CN110101689A - 二十八烷醇在制备预防肝损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了二十八烷醇在制备预防肝损伤药物中的应用，涉及医药技术领域。本发明提供了一种二十八烷醇的新用途，二十八烷醇在制备预防肝损伤药物中的应用。二十八烷醇能够有效预防肝损伤，且无毒副作用。

Description

二十八烷醇在制备预防肝损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及二十八烷醇在制备预防肝损伤药物中的应用。

背景技术

肝脏是哺乳动物体内重要器官之一，具有合成、解毒、代谢、分泌、生物转化以及免疫防御等功能。肝脏疾病是目前威胁人类健康的最重要的疾病之一，肝损伤由于其发病原因的普遍性和多样性而在人群中广泛存在，肝损伤会产生很多并发症，包括感染性并发症、肝创面胆漏、继发性出血、急性肝肾肺功能障碍，少数严重患者会导致暴发性或重症肝功能衰竭，死亡率极高。

在药物使用过程中，因药物本身或其代谢产物或由于特殊体质对药物的超敏感性或耐受性降低导致的肝损伤称为药物性肝损伤，多种药物可引起药物性肝损伤，如抗肿瘤的化疗药物、抗结核药、解热镇痛药、免疫抑制剂、降糖降脂药、抗细菌、抗真菌剂抗病毒药等。在美国，成人急性肝衰竭病例中50％以上是由药物引起，其中对乙酰氨基酚(APAP)导致急性肝衰竭最为常见，而且近年来病例还在增加。在我国APAP也被广泛应用于成人和儿童的感冒发热、头痛以及其他疾病所致的发热和疼痛，由药物引起的肝衰竭仅次于肝炎病毒引起的肝衰竭。大部分药物致病机制有相似的地方，APAP导致的急性肝损伤模型可作为最典型的且最容易操作的药物性肝损伤模型。

目前，临床上安全有效的肝损伤治疗药物或手段十分有限，寻找预防和治疗肝损伤的安全有效方法十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供二十八烷醇在制备预防肝损伤药物中的应用。二十八烷醇能够有效预防肝损伤，且无毒副作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种二十八烷醇在制备预防肝损伤药物中的应用。

优选地，所述肝损伤为药物性肝损伤。

优选地，所述药物性肝损伤的症状包括肝功能衰竭、继发性出血和急性肝肾肺功能障碍。

优选地，导致所述药物性肝损伤的药物包括抗肿瘤的化疗药物、抗结核药、解热镇痛药、免疫抑制剂和降糖降脂药。

优选地，所述解热镇痛药为对乙酰氨基酚。

优选地，所述二十八烷醇是从动植物蜡质中提取得到。

优选地，所述动植物蜡质的来源包括糠蜡、蔗蜡、蜂蜡和虫蜡中的一种或几种。

优选地，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂或颗粒剂。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

本发明提供了二十八烷醇在制备预防肝损伤药物中的应用。通过细胞和动物试验，证实了二十八烷醇无细胞毒性，能够有效预防药物性肝损伤。

附图说明

图1为二十八烷醇标准品GC图谱；

图2为本发明精馏制备的二十八烷醇GC图谱；

图3为先二十八烷醇后对乙酰氨基酚分别孵育HL-7702细胞24h后细胞存活率图；

图4为二十八烷醇细胞毒性检测图；

图5为生化试剂盒法检测先二十八烷醇后对乙酰氨基酚分别孵育 HL-7702细胞24h后培养液上清中ALT和AST指标；

图6为生化试剂盒法检测先二十八烷醇后对乙酰氨基酚分别孵育 HL-7702细胞24h后培养液上清中LDH和AKP指标；

图7为TC20全自动细胞计数仪检测先二十八烷醇后对乙酰氨基酚分别孵育HL-7702细胞24h后总细胞数、活细胞数、活细胞率图；

图8为荧光法检测先二十八烷醇后对乙酰氨基酚分别孵育HL-7702细胞 24h后细胞凋亡坏死程度，其中(1)200ug/mL；(2)100ug/mL；(3)50ug/mL； (4)0ug/mL；(5)CK；

