CN109423472A - 体外3d肝脏模型和肠肝共培养模型及其建立方法和应用 - Google Patents

体外3d肝脏模型和肠肝共培养模型及其建立方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种体外3D肝脏模型和肠肝共培养模型及其建立方法和应用，属于药物评价技术领域。该方法包括以下步骤：细胞培养：将HepaRG细胞和人肝星形细胞分别进行细胞培养，备用；细胞诱导：将上述HepaRG细胞接种于培养瓶内进行细胞培养，待HepaRG细胞贴壁生长至预定数量后，更换为诱导培养基进行诱导培养，得到经诱导的HepaRG细胞，备用；模型构建：将经诱导的HepaRG细胞和人肝星形细胞制成混合细胞悬液，接种于预定载体上，培养，得到具肝小球三维结构的微组织，即得3D肝脏模型。该模型具肝小球的肝脏三维结构的微组织，能够很好的模拟体内肝脏的实际生理情况，从而准确预测药物的肝脏毒性。

Description

体外3D肝脏模型和肠肝共培养模型及其建立方法和应用
技术领域
本发明涉及药物评价技术领域，特别是涉及一种体外3D肝脏模型和肠肝共培养模型及其建立方法和应用。
背景技术
药物引起的肝损伤一直是急性肝损伤和上市药撤市的主要原因。但是由于人和动物肝脏功能差异，临床前动物实验很难准确预测药物的代谢和毒性。近年来随着细胞生物学的发展，许多离体人源模型应用于药物肝脏毒性研究，比如人肝微粒体、人肝细胞、原代肝细胞等等。人肝细胞可扩增传代，又具有整体细胞的功能特性被广泛应用于药物毒性筛选，但大部分永生化的肝细胞2D培养丧失了部分人体肝细胞的肝特异性代谢功能，为准确评价药物肝脏代谢带来了困难。原代肝细胞被认为是肝脏离体模型中研究药物毒性和代谢的金标准。
分离后的原代肝细胞的肝特异性基因的表达水平较高，维持肝脏的药物代谢功能。但是人原代肝细胞来源有限，样品差异大，单细胞平板培养不能模拟体内的实际生理情况，且在体外标准2D培养环境中快速丧失肝脏功能，为体外评价药物长期毒性和代谢带来了挑战。现有的体外培养3D模型也多用人原代肝细胞，虽然克服了2D培养的缺点，但也同样受来源有限，样品差异大的缺陷很难大面积推广。
HepaRG是目前全球最为流行的永生化人肝脏细胞，也有研究表明HepaRG细胞可以形成体外3D细胞球或者在支架上形成3D肝模型，在代谢和毒性评价中优势凸显。但是HepaRG单独培养缺少了体内肝脏非实质细胞的相互作用，从而造成体外3D模型稳定性低等，不能形成模拟体内肝组织等一系列问题。
近年来也出现了一系列模型把HepaRG和不同肝非实质细胞共培养来更好的模拟肝脏体内生理结构，然而，依然缺乏全面系统优化评价这些模型在模拟肝脏功能方面的能力及在药物毒性和新材料评价中的应用优势。
另外，小肠吸收和肝脏代谢共同构成了口服类药物进入体内的首过屏障，药物在小肠的吸收代谢对药物肝脏毒性影响巨大。大量研究表明药物在小肠的吸收和代谢占肝脏代谢的15-50％不等，阐明药物小肠吸收代谢是准确研究评价药物体内分布代谢的第一步。小肠吸收模型Caco-2人克隆结肠腺癌细胞是得到美国FDA和欧洲药品管理局EMA广泛认可的评价药物吸收代谢特性的体外模型。大量研究证明Caco-2在预测药物小肠通透方面具有较好的人体相关性。然而小肠吸收代谢后，药物在肝脏的代谢毒性变化的评价，仍然多依赖于动物实验。
由此可知，目前缺乏模拟体内肝脏的实际生理情况，长期维持体内肝脏功能的肝脏模型及该模型与肠道模型的稳定结合，从而缺乏可以高通量准确预测药物肠道吸收和肝脏毒性的体外模型，特别是多次给药和长期给药体外毒性评价。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种体外3D肝脏模型的建立方法，采用该方法建立得到的肝脏模型，能够很好的模拟体内肝脏的实际生理情况，从而准确预测药物的肝脏毒性。
一种体外3D肝脏模型的建立方法，包括以下步骤：
细胞培养：将HepaRG细胞和人肝星形细胞分别进行细胞培养，备用；
细胞诱导：将上述HepaRG细胞接种于培养瓶内进行细胞培养，待HepaRG细胞贴壁生长至预定数量后，更换为诱导培养基进行诱导培养，得到经诱导的HepaRG细胞，备用；
模型构建：将经诱导的HepaRG细胞和人肝星形细胞制成混合细胞悬液，接种于预定载体上，培养，得到具肝小球三维结构的微组织，即得3D肝脏模型。
上述体外3D肝脏模型的建立方法，通过选用HepaRG细胞和人肝星形细胞共培养，人肝星形细胞可通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成，加强肝实质细胞HepaRG细胞的肝内结构的重建，构建得到肝实质细胞与非实质细胞混合培养而模拟体内生理的模型体系，该模型具肝小球的肝脏三维结构的微组织，能够很好的模拟体内肝脏的实际生理情况，从而准确预测药物的肝脏毒性。
