CN110108815A - 一种用于二十八烷醇预防肝损伤效果的体外评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于二十八烷醇预防肝损伤效果的体外评价方法，涉及药物评价技术领域，包括以下步骤：(1)用导致肝损伤的药液孵育人正常肝细胞，得到第一孵育肝细胞，测定第一孵育肝细胞的存活率和凋亡率；(2)用二十八烷醇溶液和导致肝损伤的药液共同孵育人正常肝细胞，得到第二孵育肝细胞，测定第二孵育肝细胞的存活率和凋亡率；(3)用步骤(2)所述第二孵育肝细胞的存活率减去步骤(1)所述第一孵育肝细胞的存活率，得到第一差值；(4)用步骤(1)所述第一孵育肝细胞的凋亡率减去步骤(2)所述第二孵育肝细胞的凋亡率，得到第二差值；当所述第一差值≥10％或第二差值≥10％时，二十八烷醇对肝损伤具有预防效果。

Description

一种用于二十八烷醇预防肝损伤效果的体外评价方法
技术领域
本发明涉及药物评价技术领域，具体涉及一种二十八烷醇预防肝损伤效果的体外评价方法。
背景技术
肝脏是哺乳动物体内重要器官之一，具有合成、解毒、代谢、分泌、生物转化以及免疫防御等功能。肝脏疾病是目前威胁人类健康的最重要的疾病之一，肝损伤由于其发病原因的普遍性和多样性而在人群中广泛存在，肝损伤会产生很多并发症，包括感染性并发症、肝创面胆漏、继发性出血、急性肝肾肺功能障碍，少数严重患者会导致暴发性或重症肝功能衰竭，死亡率极高。
在药物使用过程中，因药物本身或其代谢产物或由于特殊体质对药物的超敏感性或耐受性降低导致的肝损伤称为药物性肝损伤，多种药物可引起药物性肝损伤，如抗肿瘤的化疗药物、抗结核药、解热镇痛药、免疫抑制剂、降糖降脂药、抗细菌、抗真菌剂抗病毒药等。在美国，成人急性肝衰竭病例中50％以上是由药物引起，其中对乙酰氨基酚(APAP)导致急性肝衰竭最为常见，而且近年来病例还在增加。在我国APAP也被广泛应用于成人和儿童的感冒发热、头痛以及其他疾病所致的发热和疼痛，由药物引起的肝衰竭仅次于肝炎病毒引起的肝衰竭。大部分药物致病机制有相似的地方，APAP导致的急性肝损伤模型可作为最典型的且最容易操作的药物性肝损伤模型。
目前，用于评价药物性肝损伤的评价方法中用的动物模型，建模时间长造价高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于二十八烷醇预防肝损伤效果的体外评价方法。本发明提供的是一种在细胞水平评价预防药物性肝损伤效果的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种二十八烷醇预防肝损伤效果的体外评价方法，包括以下步骤：
(1)用导致肝损伤的药液孵育人正常肝细胞，得到第一孵育肝细胞，测定第一孵育肝细胞的存活率和凋亡率；
(2)用二十八烷醇溶液和导致肝损伤的药液共同孵育人正常肝细胞，得到第二孵育肝细胞，测定第二孵育肝细胞的存活率和凋亡率；
(3)用步骤(2)所述第二孵育肝细胞的存活率减去步骤(1)所述第一孵育肝细胞的存活率，得到第一差值；
(4)用步骤(1)所述第一孵育肝细胞的凋亡率减去步骤(2)所述第二孵育肝细胞的凋亡率，得到第二差值；
当所述第一差值≥10％或第二差值≥10％时，二十八烷醇对肝损伤具有预防效果；
所述二十八烷醇溶液的浓度为50～200ug/mL；
所述导致肝损伤的药液的浓度为8～20mmol/L；
