CN106706626A - 一种岩生忍冬成分鉴定及抗菌活性评价方法 - Google Patents

一种岩生忍冬成分鉴定及抗菌活性评价方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种岩生忍冬成分鉴定及抗菌活性评价方法，所述岩生忍冬成分鉴定方法采用理化反应和薄层层析法鉴定岩生忍冬的化学成分，用纸片法和微量肉汤稀释法检测岩生忍冬石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水提取物的体外抑菌活性。本发明采用理化反应法和薄层层析法粗略鉴定该植物进行主要化学成分，用纸片法和微量肉汤稀释法测定该植物体外抑菌活性，用多种细菌株进行抗菌作用的对比，分析不同溶剂提取物的活性成分对细菌的抑制效果。

Description

一种岩生忍冬成分鉴定及抗菌活性评价方法
技术领域
本发明属于岩生忍冬成分鉴定技术领域，尤其涉及一种岩生忍冬成分鉴定及抗菌活性评价方法。
背景技术
岩生忍冬(Lonicera rupicola Hook.f.et Thomson)，又名西藏忍冬，为忍冬科忍冬属植物，产于宁夏南部、甘肃临潭、青海东南部、四川西部、云南西北部及西藏东部至西南部，长于海拔3.6km以上的高山或山坡灌木丛中。在中国，忍冬属资源也较为丰富，尤以西南部种类最多。忍冬属内有不少药用植物和具有观赏价值的绿化植物，据初步统计，属内可药用植物有49种，对许多致病菌有较强的抗菌作用。据现有资料表明，忍冬属植物中的化学成分主要有四类：黄酮类、挥发油类、绿原酸类、苷类，此外还有甾醇类、糖类、无机元素类等。近年来，随着合成及半合成抗菌素的增多和广泛使用，临床上细菌耐药性问题日趋严重，面对这一严峻现状，发挥中药的治疗优势将成为重要课题。随着抗菌素种类增多和广泛使用，细菌耐药性问题日趋严重，药物的不良反应也不断增加。由于化学合成药物开发难度大，毒副作用明显。学者们都在各种中草药成分的抗菌活性方面展开了研究工作，期望从中草药中得到更加理想的抗菌药物。目前为止，忍冬属植物中除金银花、山银花等在医药、食品等方面广为应用而其药理毒理作用得到深入研究外，其他忍冬属的药理毒理作用很少有研究报道。相关报道金银花醇浸液对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎杆菌、脑膜炎双球菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌、百日咳杆菌、绿脓杆菌、结核杆菌、霍乱杆菌等多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有一定的抑制作用。山银花对白喉杆菌也有很强的抗菌作用，高剂量的山银花能明显减少金黄色葡萄球菌感染小鼠所致死亡率。目前，由于岩生忍冬生长条件的特殊性及其资源分布等因素，对岩生忍冬作为药用植物研究尤其是对其活性成分和抗菌活性无明确报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种岩生忍冬成分鉴定及抗菌活性评价方法，旨在解决目前由于岩生忍冬生长条件的特殊性及其资源分布等因素，对岩生忍冬作为药用植物研究尤其是对其活性成分和抗菌活性无明确报道的问题。
本发明是这样实现的，一种岩生忍冬成分鉴定方法，所述岩生忍冬成分鉴定方法采用理化反应和薄层层析法鉴定岩生忍冬的化学成分，用纸片法和微量肉汤稀释法检测岩生忍冬石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水提取物的体外抑菌活性；
所述理化反应具体包括：称取10g岩生忍冬粉末，浸泡于100mL蒸馏水中，密封浸泡24h，过滤，取其滤液；取若干灭菌试管，在试管中加入一定量岩生忍冬滤液，再分别加入各类一定量检测试剂，观察并记录结果；
所述薄层层析法具体包括：取层析缸，以石油醚：乙酸乙酯＝1:10，v/v，为展开剂，在硅胶板上点样后放入层析缸中，展开后在紫外灯365nm下观察记录有无荧光及荧光颜色，喷上显色剂后再在紫外灯365nm下观察荧光情况并记录。
