CN112899234B - 一种帕金森病伴发抑郁细胞模型及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种帕金森病伴发抑郁细胞模型及其制备方法和用途，包括：获取SH‑SY5Y细胞，将获取的SH‑SY5Y细胞在基础培养基中培养至一定融合度，进行消化，获得SH‑SY5Y细胞悬液；利用极低频脉冲电磁场对SH‑SY5Y神经细胞进行刺激培养后再进行诱导培养，最后利用6‑OHDA与皮质酮结合电处理诱导得到帕金森病伴发抑郁细胞模型。本发明利用6‑OHDA与皮质酮联合诱导SH‑SY5Y细胞损伤，同时利用探针进行细胞电刺激加深SH‑SY5Y细胞的抑郁程度，全面而整体模拟了PDD的特点，对于PDD的病理生理研究、发病机制研究、体外药物筛选和药物评价等，均具有广泛的意义。

Description

一种帕金森病伴发抑郁细胞模型及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种帕金森病伴发抑郁细胞模型及其制备方法和用途。
背景技术
目前：帕金森病(Parkinson's disease)，是一种常见的神经系统疾病，帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺能的变性死亡，由此而引起纹状体多巴胺含量显著性减少而致病。导致这一病理改变的确切病因目前仍不清楚，遗传因素、环境因素、氧化应激等均可能参与帕金森病多巴胺能神经元的变性死亡过程。
帕金森病作为典型运动障碍性疾病，以典型四大运动症状(震颤、肌强直、动作迟缓及姿势平衡障碍)为主要表现。除此之外，大多数患者在病程中会出现非运动症状，尤其是抑郁。帕金森病伴发抑郁（Parkinson’s disease depression，PDD）的发生率为40%~50%，然而，现有技术虽然有构建帕金森或抑郁症的细胞模型，但是并没有帕金森病伴发抑郁的复合细胞模型，帕金森或抑郁症的细胞模型不能全面而整体模拟PDD的特点，只是局限于单病的细胞模型，极大限制了PDD的病理生理研究、发病机制研究、体外药物筛选和药物评价等。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术没有帕金森病伴发抑郁的复合细胞模型；现有帕金森或抑郁症的细胞模型不能全面而整体模拟PDD的特点，极大限制了PDD的病理生理研究、发病机制研究、体外药物筛选和药物评价等。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种帕金森病伴发抑郁细胞模型及其制备方法和用途。
本发明是这样实现的，一种帕金森病伴发抑郁细胞模型的构建方法，所述帕金森病伴发抑郁细胞模型的构建方法包括：
步骤一，获取SH-SY5Y细胞，将获取的SH-SY5Y细胞在基础培养基中培养至一定融合度，进行消化，获得SH-SY5Y细胞悬液；
步骤二，将得到的SH-SY5Y细胞悬液接种于6孔板中，并利用极低频脉冲电磁场对SH-SY5Y神经细胞进行刺激培养一段时间；
步骤三，步骤二培养得到的SH-SY5Y细胞在含有多聚赖氨酸以及全反式维甲酸的培养基中进行诱导培养后，并利用D-Hanks’液清洗2遍；
步骤四，向孔内加入包含6-OHDA与皮质酮的无FBS的DMEM培养液，边对培养基中的细胞进行电处理边孵育即可得所述帕金森病伴发抑郁细胞模型。
进一步，步骤一中，所述将获取的SH-SY5Y细胞在基础培养基中培养至一定融合度，进行消化，获得SH-SY5Y细胞悬液包括：
（1）将SH-SY5Y细胞放置于基础培养基中在35-38℃、4.5-6.5％的CO2、饱和湿度下进行培养；
（2）待细胞长满细胞培养板后，利用0.3％的胰酶消化后进行离心；收集细胞，正常DMEM培养液重悬，即可得到H-SY5Y细胞悬液。
进一步，所述基础培养基为包含10％胎牛血清、2％双抗以及2%谷氨酰胺的DMEM-F12培养基；所述培养基每28小时更换一次液体。
进一步，所述利用极低频脉冲电磁场刺激SH-SY5Y神经细胞包括：
采用信号频率为60Hz、输出电流为0.2A，脉冲电磁场输出频率为60Hz、电流强度为0.2A的脉冲波形刺激SH-SY5Y神经细胞。
进一步，步骤二中，所述接种密度为6×105～8×105/孔。