在其中一个实施例中，所述细胞培养步骤中，所述HepaRG细胞和人肝星形细胞的培养基均为含2-20％胎牛血清的完全培养基。优选含10％胎牛血清的完全培养基，更优选的RPMI 1640完全培养基。本发明人经过多方探索、比对、筛选后，选用上述培养基，成功地将不同细胞系驯化在一个比较简单的培养体系里面，且具有生长良好的优点。
在其中一个实施例中，所述细胞诱导步骤中，所述诱导培养基为含0.5-3％DMSO(二甲基亚砜)和2-20％胎牛血清的完全培养基。优选含1.5-2.5％DMSO和8-12％胎牛血清的完全培养基，更优选含2％DMSO和10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养基。
在其中一个实施例中，所述细胞诱导步骤中，所述预定数量为HepaRG细胞正常贴壁生长至覆盖瓶底75％～95％的面积。优选80％～90％。
在其中一个实施例中，所述细胞培养的条件为：将细胞置于35-39℃，含4-6％CO2和相对湿度为85-95％的培养箱内培养，培养基每1-3天更换；
所述诱导培养的条件为：将HepaRG细胞置于35-39℃，含4-6％CO2和相对湿度为85-95％的培养箱内培养，培养基每天更换，共进行诱导培养12-16天。
在其中一个实施例中，所述模型构建步骤中，所述混合细胞悬液中HepaRG细胞和人肝星形细胞的数量比为20:1-5:1。优选8:1-12:1，更优选10:1。特定的比例能够使人肝星形细胞和HepaRG细胞更好的相互配合，得到更好的模拟体内生理的模型体系。
在其中一个实施例中，所述模型构建中，所述预定载体为悬滴板，悬滴3D肝脏模型构建的具体方法为：
制备混合细胞悬液：将经过诱导的HepaRG细胞和人肝星形细胞制备为每40μl含6×104-10×104个HepaRG和0.3×104-2.0×104个人肝星形细胞的混合细胞悬液；
接种：将上述混合细胞悬液按照30-50μl/孔的量接种至悬滴板中，并对悬滴板湿度进行控制，降低悬滴体系的液体蒸发；
培养：将上述接种细胞后的悬滴板置于35-39℃，含4-6％CO2和相对湿度为85-95％的培养箱内培养，直至形成微组织；
模型建立：向上述悬滴板中注入培养基，从而将上述微组织转移至收集板中，定时更换培养基，即得悬滴3D肝脏模型；
或者
所述预定载体为球形微孔板，微孔3D肝脏模型构建的具体方法为：
制备混合细胞悬液：将经过诱导的HepaRG细胞和人肝星形细胞制备为每50μl含6×104-10×104个HepaRG和0.3×104-2.0×104个人肝星形细胞的混合细胞悬液；
接种并培养：将上述混合细胞悬液按照30-70μl/孔的量接种至球形微孔板中，并将上述接种细胞后的球形微孔板置于35-39℃，含4-6％CO2和相对湿度为85-95％的培养箱内培养，直至形成微组织；优选按照40-60μl/孔接种至384孔球形微孔板中；
模型建立：更换上述具有微组织的球形微孔板中的培养基，并定时更换培养基，即得形微孔板模型；
或者
所述预定载体为3D培养支架，支架3D肝脏模型构建的具体方法为：
制备混合细胞悬液：将经过诱导的HepaRG细胞和人肝星形细胞制备为每60μl含4×105-6×105个HepaRG和0.2×105-1.2×105个人肝星形细胞的混合细胞悬液；
接种：将上述混合细胞悬液接种于置于细胞培养板孔内的3D培养支架上；
培养：将上述接种细胞后的细胞培养板置于35-39℃，含4-6％CO2和相对湿度为85-95％的培养箱内静置稳定，随后加入培养基浸没所述3D培养支架，孵育预定时间；
模型建立：将上述孵育后的3D培养支架转移至另一细胞培养板中，补充培养基，并定时更换培养基，即得。
上述模型建立步骤中，通过将孵育后的3D培养支架转移至新的细胞培养板中，从而将接种时未成功附着在支架内部而生长在培养板上的细胞去除，消除了其对3D培养系统的影响。
在其中一个实施例中，所述悬滴3D肝脏模型构建中，所述接种步骤中，通过向悬滴板周围通道加入水来降低悬滴体系的液体蒸发；
所述模型建立步骤中，所述向悬滴板中注入的培养基为50-90μL/孔，将上述微组织转移至收集板中后，以150-250转/min离心1-3min，弃去上清，再加入50-90μL培养基，之后培养基每1-3天更换，即得悬滴3D肝脏模型；
所述微孔3D肝脏模型构建中，所述模型建立步骤中，先吸取1/3-2/3的上清液弃去，再加入等量培养基进行更换；
所述支架3D肝脏模型构件中，所述接种步骤中，将所述混合细胞悬液按照15-25μl/孔的量滴加至细胞培养板中，再将3D培养支架置于上述细胞悬液上，随后再按照30-50μl/孔的量将上述混合细胞悬液滴加至所述3D培养支架上，洗吹液体以使所述3D培养支架两侧的细胞接种均匀；所述培养步骤中，所述静置稳定的时间为3-5h，所述孵育预定时间为12-36h。