进一步，所述理化反应中试剂配制包括：
有机酸类显色剂：
甲基红试剂：称取甲基红100mg溶于100mL乙醇中即可；
溴甲酚绿指示剂：称取溴甲酚绿0.04g溶于100mL乙醇中，用0.1mol/mL氢氧化钠溶液调至蓝色刚刚出现，移入棕色瓶中保存；
吖啶试剂：称取吖啶5mg溶于100mL乙醇中即可；
酚和鞣质类显色剂：
氯化钠明胶试剂：称取明胶1g溶于50mL水中，然后加10g氯化钠使溶解，加水稀释到100mL；
三氯化铁试剂：5％三氯化铁乙醇溶液加入少许盐酸；
三萜、甾体类显色剂：20％磷钼酸乙醇试剂；
黄酮类显色剂：2％醋酸镁甲醇试剂；
苯丙素类显色剂：5％氢氧化钠甲醇溶液试剂；
醌类显色剂：
无色亚甲基蓝试剂：准确称取100mg亚甲基蓝溶于100mL乙醇中，加入1mL冰醋酸、1g锌粉，搅拌至蓝色消失，移入棕色瓶中，避光保存；
强心苷类显色剂：
3，5-二硝基苯甲酸试剂：称取3，5-二硝基苯甲酸1g，用50mL甲醇溶解，加入1mol/L氢氧化钠溶液50mL，混合即可；
三氯乙酸试剂：称取25g三氯乙酸溶于100mL乙醇中即可；
生物碱类显色剂：
改良碘化铋钾试剂：称取次硝酸铋0.85g加入10mL冰醋酸和40mL水混合得溶液1；称取碘化钾8g加入20mL水溶液得溶液2；取溶液1和溶液2混合，取混合液1mL，加入2mL冰醋酸和10mL水混合即得试剂，移入棕色瓶中保存；
碘-碘化钾试剂：称取碘1g和碘化钾10g溶于50mL水中加热溶解，加入2mL冰醋酸用水稀释到100mL，移入棕色瓶中保存。
本发明的另一目的在于提供一种所述岩生忍冬成分鉴定方法中岩生忍冬石油醚提取物制备方法，所述岩生忍冬石油醚提取物制备方法包括：称取100g岩生忍冬浸泡于1L石油醚中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL石油醚提取物用二甲基亚砜溶解至溶液透亮，共加入了4mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm微孔滤膜过滤。
本发明的另一目的在于提供一种所述岩生忍冬成分鉴定方法中岩生忍冬乙酸乙酯提取物制备方法，所述岩生忍冬乙酸乙酯提取物制备方法包括：称取100g岩生忍冬浸泡于1L甲醇溶液中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL乙酸乙酯提取物用二甲基亚砜溶解至溶液透亮，共加入了6mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm的微孔滤膜过滤。
本发明的另一目的在于提供一种所述岩生忍冬成分鉴定方法中岩生忍冬醇提取物制备方法，所述岩生忍冬醇提取物制备方法包括：称取100g粉碎后的岩生忍冬浸泡于1L甲醇溶液中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL甲醇提取物用二甲基亚砜溶解至溶液透亮，共加入了3mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm的微孔滤膜过滤。
本发明的另一目的在于提供一种所述岩生忍冬成分鉴定方法中岩生忍冬水提取物制备方法，所述岩生忍冬水提取物制备方法包括：称取100g岩生忍冬浸泡于1L蒸馏水中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL蒸馏水提取物用二甲基亚砜溶解至溶液，共加入了5mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm的微孔滤膜过滤。
本发明的另一目的在于提供一种所述岩生忍冬成分鉴定方法中岩生忍冬成分抗菌活性评价方法，所述岩生忍冬成分抗菌活性评价方法包括：
(1)石油醚提取物制备：称取100g岩生忍冬浸泡于1L石油醚中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL石油醚提取物用二甲基亚砜溶解至溶液透亮，共加入了4mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm微孔滤膜过滤；