图9为小鼠肝脏组织H&E染色。

具体实施方式

本发明提供了二十八烷醇在制备预防肝损伤药物中的应用。

本发明对所述二十八烷醇的来源没有特殊限定，优选从动植物蜡质中提取得到的二十八烷醇；所述动植物蜡质的来源优选为糠蜡、蔗蜡、蜂蜡和虫蜡中的一种或几种。本发明对所述二十八烷醇的制备方法没有特殊限定，在本发明实施例中优选包括以下步骤：

将无水乙醇、航空煤油、氢氧化钠与动植物蜡质混合后进行加热回流提取，得到提取液；将所述提取液进行过滤后，取上清液冷却、抽滤后，得到滤饼；将所述滤饼脱溶、烘干，得到二十八烷醇粗品；将所述二十八烷醇粗品进行精馏，收集二十八烷醇。

在本发明中，所述无水乙醇、航空煤油的体积和氢氧化钠、动植物蜡质的质量比优选为(100～140)ml:(260～300)ml:(4.6～5.0)g:(38～42)g，更优选为 120ml:280ml:4.8g:40g。

在本发明中，所述加热回流提取的时间优选为4～5h，更优选为4.5h。

在本发明中，所述二十八烷醇粗品进行精馏的方法优选将二十八烷醇粗品放入精馏釜，加热，当釜温到达240℃后，开真空泵，真空度保持在20～50Pa，全回流30～50min后，控制回流比为1:10，收集210～235℃主馏分，即为二十八烷醇。

在本发明中，所述肝损伤优选为药物性肝损伤；所述药物性肝损伤的症状优选包括肝功能衰竭、继发性出血和急性肝肾肺功能障碍；所述导致所述药物性肝损伤的药物优选包括抗肿瘤的化疗药物、抗结核药、解热镇痛药、免疫抑制剂或降糖降脂药。

在本发明中，所述解热镇痛药优选为对乙酰氨基酚。

本发明对所述制备预防肝损伤药物的辅料的种类没有特殊限定，采用常规制备药物的辅料即可。本发明对所述制备预防肝损伤药物的剂型没有特殊限定，优选片剂、胶囊剂和颗粒剂。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

二十八烷醇的制备：将40g蜂蜡于500mL三口烧瓶中，加入120mL无水乙醇，280mL航空煤油，加入4.8g氢氧化钠，水浴加热至沸，搅拌回流反应4.5小时后，将反应液移至分液漏斗，用热水洗涤多次，除去下层水相，洗至 PH值等于7，将上层清液倒入烧杯冷却过夜，真空抽滤，得滤饼，将滤饼脱溶、烘干，即得二十八烷醇粗品；将获得的二十八烷醇粗品放入精馏釜中，加热，当釜温到达240℃后，开真空泵，真空度保持在20～50Pa，全回流30min 后，控制回流比为1:10；根据塔顶温度的变化情况，收集210～235℃主馏分，气相色谱检测，含量为73％的二十八烷醇。如图1和2所示。

实施例2

(1)取实施例1制备的二十八烷醇，添加5％DMSO(V/V)和0.1％吐温 80(V/V)，用灭菌双蒸水配制2000ug/mL二十八烷醇混悬液，将二十八烷醇混悬液避光在沸水中加热溶解30min，后将二十八烷醇溶液放置于装有90℃热水的超声波仪器中超声30min，二十八烷醇溶液变澄清并达到灭菌效果；配制的2000ug/mL二十八烷醇溶液用灭菌双蒸水配制含5％DMSO(V/V)和0.1％吐温80(V/V)的1000ug/mL、500ug/mL、0ug/mL二十八烷醇溶液，用RPMI-1640 完全培养液配制含200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、0ug/mL二十八烷醇工作浓度，其中，含200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、0ug/mL的二十八烷醇工作浓度中，DMSO和吐温80终浓度分别为0.5％和0.01％(V/V)。

