイソタイプ適合対照として、マウスIgG1κをBD Biosciencesから、モルモット血清及びウサギIgGをSanta Cruz Biotechnologyから購入した。膵臓スライドについては、本発明者らは免疫染色後にヘマトキシリン(Sigma)対比染色を行った。どの実験にも、アイソタイプ適合抗体を陰性対照として用いた。細胞の写真撮影は、HRP免疫染色画像の場合には、Zeiss Axioskop Histology/Digital蛍光顕微鏡を用いてZeiss Axiocam Colorカメラにて、蛍光画像の場合にはZeiss LSM 510 META共焦顕微鏡を用いて行った。
マウス血漿中のサイトカインレベルを、市販のELISAキットを製造者の説明書に従って用いて定量した。本発明者らはマウスIFN−γ ELISAキットをBiolegend Inc.(サンディエゴ、CA)から、マウスIL−4及びIL−10 ELISAキットをAssay Designs(アナーバー、MI)から、そしてTGF−β1 ELISAキットをPromega(マディソン、WI)から購入した。
マウス調節性リンパ球の調節
T1DにおけるTregの治療能を調べるため、本発明者らは実験的非肥満性糖尿病(NOD)マウスモデルを用いた。まず、本発明者らは、CB−SCとNODマウス脾臓由来リンパ球の同時培養を試験し、CB−SCとの同時培養が種々の比率のCB−SC:リンパ球(1:5、1:10及び1:20)でマウスリンパ球の増殖を有意に刺激せず(図4Aのそれぞれp=0.25、p=0.15、p=0.16)、それはCB−SCとヒトリンパ球の同時培養と同様であることを見出した。データは4回の独立した実験の平均値±s.d.で表した。
次に、顕性糖尿病NODマウス(雌、24〜28週齢)を、T1Dの診断後5〜20日間、mCD4CD62L Treg(計500万細胞/マウス、i.p.、マウスn=8)で処置し、それらの治療能を判定した。同じ細胞量の対照CD4CD62L Treg(i.p.、マウスn=5)とビヒクルPBS(計200μl/マウス、i.p.、マウスn=5)を対照とした。特に、本発明者らは、mCD4CD62L Tregによる処置がこれらの顕性糖尿病マウス(6/8マウス)において正常血糖を回復させることを見出した(図5A)。しかしながら、対照CD4CD62L TregまたはPBSによる処置は糖尿病マウスの高血糖を軽減することはできなかった(それぞれ5/5、5/5マウス)(図5B)。mCD4CD62L Tregで処置した後に正常血糖となった糖尿病マウスも、7週目に非糖尿病NODマウスの場合と同様の糖負荷試験(IPGTT)の改善を示した(図5B)。しかしながら、PBSまたは対照CD4CD62L Tregで処置した糖尿病マウスは、見て取れる下方制御はなく、高いグルコースレベル(>500mg/dL)を維持していた(図5B)。さらに、本発明者らは、mCD4CD62L Treg処置から6週間後に血中インスリンレベルをモニタリングした。結果は、対照CD4CD62L TregまたはPBSビヒクルで処置された糖尿病マウスにおけるインスリンはELISAにより検出不能であることを示した(ELISAキット感度は0.019ng/ml、図5C)。これらのマウスは、動物実験委員会により認可されたプロトコールに従い、重篤な高血糖(BG>600mg/dL)と体重減少(>20%)のために犠牲にしなければならなかった(図5D)。これに対して、mCD4CD62L Tregで処置した糖尿病NODマウスの血中インスリンレベルは有意に上昇した(図5D、p=0.0025)。
mCD4CD62L Tregが自己反応性エフェクターT細胞に対して免疫抑制作用を示すかどうかを確認するため、本発明者らは処置後45日目に膵臓の組織学的分析とインスリン炎のスコア化を行った。組織学的評価は、処置前の糖尿病NODマウスでは、膵島β細胞のおよそ80%(顕著なインスリン炎)が破壊されていたことを示した。処置6週間後、本発明者らは、mCD4CD62L Tregを受容した糖尿病マウスで、膵島の36%で炎症性細胞の浸潤の徴候が全くないか少なく、膵島の20%が軽度のインスリン炎を示し、膵島の1%が中度のインスリン炎を示し、膵島の18%が重度のインスリン炎を有し、膵島のわずか11%が顕著なインスリン炎を示したことを見出した(図6A及び6B)。インスリン炎不在の膵島は小さく、増殖マーカーKi67が陽性であり(データは示されていない)、これらのことは、これらの膵島が新たに生成された可能性があることを示唆する。これに対して、対照CD4CD62L Tregを受容した糖尿病マウスの全ての膵島は、炎症性細胞の大量浸潤と膵臓構造の重大な破壊を示し(図6B)、インスリン陽性細胞の存在は少ないか、全く無かった。同様に、膵臓の組織学的検査は、mCD4CD62L Treg処置に耐性のあった2匹のマウス(2/8マウス)も、観察45日後に顕著なインスリン炎を示したことを実証した(データは示されていない)。代表的なデータは、mCD4CD62L Treg処置に感受性のある、正常血糖の6匹の糖尿病マウス(6/8マウス)からのものである。インスリンに対する免疫染色とヘマトキシリンによる対比染色の後、膵島を、単核細胞浸潤のパーセントに関してスコア化した。
in vitro免疫変調