乙酸乙酯提取物制备：称取100g岩生忍冬浸泡于1L乙酸乙酯溶液中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL乙酸乙酯提取物用二甲基亚砜溶解至溶液透亮，共加入了6mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm的微孔滤膜过滤；
醇提取物制备：称取100g粉碎后的岩生忍冬浸泡于1L甲醇溶液中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL甲醇提取物用二甲基亚砜溶解至溶液透亮，共加入了3mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm的微孔滤膜过滤；
水提取物制备：称取100g岩生忍冬浸泡于1L蒸馏水中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL蒸馏水提取物用二甲基亚砜溶解至溶液，共加入了5mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm的微孔滤膜过滤；
(2)培养基制备：
TSA培养基：按胰蛋白胨大豆肉汤粉、蒸馏水比例为30g/1000mL配制，在电子天平上称取胰蛋白胨大豆肉汤粉和琼脂粉与锥形瓶中，并加入相应比例的蒸馏水，加热溶解，放入立式压力蒸汽灭菌器121℃高压蒸汽灭菌20min后取出，与已高压好的平板一同放入无菌操作台，紫外灯照射15min；随即在无菌操作台中将溶液倒入灭菌平皿中，每个平皿倒入15-20mL，等培养基冷却，放入37℃恒温培养箱中，24h后取出做无菌检查，合格者放入4℃冰箱中备用；
MH肉汤：按MH肉汤粉、蒸馏水比例为21g/1000mL配制；在电子天平上称取MH肉粉剂于锥形瓶中，并加入蒸馏水，溶解后将一部分分装至试管，每管3mL，密封，放入立式压力蒸汽灭菌器121℃高压蒸汽灭菌20min后取出，放置于37℃培养箱，24h后做无菌检查，合格者放入4℃冰箱保存备用；
MH肉汤琼脂培养基：在MH肉汤中按1.5％的比例加入琼脂粉，加热煮沸溶解，放入立式压力蒸汽灭菌器121℃高压蒸汽灭菌20min后取出，与以高压好的平板一同放入无菌操作台，紫外灯照射15min；在无菌操作台中将溶液倒入灭菌平皿中，每个平皿倒入15-20mL，等培养基冷却，放入37℃恒温培养箱中，24h后取出做无菌检查，合格者放入4℃冰箱中备用；
(3)供试菌复苏与菌悬液制备：
供试菌株复苏：在无菌操作台中，挑取10种标准菌株接种于TSA培养基中，编号，放至37℃培养箱中16h后，取出放于4℃冰箱中备用；
菌悬液的制备：在无菌操作台中，在标准菌株培养基中挑取单个菌落接种于3mLMH肉汤试管中，放置于37℃350rpm的摇床中震荡培养4h，得菌液，再用MH肉汤将菌液稀释1000倍后备用；
(4)纸片法
取10个MH肉汤琼脂培养平板，每个培养平板加入1种受试菌菌液30μL，铺匀，做好标记；每个平板中均匀放置4个灭菌空白药敏片，在平板外壁药敏片对应的位上分别标记为1、2、3、4，在位置1的药敏片上滴上10μL水提取物，在位置2的药敏片上滴上10μL石油醚提取物，在位置3的药敏片上滴上10μL的甲醇提取物，在位置4的药敏片上滴上10μL的乙酸乙酯提取物，置37℃恒温培养箱中培养12h，观察测量记录抑菌圈直径；
(5)微量肉汤稀释法
采取微量肉汤稀释法测定岩生忍冬4种溶剂提取物对10种标准菌株的体外抑菌活性；取10个灭菌96孔板，每个板每孔加入100μLMH肉汤，每个板1、2排加水提取物，3、4排加石油醚提取物，5、6排加甲醇提取物，7、8排加乙酸乙酯提取物，提取物均加100μL，然后从第一孔倍比稀释均匀至第12孔，每个板1～11列各孔中加入1种受试菌100μL，做好标记，置37℃恒温培养箱中培养12h，观察并记录结果。