进一步，步骤四中，所述无FBS的DMEM培养液中包含60mM/L的 6-OHDA与90μM/L的皮质酮。
进一步，所述对培养基中的细胞进行电处理包括：
利用脑深部电磁耦合刺激与电信号检测的探针对培养基中的细胞进行电处理。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述帕金森病伴发抑郁细胞模型的构建方法构建的帕金森病伴发抑郁细胞模型。
本发明的另一目的在于提供一种所述帕金森病伴发抑郁细胞模型在筛选药物中的用途。
进一步，所述用途包括：在筛选改善或治愈帕金森病伴发抑郁的药物中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明利用6-OHDA与皮质酮联合诱导SH-SY5Y细胞损伤，同时利用探针进行细胞电刺激加深SH-SY5Y细胞的抑郁程度，全面而整体模拟了PDD的特点，克服了单一细胞模型的缺陷，对于PDD的病理生理研究、发病机制研究、体外药物筛选和药物评价等，均具有广泛的意义。
同时本发明在细胞培养过程中利用极低频脉冲电磁场刺激SH-SY5Y神经细胞有效提高了细胞的增殖速度明显更快，细胞活性更强，避免了传代培养导致的细胞活性降低，利用不高的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的帕金森病伴发抑郁细胞模型的构建方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种帕金森病伴发抑郁细胞模型及其制备方法和用途，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的SH-SY5Y细胞购买自华越洋生物SH1703。
如图1所示，本发明实施例提供的帕金森病伴发抑郁细胞模型的构建方法包括：
S101，获取SH-SY5Y细胞，将获取的SH-SY5Y细胞在包含10％胎牛血清、2％双抗以及2%谷氨酰胺的DMEM-F12培养基于35-38℃、4.5-6.5％的CO2、饱和湿度下进行培养；
S102，待细胞长满细胞培养板后，利用0.3％的胰酶消化后进行离心；收集细胞，正常DMEM培养液重悬，得到SH-SY5Y细胞悬液；将得到的SH-SY5Y细胞悬液以6×105～8×105/孔的密度接种于6孔板中；
S103，利用信号频率为60Hz、输出电流为0.2A的极低频脉冲电磁场以输出频率为60Hz、电流强度为0.2A的脉冲波形刺激SH-SY5Y神经细胞对SH-SY5Y神经细胞进行刺激培养一段时间；
S104，步骤S103培养得到的SH-SY5Y细胞在含有多聚赖氨酸以及全反式维甲酸的培养基中进行诱导培养后，并利用D-Hanks’液清洗2遍；
S105，向孔内加入包含60mM/L的 6-OHDA与90μM/L的皮质酮的无FBS的DMEM培养液，边利用脑深部电磁耦合刺激与电信号检测的探针对培养基中的细胞进行电处理边孵育即可得所述帕金森病伴发抑郁细胞模型。
下面结合具体实验对本发明的技术方案与技术效果作进一步说明。
1、实验分组：
正常对照组：未做任何处理的SH-SY5Y细胞；
帕金森病细胞模型：60mM/L 6-OHDA干预SH-SY5Y细胞；
抑郁症细胞模型：90μM/L的皮质酮干预SH-SY5Y细胞；
6-OHDA联合皮质酮组：利用本发明实施例提供的帕金森病伴发抑郁细胞模型构建方法构建的帕金森病伴发抑郁细胞模型。
2、指标检测：
（1）MTT比色法检测细胞存活率：
分别向未做任何处理的SH-SY5Y细胞、60mM/L的6-OHDA干预SH-SY5Y细胞、90μM/L的皮质酮干预SH-SY5Y细胞以及帕金森病伴发抑郁细胞模型中加入25uL 的0.5% 的MTT溶液培养一段时间后去除培养液，并分别加入120uL DMSO，置水平摇床上低速振荡15min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上检测OD490。
结果处理公式如下：细胞存活率(%)=OD490(实验组)/OD490(对照组)*100%；
设定正常组MTT代谢率为100，其余各组吸光度值与之相比得到各自的MTT代谢率，监测细胞的数目与活力。
（2）TUNEL染色法检测细胞凋亡率
