CN103301198B - 一种厚朴全效成分获得方法及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种厚朴全效成分的获得方法。利用冷冻‑超微‑酶解处理，水提、有机溶剂反复浸提等方法获得了厚朴全效成分。通过此方法能获得厚朴酚与和厚朴酚的提取率较超临界萃取、普通水提醇沉提取有了较大提高，总药效成分损失少，全效成分的抑菌效果好于主成分的抑菌效果。

Description

一种厚朴全效成分获得方法及其制备方法

技术领域

本发明属于中药有效成分提取领域，具体涉及一种厚朴有效成分的提取物新方法，该方法可以同时提取中药中水溶、脂溶成分。

背景技术

厚朴为常用中药，始载于《神农本草经》，其后历代本草与药典均有记载。《中华人民共和国兽药典》2010年版二部记载，厚朴为木兰科木兰属植物，为厚朴Magnoliaofficinalis Rehd.et Wils.或凹叶厚朴Magnolia officinalis Rehd.etWils.var.biloba Rehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮。其性温，味苦、辛，具燥湿消痰、下气除满之功效，用于湿滞伤中、脱痞吐泻、食积气滞、腹胀便秘、痰饮喘咳。厚朴具有广谱抗菌的作用，其抗菌性质比较稳定。

厚朴具有较强的抗菌作用，并且抗菌性质稳定。王志强等探讨了厚朴的体外抑菌作用。采用KB纸片扩散法，使用100％厚朴浸出液滤纸片对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、甲型链球菌、乙型链球菌抑菌作用进行研究。发现厚朴对以上细菌均有明显抑制作用，说明厚朴在体外有明显的抑菌作用。林桂芸等以和厚朴酚的标准品为试验材料，测定其对3种引起人类疾病的细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌）的抑菌活性。结果表明和厚朴酚对供试的3种致病细菌均有很强的抑菌作用，抑菌浓度在l0mg/L以内。

厚朴主要的化学成分包括木脂素类、生物碱类、挥发油类。厚朴中有近20中木脂素类成分，主要有厚朴酚(magnolol)、和厚朴酚(honokiol)、厚朴三醇B(Magnatriol B)、厚朴醛B,D(Magnoldehyde B，D)、木兰醌、单菇木脂素、厚朴木脂体A-H、对-羟基辣薄荷基厚朴酚、邻-羟基辣薄荷基厚朴酚、厚朴三酚、台湾擦木醛、四氢木兰醇、芥子醛、丁香树脂酚等；厚朴中的生物碱包括9个异喹啉生物碱、5个有活性的阿朴啡生物碱类化合物，其余生物碱类成分主要为厚朴碱、木兰花碱、武当木兰碱、白兰花碱、木兰箭毒碱等；厚朴挥发油中主要成分为按叶油醇及其异构体，其次是聚伞花素，约占挥发油总量的10%-20%。另外，按叶油素、茨烯、胁柠檬烯、龙脑、樟脑等含量大于1%，还含有丁香酚、香芹醇、香芹酮、甲基丁香酚、薄荷酮、乙酸肉桂酷等化合物。

厚朴发挥作用的主要结构为厚朴酚、和厚朴酚，两者的结构式如为：

所以在提取过程中，以此两成分的提取率为主要指标，但其他成分也要尽量提取出来。

目前，提取方法天然活性物质的提取的一般方法有水提法、碱提酸沉法、溶剂提取法、超临界CO₂、超声波、高速逆流色谱法等。提取方法中普遍存在细胞壁影响药物成分释放、提取不完全或设备成本高等缺点。为了更全效的提取厚朴中主要成分，本发明首次提出把冷冻-超微-酶解提取法用于厚朴有效成分的提取，通过此方法厚朴提取物的提取率较超临界萃取、普通水提醇沉提取有了较大提高，并且药效成分损失少，临床使用效果好。

发明内容

本发明目的在于提供一种厚朴全效成分获得方法，所述全效成分包括厚朴酚（Magnolol）、异厚朴酚（Isomagnolol）、和厚朴酚（Honokiol）、四氢厚朴酚（Tetrahydromagnolol）、厚朴醛（Magnal-dehyde）、厚朴木脂素（Magnolignan）、丁香脂素（Syringaresinol）、挥发油、桉叶醇（Eudesmol）等中的一种或多种。

本发明是通过以下途径实现的：

（1）取厚朴饮片，置于密闭包装袋中，-80℃至-20℃冷冻72小时至144小时后取出，立即进行粉碎处理；

（2）取上述厚朴饮片置风悬粉碎机中，开启电机进行粉碎，取100目筛的筛下物；

（3）取筛下物，加入其重量6-30倍量的纯化水，配制成混悬液；

（4）在上述混悬液中加入0.1-5.0%（W/W）纤维素酶、0.1-5.0%（W/W）β-葡聚糖酶、0.05-0.5%木聚糖酶（W/W），37℃加热搅拌，反应6小时，静置1小时；