本发明提供的岩生忍冬成分鉴定及抗菌活性评价方法，采用理化反应和薄层层析法粗略鉴定岩生忍冬的主要化学成分，用纸片法和微量肉汤稀释法检测岩生忍冬4种不同溶剂(石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水)提取物的体外抑菌活性。抑菌结果表明4种不同溶剂提取物对受试菌均有一定的抑制作用。本发明以石油醚、乙酸乙酯、甲醇和蒸馏水为溶剂，以岩生忍冬全草为原料，采用理化反应法和薄层层析法粗略鉴定该植物进行主要化学成分，用纸片法和微量肉汤稀释法测定该植物体外抑菌活性，用多种细菌株进行抗菌作用的对比，分析不同溶剂提取物的活性成分对细菌的抑制效果。
附图说明
图1是本发明实施例提供的岩生忍冬成分鉴定方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明采用理化反应和薄层层析法粗略鉴定岩生忍冬的主要化学成分，用纸片法和微量肉汤稀释法检测岩生忍冬4种不同溶剂(石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水)提取物的体外抑菌活性。抑菌结果表明4种不同溶剂提取物对受试菌均有一定的抑制作用。本发明参考金银花、山银花的药理研究方法来研究岩生忍冬的主要成分及抑菌活性，为今后进一步研究岩生忍冬的药用情况奠定基础，试验以石油醚、乙酸乙酯、甲醇和蒸馏水为溶剂，以岩生忍冬全草为原料，采用理化反应法和薄层层析法粗略鉴定该植物进行主要化学成分，用纸片法和微量肉汤稀释法测定该植物体外抑菌活性，用多种细菌株进行抗菌作用的对比，分析不同溶剂提取物的活性成分对细菌的抑制效果。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的岩生忍冬成分鉴定方法包括以下步骤：
S101：精确称取10g岩生忍冬粉末，浸泡于100mL蒸馏水中，密封浸泡24h，过滤，取其滤液。取若干灭菌试管，在试管中加入一定量岩生忍冬滤液，再分别加入各类一定量检测试剂，观察并记录结果；
S102：取层析缸，以石油醚：乙酸乙酯(1:10，v/v)为展开剂，在硅胶板上点样后放入层析缸中，展开后在紫外灯365nm下观察记录有无荧光及荧光颜色，喷上显色剂后再在紫外灯365nm下观察荧光情况并记录。
下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。
1.材料
1.1药材
药材为岩生忍冬全草，采自四川省阿坝藏族羌族自治州红原县，经兽医学药理实验室陈朝喜副教授鉴定为忍冬属岩生忍冬，晾干，粉粹待用。
1.2供试菌株
供试菌株为10种标准菌株：屎肠球菌；粪肠球菌；粘质沙雷氏菌；肺炎克雷伯氏菌；阴沟肠杆菌阴沟亚种；痢疾志贺氏菌；肠沙门氏菌肠亚种；阪崎肠杆菌；金黄色葡萄球菌；普通变形杆菌；由西南民族大学兽医药理实验室保存提供。
1.3主要耗材及仪器
琼脂粉；MH肉汤粉；胰蛋白胨大豆肉汤粉；磷钼酸；氢氧化钠；醋酸镁；氯化钠；明胶；三氯化铁；甲基红；溴甲酚绿；吖啶；亚甲基蓝；冰醋酸；锌粉；3，5-二硝基苯甲酸；三氯乙酸；次硝酸铋；碘化钾；碘；盐酸；甲醇；乙醇；乙酸乙酯；石油醚；蒸馏水。
试管、试管架、培养皿、96孔聚苯乙烯微孔板、锥形瓶、注射器、记号笔、铅笔、直尺、毛细管、洗耳球、称量纸、滤纸、移液枪、枪头、接种环(针)、量筒、烧杯、玻璃棒、层析缸、层析用硅胶、一次性手套、口罩等。
旋转蒸发器；手提式不绣钢蒸汽消毒器；隔热式电热恒温培养箱；净化工作台；电子天平；三用紫外分析仪；热风循环型实验室烘干箱；超纯水仪；循环水真空泵；低温冷却液循环泵。
2.方法
2.1化学成分鉴定
2.1.1理化试剂配制
有机酸类显色剂：
甲基红试剂：称取甲基红100mg溶于100mL乙醇中即可。
溴甲酚绿指示剂：称取溴甲酚绿0.04g溶于100mL乙醇中，用0.1mol/mL氢氧化钠溶液调至蓝色刚刚出现，移入棕色瓶中保存。
吖啶试剂：称取吖啶5mg溶于100mL乙醇中即可。
酚和鞣质类显色剂：
氯化钠明胶试剂：称取明胶1g溶于50mL水中，然后加10g氯化钠使溶解，加水稀释到100mL。
三氯化铁试剂：5％三氯化铁乙醇溶液加入少许盐酸。
