CN104000887B - 一种用于手、皮肤抗菌的中草药组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于手、皮肤抗菌的中草药配方，属于预防医学领域。该配方的重量份组成为：五倍子0.95-1.05份、黄芩7.6-8.4份和大黄1.9-2.1份。它的重量份组成优选为：五倍子1份、黄芩8份和大黄2份。该复方中草药合剂中各中草药提取物的浓度明显低于各中草药提取物单独使用对本试验指标菌产生有效作用的浓度。本发明研制的新型复方中草药合剂可用于手、皮肤抗菌，其为纯植物来源的抗菌合剂，不含任何化学添加剂，对皮肤无刺激性、无生殖毒性、对人体安全无毒。

Description

一种用于手、皮肤抗菌的中草药组合物

技术领域

本发明涉及一种新型用于手、皮肤抗菌的中草药配方，属于预防医学领域。

背景技术

传统的消毒剂是指用于杀灭传播媒介上病原微生物，使其达到无害化要求的制剂，其在防病中的主要作用是将病原微生物消灭于人体之外，切断传染病的传播途径，达到控制传染病的目的。而目前用的消毒剂主要为“化学消毒剂”，主要是指其有效成分是化学物质，以化学物质为主要有效成分的消毒剂存在环境降解周期长、长期残留影响环境、广谱消毒杀菌对环境与人体微生态产生影响等，进而可能影响机体代谢而对人类健康产生潜在不良影响。近年来，人群的肿瘤、代谢紊乱性疾病的发病率不断上升。因此开发研究绿色环保、无毒、无残留的新型抗菌物质是近年来全世界预防医学界研究的重点问题。

我国有着丰富的中草药资源，在相关研究报告中明确指出了中草药成分具有显著的抗菌抑菌活性，并且具有低毒、低残留、对环境友好、可降解等特点。文献记载和多年的临床应用表明，众多中草药如五倍子、黄芩、大黄、野菊花、虎杖等的提取物均具有有效抑菌成分。

发明内容

本发明的目的在于研制出一种具有有效抑菌作用、使用浓度低、无急性毒性作用、无皮肤刺激作用、无遗传毒性、价格低廉、易溶解的新型复方中草药配方。

本发明以2002年版《消毒技术规范》中规定用于手、皮肤抗菌产品鉴定指标菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和白色念珠菌为指标菌，进行复方中草药合剂的研制，试图从中筛选出2-3种对易引起手、皮肤感染常见细菌有抑菌作用的中草药，制成复方中草药合剂，研究其最小抑菌浓度，并对其进行毒理学研究，包括急性毒性研究、亚急性毒性研究、皮肤刺激性研究及遗传毒性研究。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种用于手、皮肤抗菌的复方中草药配方，它的重量份组成为：五倍子0.95-1.05份、黄芩7.6-8.4份和大黄1.9-2.1份。

该配方中重量份组成优选为：五倍子1份、黄芩8份和大黄2份。

其中，五倍子、黄芩和大黄可选用五倍子提取物、黄芩提取物和大黄提取物，优选五倍子提取物为1:2(重量比)提取物，黄芩提取物为1.5:10(重量比)提取物，大黄提取物为1:3(重量比)提取物。

五倍子提取物、黄芩提取物与大黄提取物的重量比例为(0.95-1.05):(2.28-2.52):(1.27-1.4)，优选为1:2.4:1.33。

在该复方中草药配方中，五倍子提取物的剂量范围为63-75mg/100ml、黄芩提取物的剂量范围为150-180mg/100ml、大黄提取物的剂量范围为83-100mg/100ml。

如中草药提取物提取比例改变，该配方可相应改变。如五倍子改为1:4提取物，该配方中含五倍子提取物为32-38mg/100ml。

该复方配方的药物剂型为片剂，按每片含1:2五倍子提取物63-75mg、1.5:10黄芩提取物150-180mg和1:3黄芩提取物83-100mg，制备成片剂，用时加水溶解，每片加水量为100ml，溶解混匀后可直接用于手和皮肤抗菌。

