CN113337454A - 3d肝纤维化模型的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了3D肝纤维化模型的构建方法及其应用。该肝纤维化模型的构建方法包括采用刀豆蛋白和TGF‑β1处理类肝组织球体,获得肝纤维化模型。该肝纤维化模型能够特异性引起I型胶原基因表达上调。
Description
技术领域
本发明涉及疾病模型的技术领域,尤其是涉及3D肝纤维化模型的构建方法及其应用。
背景技术
肝脏作为机体重要的代谢场所,常暴露于各种外源性物质及其代谢产物,容易受到损伤。肝纤维化的发生往往与肝脏的损伤密切相关,肝纤维化是由多细胞、多因子共同参与的复杂病理进程,是各种急慢性肝损伤引起的炎症反应和细胞外基质在肝脏中过度累积为主要修复特点的病理过程。肝纤维化的发生与肝脏受损紧密相连,内源性(细胞因子、代谢物)和外源性(疾病、毒性物质)的刺激会损伤肝脏组织,促使损伤组织周围的上皮和内皮细胞分泌损伤相关的趋化因子、细胞因子以及损伤相关分子模式信号等,从而增加血管通透性以及免疫细胞浸润以及激活一系列纤维发生细胞如:纤维母细胞、纤维细胞和肝星状细胞。纤维发生细胞激活增殖为肌成纤维细胞,其增殖和迁移能力与母细胞相比都有很大提高,高度表达纤维化基因和蛋白,并大量堆积细胞外基质形成瘢痕,最后导致肝纤维化的发生和延续。在大多数类型的肝损伤中,肝星状细胞(HSC)被公认为主要的瘢痕形成细胞类型,是影响肝纤维化最主要的细胞。肝损伤后,HSC被激活,从静止的储存维生素A的肝星状细胞转变为增殖的纤维性肌成纤维细胞样细胞。
目前对肝纤维化的研究都停留在动物和2D细胞水平,虽然传统的2D细胞培养系统在研究细胞行为和模型建立的可能机制方面是有效的,但在维持细胞行为方面存在局限性。并且从CCl4(四氯化碳)、CBDL(胆总管结扎)诱导的肝纤维化小鼠肝脏中分离出的原代活化HSC与培养诱导活化的HSC基因表达谱比较表明,培养诱导HSC激活并不能概括体内HSC激活,mRNA表达谱更是清楚地显示了体外和体内肝星状细胞激活之间的差异。另外,将新鲜分离出HSC在硬支架(12kPa)条件下培养可获得其激活的成纤维细胞表型,而在软支架(0.4kPa)则保持静止状态,普通组织培养皿的硬度为10000kPa,这表明了HSC体外激活研究环境并不理想。同时在肝纤维化领域,由于药物开发期间安全风险评估的重要性,体外肝培养领域的大多数研究都集中在肝细胞单一培养系统的开发及其在药物开发的早期阶段对药物性肝损伤(DILI)的潜力,并没有主要解决肝纤维化相关问题。
发明内容
目前,3D技术的出现确实扭转了传统2D细胞培养的局面,也克服了2D细胞层面的许多表观和遗传上的问题,为细胞多样化和深层次的研究提供了条件基础,但是现在的3D细胞球体技术大多都局限于单细胞的培养和筛选,往往会忽略了细胞存在于生物内环境中,不仅仅受相同细胞的影响,还有相邻细胞及其生存的环境。而肝纤维化是由多细胞共同参与的长期复杂生理作用下发生的,因此在研究体外肝纤维化模型时,应至少保证有肝细胞与肝星状细胞的参与。
本发明提供了一种肝纤维化模型的构建方法,包括采用刀豆蛋白和TGF-β1处理类肝组织球体,获得肝纤维化模型。
可选地,根据上述的构建方法,包括:
(1)将所述刀豆蛋白加入至培养所述类肝组织球体的培养基,培养所述类肝组织球体12小时;
(2)在完成步骤(1)后,将所述TGF-β1加入至所述培养基,培养所述类肝组织球体24小时获得所述肝纤维化模型。
可选地,根据上述的构建方法,步骤(1)中,所述刀豆蛋白在所述培养基中的浓度为0.3125-1.25μM。
可选地,根据上述的构建方法,步骤(2)中,所述TGF-β1在所述培养基中的浓度为10ng/mL。
可选地,根据上述的构建方法,所述类肝组织球体采用如下步骤制各:
将肝细胞和肝星状细胞在装有培养基的圆底孔板中悬浮培养至少72小时获得所述类肝组织球体。
所述肝细胞可为肝细胞样Hepa RG细胞,所述肝星状细胞可为人源性LX-2肝星状。所述圆底孔板可为96孔圆底孔板(康宁公司,货号3799)。
可选地,根据上述的构建方法,所述肝细胞与所述肝星状细胞的总细胞数量为1000,所述肝细胞与所述肝星状细胞的数量比例为1∶3。
所述肝细胞可由Hepa RG细胞参考文献Laurent V,Glaise D,Nübel T,Gilot D,Corlu A,Loyer P.Highly efficient SiRNA and gene transfer into hepatocyte-likeHepaRG cells and primary human hepatocytes:new means for drug metabolism andtoxicity studies.Methods Mol Biol.2013;987:295-314.doi:10.1007/978-1-62703-321-3_25.PMID:23475687.中的方法诱导制备。
所述肝星状细胞可由人肝星状细胞在低血清条件下自发形成的。
例如,肝纤维化模型的构建方法包括:
(1)肝细胞样Hepa RG细胞和人源性LX-2肝星状细胞在培养基中悬浮培养至少72小时获得类肝组织球体,所述培养基可为Williams’E培养基(含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1%谷氨酰胺);
(2)将步骤(1)中的培养基更换为无血清培养基,培养所述类肝组织球体24小时,所述无血清培养基可为无血清Williams’E培养基;
(3)在步骤(2)中的所述无血清培养基中加入刀豆蛋白,培养所述类肝组织球体12小时;
(4)在步骤(3)中的所述无血清培养基中加入TGF-β1,培养所述类肝组织球体24小时,获得所述肝纤维化模型。
上述的构建方法制备的肝纤维化模型及其应用也属于本发明的保护范围之内。所述应用为在肝纤维化致病机理研究中的应用或在制备筛选治疗肝纤维化药物的产品中的应用。
本发明还提供了一种用于构建肝纤维化模型的组合物,所述组合物包括刀豆蛋白和TGF-β1。例如,所述刀豆蛋白和TGF-β1的比例为0.625-2.5mmol∶20ng。刀豆蛋白和TGF-β1均可为独立包装。
本发明实施例采用细胞共培养技术建立了体外3D类肝组织球体,明确了建立类肝组织球体所需条件,并联合KA和TGF-β1共同作用建立体外肝纤维化模型,特异性引起I型胶原蛋白表达增加。
本发明实施例建立的肝纤维化模型能弥补传统2D细胞的体外肝纤维化模型不足,并且特异性引起肝纤维化基因Collagen I的表达增加,建立了一种全新的具有特异性的肝纤维化模型
本发明实施例中3D肝球体培养方法是使用超低吸附、非粘附材料的96圆底孔板,让细胞能悬浮于培养基中,细胞间自然聚集从而形成球体,此方法简单快捷,无需冗杂的操作,只需将细胞混合置于孔板中于适宜培养条件下即可。采用肝细胞和肝星状细胞按一定比例和数量共培养后,得到实验所需的类肝组织球体。
本发明首次建立了特异性引起I型胶原基因表达上调所致的体外3D肝纤维化模型,能特异性针对I型胶原蛋白的表达来筛选抗肝纤维化药物,和针对性研究引起I型胶原基因表达的相关机制研究,此模型具有很大的研究前景,为临床抗肝纤维化药物开发提供模型基础。
附图说明
图1A为实施例1A组成球情况。
图1B为实施例1B组成球情况。
图1C为实施例1C组成球情况。
图1D为实施例1D组成球情况。
图1E为实施例1E组成球情况。
图2为实施例1 LX-2与Hepa RG细胞成球稳定性考察。
图3A为实施例2 RT-qPCR检测结果。
图3B为实施例2各组类肝组织球体显微镜照片。