三萜、甾体类显色剂：20％磷钼酸乙醇试剂。
黄酮类显色剂：2％醋酸镁甲醇试剂。
苯丙素类显色剂：5％氢氧化钠甲醇溶液试剂。
醌类显色剂：
无色亚甲基蓝试剂：准确称取100mg亚甲基蓝溶于100mL乙醇中，加入1mL冰醋酸、1g锌粉，搅拌至蓝色消失，移入棕色瓶中，避光保存。
强心苷类显色剂：
3，5-二硝基苯甲酸试剂：称取3，5-二硝基苯甲酸1g，用50mL甲醇溶解，加入1mol/L氢氧化钠溶液50mL，混合即可。
三氯乙酸试剂：称取25g三氯乙酸溶于100mL乙醇中即可。
生物碱类显色剂：
改良碘化铋钾试剂：称取次硝酸铋0.85g加入10mL冰醋酸和40mL水混合得溶液1；
称取碘化钾8g加入20mL水溶液得溶液2；取溶液1和溶液2混合，取混合液1mL，加入2mL冰醋酸和10mL水混合即得试剂，移入棕色瓶中保存。
碘-碘化钾试剂：称取碘1g和碘化钾10g溶于50mL水中加热溶解，加入2mL冰醋酸用水稀释到100mL，移入棕色瓶中保存。
2.1.2理化反应
精确称取10g岩生忍冬粉末，浸泡于100mL蒸馏水中，密封浸泡24h，过滤，取其滤液。取若干灭菌试管，在试管中加入一定量岩生忍冬滤液，再分别加入各类一定量检测试剂，观察并记录结果。
2.1.3薄层层析法
取层析缸，以石油醚：乙酸乙酯(1:10，v/v)为展开剂，在硅胶板上点样后放入层析缸中，展开后在紫外灯365nm下观察记录有无荧光及荧光颜色，喷上显色剂后再在紫外灯365nm下观察荧光情况并记录。
2.2体外抑菌试验
2.2.1供试液准备
石油醚提取物制备：准确称取100g岩生忍冬浸泡于1L石油醚中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm左右，温度控制在50℃左右。取1mL石油醚提取物用二甲基亚砜溶解至溶液透亮，共加入了4mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm(尼龙66)微孔滤膜过滤。
乙酸乙酯提取物制备：准确称取100g岩生忍冬浸泡于1L乙酸乙酯溶液中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm左右，温度控制在50℃左右。取1mL乙酸乙酯提取物用二甲基亚砜溶解至溶液透亮，共加入了6mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm(尼龙66)的微孔滤膜过滤。
醇提取物制备：准确称取100g粉碎后的岩生忍冬浸泡于1L甲醇溶液中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm左右，温度控制在50℃左右。取1mL甲醇提取物用二甲基亚砜溶解至溶液透亮，共加入了3mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm(尼龙66)的微孔滤膜过滤。
水提取物制备：准确称取100g岩生忍冬浸泡于1L蒸馏水中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm左右，温度控制在50℃左右。取1mL蒸馏水提取物用二甲基亚砜溶解至溶液，共加入了5mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm(尼龙66)的微孔滤膜过滤。
2.2.2培养基制备
TSA培养基：按胰蛋白胨大豆肉汤粉、蒸馏水比例为30g/1000mL配制，在电子天平上称取一定量的胰蛋白胨大豆肉汤粉和琼脂粉与锥形瓶中，并加入相应比例的蒸馏水，加热溶解，放入立式压力蒸汽灭菌器121℃高压蒸汽灭菌20min后取出，与已高压好的平板一同放入无菌操作台，紫外灯照射15min。随即在无菌操作台中将溶液倒入灭菌平皿中，每个平皿倒入约15-20mL，等培养基冷却，放入37℃恒温培养箱中，24h后取出做无菌检查，合格者放入4℃冰箱中备用。