通过上述具体操作，能够更好的建立3D肝脏模型。
本发明还公开了上述的体外3D肝脏模型的建立方法建立得到的3D肝脏模型。
该3D肝脏模型，具有肝小球三维结构的微组织，能够很好的模拟体内肝脏的实际生理情况，从而准确预测药物的肝脏毒性。
本发明还公开了上述的体外3D肝脏模型在进行体外肝脏毒性评价中的应用。
在其中一个实施例中，所述体外3D肝脏模型在制备用于体外肝脏毒性评价的试剂和/或设备中的应用。
本发明还公开了一种体外肠肝共培养模型的建立方法，包括以下步骤：
建立小肠吸收模型：以Caco-2细胞在Transwell小室中建立小肠吸收模型；
建立肠肝共培养模型：将上述的3D肝脏模型转移至Transwell小室的受池侧，即得肠肝共培养模型。
上述方法建立得到的体外肠肝共培养模型，能够稳定结合，同时可以维持肠道模型的合理通透和肝脏模型功能，成功应用于体外高通量准确预测药物肠通透和肝脏毒性。
在其中一个实施例中，所述建立小肠吸收模型步骤中，先将含2-20％胎牛血清的完全培养基加入Transwell小室的受池侧，再将Caco-2细胞悬液加入至Transwell小室的供给侧，使细胞密度相当于0.5×106-1.5×106cells/1.12cm2，进行细胞培养，至跨膜电阻大于180Ω/cm2，即得小肠吸收模型；
所述建立肠肝共培养模型中，所述3D肝脏模型为悬滴3D肝脏模型时，每1.12cm2小肠模型面积需转移15-25个悬滴3D肝脏模型；所述3D肝脏模型为微孔3D肝脏模型时，每1.12cm2小肠模型面积需转移15-25个微孔3D肝脏模型；所述3D肝脏模型为支架3D肝脏模型时，每1.12cm2小肠模型面积需转移1-2个支架3D肝脏模型。
如使用不同表面积Inserts进行培养时，转移各3D肝脏模型个数随小肠面积改变而按比例增减。
例如：使用24孔培养板/Inserts构建共培养模型(Inserts的表面积为1.12cm2)，如所述3D肝脏模型为悬滴3D肝脏模型，则按照15-25个/孔转移悬滴3D肝脏模型；如所述3D肝脏模型为微孔3D肝脏模型，则按照15-25个/孔转移微孔3D肝脏模型；如所述3D肝脏模型为支架3D肝脏模型，则按照1-2个/孔转移形支架3D肝脏模型。
本发明还公开了上述的体外肠肝共培养模型的建立方法建立得到的体外肠肝共培养模型。
本发明还公开了上述的体外肠肝共培养模型在进行体外肠道吸收和肝脏毒性评价中的应用。
在其中一个实施例中，所述体外肠肝共培养模型在制备用于体外肠道吸收和肝脏毒性评价的试剂和/或设备中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种体外3D肝脏模型的建立方法得到的体外3D肝脏模型，比现有体外3D肝脏培养方法能更好的模拟体内肝脏功能和肝药酶活性，从而准确预测药物在肝脏的代谢毒性变化，特别是多次给药和长期给药体外毒性评价。并能用于合理评价纳米颗粒等新剂型的体内吸收和肝脏毒性情况。
并且，该体外3D肝脏模型还可与肠道模型稳定结合，同时可以维持肠道模型的合理通透和肝脏模型功能，成功应用于体外高通量准确预测药物肠通透和肝脏毒性。
进一步的，上述模型的多种细胞系均成功在相同培养基中混合培养并各自维持较好的功能，使该模型制造成本较低，利于大量的推广应用。
附图说明
图1为未经诱导的HepaRG细胞(20×)；
图2为在含2％DMSO的培养液中诱导培养5天后的HepaRG细胞(20×)；
图3为在含2％DMSO的培养液中诱导培养14天后的HepaRG细胞(40×)；
其中，H表示肝状样细胞，EP表示上皮细胞；
图4为悬滴接种示意图；
图5为收集板附着的微组织(10×)；
图6为长满底孔的微组织(10×)；
图7为支架接种示意图；
图8为支架3D肝脏模型细胞团示意图(40×)，其中，A为Cellusponge支架，B为Go-Matrix支架；
图9 P-gp和MCT在不同培养时间的表达。
图10不同培养时间，白蛋白在2D和3D模型中的表达水平：A为悬滴模型、B为微孔模型、C为GO-Matrix支架、D为CelluSponge支架；
图11不同培养时间，尿素在2D和3D模型中的表达水平：A为悬滴模型、B为微孔模型、C为GO-Matrix支架、D为CelluSponge支架；
图12不同培养时间，CYP3A4在2D和3D模型中的表达水平和经诱导剂处理和经抑制剂CYP3A4活的表达水平：A为悬滴模型、B为微孔模型、C为GO-Matrix支架、D为CelluSponge支架；