所述第一孵育肝细胞中的人正常肝细胞的种类、数量和孵育的条件与第二孵育肝细胞中人正常肝细胞相同；
所述步骤(3)和(4)之间无时间顺序限定。
优选地，所述人正常肝细胞的数量为1×105～6个/mL。
优选地，所述人正常肝细胞包括HL-7702细胞。
优选地，所述步骤(2)中二十八烷醇溶液和导致肝损伤的药液的体积比为(0.8～1.2):(0.8～1.2)。
优选地，所述孵育的时间为24～72h。
优选地，所述肝损伤为药物性肝损伤。
优选地，所述导致药物性肝损伤的药物包括对乙酰氨基酚。
本发明提供了一种二十八烷醇预防肝损伤效果的体外评价方法。本发明提供的评价方法是在细胞水平上评价二十八烷醇对对乙酰氨基酚引发的急性药物性肝损伤的预防功效。
附图说明
图1为二十八烷醇标准品GC图谱；
图2为本发明精馏制备的二十八烷醇GC图谱；
图3为二十八烷醇与对乙酰氨基酚共孵育HL-7702细胞24h后细胞存活率图；
图4为二十八烷醇细胞毒性检测图；
图5为TC20全自动细胞计数仪检测二十八烷醇与对乙酰氨基酚共孵育HL-7702细胞24h后总细胞数、活细胞数、活细胞率图；
图6为荧光法检测二十八烷醇与对乙酰氨基酚共孵育HL-7702细胞24h后细胞凋亡坏死程度其中，(1)CK；(2)200ug/mL；(3)100ug/mL；(4)50ug/mL；(5)0ug/mL；
图7为生化试剂盒法检测二十八烷醇与对乙酰氨基酚共孵育HL-7702细胞24h后培养液上清中ALT和AST指标；
图8生化试剂盒法检测二十八烷醇与对乙酰氨基酚共孵育HL-7702细胞24h后培养液上清中LDH和AKP指标；
图9为流式细胞法检测二十八烷醇与对乙酰氨基酚共孵育HL-7702细胞24h后细胞凋亡坏死程度，其中(1)CK；(2)200ug/mL；(3)100ug/mL；(4)50ug/mL；(5)0ug/mL。
具体实施方式
本发明提供了一种用于二十八烷醇预防肝损伤效果的体外评价方法，包括以下步骤：(1)用导致肝损伤的药液孵育人正常肝细胞，得到第一孵育肝细胞，测定第一孵育肝细胞的存活率和凋亡率；(2)用二十八烷醇溶液和导致肝损伤的药液共同孵育人正常肝细胞，得到第二孵育肝细胞，测定第二孵育肝细胞的存活率和凋亡率；(3)用步骤(2)所述第二孵育肝细胞的存活率减去步骤(1)所述第一孵育肝细胞的存活率，得到第一差值；(4)用步骤(1)所述第一孵育肝细胞的凋亡率减去步骤(2)所述第二孵育肝细胞的凋亡率，得到第二差值；当所述第一差值≥10％或第二差值≥10％时，二十八烷醇对肝损伤具有预防效果；所述二十八烷醇溶液的浓度为50～200ug/mL；所述导致肝损伤的药液的浓度为8～20mmol/L；所述第一孵育肝细胞中的人正常肝细胞的种类、数量和孵育的条件与第二孵育肝细胞中人正常肝细胞相同；所述步骤(3)和(4)之间无时间顺序限定。。
本发明对所述二十八烷醇的来源没有特殊限定，优选从动植物蜡质中提取得到的二十八烷醇；所述动植物蜡质的来源优选为糠蜡、蔗蜡、蜂蜡和虫蜡中的一种或几种。本发明对所述二十八烷醇的制备方法没有特殊限定，在本发明实施例中优选包括以下步骤：
将无水乙醇、航空煤油、氢氧化钠与动植物蜡质混合后进行加热回流提取，得到提取液；将所述提取液进行过滤后，取上清液冷却、抽滤后，得到滤饼；将所述滤饼脱溶、烘干，得到二十八烷醇粗品；将所述二十八烷醇粗品进行精馏，收集二十八烷醇。