CB−SCは、NODマウスモデルにおいて、CD4+CD62L+ Tregの機能を変調し、顕性自己免疫性1型糖尿病(T1D)の予防及び逆転をもたらし得る。本発明者らは、有糸分裂促進剤PHAの存在下で、T1D患者のCD4+CD62L+ Tregに対するCB−SCの免疫変調を調べた(図8A及び図8B)。細胞内サイトカイン染色の結果は、対照PHA処置に比べ、CB−SCと同時培養した後のCD4+CD62L+ Tregでは、IL−5レベルが有意に下方制御され(p=0.007)、IL−10及びTGF−1が上方制御されることを示し(それぞれp=0.0018及びp=0.019)、これはNODマウスのCD4+CD62L+ Tregの場合と一致していた。これに対して、IL−4、IL−12及びIFNの発現はCB−SCとの同時培養後も変化しなかった(図8A)。さらに、Tregの特異的マーカーである転写因子Foxp3もまた、対照PHA処置に比べてPHA+CB−SCによる処置後に2.7倍上方制御された(図8B)。従って、これらのデータは、CB−SCがT1D患者のCD4+CD62L+ Tregを変調し得ることを示唆する。
本発明者らは、CB−SCが膜カルボキシペプチダーゼM(CPM)、ブラジキニンB1受容体、及び誘導型酸化窒素シンターゼ(iNOS)を発現することを見出した(図9A)。カルボキシペプチダーゼMにより媒介されるiNOSのアルギニン基質の生成は、マクロファージ及び内皮細胞においてNOの産生を増強することが示された。結果は、NO産生はB1Rアクチベーターdes−Arg 10−ブラジキニン(DAKD)の存在下で増大するが、iNOS特異的阻害剤1400Wまたは選択的B1受容体アンタゴニスト[Des−Arg 10、Leu9]カリジン(DALKD)と組み合わせると阻害されることを示した(図9B及び図9C)。特異的B型カルボキシペプチダーゼ阻害剤である2−メルカプトメチル−3−グアニジノエチルチオプロパン酸(MGTA)による遮断は、CB−SCのNO産生を遮断し、iNOS阻害剤1400Wを用いた場合と同様に、同種リンパ球に対するCB−SCの抑制を逆転させることができる。
Aireは、末梢自己抗原の異所発現及び自己反応性T細胞の欠損を媒介することにより、免疫寛容に重要な役割を果たす。CB−SCの免疫変調の基礎にある分子機構を探るため、本発明者らは、CB−SCが遺伝子レベル(図10A)とタンパク質レベル(図10B)の両面でAireを発現することを見出した。CB−SCにおけるAireは免疫変調に寄与する可能性があることが示唆される。データは3つのCB−SC調製物の代表的なものである。
Claims (54)
- リンパ球を変調し、自己反応性T細胞を抑制するためのバイオリアクタであって、
少なくとも1つの正電荷支持体表面を備えたチャンバと、
その支持体表面に付着された幹細胞の集団と、
チャンバにリンパ球を導入するための流入コンジットと、
幹細胞と同時培養した後に処置済みのリンパ球を抜き取るための流出コンジットと、を備える
ことを特徴とするバイオリアクタ。 - 支持体表面が少なくとも1つのシート層を備える
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - 支持体表面が複数の微小担体を備える
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - 支持体表面が少なくとも1つの透過膜層を備える
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - 支持体表面が疎水性ポリスチレンを備える
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - 幹細胞が支持体表面で少なくとも50%の集密度である
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - 幹細胞が支持体表面で少なくとも80%の集密度である
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - 幹細胞が支持体表面で少なくとも90%の集密度である
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - チャンバが幹細胞とリンパ球の間の細胞間接触を許容する構成である
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - チャンバが幹細胞とリンパ球の間の細胞間接触を妨げる構成である
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - 幹細胞が臍帯血から得られたものである
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - 幹細胞が末梢血から得られたものである
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - 幹細胞がリンパ球に対して同種である
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - 幹細胞がリンパ球に対して自己である
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - 少なくとも106個の幹細胞の集団がチャンバ内に存在する
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - 幹細胞がリンパ球に対して少なくとも1:10の比率でチャンバ内に存在する
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - 幹細胞がチャンバ内の複数の支持体表面層上で培養される