图13不同培养时间，CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9和P-gp在3D模型中与在2D模型中的表达水平倍数关系:A为悬滴模型、B为微孔模型、C为GO-Matrix支架、D为CelluSponge支架；
图14不同培养时间，白蛋白在3D肝脏模型和3D肠肝模型中的表达：A为悬滴模型、B为微孔模型、C为GO-Matrix支架、D为CelluSponge支架；其中：该培养时间为肝肠模型建立后的培养时间，而非肝脏模型建立培养时间；
图15不同培养时间，CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9和P-gp在3D肝脏模型和3D肠肝模型中分别与在2D模型中的表达水平倍数关系：A为悬滴模型、B为微孔模型、C为GO-Matrix支架、D为CelluSponge支架。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例中所用试剂、细胞系和材料均为市售。
实施例1
一种体外3D肝脏模型的建立，包括以下步骤：
一、细胞培养。
将HepaRG细胞(来源：ATCC，由广州吉尼欧生物有限公司代购)和人肝星形细胞(Human Hepatic Stellate Cell,HHSC，来源：ScienCell，由北京裕恒丰科技有限公司代购)分别以的RPMI 1640完全培养基(含10％FBS)进行细胞培养，细胞生长良好，备用。
上述细胞在37℃，含5％CO2和相对湿度为90％的培养箱内培养，培养基隔天更换，2天～3天细胞贴壁生长覆盖瓶底80％～90％后传代培养。
二、细胞诱导。
在T150常规培养瓶内每瓶接种2×106个HepaRG细胞，用含10％FBS的1640完全培养基中在37℃，含5％CO2和相对湿度为90％的培养箱内培养，培养基隔天更换。待细胞正常贴壁生长至覆盖瓶底80％～90％后更换新鲜的含2％DMSO和10％FBS的RPMI1640完全培养基，于培养箱内进行诱导培养，培养基每天更换，共进行诱导培养14天。
上述未经诱导的HepaRG细胞形态饱满，折光率好，胞浆清晰可见，细胞-细胞间分辨明显，如图1所示。在含2％DMSO的培养液中培养5天后，细胞逐渐分化成扁平状和颗粒状两种形态，如图2所示。经过14天2％DMSO诱导成扁平状、胞质透明的内皮细胞或颗粒肝脏样细胞，如图3所示。
三、模型构建。
1、悬滴3D肝脏模型构建。
1.1培养材料准备：
①用镊子取出一块加湿垫，于20mL的0.5×PBS中至完全浸润(约5min)。
②将完全浸润的加湿垫置于悬滴底板的蓄水池中。
1.2制备细胞悬液：
HepaRG细胞诱导完成后，用胰酶消化后用培养液终止消化，并于1000rpm离心5min，之后用含10％FBS的RPMI 1640完全培养基制备成密度为4×106cells/mL的HepaRG细胞悬液；预计在HepaRG细胞刚诱导完成时HHSC(人肝星形细胞)能够长至培养瓶的80％～90％，并同时用上述方法制备成密度为4×106cells/mL的HHSC细胞悬液。之后HepaRG细胞悬液和HHSC细胞悬液等体积混合均匀，成密度为(8×104HepaRG+0.8×104HHSC)cells/40μl的混合细胞悬液。
1.3接种：
往悬滴板中轻打接种40μl/孔的混合细胞悬液，形成悬滴，如图4所示，图中悬挂的半圆即表示悬滴。加2ml灭菌水至板周围的通道，增加湿度，从而有效降低悬滴体系的液体蒸发。
1.4培养：
盖上盖子，置于37℃，含5％CO2和相对湿度为90％的培养箱内培养。接种1天后细胞聚集，4天后细胞生长形成微组织。
1.5模型建立：
接种4天后往悬滴板每孔轻打70μL的新鲜含10％FBS的RPMI 1640完全培养基，将微组织转移至低吸附的收集板上，如图5所示，200RCF(转/min)离心2min，弃去上清液更换成70μL的新鲜含10％FBS的RPMI 1640完全培养基，之后继续培养，隔天换液，培养至第5天已长满底孔，之后紧密生长，透光性低，如图6所示，即得悬滴3D肝脏模型。注意，更换上清液的时候枪头应45°倾斜贴住板孔斜壁，缓慢均匀吸出，勿触碰孔底。
该悬滴模型可以用含10％FBS的RPMI 1640完全培养基(隔天换液)维持培养30天而不失去肝小球三维结构和肝脏相关功能。
2、微孔3D肝脏模型构建。
2.1制备细胞悬液：
按照上述方法，将HepaRG细胞和人肝星形细胞制备成密度为(8×104HepaRG+0.8×104HHSC)cells/50μl的混合细胞悬液。
2.2接种并培养：
在384孔低吸附球形微孔板中，每孔中接种50μl混合细胞悬液，置于37℃，5％CO2和相对湿度为90％的培养箱中培养。
接种3天后形成微组织，更换孔中培养基，具体为：从每孔中缓慢吸出25μl上清液，弃去，再缓慢加入25μl新鲜培养基，每天更换培养基。