（5）取上述反应后溶液，8000-12000转离心，离心后的上清浓缩5倍以上，然后进行低温喷雾干燥或冷冻干燥后得厚朴水提部分，标记为成分I；离心后沉淀部分进行醇提取；

（6）醇提取：将沉淀物用浓度为70%-90%的乙醇溶解，搅拌、回流提取4-5小时，回收溶剂，合并滤液，滤液减压浓缩至固体，干燥后粉碎，标记为成分II。

所述纤维素酶活性大于等于140万U/g，β-葡聚糖酶活性大于等于3000万U/g，木聚糖酶活性大于等于6000万U/g。

本发明获得的厚朴水提成分I和醇提取成分II水提可以合并到一种制剂中使用，也可以单独制成制剂使用。

本发明的有益效果是：

从厚朴中分离全效成分，并且要保证厚朴酚及和厚朴酚主成分是提取的关键，本发明突破了其他限制，采用了冷冻-超微-酶解提取法，得到了厚朴的脂溶和水溶所有有效成分，厚朴酚及和厚朴酚的纯度高，厚朴提取物的提取率较超临界萃取、普通水提醇沉提取有了较大提高。

具体实施方式

结合以下实施例可以观察到本发明的有益性质，这些实施例是说明性的，不会对本发明构成限制。

实施例1：一种厚朴全效成分获得方法

为了有效获得厚朴提取物，对厚朴饮片进行了冷冻-超微-酶解提取，具体操作如下：

1、称取100kg厚朴饮片，置于密闭包装袋中，-80℃冷冻72小时后取出进行以下处理；

2、取上述厚朴饮片置风悬粉碎机中，开启电机进行粉碎，取100目筛的筛下物；

3、此次共获得筛下物80kg，加入480L纯化水，搅拌获得混悬液；

4、在上述混悬液中加入0.1%纤维素酶（活性140万U/g，W/W）、0.1%β-葡聚糖酶（活性3000万U/g，W/W）、0.05%木聚糖酶（活性6000万U/g，W/W），37℃加热搅拌，反应6小时后静置1小时；

5、取上述溶液，进行8000转离心，离心后的上清进行浓缩10倍，然后进行低温喷雾干燥，得厚朴水提部分，标记为成分I；

6、醇提取：将沉淀物用浓度为70%的乙醇溶解，搅拌、回流提取4小时，回收溶剂，合并滤液，滤液减压浓缩至固体，干燥后粉碎，标记为成分II。

实施例2、一种厚朴全效成分获得方法

1、称取100kg厚朴饮片，置于密闭包装袋中，-20℃冷冻144小时后取出进行以下处理；

2、取上述厚朴饮片置风悬粉碎机中，开启电机进行粉碎，取100目筛的筛下物；

3、此次共获得筛下物90kg，加入1900L纯化水，搅拌获得混悬液；

4、在上述混悬液中加入2.5%纤维素酶（活性140万U/g，W/W）、2.5%β-葡聚糖酶（活性3000万U/g，W/W）、0.25%木聚糖酶（活性6000万U/g，W/W），37℃加热搅拌，反应6小时后静置1小时；

5、取上述溶液，进行12000转离心，离心后的上清进行浓缩20倍，然后进行冷冻干燥，得厚朴水提部分，标记为成分I；

6、醇提取：将沉淀物用浓度为90%的乙醇溶解，搅拌、回流提取4小时，回收溶剂，合并滤液，滤液减压浓缩至固体，干燥后粉碎，标记为成分II。

实施例3、一种厚朴全效成分获得方法

1、称取100kg厚朴饮片，置于密闭包装袋中，-40℃冷冻100小时后取出进行以下处理；

2、取上述厚朴饮片置风悬粉碎机中，开启电机进行粉碎，取100目筛的筛下物；

3、此次共获得筛下物95kg，加入2850L纯化水，搅拌获得混悬液；

4、在上述混悬液中加入5%纤维素酶（活性140万U/g，W/W）、5%β-葡聚糖酶（活性3000万U/g，W/W）、0.5%木聚糖酶（活性6000万U/g，W/W），37℃加热搅拌，反应6小时后静置1小时；

5、取上述溶液，进行12000转离心，离心后上清进行浓缩15倍，喷雾干燥，得厚朴水提部分，标记为成分I；离心后沉淀部分进行醇提取；

6、醇提取：将沉淀物用浓度为85%的乙醇溶解，搅拌、回流提取5小时，回收溶剂，合并滤液，滤液减压浓缩至固体，干燥后粉碎，标记为成分II。

实施例4：有效成分含量的测定

用《中华人民共和国药典》方法测定上述成分II中有效成分含量，具体方法如下。

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇一水（78:22）为流动相；检测波长为294nm．理论板数按厚朴酚峰计算应不低于3800。

