CN102258772B - 一种新的肿瘤树突状细胞治疗性疫苗的制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新的肿瘤的树突状细胞治疗性疫苗的制备方法及其用途。该类疫苗为化疗药物诱导性肿瘤抗原，负载并活化树突状细胞，制备成肿瘤治疗性疫苗。本发明的化疗药物诱导性肿瘤抗原，包含多种免疫刺激分子和肿瘤相关及特异性抗原，可以显著趋化和激活树突状细胞和T细胞等免疫细胞，刺激树突状细胞成熟并表达多种细胞因子和趋化因子，有效诱导抗原特异性和非特异性的免疫应答反应，增强机体免疫功能。本发明的疫苗可用于肿瘤的预防及治疗，具有制备简便、成本低、特异性强、疗效显著等特点。

Description

一种新的肿瘤树突状细胞治疗性疫苗的制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及生物学和医学领域，更具体地涉及一种新型高效树突状细胞肿瘤治疗性疫苗的制备方法以及该类疫苗在各类肿瘤治疗预防中的应用。

背景技术

肿瘤的主动性免疫治疗是治疗及预防肿瘤或感染性疾病的有效手段，自从人类采用接种牛痘预防天花以来，人类在感染性疾病的预防及控制上取得了很大的进展，目前在我国已经基本消灭了天花、脊髓灰质炎等感染性疾病，但在其他重大疾病的治疗方面如肿瘤等疾病的预防及治疗方面，仍然缺乏有效的手段。

肿瘤的免疫治疗是继手术、放疗、化疗之后的一个新的治疗模式，肿瘤免疫治疗的中心环节就是诱导机体产生特异性和非特异性的抗肿瘤免疫。采用肿瘤疫苗去诱导特异性的抗肿瘤免疫，对于抑制肿瘤的生长及转移更为重要，目前尽管已知一些肿瘤抗原，但对于大多数肿瘤来说，肿瘤抗原仍是未知的。目前常用的肿瘤疫苗包括采用全细胞瘤苗、肿瘤细胞的裂解物、肿瘤抗原致敏的树突状细胞瘤苗、基因工程疫苗等，取得了一定的疗效，但也明显存在不足。

1.肿瘤相关抗原肽疫苗。目前人类已经获得了四类肿瘤相关抗原，(1)肿瘤特异性抗原，包括MAGE-1、MAGE-3、GAGE、RAGE等，这类抗原在正常组织除了睾丸和胎盘外不表达，只在肿瘤细胞中表达；(2)肿瘤分化抗原，包括MART-1、gp-100、酪氨酸激酶相关蛋白-1，分布于黑色素细胞瘤；(3)突变基因编码蛋白，如MUM-1等这些基因分布广泛，但在肿瘤组织中突变而成为肿瘤抗原；(4)在肿瘤组织高表达的一类抗原，如HER2-neu等。目前采用合成抗原肽或基因工程表达及DNA疫苗的方式制备该类疫苗。

2.树突状细胞瘤苗。树突状细胞是体内最强的专职性抗原递呈细胞，是抗肿瘤免疫应答的始作俑者，采用肿瘤细胞裂解物或肿瘤相关抗原肽致敏树突状细胞回输体内，可以诱导抗原特异性的免疫应答，目前该类疗法已经进入临床Ⅰ-Ⅲ期试验

3.抗独特型抗体疫苗。抗独特型抗体可以模仿蛋白和抗原肽，在部分试验中人们已经可以应用抗独特型抗体诱导针对肿瘤相关抗原的特异性的免疫反应，该类疫苗的优势在于可以产生比抗原肽更强的免疫应答。

4.基因修饰的肿瘤疫苗。采用病毒或基因修饰肿瘤细胞作为瘤苗是研究较多的一类肿瘤疫苗，主要是采用细胞因子基因、共刺激分子等、希望提高肿瘤细胞的免疫原性，诱导抗肿瘤免疫应答。

然而，目前以上4种肿瘤疫苗均存在明显不足，许多肿瘤抗原不明确，无法诱导肿瘤特异性的CTL，而采用树突状细胞瘤苗和基因修饰的肿瘤细胞瘤苗，也存在体外操作复杂、质量难以控制、疗效有限等因素。

因此，本领域迫切需要开发新的疗效好、操作简便的新肿瘤疫苗。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效的用于肿瘤治疗及预防的疫苗成分，该疫苗成分是采用细胞经化疗药物5-FU后的含肿瘤抗原的上清液；