该微孔模型型可以用含10％FBS的RPMI1640完全培养基(隔天换液)维持培养30天而不失去肝小球三维结构和肝脏相关功能。
3、支架3D肝脏模型构建。
3.1制备混合细胞悬液：
按照上述方法，将HepaRG细胞和人肝星形细胞制备成密度为(5×105HepaRG+0.5×105HHSC)cells/60μl的混合细胞悬液。
3.2接种：
在24孔板的每个孔中心滴加20μl的细胞悬液，将GO-Matrix或CelluSponge支架材料置于细胞悬液的上方(不需提前润湿支架)，预留一些时间(约2min)，使培养基被支架充分吸收。然后在支架的上端再加40μl的细胞悬液，如图7所示，轻轻反复吸吹，确保其两侧细胞接种均一。注意尽量不要吹到气泡到支架内部。
3.3培养：
将上述接种细胞后的细胞培养板置于37℃，5％CO2和相对湿度为90％的培养箱孵育4h。(该步骤可去除支架内部的小气泡，同时有利于细胞稳定)；之后，在每个孔中加500μl的培养基使其浸没支架。培养基勿直接加到支架上，要从每个孔边缘缓慢加入。随后孵育过夜。
3.4模型建立：
将接种好的支架转移至新的培养板中(更换新培养板防止生长在细胞培养板上而未吸附在支架生长的细胞影响实验结果)，补充培养基继续培养，之后隔天换液，随着培养天数的增加，细胞逐渐在支架内部结构中形成细胞团，培养至5天就可以观察到非常明显的细胞团，随着培养时间的增强细胞团逐渐增加，光学显微镜下透光率越来越小，支架3D肝脏模型细胞团如图8所示。
该支架模型可以用含10％FBS的RPMI1640完全培养基(隔天换液)维持培养30天而不失去3D结构和肝脏相关功能。
实施例2
一种体外肠肝共培养模型的建立，包括以下步骤：
一、建立小肠吸收模型。
1、模型建立。
1.1、准备细胞悬液：待MDCKII/Caco-2细胞长至瓶底80％～90％时，用胰酶消化后用培养液终止消化，并于1000rpm离心5min，之后用含10％FBS的RPMI1640完全培养基制备成密度为2×106cells/ml的细胞悬液。
1.2、往Transwell受池侧(底孔)中每孔加入新鲜的含10％FBS的1640空白培养液(保持受池和供给池页面齐平)。
1.3、在供给池侧(Inserts)中每孔加入已制备好的细胞悬液(相当于1×106cells/1.12cm2)。
1.4、置于37℃，5％CO2培养箱中培养，隔天更换培养基。
1.5、培养15天后测定跨膜电阻，之后每隔2天测定一次跨膜电阻。
1.6、待跨膜电阻大于180Ω/cm2时(接种后约21天)，认为其形成小肠吸收模型。通过测定Tanswell的跨膜电阻，当其跨膜电阻稳定在180-220Ω·cm-2时，初步认为Caco-2在Inserts膜上形成了稳定的生物膜；此外，还可利用荧光通透检测的方法(荧光素钠)检测膜表观通透系数为6×10-8cm·s-1以下，每小时通透速率<0.1％，符合小肠吸收生物膜对细胞间隙的标准，对小肠吸收模型进行评价。
2、模型评价。
2.1碱性磷酸酯酶活性实验。
使用AKP试剂盒按说明书步骤分别在Caco-2细胞接种第3、15、21、35天从Transwell膜的两侧取样，测定不同时间段的碱性磷酸酶活力。
结果显示，发现从15天起，小室内的碱性磷酸酶活力明显高于小室外，比值为3.7，说明细胞开始极化。接种22天后，比值升高到6.5，到35天比值一直维持在6以上。
2.2转运体的表达实验。
采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)的方法检测一元羧酸转运蛋白(MCT)和药物外排转运体P-gp的表达，结果如图9所示。
结果显示，Caco-2细胞接种第21后，MCT和P-gp的表达达到稳态，并一直维持到35天。
二、建立肠肝共培养模型。
将上述实施例1已形成的悬滴3D肝脏模型、微孔3D肝脏模型、支架3D肝脏模型转移至受池侧。
其中悬滴3D肝脏模型和微孔3D肝脏模型形成的肝脏微组织收集转移20个/孔，支架3D肝脏模型转移1个/孔。
该共培养模型可以维持在含10％FBS的RPMI1640完全培养基中14天而不丧失小肠和肝脏结构及相关功能。
对比例1
肝脏细胞2D培养模型的建立。
1.制备细胞悬液：
按照1.2中的方法制备成密度为(5×104HepaRG+0.5×104HHSC)cells/ml的混合细胞悬液，备用。
2.接种：
在96孔培养板中每孔接种100μl混合细胞悬液，置于37℃，5％CO2和相对湿度为90％的培养箱中培养。
接种后孵育过夜，细胞贴壁生长，根据需要更换成新鲜的含10％FBS的RPMI 1640完全培养基或者含一定浓度药物的10％FBS的RPMI 1640完全培养基。
将该模型作为3D培养肝细胞功能水平检测和毒性评价应用的对照模型。
实验例1