MH肉汤：按MH肉汤粉、蒸馏水比例为21g/1000mL配制。在电子天平上称取一定量的MH肉粉剂于锥形瓶中，并加入相应比例的蒸馏水，溶解后将一部分分装至试管，每管3mL，密封，放入立式压力蒸汽灭菌器121℃高压蒸汽灭菌20min后取出，放置于37℃培养箱，24h后做无菌检查，合格者放入4℃冰箱保存备用。
MH肉汤琼脂培养基：在MH肉汤中按1.5％的比例加入琼脂粉，加热煮沸溶解，放入立式压力蒸汽灭菌器121℃高压蒸汽灭菌20min后取出，与以高压好的平板一同放入无菌操作台，紫外灯照射15min。随即在无菌操作台中将溶液倒入灭菌平皿中，每个平皿倒入约15-20mL，等培养基冷却，放入37℃恒温培养箱中，24h后取出做无菌检查，合格者放入4℃冰箱中备用。
2.2.3供试菌复苏与菌悬液制备
供试菌株复苏：在无菌操作台中，挑取10种标准菌株接种于TSA培养基中，编号，放至37℃培养箱中16h后，取出放于4℃冰箱中备用。
菌悬液的制备：在无菌操作台中，在标准菌株培养基中挑取单个菌落接种于3mLMH肉汤试管中，放置于37℃350rpm的摇床中震荡培养4h，得菌液，再用MH肉汤将菌液稀释1000倍后备用。
2.2.4纸片法
取10个MH肉汤琼脂培养平板，每个培养平板加入1种受试菌菌液30μL，铺匀，做好标记；每个平板中均匀放置4个灭菌空白药敏片，在平板外壁药敏片对应的位上分别标记为1、2、3、4，在位置1的药敏片上滴上10μL水提取物，在位置2的药敏片上滴上10μL石油醚提取物，在位置3的药敏片上滴上10μL的甲醇提取物，在位置4的药敏片上滴上10μL的乙酸乙酯提取物，置37℃恒温培养箱中培养12h，观察测量记录抑菌圈直径。
2.2.5微量肉汤稀释法
参照CLSI(2013版)指导原则和执行标准，采取微量肉汤稀释法测定岩生忍冬4种溶剂提取物对10种标准菌株的体外抑菌活性。取10个灭菌96孔板，每个板每孔加入100μLMH肉汤，每个板1、2排加水提取物，3、4排加石油醚提取物，5、6排加甲醇提取物，7、8排加乙酸乙酯提取物，提取物均加100μL，然后从第一孔倍比稀释均匀至第12孔，每个板1～11列各孔中加入1种受试菌100μL，做好标记，置37℃恒温培养箱中培养12h，观察并记录结果。
3.结果
3.1成分鉴定结果
3.1.1理化反应成分鉴定结果
表1岩生忍冬化学成分理化反应鉴定结果
注：岩生忍冬原液为橙红色，浑浊。
3.1.2薄层层析成分鉴定结果
表2岩生忍冬化学成分薄层层析鉴定结果
3.2体外抑菌结果
3.2.1纸片法抑菌结果
表3岩生忍冬纸片法体外抑菌结果
3.2.2微量肉汤稀释法抑菌结果
表4岩生忍冬4种溶剂提取物微量肉汤稀释法抑菌结果
注：D为水，PE为石油醚，MT为甲醇，EAC为乙酸乙酯。
本试验采用理化反应和薄层层析法粗略鉴定岩生忍冬的主要化学成分，结果表明岩生忍冬中含有黄酮类、有机酸类、酚和鞣质类、三萜和甾体类、强心苷类、生物碱类、皂苷类等化学成分。从两种体外抑菌试验中可以得出，岩生忍冬4种不同溶剂提取物对受试菌均有一定的抑制作用，其中水提取物的抑菌效果较其他三种提取物的抑菌效果差，其他三种提取物的抑菌效果相当。
两种体外抑菌试验中，可选用平板稀释法代替微量肉汤稀释法，平板法稳定，且不受药液颜色及浑浊度的影响，比较适合于中药制剂体外抑菌浓度的测定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种岩生忍冬成分鉴定方法，其特征在于，所述岩生忍冬成分鉴定方法采用理化反应和薄层层析法鉴定岩生忍冬的化学成分，用纸片法和微量肉汤稀释法检测岩生忍冬石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水提取物的体外抑菌活性；
所述理化反应具体包括：称取10g岩生忍冬粉末，浸泡于100mL蒸馏水中，密封浸泡24h，过滤，取其滤液；取若干灭菌试管，在试管中加入岩生忍冬滤液，再分别加入各类一定量检测试剂，观察并记录结果；
所述薄层层析法具体包括：取层析缸，以石油醚：乙酸乙酯＝1:10，v/v，为展开剂，在硅胶板上点样后放入层析缸中，展开后在紫外灯365nm下观察记录有无荧光及荧光颜色，喷上显色剂后再在紫外灯365nm下观察荧光情况并记录。