或者每片含1:2五倍子提取物63mg、1.5:10黄芩提取物150mg、1:3大黄提取物83mg，加水溶解混匀，每片加水量为80-100ml，溶解混匀后可直接用于手和皮肤抗菌，该溶液使用有效期为一年。

本发明对上述中草药配方对手、皮肤感染的指标菌进行了抑菌试验，抑菌试验结果为：对于4种指标菌－金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌来说，五倍子提取物、黄芩提取物和大黄提取物稀释液分别对其中的部分指标菌有抑菌效果，没有一种中草药提取物稀释液可以同时对4种指标菌有抑菌作用，要达到对4种指标菌均有抑菌作用，必须应用多种中草药提取物制备合剂。故本发明选用对试验菌抑菌作用较好的五倍子、黄芩和大黄提取物进行了配方筛选，从五倍子、黄芩和大黄提取物不同的配伍剂量中筛选出了抑菌作用最好的配方，即五倍子提取物:黄芩提取物:大黄提取物的比例为1:2.4:1.33。进一步进行了最小抑菌浓度试验，最小抑菌浓度为含1:2五倍子提取物0.625mg/ml、1.5:10黄芩提取物1.5mg/ml、1:3大黄提取物0.83mg/ml。该配方中各中草药含量明显低于各单一中草药成分对4种指标菌作用的有效浓度，故该配方对于抑制手、皮肤感染指标菌有明显的增效作用。其抑菌机制主要为破坏试验菌细胞壁、细胞膜的通透性，使细胞内容物漏出，抑制试验菌生长。

本发明按照2002年版《消毒技术规范》中植物成分组成的抗菌产品毒理学试验要求，进行了急性毒性试验、多次皮肤刺激试验、致突变试验(小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验)、亚急性毒性试验。急性毒性试验结果为：本复方中草药合剂为实际无毒类物质；多次皮肤刺激试验结果为：本复方中草药合剂对皮肤无刺激性；小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果为：复方中草药合剂对小鼠无体内染色体损伤作用；亚急性毒性试验结果为：各剂量组试验动物血液生化指标检测结果、血液学指标检测结果与阴性对照组比较差异均无显著性(P>0.05)、与阳性对照组比较差异有显著性(P<0.05)，动物脏器检查结果：各剂量组大鼠肝/体、肾/体、脾/体比与阴性对照组比较，差异均无显著性(P＞0.05)。

本发明的优点：

1、该复方中草药合剂中各中草药提取物的浓度明显低于各中草药提取物单独使用对本试验指标菌产生有效作用的浓度。其中黄芩提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌有抗菌作用，五倍子提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌有抗菌作用，大黄提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有抑菌作用。

2、用本复方中草药合剂涂抹手、皮肤易污染部位后无需用清水冲洗，其对涂抹部位有持续抗菌作用，且对涂抹部位皮肤无刺激作用。

3、本发明研制的新型复方中草药合剂可用于手、皮肤抗菌，其为纯植物来源的抗菌合剂，不含任何化学添加剂，对皮肤无刺激性、无生殖毒性、对人体安全无毒。本发明为一种对手、皮肤感染指标菌具有有效抗菌作用、无任何毒副作用、使用浓度低、易保存、使用有效期长、价格低廉、使用和携带方便的新型抗菌配方。

下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

附图说明

图1-1和图1-2是部分中草药对试验菌抑菌效果照片。

图2是蛋白质浓度—吸光度标准曲线。

图3是白色念珠菌DNA电泳图。

图4是绿脓杆菌DNA电泳图。

图5-6是正常绿脓杆菌透射电镜照片。

图7-8是复方中草药合剂与绿脓杆菌作用1h后透射电镜照片。

图9-10是复方中草药合剂与绿脓杆菌作用2h后透射电镜照片。

图11-12是复方中草药合剂与绿脓杆菌作用6h后透射电镜照片。

具体实施方式

1实验材料

1.1中草药成分

五倍子提取物：1:2提取物；黄芩提取物：1.5:10提取物；大黄提取物：1:3提取物。

中草药提取物购自深圳华润三九医药股份有限公司，重金属、农药残留及微生物指标均符合国家标准要求。

1.2试验菌株

根据2002年版《消毒技术规范》规定，选用手、皮肤感染的指标菌：大肠杆菌(E.coliATCC8099)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus,S.aureusATCC6538)、绿脓杆菌(P.aeruginosaATCC9027)、白色念珠菌(MoniliaalbicanATCC10231)，菌种均由青岛大学医学院微生物学教研室菌种室提供。