将未做任何处理的SH-SY5Y细胞、60mM/L的6-OHDA干预SH-SY5Y细胞、90μM/L的皮质酮干预SH-SY5Y细胞以及帕金森病伴发抑郁细胞模型均匀接种在放有14 mm圆形盖玻片的24孔板中，取出培养有细胞的盖玻片置于3%的中性甲醛中固定15 min，用PBS缓冲液清洗3次，严格按照TUNEL染色试剂盒操作步骤进行染色。光镜下随机取20个高倍镜视野观察，并计算凋亡细胞的百分比。
（3）乳酸脱氢酶LDH漏出率的测定
用LDH试剂盒的方法对未做任何处理的SH-SY5Y细胞、60mM/L的6-OHDA干预SH-SY5Y细胞、90μM/L的皮质酮干预SH-SY5Y细胞以及帕金森病伴发抑郁细胞的LDH的释放情况进行测定。
按照LDH试剂盒说明书的方法，于440nm波长条件测定各管吸光值，并计算每个处理组的LDH漏出率。LDH漏出率计算公式如下：
LDH漏出率=[（培养液OD值）/（培养液OD+细胞匀浆液OD值）]*100%
（4）神经递质检测
采用酶联免疫吸附测定(Elisa)检测细胞内神经递质NE, DA, 5-HT的含量。每组设5个复孔，重复三次。将未做任何处理的SH-SY5Y细胞、60mM/L的6-OHDA干预SH-SY5Y细胞、90μM/L的皮质酮干预SH-SY5Y细胞以及帕金森病伴发抑郁细胞浓度调整到100万/ml左右，加入细胞裂解液使细胞放出细胞内成份。离心15分钟左右(3200-3500转/分)。认真收集上清液。严格按照Elisa试剂盒说明测定指标含量。
（5）CREB、BDNF含量检测
采用免疫细胞化学法检测神经营养因子BDNF, CREB含量。将未做任何处理的SH-SY5Y细胞、60mM/L的6-OHDA干预SH-SY5Y细胞、90μM/L的皮质酮干预SH-SY5Y细胞以及帕金森病伴发抑郁细胞分别放置于玻片上，并用多聚甲醛溶液(4% ) 在室温下固定20min；在每张玻片上滴加阻断内源性过氧化物酶的4%的H202作用8min,PBS洗涤3次，每次3min；加入正常山羊血清作封闭液，20℃下孵育15min；加入一抗，4℃水盒孵育过夜；在20℃下，滴加二抗孵育15 min；加入HRP标记的链霉菌杭生物素蛋白孵育15min；新鲜配制的DAB显色；去离子水冲洗5min；55℃烘干后中性树脂封片；倒置显微镜拍照记录染色情况。
3、统计学处理
所有数据用SPSS 17.0软件处理，结果用均数4-标准差表示，每组实验重复5次或5次以上。采用单因素方差分析(ANOVA)检验，t检验进行均数间的多重比较，以p<0.05为统计学有显著差异。
4、实验结果：
（1）MTT比色法检测细胞存活率：
与正常组比较，6-OHDA组、皮质酮组细胞存活率均显著下降(P<0.01)；6-OHDA联合皮质酮组的细胞存活率均明显下降，差异有统计学意义(P<0.05 )。
与6-OHDA组比较，6-OHDA联合皮质酮组细胞存活率均下降，且差异有统计学意义( P<0.05 )。
与皮质酮组比较，6-OHDA联合皮质酮组细胞存活率均下降，但差异无统计学意义。
（2）TUNEL染色法检测细胞凋亡率
正常组TUNEL染色阳性细胞极为少见，在所选取的20个视野中只见3个阳性细胞；6-OHDA组、皮质酮组阳性细胞数量有所增加，每个高倍镜视野可见4-5个阳性细胞，细胞核染呈蓝黑色，形态不规则；6-OHDA联合皮质酮组阳性细胞较多，每个高倍镜视野可见6-7个。
（3）乳酸脱氢酶LDH漏出率的测定
乳酸脱氢酶C Lactate Dehydrogenase, LDH )，是一种胞浆酶，正常生理条件下LDH主要分布在细胞内，极少漏出到细胞外，但是当细胞病变损伤，细胞质膜受到破坏时，就会有大量LDH由细胞内漏出至培养液。所以，经常用LDH释放情况评价细胞质膜完整程度以及细胞的损伤情况，LDH漏出率越大，说明细胞受到的损伤越严重，细胞凋亡程度也越高。
正常组的DH漏出率为5%左右，6-OHDA组、皮质酮组LDH漏出率为25-30%；6-OHDA联合皮质酮组DH漏出率为30%。
（4）神经递质检测
与正常组比较，6-OHDA组细胞内5-HT含量降低，差异无统计学意义(P>0.05 )；DA、NE含量降低，差异有统计学意义(P<0.01 ) ；
皮质酮组、6-OHDA联合皮质酮组细胞内DA、NE、5-HT含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.01 )；