在本发明中，所述无水乙醇、航空煤油的体积和氢氧化钠、动植物蜡质的质量比优选为(100～140)mL:(260～300)mL:(4.6～5.0)g:(38～42)g，更优选为120mL:280mL:4.8g:40g。
在本发明中，所述加热回流提取的时间优选为4～5h，更优选为4.5h。
在本发明中，所述二十八烷醇粗品进行精馏的方法优选将二十八烷醇粗品放入精馏釜，加热，当釜温到达240℃后，开真空泵，真空度保持在20～50Pa，全回流30～50min后，控制回流比为1:10，收集210～235℃主馏分，评价即为二十八烷醇。
在本发明中，所述二十八烷醇溶液的制备方法优选如下步骤：
取二十八烷醇，添加DMSO(V/V)和吐温80(V/V)，用PBS配制二十八烷醇混悬液，将二十八烷醇混悬液避光在沸水中加热溶解30min，后将二十八烷醇溶液放置于装有90℃热水的超声波仪器中超声30min，二十八烷醇溶液变澄清并达到灭菌效果；配制的二十八烷醇溶液用灭菌双蒸水配制含DMSO(V/V)和吐温80(V/V)的浓度为0～2000ug/mL二十八烷醇溶液，用RPMI-1640完全培养液稀释成浓度为0～200ug/mL的二十八烷醇溶液。
在本发明中，所述肝损伤优选为药物性肝损伤，所述药物优选为对乙酰氨基酚。
在本发明中，所述对乙酰氨基酚标准药液的制备方法优选如下步骤：
用PBS配制对乙酰氨基酚储存液，用RPMI-1640完全培养液配制含8～20mmol/L对乙酰氨基酚药液。
在本发明中，所述人正常肝细胞优选为HL-7702细胞；所述人正常肝细胞的数量优选为1×105～6个/mL。
在本发明中，所述二十八烷醇溶液和导致肝损伤的药液的体积比优选为(0.8～1.2):(0.8～1.2)，更优选为1:1。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
二十八烷醇的制备：将40g蜂蜡于500mL三口烧瓶中，加入120mL无水乙醇，280mL航空煤油，加入4.8g氢氧化钠，水浴加热至沸，搅拌回流反应4.5h后，将反应液移至分液漏斗，用热水洗涤多次，除去下层水相，洗至PH值等于7，将上层清液倒入烧杯冷却过夜，真空抽滤，得滤饼，将滤饼脱溶、烘干，即得二十八烷醇粗品；将获得的二十八烷醇粗品放入精馏釜中，加热，当釜温到达240℃后，开真空泵，真空度保持在20～50Pa，全回流50min后，控制回流比为1:10；根据塔顶温度的变化情况，收集210～235℃主馏分，气相色谱检测，含量为75％的二十八烷醇。如图1和2所示。
实施例2
二十八烷醇溶液的制备：通过添加5％DMSO(V/V)和0.1％吐温80(V/V)，用PBS配制2000ug/mL二十八烷醇混悬液，将二十八烷醇混悬液避光在沸水中加热溶解30min，后将二十八烷醇溶液放置于装有100℃热水的超声波仪器中超声30min，二十八烷醇溶液变澄清并达到灭菌效果，配制的2000ug/mL二十八烷醇溶液用灭菌双蒸水或PBS配制含5％DMSO(V/V)和0.1％吐温80(V/V)的1000ug/mL、500ug/mL、0ug/mL二十八烷醇溶液，用RPMI-1640完全培养液稀释成浓度为200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、0ug/mL二十八烷醇溶液，其中，200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、0ug/mL二十八烷醇溶液中DMSO和吐温80终浓度分别为0.5％和0.01％(V/V)。