2实验方法与结果

2.1基础实验液制备

2.1.1中草药提取方法及中草药溶液制备

中草药提取物均采用热回流低温提取浓缩机提取，溶剂均为乙醇，乙醇温度≤85℃，提取罐温度60-80℃，浓缩罐温度50-70℃。均为比例提取物。

用电子天平分别称取中草药提取物，分别用蒸馏水溶解，用漩涡混合器混合均匀，置于电炉上加热，溶液经煮沸消毒15min后，冷却至室温备用。中草药溶液在每次试验前配制。将各中草药提取物分别换算成原药量用双倍稀释法稀释为5个浓度梯度：①400mg/ml②200mg/ml③100mg/ml④50mg/ml⑤25mg/ml。

2.1.2细菌悬液制备

用灭菌接种环在新鲜培养物平皿上取下菌苔，加入无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗菌苔，置于漩涡混合器上震荡均匀，用麦氏比浊法确定菌落浓度为1.5×10⁸cfu/mL，根据实验需要双倍稀释。菌液在每次试验前配制。

2.23种中草药抑菌效果试验

抑菌环试验：利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。试验通过抑菌环大小判断其是否具有抑菌能力。

(1)将配制好的不同浓度抑菌剂溶液20μl，分别滴加于无菌干燥直径5mm的滤纸片上，滴加无菌蒸馏水滤纸片作为阴性对照，将滤纸片干燥后备用。

(2)用麦氏比浊法配制浓度为5×10⁵cfu/ml～5×10⁶cfu/ml的试验菌悬液，用无菌棉拭子蘸取菌液并在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹，置于室温干燥5min。

(3)在每个染菌平板上贴放制备好的样片和阴性对照，盖好平皿，置37℃培养箱培养16-18h观察结果。

(4)用游标卡尺测量抑菌环直径，抑菌环直径大于7mm者，判为有抑菌作用。抑菌环直径小于或等于7mm者，判为无抑菌作用。

抑菌环试验结果：将各中草药用双倍稀释法分别配制成5个浓度梯度，分别对4种试验菌应用琼脂扩散法抑菌试验并记录结果，结果见表1-4，部分中草药平皿抑菌环结果见图1-1和图1-2。图1-1是不同浓度的五倍子稀释液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果照片，1号：400mg/ml，2号：200mg/ml，3号：100mg/ml，对照：无菌蒸馏水；图1-2是不同浓度的五倍子稀释液对绿脓杆菌的抑菌效果照片，1号：400mg/ml，2号：200mg/ml，3号：100mg/ml，对照：无菌蒸馏水。

表13种中草药对金黄色葡萄球菌抑菌环试验结果

注：抑菌环直径大于7mm为有抑菌作用。

表23种中草药对绿脓杆菌抑菌环试验结果

表33种中草药对白色念珠菌抑菌环试验结果

表43种中草药对大肠杆菌抑菌环试验结果

由以上研究结果可见，对金黄色葡萄球菌有抑菌作用的中草药有五倍子、黄芩、大黄；对绿脓杆菌有抑菌作用的中草药只有五倍子；对白色念珠菌有抑菌作用的中草药只有黄芩；对大肠杆菌有抑菌作用的中草药有五倍子、黄芩和大黄。为了对研究的4种指标菌同时有抑菌效果，最少应选择五倍子、黄芩和大黄作为复方中草药合剂配方，进一步进行五倍子、黄芩和大黄的含量配比研究以筛选复方中草药合剂的最佳配方组成。

2.3复方中草药合剂配方的筛选

根据中草药提取物的抑菌效果，选取五倍子提取物、黄芩提取物、大黄提取物换算成原药量按不同比例配制溶液，分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和白色念珠菌按滤纸片扩散法进行抑菌试验，筛选复方中草药合剂的最佳配方，各组配方筛选组成见表5。