2.如权利要求1所述的岩生忍冬成分鉴定方法，其特征在于，所述理化反应中试剂配制包括：
有机酸类显色剂：
甲基红试剂：称取甲基红100mg溶于100mL乙醇中即可；
溴甲酚绿指示剂：称取溴甲酚绿0.04g溶于100mL乙醇中，用0.1mol/mL氢氧化钠溶液调至蓝色刚刚出现，移入棕色瓶中保存；
吖啶试剂：称取吖啶5mg溶于100mL乙醇中即可；
酚和鞣质类显色剂：
氯化钠明胶试剂：称取明胶1g溶于50mL水中，然后加10g氯化钠使溶解，加水稀释到100mL；
三氯化铁试剂：5％三氯化铁乙醇溶液加入少许盐酸；
三萜、甾体类显色剂：20％磷钼酸乙醇试剂；
黄酮类显色剂：2％醋酸镁甲醇试剂；
苯丙素类显色剂：5％氢氧化钠甲醇溶液试剂；
醌类显色剂：
无色亚甲基蓝试剂：准确称取100mg亚甲基蓝溶于100mL乙醇中，加入1mL冰醋酸、1g锌粉，搅拌至蓝色消失，移入棕色瓶中，避光保存；
强心苷类显色剂：
3，5-二硝基苯甲酸试剂：称取3，5-二硝基苯甲酸1g，用50mL甲醇溶解，加入1mol/L氢氧化钠溶液50mL，混合即可；
三氯乙酸试剂：称取25g三氯乙酸溶于100mL乙醇中即可；
生物碱类显色剂：
改良碘化铋钾试剂：称取次硝酸铋0.85g加入10mL冰醋酸和40mL水混合得溶液1；称取碘化钾8g加入20mL水溶液得溶液2；取溶液1和溶液2混合，取混合液1mL，加入2mL冰醋酸和10mL水混合即得试剂，移入棕色瓶中保存；
碘-碘化钾试剂：称取碘1g和碘化钾10g溶于50mL水中加热溶解，加入2mL冰醋酸用水稀释到100mL，移入棕色瓶中保存。
3.一种如权利要求1所述岩生忍冬成分鉴定方法中岩生忍冬石油醚提取物制备方法，其特征在于，所述岩生忍冬石油醚提取物制备方法包括：称取100g岩生忍冬浸泡于1L石油醚中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL石油醚提取物用二甲基亚砜溶解至溶液透亮，共加入了4mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm微孔滤膜过滤。
4.一种如权利要求1所述岩生忍冬成分鉴定方法中岩生忍冬乙酸乙酯提取物制备方法，其特征在于，所述岩生忍冬乙酸乙酯提取物制备方法包括：称取100g岩生忍冬浸泡于1L乙酸乙酯溶液中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL乙酸乙酯提取物用二甲基亚砜溶解至溶液透亮，共加入了6mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm的微孔滤膜过滤。
5.一种如权利要求1所述岩生忍冬成分鉴定方法中岩生忍冬醇提取物制备方法，其特征在于，所述岩生忍冬醇提取物制备方法包括：称取100g粉碎后的岩生忍冬浸泡于1L甲醇溶液中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL甲醇提取物用二甲基亚砜溶解至溶液透亮，共加入了3mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm的微孔滤膜过滤。
6.一种如权利要求1所述岩生忍冬成分鉴定方法中岩生忍冬水提取物制备方法，其特征在于，所述岩生忍冬水提取物制备方法包括：称取100g岩生忍冬浸泡于1L蒸馏水中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL蒸馏水提取物用二甲基亚砜溶解至溶液，共加入了5mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm的微孔滤膜过滤。
7.一种如权利要求1所述岩生忍冬成分鉴定方法中岩生忍冬成分抗菌活性评价方法，其特征在于，所述岩生忍冬成分抗菌活性评价方法包括：
(1)石油醚提取物制备：称取100g岩生忍冬浸泡于1L石油醚中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL石油醚提取物用二甲基亚砜溶解至溶液透亮，共加入了4mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm微孔滤膜过滤；