图4A为实施例2各组的细胞球体高内涵染色。
图4B为实施例2各组的细胞球体高内涵染色。
图4C为实施例2 westernblot检测结果。
图5A为实施例3 Hepa RG细胞球体的细胞活力检测。
图5B为实施例3 LX-2细胞球体的细胞活力检测。
图5C为实施例3 Hepa RG细胞与LX-2细胞共培养球体的细胞活力检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
采用GraphPad Prism5.0(GraphPad Software,San Diego RRID:SCR_002798)统计软件对数据进行处理,实验结果以平均值士标准偏差表示,采用One-way ANOVA检验。
下述实施例中所使用的肝细胞样Hepa RG细胞由Hepa RG细胞(上海泽叶生物科技有限公司,ZY554)诱导分化获得,诱导分化方法参考文献LaurentV,Glaise D,Nübel T,Gilot D,Corlu A,Loyer P.Highly efficient SiRNA and gene transfer intohepatocyte-like HepaRG cells and primary human hepatocytes:new means for drugmetabolism and toxicity studies.Methods Mol Biol.2013;987:295-314.doi:10.1007/978-1-62703-321-325.PMID:23475687.。具体诱导分化方法包括将刚复苏的HepaRG细胞用含人工重组胰岛素(5ug/mL),50μM琥珀酸氢化可的松的WE完全培养基于孵箱37℃,5%二氧化碳条件培养2周,期间不可传代,只换液。2周后,将培养基更换为含2%DMSO的上述培养基继续培养2周即可获得肝细胞样Hepa RG细胞,同样地,期间不可传代,只换液。肝细胞样Hepa RG细胞培养基为完全Williams’E培养基,其是向Williams’E培养基中加入FBS、青霉素、链霉素和谷氨酰胺得到的培养基,完全Williams’E培养基中,FBS的含量为10%(体积百分含量),青霉素的含量为5,000UI/mL,链霉素的含量为5,000mg/mL,谷氨酰胺的含量是2mM。肝细胞样Hepa RG细胞是通过肝癌细胞进行诱导肝功能相关酶分化的一种肝功能高表达的肝实质细胞,其结构和功能都与原代肝细胞接近,胜于LO2和Hepa G2肝细胞系。
下述实施例中所使用的人源性LX-2肝星状细胞(上海钰博生物科技有限公司,YB-H3614)是人肝星状细胞在低血清条件下自发形成的,其表型和功能都很好的保存遗传下来,特别是导致肝纤维化相关基因表达和代谢维生素A功能与原细胞系相比都较相近。人源性LX-2肝星状细胞培养基为标准DMEM培养基(是向DMEM中加入FBS、青霉素和链霉素得到的培养基,标准DMEM培养基中,FBS的含量为10%(体积百分含量),青霉素的含量为100U/mL,链霉素的含量为10μg/mL)。
刀豆蛋白(Kongensin A,KA)是中药刀豆中的一种蛋白质成分,CAS号885315-96-8,购买于MCE,货号为HY-N3417。
TGF-β1购买于PeproTech,货号为AF-100-21C。
无血清Williams’E培养基为除10%胎牛血清之外的上述完全Williams’E培养基。
实施例1、类肝组织球体的制备
1.不同数量和比例的LX-2细胞与Hepa RG细胞成球性筛选
传代后的人源性LX-2肝星状细胞和肝细胞样Hepa RG细胞按相同数量、不同比例和相同比例、不同数量进行共培养成球性筛选,以成球性优劣和球体直径(小于200um)作为直接筛选条件。