表5各组复方中草药合剂的成分

表5续各组复方中草药合剂的成分

复方中草药合剂配方筛选试验结果：

选用对4种试验菌抑菌效果好的中草药五倍子、黄芩和大黄，按不同浓度配比配制的复方中草药合剂对4种试验菌进行抑菌试验，结果见表6。由表6结果可见只有4号、8号、20号和24号配方对白色念珠菌有抑菌作用，其中以20号对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果最好，故选择20号配方为复方中草药合剂的配方组成。20号配方为含五倍子原药量50mg/ml、黄芩原药量400mg/ml、大黄原药量100mg/ml，五倍子:黄芩:大黄的比例为1:8:2。因本试验选用五倍子为1:2提取物、黄芩为1.5:10提取物、大黄为1:3提取物，故20号配方为含五倍子提取物25mg/ml，含黄芩提取物60mg/ml、大黄提取物33.33mg/ml，五倍子提取物:黄芩提取物:大黄提取物的比例为1:2.4:1.33。

表6各组复方中草药合剂的抑菌效果

注：16号因中草药浓度过高不可溶解，无法试验。

表6续各组复方中草药合剂的抑菌效果

注：28、31、32、36、40、44、45、46、47、48、51、52、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64号因中草药浓度过高不可溶解，无法试验。

2.4最小抑菌浓度试验

根据复方中草药合剂配方筛选试验结果，对4种试验菌抑菌效果最好的中草药配方为20号：五倍子50mg/ml、黄芩400mg/ml、大黄100mg/ml，即五倍子:黄芩:大黄的比例为1:8:2。按此比例配制并稀释的复方中草药溶液对4种试验菌进行最小抑菌浓度试验，中草药溶液配方见表7。

将五倍子提取物、黄芩提取物、大黄提取物按比例配制的复方中草药溶液用双倍稀释法制备成不同浓度的溶液，分别混合溶解于琼脂培养基中，分别点种金色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌，白色念珠菌点种于沙氏培养基中，37℃培养箱中培养18h～24h，观察记录各组平皿菌落生长情况。

为了说明中草药配伍的优势，本试验同时进行了单一中草药溶液的最小抑菌浓度筛选，五倍子提取物应用50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.12mg/ml5个浓度梯度，黄芩提取物应用400mg/ml、200mg/ml、100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml6个浓度梯度，大黄提取物应用100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.12mg/ml6个浓度梯度。试验过程同上。

表7各组复方中草药合剂中中草药浓度

最小抑菌浓度(MIC)试验结果：

根据复方中草药合剂配方筛选试验结果，对4种试验菌抑菌效果最好的中草药配方为20号，按20号配方配制不同浓度复方中草药合剂对4种试验菌最小抑菌浓度试验结果见表8。为了达到对手、皮肤感染的指标菌均有较好抑菌效果，本复方中草药合剂应采用含五倍子1.25mg/ml、黄芩10mg/ml、大黄2.5mg/ml为最小抑菌浓度。因本试验选用五倍子为1:2提取物、黄芩为1.5:10提取物、大黄为1:3提取物，故最小抑菌浓度溶液为含五倍子提取物0.625mg/ml、黄芩提取物1.5mg/ml、大黄提取物0.83mg/ml。单一中草药溶液分别对4种试验菌最小抑菌浓度筛选结果见表9，由表9结果可见单一中草药溶液对4种试验菌的最小抑菌浓度明显高于复方中草药合剂中各中草药浓度，以大黄最为明显，大黄对白色念珠菌和绿脓杆菌无抑菌作用，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度为50mg/ml，而在复方中草药合剂最小抑菌浓度溶液中大黄的浓度仅为2.5mg/ml。