本发明的另一目的是提供所述含肿瘤抗原的上清液的制法及用途。

在本发明的第一方面，提供了一种含肿瘤抗原的上清液，所述的上清液是由肿瘤细胞经化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导培养后的，经离心去除肿瘤细胞和固态杂质后获得的上清液，并且所述的上清液具有以下特征：

(a)包含以下免疫刺激分子：HMGB1；

(b)含有选自下组的免疫分子：肿瘤抗原、MHC分子、粘附分子或共刺激分子；和

(c)含有热休克蛋白分子。

在另一优选例中，所述的上清液还具有以下特性：

(d)可以刺激树突状细胞分泌选自下组的细胞因子和趋化因子：IL-1β、IL-12、TNF-α和MIP-1α(CCL3)、MIP-3β(CCL19)和IP-10(CXCL10)；

(e)所述的含肿瘤抗原的上清液在体外可以趋化和激活树突状细胞、T细胞，诱导抗原特异性和非特异性的免疫应答反应。

在另一优选例中，所述的上清液是用如下方法制备的：

(a)将所述的肿瘤细胞在37±3℃下用化疗药物5-FU诱导培养0.5-48小时，获得培养液；和

(b)对步骤(a)的培养液进行离心，从而获得培养上清。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞是选自下组肿瘤的细胞：肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、恶性淋巴瘤、白血病、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、口腔癌、骨肉瘤、脑胶质瘤、膀胱癌、多发性骨髓瘤。

在本发明的第二方面，提供了一种致敏的树突状细胞，所述的树突状细胞是用本发明第一方面中所述的含肿瘤抗原的上清液致敏的。

在另一优选例中，所述的致敏的树突状细胞具有以下特性：

(i)分泌选自下组的细胞因子和趋化因子：IL-1β、IL-12、TNF-α和MIP-1α(CCL3)、MIP-3β(CCL19)和IP-10(CXCL10)；

(ii)分泌MHCⅡ分子HLA-DR；

(iii)分泌共刺激分子CD80，CD86；

(iv)刺激同种异体的T细胞增殖。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有有效量的本发明第二方面中所述的致敏的树突状细胞，和药学上可接受的载体。或者，所述的药物组合物含有有效量的本发明第一方面中所述的含肿瘤抗原的上清液，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的组合物是疫苗组合物。

在本发明的第四方面，提供了一种制备含肿瘤抗原的上清液的方法，包括以下步骤：

(a)将所述的肿瘤细胞在37±3℃下用化疗药物5-FU诱导培养0.5-48小时，获得培养液；和

(b)对步骤(a)的培养液进行离心，从而获得培养上清。

在另一优选例中，在步骤(a)中，在浓度为1.0×10^-6M至1.0×10^-2M(较佳地0.5-1.5×10^-3M)的5-FU存在下，进行诱导培养。

在另一优选例中，在步骤(a)中，肿瘤细胞的数量为1×10⁵至1×10⁷个细胞/ml，较佳地0.5×10⁶个细胞/ml至5×10⁶个细胞/ml。

在另一优选例中，在步骤(b)中，离心在5000-20000rpm下进行。

在本发明的第五方面，提供了一种制备本发明上述的致敏的树突状细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

用本发明第一方面中所述的含肿瘤抗原的上清液，按50μg/10⁶个树突状细胞的剂量(或按50μg/ml树突状细胞培养液的剂量)致敏树突状细胞，从而获得致敏的树突状细胞。

在另一优选例中，所述的被致敏的树突状细胞是培养5-7天的树突状细胞。

在本发明的第五方面，提供了本发明上述的含肿瘤抗原的上清液或所述的致敏的树突状细胞的用途，它们被用于制备预防或治疗肿瘤药物。

在本发明的第六方面，提供了一种预防或治疗肿瘤的方法，该方法包括，给个体施用安全有效量的本发明的上述的含肿瘤抗原的上清液或所述的致敏的树突状细胞的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明一个实例中，用化疗药物诱导性肿瘤抗原，负载并活化树突状细胞的显微镜观察结果。