以培养细胞总数量分为A组(16000个培养细胞/孔)、B组(8000个培养细胞/孔)、C组(4000个培养细胞/孔)、D组(2000个培养细胞/孔)和E组(1000个培养细胞/孔)。A-E组中以肝细胞样Hepa RG细胞和人源性LX-2肝星状细胞数量比例1∶0、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和0∶1分别培养,每种数量比例重复培养3孔。
培养载体采用96孔圆底孔板(康宁公司,货号3799),此孔板能让细胞悬浮于培养基中,混合培养的细胞在此环境中能自发聚集成球,肝星状细胞成球性好聚集在球体内部,肝细胞则包被在肝星状细胞球体外。细胞培养基采用完全Williams’E培养基,培养当天每孔添加培养基130μl,培养第四天补加20μl,培养第六天补加20μl。37℃、5%CO2孵箱中,培养时间为七天。
结果如图1A-图1E,每张图下方比例为肝细胞样Hepa RG细胞和人源性LX-2肝星状细胞数量比例。经过横向和纵向比较筛选,发现当LX-2细胞与Hepa RG细胞共培养数量为1000个细胞/孔,比例为3∶1时,成球性好,球体直径接近并不超过200um。
2.LX-2与Hepa RG细胞成球稳定性考察
按上述筛选出的最佳方案,将传代后的人源性LX-2肝星状细胞和肝细胞样HepaRG细胞以1000个/孔,比例为3∶1种于96孔板中,采用的96孔板、培养基及用量与“1.不同数量和比例的LX-2细胞与Hepa RG细胞成球性筛选”中相同。种板后将孔板置于摇床上600RPM,2Min,振摇混匀。然后每孔补加30ul培养基,置于37℃、5%CO2孵箱中,前三天不用补液,避免在补液操作过程中影响细胞成球。在第四天,每孔补液(即完全Williams’E培养基)20ul,此后每隔一天补液。分别于第一、三、五、七天于显微镜下观察成球情况。
结果参见图2,种板后第一天(Day1-Day2)细胞明显聚集在一起,并无规则性;第三天(Day3-Day4)细胞明显成球,但球体边缘仍有些不规整;第五天和第七天(Day5-Day7)都为规则的球体,可以作为类肝组织球体用于实验。
下述实施例中的类肝组织球体按照如下方法制备:将肝细胞样Hepa RG细胞和人源性LX-2肝星状细胞按照1∶3的个数比在96孔圆底孔板(康宁公司,货号3799)以1000个细胞/孔的密度(即肝细胞样Hepa RG细胞的含量为250个细胞/孔,人源性LX-2肝星状细胞的含量为750个细胞/孔)在完全Williams’E培养基中,再在37℃、5%CO2孵箱中,培养七天得到类肝组织球体。
实施例2、体外类肝组织球体肝纤维化模型的建立
采用实施例1“2.LX-2与Hepa RG细胞成球稳定性考察”中的方法将人源性LX-2肝星状细胞和肝细胞样Hepa RG细胞共培养成球。培养第六天采取半量换液的方式,给予无血清Williams’E培养基,第七天给药建立模型。
将类肝组织球体分为10组,分别为:空白组(1)、TGF-β1组(2)、APAP(对乙酰氨基酚)阳性模型组(3)、APAP阳性模型+TGF-β1组(4)、肝损伤药物低浓度组(5)、肝损伤药物低浓度+TGF-β1组(6)、肝损伤药物中浓度组(7)、肝损伤药物中浓度+TGF-β1组(8)、肝损伤药物高浓度组(9)、肝损伤药物高浓度+TGF-β1组(10),每组重复4孔。APAP用无血清Williams’E培养基配制成APAP的浓度为20mM的APAP溶液。肝损伤药物为KA(刀豆蛋白),用无血清Williams’E培养基将KA分别配制成KA的浓度分别为0.625uM的低浓度KA溶液、1.25uM的中浓度KA溶液、2.5uM的高浓度KA溶液。TGF-β1用无血清Williams’E培养基配制成TGF-β1的浓度为20ng/mL的TGF-β1溶液。