与6-OHDA组比较，皮质酮组、6-OHDA联合皮质酮组细胞内DA、NE、5-HT含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.01 )。
（5）CREB、BDNF含量检测
各组细胞BDNF、CREB免疫细胞化学结果表明：与正常组比较，6-OHDA组BDNF、CREB蛋白含量没有显著变化，皮质酮组和6-OHDA联合皮质酮组BDNF、CREB免疫阳性显著减弱(P<0.01)。与葡萄糖组和皮质酮组比较，6-OHDA联合皮质酮组BDNF、CREB免疫反应变化更加显著(P<0.05 )。
5、结论
实验数据表明，6-OHDA组和皮质酮组的DA、NE、5-HT、CREB及BDNF含量均会有所下降，但与正常组比较，无明显差异(p>0.05 )；而6-OHDA联合皮质酮组细胞内DA、NE、 5-HT、CREB及BDNF含量均显著下降(p<0.05)。
因此，本发明以SH-SY5Y细胞为研究对象，6-OHDA、皮质酮为干预因素，细胞存活率、损伤率和DA、NE、5-HT、CREB、BDNF为观测指标，建立的PDD细胞模型具有高效率、低成本、短周期的特点，并且可操作性强，重复性好。故可以用作研究PDD发病机制动物模型以及治疗药物筛选的模型。
以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种帕金森病伴发抑郁细胞模型的构建方法，其特征在于，所述帕金森病伴发抑郁细胞模型的构建方法包括：
步骤一，获取SH-SY5Y细胞，将获取的SH-SY5Y细胞在基础培养基中培养至一定融合度，进行消化，获得SH-SY5Y细胞悬液；
步骤二，将得到的SH-SY5Y细胞悬液接种于6孔板中，并利用极低频脉冲电磁场对SH-SY5Y神经细胞进行刺激培养一段时间；
步骤三，步骤二培养得到的SH-SY5Y细胞在含有多聚赖氨酸以及全反式维甲酸的培养基中进行诱导培养后，并利用D-Hanks’液清洗2遍；
步骤四，向孔内加入包含6-OHDA与皮质酮的无FBS的DMEM培养液，边对培养基中的细胞进行电处理边孵育即可得所述帕金森病伴发抑郁细胞模型；
步骤一中，所述，将获取的SH-SY5Y细胞在基础培养基中培养至一定融合度，进行消化，获得SH-SY5Y细胞悬液包括：
(1)将SH-SY5Y细胞放置于基础培养基中在35-38℃、4.5-6.5％的CO2、饱和湿度下进行培养；
(2)待细胞长满细胞培养板后，利用0.3％的胰酶消化后进行离心；收集细胞，正常DMEM培养液重悬，即可得到H-SY5Y细胞悬液；
所述利用极低频脉冲电磁场刺激SH-SY5Y神经细胞包括：
采用信号频率为60Hz、输出电流为0.2A，脉冲电磁场输出频率为60Hz、电流强度为0.2A的脉冲波形刺激SH-SY5Y神经细胞。
2.如权利要求1所述帕金森病伴发抑郁细胞模型的构建方法，其特征在于，所述基础培养基为包含10％胎牛血清、2％双抗以及2％谷氨酰胺的DMEM-F12培养基；所述培养基每28小时更换一次液体。
3.如权利要求1所述帕金森病伴发抑郁细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤二中，所述接种密度为6×105～8×105/孔。
4.如权利要求1所述帕金森病伴发抑郁细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤四中，所述无FBS的DMEM培养液中包含60mM/L的6-OHDA与90μM/L的皮质酮。
5.如权利要求1所述帕金森病伴发抑郁细胞模型的构建方法，其特征在于，所述对培养基中的细胞进行电处理包括：
利用脑深部电磁耦合刺激与电信号检测的探针对培养基中的细胞进行电处理。
6.一种利用如权利要求1-5任意一项所述帕金森病伴发抑郁细胞模型的构建方法构建的帕金森病伴发抑郁细胞模型。
7.一种如权利要求6所述帕金森病伴发抑郁细胞模型在筛选药物中的用途。
8.如权利要求7所述用途，其特征在于，所述用途包括：在筛选改善或治愈帕金森病伴发抑郁的药物中的应用。
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