白蛋白和尿素分泌水平实验。
一、白蛋白分泌水平。
在细胞培养的不同时间点，用白蛋白试剂盒和高内涵荧光标记对实施例1和对比例1中细胞白蛋白表达水平进行了测定。结果如图10所示。
结果显示，实施例1中制备得到的悬滴3D肝脏模型和支架3D肝脏模型培养3天后，白蛋白分泌达到较高的水平，且都显著性高于2D培养水平(相同细胞数2倍以上)。且该水平一直维持到培养30天后。
二、尿素分泌水平。
在细胞培养的不同时间点，用尿素试剂盒对细胞对白蛋白表达水平进行了测定，结果如图11所示。
结果显示，悬滴3D肝脏模型和支架3D肝脏模型培养5天后，尿素分泌达到较高的水平，且都显著性高于2D培养水平(相同细胞数3倍左右)。且该水平一直维持到培养30天后。
上述结果表明本发明的体外3D肝脏模型可以长时间保持高水平白蛋白和尿素分泌，维持其肝脏功能。
实验例2
肝药酶CYP3A4活性实验。
肝药酶活性是影响药物肝毒性的重要因素。为检测3D肝脏模型培养下细胞的代谢能力，本实验通过CYP3A4诱导剂和抑制剂检测细胞在对比例1和实施例1中2D培养和3D模型中肝药酶表达的强弱。用非细胞裂解型CYP3A4检测试剂检测各孔化学发光强度(参照Promega公司产品P450-Glo CYP3A4Assay with Luciferin-IPA试剂盒提供的方法)，结果如图12所示。
结果显示，培养不同时间后，经诱导剂(浓度为100μM的苯妥因钠)处理24h后，3D培养细胞的CYP3A4活性诱导水平均明显高于2D培养的诱导水平。同时经抑制剂(浓度为25μM的酮康唑)处理24h后，CYP3A4活性均受抑制，该诱导抑制能力一直维持到培养30天后才开始下降。
实验例3
主要肝药酶和药物相关转运糖的表达实验。
一、主要肝药酶表达实验。
采用实时荧光定量PCR(RealTime-PCR)的方法(参照Caroline Aninat etal.EXPRESSION OF CYTOCHROMES P450,CONJUGATING ENZYMES AND NUCLEAR RECEPTORSIN HUMAN HEPATOMA HepaRG CELLS.DRUG METABOLISM AND DISPOSITION,Vol.34,No.1,34:75–83,2006方法)检测实施例1和对比例1不同肝脏模型中肝药酶(CYP3A4、CY2B6、CY2C9)的表达倍数关系。结果如图13所示。
结果显示，3D肝脏模型中CYP3A4、CY2B6、CY2C9的表达均显著性高于2D平面培养得到的细胞系，而且可以维持到培养30天。
二、药物相关转运糖的表达实验。
采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)的方法检测实施例1和对比例1不同肝脏模型中药物外排转运蛋白P-gp的表达倍数关系。结果如图13所示。
结果显示，2D培养得到的细胞系，由于缺少细胞极化而缺乏转运蛋白P-gp的表达。转运蛋白P-gp的表达在培养6天后达到峰值，而且维持的到培养30天。
实验例4
实施例2的体外肠肝共培养模型建立后，分别在建模后3、7、10、14天对上述各评价指标进行了深入研究。
实验结果表明肠道tranwells模型和肝脏悬滴及支架模型共培养14天，对两个模型的功能都无明显影响。具体结果如下：
1)白蛋白分泌结果如图14所示，共培养模型肝脏白蛋白和尿素分泌水平与肝脏3D模型单独培养无显著性差异，且可以维持高水平分泌到共培养14天。。
2)结果如图15所示，共培养模型肝脏CYP3A4、CY2B6、CY2C9和P-gp的表达与肝脏3D模型单独培养无显著性差异，且可以维持高水平表达到共培养14天。
3)共培养期间，小肠跨膜电阻稳定维持在200Ω·cm-2以上，利用荧光通透检测的方法(荧光素钠)检测膜表观通透系数维持在6×10-8cm·s-1以下，共培养对小肠通透无明显影响。
4)碱性磷酸酶活力的结果也显示小肠细胞在14天共培养下依然维持在高度极化的状态。小室内的碱性磷酸酶活力明显高于小室外，比值一直维持在6以上。
5)MCT和P-pg的表达与单独小肠培养也无显著性差异。MCT的表达与单独小肠培养MCT的表达比值维持在0.9-1.2之间，P-gp表达比值维持在0.8-1.2之间。
实验例5
体外3D肝脏模型的应用优势。
体外3D肝脏模型能模拟体内细胞生长环境和肝药酶表达体系，保持较长时间的良好肝功能状态，相对于体外2D模型而言在新药研发过程中有独特的优势，可作为药物非临床安全性评价中对药物肝毒性的筛选模型。
在悬滴3D肝脏模型肝功能稳定时，即接种后第7天，将培养基更换成含不同浓度肝毒性阳性药的10％FBS的RPMI 1640完全培养基，其中药物浓度分别为：
异烟肼及对乙酰氨基酚：100、200、400、600、800和1000μM；