空白组(1)用无血清Williams’E培养基进行半量换液培养12h后,用无血清Williams’E培养基进行半量换液再培养24h;
TGF-β1组(2)用无血清Williams’E培养基进行半量换液培养12h后,用TGF-β1溶液进行半量换液给予TGF-β1(培养体系中的TGF-β1的含量为10ng/mL)进行药物处理24h;
APAP(对乙酰氨基酚)阳性模型组(3)用上述APAP溶液进行半量换液,进行药物处理(培养体系中的APAP含量为10mM)12h后,用无血清Williams’E培养基进行半量换液培养处理24h;
APAP阳性模型+TGF-β1组(4)用上述APAP溶液进行半量换液,进行药物处理(培养体系中的APAP含量为10mM)12h后,用TGF-β1溶液进行半量换液给予TGF-β1进行药物处理(培养体系中的TGF-β1的含量为10ng/mL)24h;
肝损伤药物低浓度组(5)用上述低浓度KA溶液进行半量换液,进行药物处理(培养体系中的KA含量为0.3125μM)12h后,用无血清Williams’E培养基进行半量换液培养处理24h;
肝损伤药物低浓度+TGF-β1组(6)用上述低浓度KA溶液进行半量换液,进行药物处理(培养体系中的KA含量为0.3125μM)12h后,用TGF-β1溶液进行半量换液给予TGF-β1进行药物处理(培养体系中的TGF-β1的含量为10ng/mL)24h;
肝损伤药物中浓度组(7)用上述中浓度KA溶液进行半量换液,进行药物处理(培养体系中的KA含量为0.625μM)12h后,用无血清Williams’E培养基进行半量换液培养处理24h;
肝损伤药物中浓度+TGF-β1组(8)用上述中浓度KA溶液进行半量换液,进行药物处理(培养体系中的KA含量为0.625μM)12h后,用TGF-β1溶液进行半量换液给予TGF-β1进行药物处理(培养体系中的TGF-β1的含量为10ng/mL)24h;
肝损伤药物高浓度组(9)用上述高浓度KA溶液进行半量换液,进行药物处理(培养体系中的KA含量为1.25μM)12h后,用无血清Williams’E培养基进行半量换液培养处理24h;
肝损伤药物高浓度+TGF-β1组(10)用上述高浓度KA溶液进行半量换液,进行药物处理(培养体系中的KA含量为1.25μM)12h后,用TGF-β1溶液进行半量换液给予TGF-β1进行药物处理(培养体系中的TGF-β1的含量为10ng/mL)24h。
分别于药物处理12h、36h时在显微镜下观察球体外观变化,药物和TGF-β1协同作用24h(即药物处理36h)后,收集各组类肝组织球体,采用RT-qPCR定量检测肝纤维化相关基因表达情况,以GAPDH为内参,检测的肝纤维化相关基因为赖氨酰氧化酶基因(LOXL2)、平滑肌激动蛋白基因(ACTA2)、I型胶原基因(Collagen I)和III型胶原基因(Collagen III)。
表1 ACTA2表达量统计
表2 Collagen III表达量统计
表3 LOXL2表达量统计
表4 Collagen I表达量统计
结果如表1-表4、图3A和图3B所示。表1-表4中,每一格表示一个重复。图3A为RT-qPCR检测结果(n=4),根据qPCR结果,KA所导致的肝纤维化模型与APAP所导致的肝纤维化模型有所不同,两者在引起肝纤维化基因表达上各不相同,APAP致肝细胞样Hepa RG细胞死亡,引起LX-2肝星状细胞中赖氨酰氧化酶基因、平滑肌激动蛋白基因高表达,并且并没有引起胶原蛋白基因的表达升高;而KA致肝细胞样Hepa RG细胞死亡在引起ACTA2基因表达升高的同时,也特异性引起I型胶原基因表达,直接导致了类肝组织球体肝纤维化的发生。图3B为显微镜下观察药物处理36h后各组类肝组织球体状况,其中,a为空白组,b为TGF-β1组,c为APAP阳性模型组,d为APAP阳性模型+TGF-β1组,e为肝损伤药物低浓度组,f为肝损伤药物低浓度+TGF-β1组,g为肝损伤药物中浓度组,h为肝损伤药物中浓度+TGF-β1组,i为肝损伤药物高浓度组,j为肝损伤药物高浓度+TGF-β1组。由图3B可知,与空白组相比,能确切地观察到APAP能造成类肝组织球体分散,不聚集,因此严重影响类肝组织球体的整体性和功能,而KA药物的三个浓度组均没有出现相同情况,对类肝组织球体的伤害较小,不损伤类肝组织球体的整体性和功能。同时TGF-β1对类肝组织球体的形态无影响。