表8复方中草药制剂对4种试验菌的最小抑菌浓度

表9单一中草药溶液分别对4种试验菌的最小抑菌浓度

注：—为无抑菌作用。

2.5复方中草药合剂稳定性试验

配制与表7相同1—8号各浓度复方中草药溶液100ml置于锥形瓶中煮沸灭菌，密封瓶口，置于54℃培养箱中保存14d。试验过程同2.4。

复方中草药合剂稳定性试验结果：

经54℃培养箱保存14d的复方中草药合剂溶液对4种试验菌的最小抑菌浓度试验结果同表8，即经加速试验后复方中草药合剂的抑菌效果没有改变，按照2002年版《消毒技术规范》贮存有效期可定为1年。

2.6抑菌机理研究

2.6.1细菌蛋白质漏出试验

(1)将牛血清白蛋白(BSA)标准品用PBS稀释为7种不同浓度：2μg/μL、1μg/μL、0.5μg/μL、0.25μg/μL、0.125μg/μL、0.0625μg/μL、0。

(2)配置BCA工作液：取18mLA试剂和0.36mLB试剂，充分混匀，备用。

(3)将用麦氏比浊法配制的大肠杆菌菌悬液(10⁷cfu/ml)与复方中草药合剂(最小抑菌浓度溶液即五倍子提取物0.625mg/ml、黄芩提取物1.5mg/ml、大黄提取物0.83mg/ml)以1:9比例混合，取0.1mL菌悬液加入含有0.9mL复方中草药合剂(对照组用等量的PBS)的EP管中，置于漩涡混合器混匀，作用15min。12000rpm离心2min，取上清液作为待测蛋白样品。

(4)微孔检测：将不同浓度BSA标准品和待测蛋白样品各15μL分别加入标记好的96孔微孔板中，每个样本设置3个复孔。每孔加入120μLBCA工作液，充分混匀，37℃孵育30min。冷却至室温后，于酶标仪测定每个样品及BSA标准品在570nm波长下的光吸收(OD)值。

(5)绘制标准曲线：以OD值为纵坐标，BSA蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据待测样品OD值在绘制出的标准曲线上查得相应蛋白浓度。

蛋白质漏出试验结果：

1)标准曲线的绘制

以绿脓杆菌和白色念珠菌为代表试验菌测定经复方中草药合剂作用后的蛋白质漏出情况，BSA标准品OD值见表10，酶标仪(570nm)测定的光吸收值拟合出标准蛋白浓度与吸光度之间的回归方程为：Y＝0.0137+0.3512X(R＝0.9956，P＜0.01)。根据回归方程，绘制蛋白质浓度—吸光度标准曲线(横坐标为蛋白质浓度，纵坐标为OD值)，见图2。

表10BSA标准品的OD值

2)蛋白质漏出量的计算：

根据标准曲线计算出对照组和各试验组中试验菌经复方中草药合剂作用不同时间后蛋白质的浓度，蛋白质漏出量为试验组蛋白质含量与对照组蛋白质含量的差值。据此计算出白色念珠菌与复方中草药合剂作用4h后有蛋白质漏出，绿脓杆菌与复方中草药合剂作用5h后有蛋白质漏出，结果见表11。

表11试验菌与复方中草药合剂作用不同时间后蛋白质的漏出情况

注：结果为3次试验的平均值

2.6.2复方中草药合剂与细菌基因组DNA的作用

以绿脓杆菌和白色念珠菌作为试验菌的代表，研究复方中草药合剂对试验菌作用前后，其基因组DNA的变化。

取0.1ml菌悬液与0.9ml复方中草药合剂(最小抑菌浓度溶液，对照组为无菌蒸馏水)混匀，分别作用1h、2h和6h。作用完成后12000rpm离心2min，取沉淀物，用试剂盒(Promega,WizardRGenomicDNAPufificationKit)提取绿脓杆菌基因组DNA，采用液氮研磨法提取白色念珠菌基因组DNA。将提取的试验菌基因组DNA，以普通琼脂糖凝胶电泳检测结果。

复方中草药合剂对实验菌基因组DNA的作用：将最小抑菌浓度的复方中草药合剂与绿脓杆菌和白色念珠菌菌液分别作用1h、2h和6h后，分别提取各组试验菌的基因组DNA，并以普通琼脂糖凝胶电泳检测结果。对各样品DNA凝胶电泳图谱观察，如图3、4所示，对照组和白色念珠菌经复方中草药合剂作用1h、2h、6h的DNA凝胶电泳图谱分别标记为图3中的1、2、3、4；对照组和绿脓杆菌与复方中草药合剂作用1h、2h、6h的DNA凝胶电泳图谱分别标记为图4中的1、2、3、4。由凝胶电泳图谱可以看出，白色念珠菌、绿脓杆菌与复方中草药合剂作用后DNA均未发生改变。