对乙酰氨基酚药液的制备：用灭菌PBS配制100mM对乙酰氨基酚储存液，用含青霉素和链霉素分别为100U/mL，100ug/mL RPMI-1640完全培养液配制含10mM对乙酰氨基酚标准药液。
HL-7702细胞的培养：用含10％血清、含青霉素和链霉素分别为100U/mL，100ug/mLRPMI-1640完全培养液培养HL-7702细胞，将HL-7702细胞置于37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱培养至细胞融合度达到80～90％，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化下细胞，用RPMI-1640完全培养液配制1×105细胞/mL细胞悬液，将细胞悬液分别均匀布液于96孔(100uL/孔，每个设置组6个重复)、24孔(1mL/孔，每个设置组3个重复)、6孔(2mL/孔，每个设置组3个重复)无菌细胞培养板中，将布好细胞悬液的细胞培养板放置于37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱培养至细胞贴壁。
实施例3
评价方法：细胞贴壁后将细胞培养板中的培养液移去，用预冷的无菌PBS洗涤细胞3次，立即用含200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、0ug/mL二十八烷醇溶液和含10mM对乙酰氨基酚药液共孵育HL-7702细胞24h，进行评价。
评价结果如下：
(1)96孔板培养细胞加入20uL 0.5％MTT溶液，置于37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱继续培养4h，小心移去上清，加入100uL DMSO避光缓慢震荡15min，使用酶标仪于562nm波长处检测每孔OD值，计算细胞存活率。细胞存活率＝(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)，结果如图3所示，OC组(50μg/mL,100μg/mL和200μg/mL二十八烷醇)细胞存活率相对于APAP组(0μg/mL二十八烷醇孵育细胞)细胞存活率分别提高了12％，23％和55％。MTT法评价二十八烷醇溶液对HL-7702细胞毒性的结果如图4所示，各浓度的二十八烷醇溶液孵育HL-7702细胞不同时间细胞存活率均未出现显著性下降(P>0.05)。
(2)6孔板培养细胞小心移去上清，用预冷的无菌PBS洗涤细胞3次，用200uL/孔胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞2min，用600uL RPMI-1640完全培养液终止消化反应，轻轻吹打细胞，将细胞悬液移入1.5mL灭菌离心管，用300uL RPMI-1640完全培养液洗涤孔2次，合并每孔细胞悬液，1000rpm，10min离心弃上清，用500uL无菌PBS重悬细胞，取9uL细胞悬液加入1uL 0.4％台盼蓝混匀，立即用TC20全自动细胞计数仪检测总细胞数和活细胞数，结果如图5所示，相较于对照组，OC组和APAP组总细胞数、活细胞数都显著性降低，但是OC组相较于APAP组细胞总数、活细胞数和活细胞率都显著性增加(P<0.05).