KA会杀伤肝细胞,特异性引起肝纤维化指标中I型胶原蛋白基因Collagen 1α1上调,但基本不会引起其他肝纤维化基因如:平滑肌激动蛋白基因Acta2、赖氨酰氧化酶LOXL2、III型胶原蛋白基因Collagen 3α1的上调或者变化不大。
药物处理36h后,显微镜下观察类肝组织球体状态。各组类肝组织球体分别用Hoechst(750x)、CalceinAM(1500x)、EthD-1(750x)染色,放置孵箱染色30min,染色结束后每孔留50u1液体于原孔板中,将孔板置于高内涵仪器中进行拍照。高内涵系统成像分析结果如图4A和图4B,其中,a为空白组,b为TGF-β1组,c为APAP阳性模型组,d为APAP阳性模型+TGF-β1组,e为肝损伤药物低浓度组,f为肝损伤药物低浓度+TGF-β1组,g为肝损伤药物中浓度组,h为肝损伤药物中浓度+TGF-β1组,i为肝损伤药物高浓度组,j为肝损伤药物高浓度+TGF-β1组。与空白组相比,APAP导致红色区域细胞占比明显增多,相反绿色区域细胞占比明显减少,这说明APAP导致了大面积细胞死亡,基本覆盖了肝球体的全部区域。然而,KA三个药物浓度组仅仅损伤的是类肝组织球体外周细胞,即肝实质细胞Hepa RG,中心区域的细胞,即肝非实质细胞LX-2,活性基本不受影响。证明了KA通过损伤球体外周Hepa RG细胞,进而影响LX-2细胞功能表达。
采用Western Blot检测空白组、TGF-β1组、肝损伤药物低浓度+TGF-β1组、肝损伤药物中浓度+TGF-β1组和肝损伤药物高浓度+TGF-β1组中蛋白Collagen I和α-SMA表达情况。使用的抗体为COL1A1(R&D,AF6220),α-SMA(CST,19245)测结果如图4C,泳道从左到右分别为空白组、TGF-β1组、肝损伤药物低浓度+TGF-β1组、肝损伤药物中浓度+TGF-β1组和肝损伤药物高浓度+TGF-β1组检测结果。Western Blot结果显示,与空白组和TGF-β1组相比,KA联合TGF-β1能呈剂量依赖性促进I型胶原蛋白的表达,表明KA联合TGF-β1能促进类肝组织球体纤维化的发生。
本实施例说明将肝细胞样Hepa RG细胞和人源性LX-2肝星状细胞按照3∶1的个数比在96孔圆底孔板(康宁公司,货号3799)以1000个细胞/孔的密度(即肝细胞样Hepa RG细胞的含量为250个细胞/孔,人源性LX-2肝星状细胞的含量为750个细胞/孔)在完全Williams’E培养基中,在37℃、5%CO2孵箱中,培养5-7天得到类肝组织球体。对该类肝组织球体先用不含血清的Williams’E培养基配制药物KA(培养体系中浓度为0.3125μM,0.625μM或1.25μM)处理12h后,再补加含TGF-β1的无血清Williams’E培养基(培养体系中浓度10ng/mL)处理24h,得到体外3D肝纤维化模型。
实施例3、KA对三种3D类肝组织球体毒性实验分析