2.6.3透射电镜观察

以绿脓杆菌作为试验菌代表进行透射电镜观察，观察复方中草药合剂的杀菌作用机制。将绿脓杆菌配制成菌悬液(10⁸cfu/ml)与复方中草药合剂(最小抑菌浓度溶液)混合后分三组进行作用，作用时间分别为1h、2h和6h，离心(12000rpm，15min)后，弃上清保留沉淀，取沉淀菌体，加入3％戊二醛固定10min，用碳网吸取菌体，室温放置5min，1％磷钨酸染色3min，室温放置15min。置于透射电镜下观察并拍照。

透射电镜观察结果：

以绿脓杆菌作为代表研究最小抑菌浓度的复方中草药合剂对试验菌的形态学影响，通过透射电镜观察经复方中草药合剂作用后绿脓杆菌的形态变化。如图5、6所示，正常绿脓杆菌细胞壁完整，外缘光滑，细菌内容物分布均匀。经复方中草药制剂作用1h，细菌细胞仍完整，菌体一侧细胞质变浅，呈空白区域，细胞内容物向一侧聚集，见图7、8。经复方中草药制剂作用2h的绿脓杆菌细胞壁部分已破损，细菌内变浅区域明显扩大，细菌内容物已明显漏出，见图9、10。经复方中草药合剂作用6h，细菌细胞壁已完全溶解，细胞内容物完全溢出，见图11、12。

2.7毒理学试验

2.7.1急性经口毒性试验

选体重18-22g小鼠20只，雌雄各半，分笼饲养。试验前预饲7d，试验期间饲喂小鼠专用维持饲料，自由饮水，每天更换垫料，定时消毒试验笼具、水具，清理试验场地，鼠房温度设为22±2℃。

(1)动物的准备：试验前禁食过夜，不限制饮水。

(2)受试物的配制：采用一次最大限度试验方法，一次灌胃剂量5000mg/(kg·bw)。按五倍子:黄芩:大黄1:8:2的比例配制溶液，电炉上煮沸灭菌备用。

(3)染毒方法：用经口灌胃方式将上述配好的复方中草药合剂给予小鼠。每只小鼠称重后，按每次30mL/(kg·bw)剂量分2次灌胃，中间间隔12h。

(4)染毒后14d内观察动物中毒表现、有无死亡、死亡数量及时间。

急性经口毒性试验结果：

采用一次最大限度试验方法，将试验小鼠按5000mg/kg体重给予复方中草药合剂灌胃，检测复方中草药合剂对实验动物的急性毒性作用。

14d内实验动物均无中毒表现、无死亡。根据判断标准，可判定复方中草药合剂LD₅₀大于5000mg/kg体重，为实际无毒级物质。

2.7.2皮肤刺激试验

采用多次完整皮肤刺激试验法，选用3只皮肤完好、重约3kg新西兰白兔，试验前24h，脱去其背部脊柱两侧各约3cm×3cm的毛，次日将最小抑菌浓度2倍复方中草药溶液0.5ml滴于2.5cm×2.5cm的2层无菌纱布上，敷贴于一侧去毛皮肤表面，用无刺激胶布固定，另一侧以蒸馏水0.5ml滴于无菌纱布上作对照。4h后去除敷贴物，用水清洗除去残留物。每天涂抹一次，连续涂抹14d。分别于去除受试物后24h观察皮肤局部反应，进行刺激反应评分。

皮肤刺激试验结果：

采用多次完整皮肤刺激试验法，对3只新西兰种白兔进行试验，以检测复方中草药合剂对实验动物皮肤的刺激作用和强度。分别于24h后观察受试兔子脊柱两侧皮肤局部反应，观察结果为试验兔两侧皮肤均无红肿和红斑，评分均为0,皮肤刺激强度分级为无刺激性级别。