对照品溶液的制备：精密称取厚朴酚、和厚朴酚对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含厚朴酚40μg、和厚朴酚24μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取实施例1、2、3中的成分Ⅱ粉末（过三号筛）0.2g（同时另取该品测定水分），精密称定，量具塞锥形瓶中，精密加人甲醇25ml，摇匀,滤过，精密量取续滤液5ml，置25rnl量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取上述两种对照品溶液各4μl与供试品溶液4μl，注人液相色谱仪，测定，即得。该品按干燥品计算，含厚朴酚（C₁₈H₁₈O₂）与和厚朴酚（C₁₈H₁₈O₂）的含量。

含量测定结果如下表所示，表中同时附上了对比文献数据信息，文献来源为“厚朴提取物工艺研究”，叶卉等，《医药导报》，第8期，第27卷，第974-975页，2008年8月

表1本发明方法与大孔吸附树脂再生法提取厚朴有效成分含量比较

实施例5：全效成分与参比文献对比方法抑菌效果的比较

1、菌种的准备

在无菌操作条件下，将供试大肠杆菌移接入相对应的试管斜面培养基上，在37℃恒温培养箱内培养24h，然后置于4℃下冷藏备用。

2、培养基的灭菌及平皿的制备

配制好的培养基，分装于250mL的三角瓶内，每瓶约200mL，瓶口加棉塞，外包报纸，高压蒸汽灭菌(121℃，30min)后，冷却至50～60℃，在无菌条件下，倾倒入干热灭菌过的培养皿内。

3、供试菌株菌悬液、供试菌株平板的制备

(1)配置菌悬液

取1中供试的培养菌株斜面各一只，分别加入5～10mL无菌水，用接种环将菌苔轻轻刮下，振荡，制成浓度大约为10⁶cfu/mL的菌悬液。此菌悬液现配现用。

(2)制含菌平板

将融化并冷却至45～50℃的培养基倾入皿中12～15mL至无菌培养皿，冷凝；分别用无菌移液枪移取100μL于相应的培养基上，然后涂布均匀，备用。

4、供试提取物的准备

样品1：实施例2成分Ⅱ，加适量辛癸酸甘油酯，稀释至5μg/ml备用；

样品2：实施例2成分Ⅰ用吐温-80稀释3倍，实施例2成分Ⅱ用适量辛癸酸甘油酯稀释，两成分混合后，使成分Ⅱ的浓度为5μg/ml备用；

样品3：按文献（“厚朴提取物工艺研究”，叶卉等，《医药导报》，第8期，第27卷，第974-975页，2008年8月）用大孔吸附树脂再生B法获得的喷雾干燥后样品，用辛癸酸甘油酯稀释为5μg/ml备用。

5、抑菌能力测定采用抑菌实验中常用的滤纸片法，具体方法如下：

(1)将新华1号定性滤纸用打孔器打成6mm的小圆片，置于培养皿中，121℃干热灭菌0.5h备用；

（2）在无菌操作的条件下，将100μl上述样品1、样品2、样品3分别浸润10片药敏片；将浸泡后的滤纸片置于已备好的含菌平板上，每皿三片加一个空白；

(3)在37℃下恒温培养1d，观察菌落生长情况，量取抑菌圈直径，测得的提取液对六种菌的抑菌圈的直径和越大，表示提取液的抑菌性越强。

6、抑菌圈直径的比较

经过试验获得的抑菌圈直径见表2所示。从测定结果可知，全效成分的抑菌效果远高于仅脂溶成分。虽然报道脂溶成分是主要抑菌的成分，但水溶成分有很好在增效左右。

表2全效成分与参比文献对比方法抑菌效果的比较

注：数字右肩字母不同标示差异显著（p<0.05）。

Claims (3)

1.一种厚朴全效成分获得方法，其特征是技术步骤如下：

（1）取厚朴饮片，置于密闭包装袋中，-80℃至-20℃冷冻72小时至144小时后取出，立即进行粉碎处理；

（2）取上述厚朴饮片置风悬粉碎机中，开启电机进行粉碎，取100 目筛的筛下物；

（3）取筛下物，加入其重量6-30 倍量的纯化水，配制成混悬液；

（4）在上述混悬液中加入0.1-5.0%（W/W）纤维素酶、0.1-5.0%（W/W）β-葡聚糖酶、0.05-0.5% 木聚糖酶（W/W），37℃加热搅拌，反应6小时，静置1小时；

（5）取上述反应后溶液，8000-12000转离心，离心后的上清浓缩5倍以上，然后进行低温喷雾干燥或冷冻干燥后得厚朴水提部分，标记为成分I；离心后沉淀部分进行醇提取；

（6）醇提取：将沉淀物用浓度为70%-90% 的乙醇溶解，搅拌、回流提取4-5 小时，回收溶剂，合并滤液，滤液减压浓缩至固体，干燥后粉碎，标记为成分II。

2.根据权利要求1所述的一种厚朴全效成分获得方法，其特征是步骤（4）中所述纤维素酶活性大于等于140万U/g，β-葡聚糖酶活性大于等于3000万U/g，木聚糖酶活性大于等于6000万U/g 。

3.根据权利要求1 所述的一种厚朴全效成分获得方法，其特征在于厚朴水提成分I和醇提取成分II 合并到一种制剂中使用。