請求項1に記載のバイオリアクタ。 - 自己免疫障害を抑制するためのシステムであって、
被験体から血液を抜き取るための流体コンジットと、
抜き取られた血液からリンパ球を分離するためのアフェレーシス装置と、
幹細胞集団が支持体表面に付着され得るように少なくとも1つの正電荷支持体表面を備えたチャンバ、そのチャンバにリンパ球を導入するための流入コンジット、及び幹細胞と同時培養した後に処置済みのリンパ球を抜き取るための流出コンジットを備えるバイオリアクタと、
処置済みのリンパ球を被験体に戻すための流体コンジットと、を備える
ことを特徴とするシステム。 - バイオリアクタの支持体表面が少なくとも1つのシート層を備える
請求項18に記載のシステム。 - バイオリアクタの支持体表面が複数の微小担体を備える
請求項18に記載のシステム。 - バイオリアクタの支持体表面が少なくとも1つの透過膜層を備える
請求項18に記載のシステム。 - バイオリアクタの支持体表面が疎水性ポリスチレンを備える
請求項18に記載のシステム。 - 支持体表面に付着された幹細胞が少なくとも50%の集密度である
請求項18に記載のシステム。 - 支持体表面に付着された幹細胞が少なくとも80%の集密度である
請求項18に記載のシステム。 - 支持体表面に付着された幹細胞が少なくとも90%の集密度である
請求項18に記載のシステム。 - バイオリアクタのチャンバが幹細胞とリンパ球の間の細胞間接触を許容する構成である
請求項18に記載のシステム。 - バイオリアクタのチャンバが幹細胞とリンパ球の間の細胞間接触を妨げる構成である
請求項18に記載のシステム。 - 支持体表面に付着された幹細胞が臍帯血から得られたものである
請求項18に記載のシステム。 - 支持体表面に付着された幹細胞が末梢血から得られたものである
請求項18に記載のシステム。 - 支持体表面に付着された幹細胞がリンパ球に対して同種である
請求項18に記載のシステム。 - 支持体表面に付着された幹細胞がリンパ球に対して自己である
請求項18に記載のシステム。 - 支持体表面に付着された幹細胞がチャンバ内で少なくとも107個の細胞の集団にまで培養される
請求項18に記載のシステム。 - 支持体表面に付着された幹細胞がチャンバ内に、リンパ球に対して少なくとも1:10の比率で存在する
請求項18に記載のシステム。 - 幹細胞がチャンバ内の複数の支持体表面層上で培養される
請求項18に記載のシステム。 - システムが閉ループ系である
請求項18に記載のシステム。 - 自己反応性T細胞による自己免疫障害を抑制する方法であって、
処置を必要とする被験体から血液を抜き取るステップ、
抜き取られた血液からリンパ球を単離するステップ、
そのリンパ球を幹細胞に曝し、その結果、調節性T(Treg)細胞が活性化されて自己反応性T細胞を抑制するステップ、
処置済みのリンパ球の少なくとも一部を被験体に戻すステップを有する
ことを特徴とする方法。 - 自己免疫障害が糖尿病である
請求項36に記載の方法。 - リンパ球を幹細胞に曝すステップが、
リアクタ内で幹細胞を培養するステップ、
リアクタに被験体のリンパ球を導入するステップを有する
請求項36に記載の方法。 - 幹細胞がリンパ球に対して同種の幹細胞である
請求項38に記載の方法。 - 幹細胞が臍帯血から得られる
請求項38に記載の方法。 - 幹細胞が末梢血から得られる
請求項38に記載の方法。 - 幹細胞が被験体自身の末梢血から得られる自己幹細胞である
請求項41に記載の方法。 - リアクタ内で幹細胞を培養するステップが、
末梢血単核細胞(PBMC)を含む末梢血を回収するステップ、
そのPBMCを培養し、その結果、PBMCが胚様幹細胞に戻るステップ、
胚様幹細胞を単離するステップ、
胚様幹細胞をリアクタの表面に付着させるステップを有する
請求項36に記載の方法。 - リアクタの表面が正味の正電荷を有する
請求項43に記載の方法。 - Treg細胞が、幹細胞によるプログラムされた細胞死リガンド1(PD−L1)の発現により変調される
請求項36に記載の方法。 - Treg細胞が、幹細胞による酸化窒素(NO)の放出により活性化される
請求項36に記載の方法。 - Treg細胞が、幹細胞との細胞間接触により活性化される
請求項36に記載の方法。 - Treg細胞が、リアクタ内の幹細胞により分泌される可溶性因子により活性化される
請求項36に記載の方法。 - Treg細胞が、CD4、CD25、CD62L及びCD69マーカーの発現により特徴付けられる
請求項36に記載の方法。 - 血液を抜き取るステップ及び処置済みのリンパ球を被験体に戻すステップが連続的に行われる
請求項36に記載の方法。 - 被験体の血液が、少なくとも1リットルの被験体の血液を抜き取るのに十分な時間、連続的に処置される
請求項50に記載の方法。 - 前記調節性T(Treg)細胞を、カルボキシペプチダーゼM(CPM)を発現する幹細胞に曝すことにより、前記Treg細胞を活性化する
ことを特徴とする方法。 - 前記調節性T(Treg)細胞を、ブラジキニンB1受容体を発現する幹細胞に曝すことにより、前記Treg細胞を活性化する
ことを特徴とする方法。 - 前記調節性T(Treg)細胞を、自己免疫レギュレーター(AIRE)タンパク質を発現する幹細胞に曝すことにより、前記Treg細胞を活性化する
ことを特徴とする方法。
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