2.7.3小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验

选体重25-30g小鼠50只，随机分成5组，每组10只，雌雄各半。试验设高、中、低剂量组，因复方中草药合剂(五倍子:黄芩:大黄1:8:2)LD₅₀＞5000mg/Kg体重，故以5000mg/kg体重为高剂量组，分别按5000mg/kg体重、1000mg/kg体重、250mg/kg体重的剂量为高、中、低剂量组，阳性对照组用环磷酰胺(40mg/kg体重)，阴性对照组用蒸馏水。操作程序如下：

(1)动物染毒采用经口灌胃30h染毒法，两次染毒间隔24h，第二次染毒后6h取材。

(2)用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开大腿上的皮肤和肌肉，取出左右两侧股骨，用纱布擦掉附在股骨上的血污和肌肉。剪掉股骨一端膨大的关节头，然后用注射器吸取5mL生理盐水，插入股骨另一端，冲洗骨髓腔，将骨髓细胞冲入离心管中。重复冲洗多次，直至骨髓腔呈白色为止。

(3)将上述所得细胞悬浮液1000rpm离心10min，轻轻倒掉上清液，留少许(约0.5mL)生理盐水，吹打均匀。

(4)滴一滴悬液于载玻片的一端，按常规涂片法涂片，晾干。

(5)将载玻片置于固定液(甲醇和冰乙酸按3:1混合)中固定10min，取出晾干。

(6)将载玻片置于玻璃染缸中，用Giemsa染色液(10％)染色10min-15min，然后用流水冲洗掉浮色，晾干。

(7)阳性对照组与阴性对照组的操作程序同试验组。

(8)选择细胞形态完整、分布均匀、着色适当的区域，在油镜下按一定顺序计数嗜多染红细胞(PCE)和微核。PCE呈灰蓝色，微核多数为圆形、边缘光滑、整齐，质地均匀，呈紫红色或蓝紫色。直径通常为红细胞主核的1/20-1/5。

(9)每只动物计数1000个PCE，微核细胞率以千分率表示。

小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果：

通过检测复方中草药合剂对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成的影响，评价其染色体损伤毒性。微核试验结果见表12，阴性对照组、阳性对照组微核细胞率分别为4.3‰、27‰，试验1组(LD₅₀)、试验2组(1/5LD₅₀)和试验3组(1/20LD₅₀)微核细胞率分别为5.0‰、5.1‰、4.8‰，微核细胞率经平方根数据转换后做统计学处理，经单因素方差分析，F＝308，P＜0.01；实验1组、实验2组和实验3组与阴性对照组比较差异均无显著性(P>0.05)、与阳性对照组比较差异有显著性(P<0.05)。说明该复方中草药合剂对小鼠无体内染色体损伤作用。

表12小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果

注a：为微核细胞率进行平方根数据转换后的结果；

注b：﹡为与阳性对照组结果比较，P＜0.05。

2.7.4亚急性毒性试验

选体重为75g-95g大鼠80只，随机分成4组，3个试验组和1个对照组，每组20只，雌雄各半。因本复方中草药合剂(五倍子:黄芩:大黄1:8:2)LD₅₀＞5000mg/Kg体重，故高剂量组为1000mg/Kg体重、中剂量组为500mg/Kg体重、低剂量组为250mg/Kg体重。采用灌胃方式经口染毒，每天灌胃一次，每周称体重，并按体重调整受试物的给予量。对照组给予蒸馏水，试验期为30天。试验期间观察动物的临床表现、一般状态、行为、食欲、活动及死亡情况。末次染毒后24h检测各项指标，然后处死实验动物，尾静脉取血进行血液常规检查，断头取血进行血生化检查，对处死动物进行全面肉眼尸检，取肝、肾、脾称重并计算脏器比值。

评价规定：将各试验组动物观察指标与阴性对照组加以比较，并进行差异统计学检验，试验结果用SPSS13.0统计软件进行数据处理。

亚急性毒性试验结果：

一般情况：整个试验期间各剂量组动物摄食、活动均正常，无异常症状和死亡。试验过程中，动物体重呈上升趋势。

血液学检测结果：3个剂量组雌雄动物白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白检测指标与对照组比较差异均无显著性(F为1.25～2.12，P＞0.05)。结果见表13。