(2)用灭菌双蒸水配制100mM对乙酰氨基酚储存液，用RPMI-1640完全培养液配制含10mM对乙酰氨基酚工作液。

(3)用含10％血清、含青霉素和链霉素分别为100U/mL，100ug/mL RPMI-1640完全培养液培养HL-7702细胞，将HL-7702细胞置于37℃，5％ CO₂，饱和湿度培养箱培养至细胞融合度达到80％，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化下细胞，用1640完全培养液配制1×10⁵细胞/mL细胞悬液，将细胞悬液分别均匀布液于96孔(100uL/孔，每个设置组6个重复)、24孔(1mL/孔，每个设置组3个重复)、6孔(2mL/孔，每个设置组3个重复)无菌细胞培养板中，将布好细胞悬液的细胞培养板放置于37℃，5％CO₂，饱和湿度培养箱培养至细胞贴壁。

(4)细胞贴壁后将细胞培养板中的培养液移去，用预冷的无菌PBS洗涤细胞3次，立即用含200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、0ug/mL二十八烷醇工作液孵育细胞24小时，小心移去上清用预冷的无菌PBS洗涤细胞3次，立即用含10mM对乙酰氨基酚工作液共同孵育细胞24小时。

(5)96孔板培养细胞加入20uL 0.5％MTT溶液，置于37℃，5％CO₂，饱和湿度培养箱继续培养4h，小心移去上清，加入100uL DMSO避光缓慢震荡15min，使用酶标仪于562nm波长处检测每孔OD值，计算细胞存活率，细胞存活率＝(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)，结果如图3所示，相较于APAP组(0ug/mL)，OC组细胞存活率分别增加了9.1％(50ug/mL)， 22％(100ug/mL)和31％(200ug/mL)。MTT法检测二十八烷醇溶液对HL-7702 细胞毒性的结果如图4所示，各浓度的二十八烷醇溶液孵育HL-7702细胞不同时间细胞存活率均未出现显著性下降(P>0.05)。

(6)6孔板培养细胞小心吸取上清，用ALT、AST、LDH、AKP生化试剂盒检测细胞培养液上清中的ALT、AST、LDH、AKP含量，结果如图5和图6所示，与对照组相比，APAP组ALT、AST、LDH、AKP 4种酶活性分别增加了61.5％、75％、45.7％和50％；与APAP组比较，OC组ALT、AST、LDH、AKP 4种酶活性极大地降低，当用超过100ug/mLOC预孵育细胞后4 种酶活性显著性降低(P<0.05)，用200ug/mLOC预孵育细胞后4种酶活性较 APAP组分别降低了49.2％、47％、22％和22％。用预冷的无菌PBS洗涤细胞 3次，用200uL/孔胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞1min，用600uL 1640完全培养液终止消化反应，轻轻吹打细胞，将细胞悬液移入1.5mL灭菌离心管，用300uL1640完全培养液洗涤孔2次，合并每孔细胞悬液，1000rpm，10min 离心弃上清，用500uL无菌PBS重悬细胞，取9uL细胞悬液加入1uL 0.4％台盼蓝混匀，立即用TC20全自动细胞计数仪检测总细胞数和活细胞数，结果如图7所示，相较于对照组，OC组和APAP组总细胞数、活细胞数都显著性降低，但是OC组相较于APAP组细胞总数、活细胞数和活细胞率都显著性增加 (P<0.05)。

(7)24孔板培养细胞小心移去上清，用预冷的无菌PBS洗涤细胞3次，每孔加入1mL细胞染色缓冲液，分别加入5uL Hoechst 33342染色液和5uL PI 染色液，混匀，冰浴或4℃孵育20min，用倒置荧光显微镜检测各组细胞凋亡和坏死情况，结果如图8所示，相较于OC组和对照组，APAP组细胞凋亡和坏死率都显著性增加，相较于APAP组，OC组细胞凋亡和坏死率都显著性降低。

实施例3

(1)通过添加10％DMSO(V/V)和1％吐温80(V/V)，用灭菌双蒸水配制 10mg/mL、0mg/mL二十八烷醇混悬液，将二十八烷醇混悬液避光在沸水中加热溶解30min，二十八烷醇溶液变成分散均匀的乳浊液并达到灭菌效果，在室温下避光能够保存2周不会析出固体颗粒。