乙酸乙酯提取物制备：称取100g岩生忍冬浸泡于1L乙酸乙酯溶液中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL乙酸乙酯提取物用二甲基亚砜溶解至溶液透亮，共加入了6mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm的微孔滤膜过滤；
醇提取物制备：称取100g粉碎后的岩生忍冬浸泡于1L甲醇溶液中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL甲醇提取物用二甲基亚砜溶解至溶液透亮，共加入了3mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm的微孔滤膜过滤；
水提取物制备：称取100g岩生忍冬浸泡于1L蒸馏水中，置旋转蒸发仪中回流提取3次滤液，每次浸泡48h，浓缩至浸膏状，转数控制在90rpm，温度控制在50℃；取1mL蒸馏水提取物用二甲基亚砜溶解至溶液，共加入了5mL二甲基亚砜，在无菌工作台中用0.22μm的微孔滤膜过滤；
(2)培养基制备：
TSA培养基：按胰蛋白胨大豆肉汤粉、蒸馏水比例为30g/1000mL配制，在电子天平上称取胰蛋白胨大豆肉汤粉和琼脂粉与锥形瓶中，并加入相应比例的蒸馏水，加热溶解，放入立式压力蒸汽灭菌器121℃高压蒸汽灭菌20min后取出，与已高压好的平板一同放入无菌操作台，紫外灯照射15min；随即在无菌操作台中将溶液倒入灭菌平皿中，每个平皿倒入15-20mL，等培养基冷却，放入37℃恒温培养箱中，24h后取出做无菌检查，合格者放入4℃冰箱中备用；
MH肉汤：按MH肉汤粉、蒸馏水比例为21g/1000mL配制；在电子天平上称取MH肉粉剂于锥形瓶中，并加入蒸馏水，溶解后将一部分分装至试管，每管3mL，密封，放入立式压力蒸汽灭菌器121℃高压蒸汽灭菌20min后取出，放置于37℃培养箱，24h后做无菌检查，合格者放入4℃冰箱保存备用；
MH肉汤琼脂培养基：在MH肉汤中按1.5％的比例加入琼脂粉，加热煮沸溶解，放入立式压力蒸汽灭菌器121℃高压蒸汽灭菌20min后取出，与以高压好的平板一同放入无菌操作台，紫外灯照射15min；在无菌操作台中将溶液倒入灭菌平皿中，每个平皿倒入15-20mL，等培养基冷却，放入37℃恒温培养箱中，24h后取出做无菌检查，合格者放入4℃冰箱中备用；
(3)供试菌复苏与菌悬液制备：
供试菌株复苏：在无菌操作台中，挑取10种标准菌株接种于TSA培养基中，编号，放至37℃培养箱中16h后，取出放于4℃冰箱中备用；
菌悬液的制备：在无菌操作台中，在标准菌株培养基中挑取单个菌落接种于3mL MH肉汤试管中，放置于37℃350rpm的摇床中震荡培养4h，得菌液，再用MH肉汤将菌液稀释1000倍后备用；
(4)纸片法
取10个MH肉汤琼脂培养平板，每个培养平板加入1种受试菌菌液30μL，铺匀，做好标记；每个平板中均匀放置4个灭菌空白药敏片，在平板外壁药敏片对应的位上分别标记为1、2、3、4，在位置1的药敏片上滴上10μL水提取物，在位置2的药敏片上滴上10μL石油醚提取物，在位置3的药敏片上滴上10μL的甲醇提取物，在位置4的药敏片上滴上10μL的乙酸乙酯提取物，置37℃恒温培养箱中培养12h，观察测量记录抑菌圈直径；
(5)微量肉汤稀释法
采取微量肉汤稀释法测定岩生忍冬4种溶剂提取物对10种标准菌株的体外抑菌活性；取10个灭菌96孔板，每个板每孔加入100μLMH肉汤，每个板1、2排加水提取物，3、4排加石油醚提取物，5、6排加甲醇提取物，7、8排加乙酸乙酯提取物，提取物均加100μL，然后从第一孔倍比稀释均匀至第12孔，每个板1～11列各孔中加入1种受试菌100μL，做好标记，置37℃恒温培养箱中培养12h，观察并记录结果。
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