表13复方中草药合剂对大鼠血液学指标的影响

血液生化检测结果表明，各剂量组试验动物谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐、血糖、甘油三脂、总胆固醇等指标与对照组比较差异均无显著性(方差分析F为0.98～3.66，P＞0.05)。结果见表14。

动物脏器检查结果：各剂量组大鼠肝/体、肾/体、脾/体比与对照组比较，差异均无显著性(P＞0.05)。组织学观察结果证明，肝、肾、脾、心、肺等脏器颜色正常，表面平滑。高剂量组雄性大鼠有一只肝脏可见有2处小灶性炎细胞浸润，程度为轻度，其他脏器与对照组比较未见明显病理改变。

表14复方中草药合剂对大鼠血液生化指标的影响

本发明应用有抗菌作用的3种中草药提取物对手、皮肤感染的指标菌进行抑菌试验，抑菌试验结果为：五倍子提取物稀释液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌均有抑菌作用，黄芩提取物稀释液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌均有抑菌效果，大黄提取物稀释液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有抑菌效果。五倍子提取物:黄芩提取物:大黄提取物的比例为1:2.4:1.33的配方为抑菌作用最好的配方，其中最小抑菌浓度为含1:2五倍子提取物0.625mg/ml、1.5:10黄芩提取物1.5mg/ml、1:3大黄提取物0.83mg/ml。该配方中各中草药含量明显低于各单一中草药成分对4种指标菌作用的有效浓度，故该配方对于抑制手、皮肤感染指标菌有明显的增效作用。其使用剂型为片剂，每片含1:2五倍子提取物63mg、1.5:10黄芩提取物150mg、1:3大黄提取物83mg(即1:2.4:1.33配比)，加水溶解混匀即可使用，每片加水量为80-100ml。

本发明的复方中草药配方，其重量份组成为五倍子0.95-1.05份、黄芩7.6-8.4份和大黄1.9-2.1份时，可以同时对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和白色念珠菌4种指标菌有抑菌作用。本发明的新型复方中草药合剂可用于手、皮肤抗菌，其为纯植物来源的抗菌合剂，不含任何化学添加剂，无生殖毒性、对人体安全无毒，且价格低廉、使用有效期长、携带方便。用本复方中草药合剂涂抹手、皮肤易污染部位后无需用清水冲洗，其对涂抹部位有持续抗菌作用，且对涂抹部位皮肤无刺激作用。

Claims (5)

1.一种用于手、皮肤抗菌的中草药组合物，其特征在于：由五倍子提取物、黄芩提取物和大黄提取物组成，所述的五倍子提取物、黄芩提取物和大黄提取物的重量比例为(0.95-1.05):(2.28-2.52):(1.27-1.4)；所述的五倍子提取物为1:2提取物，黄芩提取物为1.5:10提取物，大黄提取物为1:3提取物，中草药提取物均采用热回流低温提取浓缩机提取，溶剂为乙醇，乙醇温度≤85℃，提取罐温度60-80℃，浓缩罐温度50-70℃。

2.根据权利要求1所述的用于手、皮肤抗菌的中草药组合物，其特征在于：所述的五倍子提取物、黄芩提取物和大黄提取物的重量比例为1:2.4:1.33。

3.根据权利要求1所述的用于手、皮肤抗菌的中草药组合物，其特征在于：所述的五倍子提取物的剂量范围为63-75mg/100ml，黄芩提取物的剂量范围为150-180mg/100ml，大黄提取物的剂量范围为83-100mg/100ml。

4.根据权利要求1所述的用于手、皮肤抗菌的中草药组合物，其特征在于：所述的中草药组合物的药物剂型为片剂。

5.根据权利要求4所述的用于手、皮肤抗菌的中草药组合物，其特征在于：所述的片剂中，每片含五倍子1:2提取物63mg、黄芩1.5:10提取物150mg、大黄1:3提取物83mg。