LX-2和Hepa RG细胞共培养球体的培养方法包括:采用实施例1“2.LX-2与Hepa RG细胞成球稳定性考察”中的方法将人源性LX-2肝星状细胞和肝细胞样Hepa RG细胞共培养。LX-2细胞球体的培养方法包括:采用人源性LX-2肝星状细胞,以1000个/孔,接种于96孔圆底孔板(康宁公司,货号3799),培养基为标准DMEM培养基(含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素),每孔加入量100μL,培养条件37℃、5%CO2。HepaRG细胞球体的培养方法包括:采用肝细胞样Hepa RG细胞,以1000个/孔,接种于96孔圆底孔板(康宁公司,货号3799),培养基为Williams’E培养基(含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1%谷氨酰胺),每孔加入量100μL,培养条件37℃、5%CO2。每种细胞球体重复3孔。
按上述培养方法培养上述三种细胞球体,三天后细胞聚集成球,第四天半量换液无血清Williams’E培养基,第五天KA处理各细胞球体36h,KA用相应的无血清Williams’E培养基配制为梯度浓度:80,40,20,10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125(仅LX-2球体细胞和类肝组织球体进行该剂量处理)(uM),采用半量换液方式给药。将不做处理的三种细胞球体作为阴性对照。药物处理36h后,采用3D细胞测活试剂(Promaga,G9683)检测各组球体细胞活力。
结果如表5-表7、图5A-5C,KA对三种细胞球体均有杀伤作用,在KA浓度超过2.5uM时,LX-2细胞球体对KA更加敏感,而其他两种细胞球体活力随KA浓度增大而逐渐降低。选取KA浓度应小于5uM。
表5 KA对Hepa RG球体细胞活力的影响(%)
表6 KA对LX-2球体细胞活力的影响(%)
表7 KA对类肝组织球体细胞活力的影响(%)
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种肝纤维化模型的构建方法,其特征在于:包括采用刀豆蛋白和TGF-β1处理类肝组织球体,获得肝纤维化模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于:包括:
(1)将所述刀豆蛋白加入至培养所述类肝组织球体的培养基,培养所述类肝组织球体12小时;
(2)在完成步骤(1)后,将所述TGF-β1加入至所述培养基,培养所述类肝组织球体24小时获得所述肝纤维化模型。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法,其特征在于:步骤(1)中,所述刀豆蛋白在所述培养基中的浓度为0.3125-1.25μM。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的构建方法,其特征在于:步骤(2)中,所述TGF-β1在所述培养基中的浓度为10ng/mL。
5.根据权利要求1-4中任一所述的构建方法,其特征在于:所述类肝组织球体采用如下步骤制备:
将肝细胞和肝星状细胞在装有培养基的圆底孔板中悬浮培养至少72小时获得所述类肝组织球体。
6.根据权利要求5所述的构建方法,其特征在于:所述肝细胞与所述肝星状细胞的总细胞数量为1000,所述肝细胞与所述肝星状细胞的数量比例为1∶3。
7.采用权利要求1-8中任一所述的构建方法制备的肝纤维化模型。
8.权利要求9所述的肝纤维化模型在肝纤维化致病机理研究中的应用或在制备筛选治疗肝纤维化药物的产品中的应用。
9.一种用于构建肝纤维化模型的组合物,其特征在于:所述组合物包括刀豆蛋白和TGF-β1。
10.根据权利要求9所述的组合物,其特征在于:所述刀豆蛋白和TGF-β1的比例为0.625-2.5mmol∶20ng。
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