(2)取30只6～8周龄雄性SPF级BALB/c小鼠(18～20g)，在明暗周期 12h/12h，温度25±2℃，湿度40％-60％，自由摄食、饮水条件下喂养，用基础饲料适应性喂养1周，将小鼠分成正常对照组(NC)，模型组(AP)，二十八烷醇组(OC)3组，每组10只小鼠。NC组和AP组小鼠每日灌胃一次0mg/mL 二十八烷醇乳浊液10mL/kg.d，OC组每日灌胃一次10mg/mL二十八烷醇 100mg/kg.d，连续灌胃2周，喂养结束后AP、OC组小鼠腹腔注射配制的 20mg/mL对乙酰氨基酚200mg/kg，NC组小鼠腹腔注射10mL/kg生理盐水，并对所有小鼠禁食不禁水，10h后后采集小鼠血液3500rpm 10min离心制备血清，用ALT和AST生化试剂盒检测血清中ALT和AST含量，结果见表1。肝脏组织用组织固定液固定，用H&E染色观察肝脏组织病理变化，结果如图9所示，正常对照NC组肝组织病理学检测显示肝结构正常，中央静脉和肝细胞放射索正常；APAP组肝组织病理学检测显示小叶中心区肝细胞有明显的细胞变性和坏死，中央静脉不规则扩张伴随严重充血，肝细胞分离，严重水肿和伴有大量炎症反应分离；OC组肝组织病理学检测显示肝细胞结构基本正常，肝细胞轻度水肿。以上结果表明，二十八烷醇对由对乙酰氨基酚造成的肝毒性有显著的降低作用，二十八烷醇对预防肝损伤具有巨大的潜在作用。

表1小鼠血清ALT、AST值测定

	ALT	AST
			NC	20±4.86*	74.83±12.77*
AP	243±68.94	173.5±10.41
			OC	33.8±11.65*	123.2±10.78*

*与APAP组比较P<0.05，n＝10。

动物实验结果显示，处死小鼠前统计NC组小鼠存活率为100％，AP组小鼠存活率为70％，OC组小鼠存活率为100％。由表1可知，灌胃100mg/kg 二十八烷醇溶液OC组小鼠血清中的ALT和AST较灌胃0mg/kg二十八烷醇溶液AP组小鼠血清中的ALT和AST显著降低(p<0.05)。

由实施例2和3的结果可知，MTT法检测显示先用二十八烷醇孵育 HL-7702细胞24小时再用乙酰氨基酚溶液孵育细胞24小时后，添加大于 100ug/mL二十八烷醇组活细胞数比阳性对照组(添加0ug/mL二十八烷醇)活细胞数显著提高；MTT法检测显示各浓度的二十八烷醇溶液均对HL-7702细胞无细胞毒性；培养液上清中ALT、AST、LDH、AKP指标测定结果显示添加大于100ug/mL二十八烷醇组凋亡细胞和坏死细胞相比较阳性对照组(含 0ug/mL二十八烷醇)显著降低；TC20全自动细胞计数仪检测细胞结果显示，添加大于100ug/mL二十八烷醇组细胞总数、活细胞数均比阳性对照组(含 0ug/mL二十八烷醇)显著提高；Hoechst33342/PI双染倒置荧光法检测细胞凋亡结果显示添加大于100ug/mL二十八烷醇组凋亡细胞和坏死细胞相比较阳性对照组(含0ug/mL二十八烷醇)显著降低；小鼠肝脏H&E染色结果显示， NC组小鼠肝脏细胞基本正常，无明显变性坏死，肝窦未见淤血，组织未见炎症。AP组小鼠肝脏细胞广泛重度水肿，大面积细胞坏死。OC组小鼠肝脏出现轻度水肿，轻度炎症灶。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.二十八烷醇在制备预防肝损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝损伤为药物性肝损伤。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物性肝损伤的症状包括肝功能衰竭、继发性出血和急性肝肾肺功能障碍。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，导致所述药物性肝损伤的药物包括抗肿瘤的化疗药物、抗结核药、解热镇痛药、免疫抑制剂和降糖降脂药。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述解热镇痛药为对乙酰氨基酚。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述二十八烷醇是从动植物蜡质中提取得到。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述动植物蜡质的来源包括糠蜡、蔗蜡、蜂蜡和虫蜡中的一种或几种。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂或颗粒剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。