(3)24孔板培养细胞小心移去上清，用预冷的无菌PBS洗涤细胞3次，每孔加入1mL细胞染色缓冲液，分别加入5uL Hoechst 33342染色液和5uL PI染色液，混匀，冰浴或4℃孵育20min，用倒置荧光显微镜检测各组细胞凋亡和坏死情况，结果如图6所示，相较于OC组和对照组，APAP组细胞凋亡和坏死率都显著性增加，相较于APAP组，OC组细胞凋亡和坏死率都显著性降低。
(4)6孔板培养细胞小心吸取上清，用ALT、AST、LDH、AKP生化试剂盒检测细胞培养液上清中的ALT、AST、LDH、AKP含量，结果如图7和8所示，相较于对照组，APAP组ALT、AST、LDH、AKP分别增加了70％、80％、72％和40％，但是相较于APAP组OC组(50,100,200μg/mL)ALT、AST、LDH、AKP显著性下降(P<0.05)。用预冷的无菌PBS洗涤细胞3次，用200uL/孔胰蛋白酶消化细胞2min，用600uL 1640完全培养液终止消化反应，轻轻吹打细胞，将细胞悬液移入1.5mL灭菌离心管，用300uL 1640完全培养液洗涤孔2次，合并每孔细胞悬液，1000rpm，5min离心弃上清，用1mLBinding Buffer重悬细胞，300g离心10min，弃上清，用500uLBindingBuffer重悬细胞，加入5uL Annexin V-FITC染料室温避光轻轻混匀反应10min，加入5uL PI染料室温避光轻轻混匀反应5min，将细胞过100目尼龙膜，在1h内用流式细胞仪评价细胞凋亡率和坏死率，结果如图9所示，相较于对照组APAP组细胞凋亡率和坏死率分别增加了33.1％和39.7％。相较于APAP组OC组细胞凋亡率和坏死率均出现下降，特别是用200μg/mL二十八烷醇溶液孵育细胞，细胞凋亡率和坏死率分别下降了23.1％和19.3％。
由实施例3的检测评价结果可知，MTT法检测显示二十八烷醇溶液与对乙酰氨基酚共孵育HL-7702细胞24h后，添加大于100ug/mL二十八烷醇组活细胞数比阳性对照组(添加0ug/mL二十八烷醇)活细胞数显著提高；MTT法检测显示各浓度的二十八烷醇溶液均对HL-7702细胞无细胞毒性；TC20全自动细胞计数仪检测细胞结果显示，添加大于100ug/mL二十八烷醇组细胞总数、活细胞数均比阳性对照组(含0ug/mL二十八烷醇)显著提高；Hoechst33342/PI双染倒置荧光法检测细胞凋亡结果显示添加大于100ug/mL二十八烷醇组凋亡细胞和坏死细胞相比较阳性对照组(含0ug/mL二十八烷醇)显著降低；培养液上清中ALT、AST、LDH、AKP指标测定结果显示添加大于100ug/mL二十八烷醇组凋亡细胞和坏死细胞相比较阳性对照组(含0ug/mL二十八烷醇)显著降低；Annexin V-FIT/PI双染流式细胞法检测细胞凋亡和坏死结果显示添加大于100ug/mL二十八烷醇组凋亡细胞和坏死细胞相比较阳性对照组(含0ug/mL二十八烷醇)显著降低，正常细胞数显著增加。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于二十八烷醇预防肝损伤效果的体外评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用导致肝损伤的药液孵育人正常肝细胞，得到第一孵育肝细胞，测定第一孵育肝细胞的存活率和凋亡率；
(2)用二十八烷醇溶液和导致肝损伤的药液共同孵育人正常肝细胞，得到第二孵育肝细胞，测定第二孵育肝细胞的存活率和凋亡率；
(3)用步骤(2)所述第二孵育肝细胞的存活率减去步骤(1)所述第一孵育肝细胞的存活率，得到第一差值；
(4)用步骤(1)所述第一孵育肝细胞的凋亡率减去步骤(2)所述第二孵育肝细胞的凋亡率，得到第二差值；
当所述第一差值≥10％或第二差值≥10％时，二十八烷醇对肝损伤具有预防效果；
所述二十八烷醇溶液的浓度为50～200ug/mL；
所述导致肝损伤的药液的浓度为8～20mmol/L；
所述第一孵育肝细胞中的人正常肝细胞的种类、数量、孵育的条件与第二孵育肝细胞中人正常肝细胞相同；
所述步骤(3)和(4)之间无时间顺序限定。
2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述人正常肝细胞的数量为1×105～6个/mL。
3.根据权利要求2所述的评价方法，其特征在于，所述人正常肝细胞包括HL-7702细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中二十八烷醇溶液和导致肝损伤的药液的体积比为(0.8～1.2):(0.8～1.2)。
5.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述孵育的时间为24～72h。
6.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述肝损伤为药物性肝损伤。
7.根据权利要求6所述的评价方法，其特征在于，所述导致药物性肝损伤的药物包括对乙酰氨基酚。
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