大黄素：0.5、1、3.125、6.25、12.5和25μg/ml；
雷公藤甲素：0.5、1、5、12.5、32和62.5ng/ml；
没食子酸：50、80、100、120、150和200μM。
按同样的方法和药物浓度在悬滴3D肝脏模型上共给药3次，每次48h，共给药6天后检测其ATP发光强度，得出其IC50值。由于2D模型无法培养超过48h-72h还能保持较佳的功能水平，因此，仅能在2D模型上给药1次，孵育24h后同样的方法检测并得出IC50值。
结果显示在2D模型上给予异烟肼和对乙酰氨基酚，肝细胞IC50>1000μM，均没有显现明显的细胞毒性。这是由于这些药物的肝脏毒性与其代谢产物相关，而2D模型药物代谢能力低且不能长期给药造成无法对其毒性进行显著性评价。因此，常规实验证明异烟肼和对乙酰氨基酚肝脏毒性阳性药在2D肝脏培养难以得出具有肝脏毒性的实验结论。
而利用本发明的悬滴3D肝脏模型给药，得出异烟肼IC50＝600.7μM、对乙酰氨基酚IC50＝539.7μM。进一步对中药单体肝脏毒性进行系统评价大黄素IC50＝4.6μg/mL、雷公藤甲素IC50＝6.6ng/mL、没食子酸IC50＝142.9μM、芫花素IC50＝116.9μg/mL。
实验例6
体外肠肝共培养模型应用优势。
口服药物要经过小肠吸收代谢才能进入肝脏引起肝毒性。这也是很多常规体外肝脏模型评价药物产生假阳性结果的主要原因。
本发明的体外肠肝共培养模型既模拟了体内肠道的屏障和代谢作用，同时结合3D肝脏模型能模拟体内实际生理情况，可作为药物非临床安全性评价中对药物肠肝毒性的筛选模型。
比如没食子酸为中药的常见成分。如单用肝细胞模型评价会发现其会造成一定的肝脏细胞损伤和凋亡，肝脏3D模型得出没食子酸的IC50＝142μM。然而通过本发明的体外肠肝共培养模型进行评价，即在Transwell小室内分布给予没食子酸10、100、200、400、600、800和1000μM，孵育24h后，利用HPLC检测没食子酸的通透率和3D肝脏暴露水平。
结果发现，没食子酸的肠道吸收非常低(24小时<1％)，即在1000μM的浓度下，3D肝脏的没食子酸暴露小于10μM，远低于IC50值。因此经过小肠吸收后，无法明显观察到没食子酸的肝脏毒性。该结果与大部分临床结果类似，正常剂量下服用含有没食子酸的中药，并不会引起明显的肝脏毒性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (16)

1.一种体外3D肝脏模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
细胞培养：将HepaRG细胞和人肝星形细胞分别进行细胞培养，备用；
细胞诱导：将上述HepaRG细胞接种于培养瓶内进行细胞培养，待HepaRG细胞贴壁生长至预定数量后，更换为诱导培养基进行诱导培养，得到经诱导的HepaRG细胞，备用；
模型构建：将经诱导的HepaRG细胞和人肝星形细胞制成混合细胞悬液，接种于预定载体上，培养，得到具肝小球三维结构的微组织，即得3D肝脏模型。
2.根据权利要求1所述的体外3D肝脏模型的建立方法，其特征在于，所述细胞培养步骤中，所述HepaRG细胞和人肝星形细胞的培养基均为含2-20％胎牛血清的完全培养基。
3.根据权利要求2所述的体外3D肝脏模型的建立方法，其特征在于，所述细胞诱导步骤中，所述诱导培养基为含0.5-3％DMSO和2-20％胎牛血清的完全培养基。
4.根据权利要求1所述的体外3D肝脏模型的建立方法，其特征在于，所述细胞诱导步骤中，所述预定数量为HepaRG细胞正常贴壁生长至覆盖瓶底75％～95％的面积。
5.根据权利要求1所述的体外3D肝脏模型的建立方法，其特征在于，所述细胞培养的条件为：将细胞置于35-39℃，含4-6％CO2和相对湿度为85-95％的培养箱内培养，培养基每1-3天更换；
所述诱导培养的条件为：将HepaRG细胞置于35-39℃，含4-6％CO2和相对湿度为85-95％的培养箱内培养，培养基每天更换，共进行诱导培养12-16天。
6.根据权利要求1所述的体外3D肝脏模型的建立方法，其特征在于，所述模型构建步骤中，所述混合细胞悬液中HepaRG细胞和人肝星形细胞的数量比为20:1-5:1。
7.根据权利要求1-6任一项所述的体外3D肝脏模型的建立方法，其特征在于，所述模型构建中，所述预定载体为悬滴板，悬滴3D肝脏模型构建的具体方法为：
制备混合细胞悬液：将经过诱导的HepaRG细胞和人肝星形细胞制备为每40μl含6×104-10×104个HepaRG和0.3×104-2.0×104个人肝星形细胞的混合细胞悬液；
接种：将上述混合细胞悬液按照30-50μl/孔的量接种至悬滴板中，并对悬滴板湿度进行控制，降低悬滴体系的液体蒸发；
培养：将上述接种细胞后的悬滴板置于35-39℃，含4-6％CO2和相对湿度为85-95％的培养箱内培养，直至形成微组织；
模型建立：向上述悬滴板中注入培养基，从而将上述微组织转移至收集板中，定时更换培养基，即得悬滴3D肝脏模型；
或者
所述预定载体为球形微孔板，微孔3D肝脏模型构建的具体方法为：
制备混合细胞悬液：将经过诱导的HepaRG细胞和人肝星形细胞制备为每50μl含6×104-10×104个HepaRG和0.3×104-2.0×104个人肝星形细胞的混合细胞悬液；
接种并培养：将上述混合细胞悬液按照30-70μl/孔的量接种至球形微孔板中，并将上述接种细胞后的球形微孔板置于35-39℃，含4-6％CO2和相对湿度为85-95％的培养箱内培养，直至形成微组织；
模型建立：更换上述具有微组织的球形微孔板中的培养基，并定时更换培养基，即得微孔3D肝脏模型；
或者
所述预定载体为3D培养支架，支架3D肝脏模型构建的具体方法为：
制备混合细胞悬液：将经过诱导的HepaRG细胞和人肝星形细胞制备为每60μl含4×105-6×105个HepaRG和0.2×105-1.2×105个人肝星形细胞的混合细胞悬液；
接种：将上述混合细胞悬液接种于置于细胞培养板孔内的3D培养支架上；
培养：将上述接种细胞后的细胞培养板置于35-39℃，含4-6％CO2和相对湿度为85-95％的培养箱内静置稳定，随后加入培养基浸没所述3D培养支架，孵育预定时间；
模型建立：将上述孵育后的3D培养支架转移至另一细胞培养板中，补充培养基，并定时更换培养基，即得。
8.根据权利要求7所述的体外3D肝脏模型的建立方法，其特征在于，所述悬滴3D肝脏模型构建中，所述接种步骤中，通过向悬滴板周围通道加入水来降低悬滴体系的液体蒸发；
所述模型建立步骤中，所述向悬滴板中注入的培养基为50-90μL/孔，将上述微组织转移至收集板中后，以150-250转/min离心1-3min，弃去上清，再加入50-90μL培养基，之后培养基每1-3天更换，即得悬滴3D肝脏模型；
所述微孔3D肝脏模型构建中，所述模型建立步骤中，先吸取1/3-2/3的上清液弃去，再加入等量培养基进行更换；
所述支架3D肝脏模型构件中，所述接种步骤中，将所述混合细胞悬液按照15-25μl/孔的量滴加至细胞培养板中，再将3D培养支架置于上述细胞悬液上，随后再按照30-50μl/孔的量将上述混合细胞悬液滴加至所述3D培养支架上，洗吹液体以使所述3D培养支架两侧的细胞接种均匀；所述培养步骤中，所述静置稳定的时间为3-5h，所述孵育预定时间为12-36h。
9.权利要求1-8任一项所述的体外3D肝脏模型的建立方法建立得到的3D肝脏模型。
10.权利要求9所述的体外3D肝脏模型在进行体外肝脏毒性评价中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述体外3D肝脏模型在制备用于体外肝脏毒性评价的试剂和/或设备中的应用。
12.一种体外肠肝共培养模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
建立小肠吸收模型：以Caco-2细胞在Transwell小室中建立小肠吸收模型；
建立肠肝共培养模型：将权利要求9所述的3D肝脏模型转移至Transwell小室的受池侧，即得肠肝共培养模型。
13.根据权利要求12所述的体外肠肝共培养模型的建立方法，其特征在于，
所述建立小肠吸收模型步骤中，先将含2-20％胎牛血清的完全培养基加入Transwell小室的受池侧，再将Caco-2细胞悬液加入至Transwell小室的供给侧，使细胞密度相当于0.5×106-1.5×106cells/1.12cm2，进行细胞培养，至跨膜电阻大于180Ω/cm2，即得小肠吸收模型；
所述建立肠肝共培养模型中，所述3D肝脏模型为悬滴3D肝脏模型时，每1.12cm2小肠模型面积需转移15-25个悬滴3D肝脏模型；所述3D肝脏模型为微孔3D肝脏模型时，每1.12cm2小肠模型面积需转移15-25个微孔3D肝脏模型；所述3D肝脏模型为支架3D肝脏模型时，每1.12cm2小肠模型面积需转移1-2个支架3D肝脏模型。
14.权利要求12-13任一项所述的体外肠肝共培养模型的建立方法建立得到的体外肠肝共培养模型。
15.权利要求14所述的体外肠肝共培养模型在进行体外肠道吸收和肝脏毒性评价中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述体外肠肝共培养模型在制备用于体外肠道吸收和肝脏毒性评价的试剂和/或设备中的应用。
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