图2显示了化疗药物诱导性肿瘤抗原包含免疫刺激分子Hsp70。

图3显示了化疗药物诱导性肿瘤抗原包含免疫刺激分子HMGB1。

图4显示了化疗药物诱导性肿瘤抗原，可以刺激树突状细胞成熟并表达MHCⅡ分子HLA-DR，共刺激分子CD80，CD86。

图5显示了化疗药物诱导性肿瘤抗原，可以刺激树突状细胞成熟并表达多种细胞因子。

图6显示了化疗药物诱导性肿瘤抗原，可以刺激树突状细胞成熟并表达多种趋化因子。

图7显示了化疗药物诱导性肿瘤抗原负载的树突状细胞刺激同种异体的T细胞增殖的促进作用。

图8显示了化疗药物诱导性肿瘤抗原负载的树突状细胞对肿瘤的抑制作用。

图9显示了化疗药物诱导性肿瘤抗原负载的树突状细胞对荷瘤宿主生存期的延长作用。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现肿瘤细胞经化疗药物5-FU诱导后的含肿瘤抗原的上清液是一种新的可用于制备肿瘤的疫苗的抗原材料，可以很好地解决疾病抗原不明确、难以诱导特异性免疫应答的不足，同时可以明显提高疗效，具有制备简便、特异性高、诱导免疫应答强、疗效好等特点，这类疫苗是一种经化疗药物诱导性肿瘤抗原，负载并活化树突状细胞，制备成肿瘤治疗性的疫苗。在此基础上完成了本发明。

本发明的经化疗药物5-FU诱导培养后获得的上清液，含有肿瘤抗原，并且具有自身独特的生物学特性，具体表现在：

(1)化疗药物诱导性肿瘤抗原具体为5-氟尿嘧啶诱导的肿瘤细胞；

(2)化疗药物诱导性肿瘤抗原可以包含免疫刺激分子，如Hsp70，HMGB1

(3)化疗药物诱导性肿瘤抗原可以刺激树突状细胞分泌多种细胞因子和趋化因子，如IL-1β、IL-12、TNF-α和MIP-1α(CCL3)、MIP-3β(CCL19)和IP-10(CXCL10)等；

(4)化疗药物诱导性肿瘤抗原含有肿瘤相关及特异性抗原分子；

(5)体外可以趋化和激活树突状细胞、T细胞等免疫细胞，诱导抗原特异性和非特异性的免疫应答反应，增强机体免疫功能；

本发明的实验证实，5-FU诱导后含肿瘤抗原的上清液可以显著趋化DC和T细胞，并且被所述含肿瘤抗原的上清液所致敏的树突状细胞可有效地激发针对肿瘤细胞的免疫反应。

制备方法

本发明还提供这种所述含肿瘤抗原的上清液的制备方法，它主要包括步骤：

(a)将所述的肿瘤细胞在37±3℃下用化疗药物5-FU诱导培养0.5-48小时，获得培养液；和

(b)对步骤(a)的培养液进行离心，从而获得培养上清。

在另一优选例中，在步骤(a)中，在浓度为1.0×10^-6M至1.0×10^-2M(较佳地0.5-1.5×10^-3M)的5-FU存在下，进行诱导培养。

在另一优选例中，在步骤(b)中，离心在5000-20000rpm下进行。

另一方面，本发明还提供了被上述上清液的致敏的树突状细胞的方法，包括以下步骤：

用本发明第一方面中所述的含肿瘤抗原的上清液，致敏树突状细胞，从而获得致敏的树突状细胞。

在另一优选例中，所述的被致敏的树突状细胞是培养5-7天的树突状细胞。

在本发明的一个具体实例中，本发明方法包括：

(1)收集培养于RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清)中的人肿瘤细胞，调整浓度至1-2×10⁶/ml，，加入终浓度为0.5-1.5×10^-3M的5-Fu，5-Fu的优化终浓度为1.0×10^-3M，然后在370C孵箱中孵育12-24小时

(2)8000-10000rpm离心5-10分钟，收集上清；获得由化疗药物诱导性肿瘤抗原

(3)取此化疗药物诱导性肿瘤抗原50mg/ml致敏48h的第6天DC，即获得此种新型高效的用于肿瘤治疗及预防的疫苗。

组合物和用途

本发明还提供了一种药物组合物或免疫组合物。在所述组合物中，含有药学上可接受的载体(包括稀释剂、赋形剂等)以及有效量的本发明经所述上清液致敏的树突状细胞。所述的致敏的树突状细胞的数量通常为1万-100000万个细胞/剂，较佳地为100万-10000万个细胞/剂。

本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如肿瘤抗原)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington′s PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。此外，免疫组合物中还可以含有免疫佐剂。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

本发明的含致敏的树突状细胞的治疗或预防性药物组合物(包括疫苗)，可以经皮下、皮内、腔内、瘤内或病变部位、淋巴结、静脉注射或埋植等方式应用。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。

本发明的新型的肿瘤疫苗(即致敏的树突状细胞)可用于治疗和预防肿瘤发生，对已发生的肿瘤具有治疗作用。代表性的例子包括(但并不限于)：各种肿瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、恶性淋巴瘤、白血病、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、口腔癌、骨肉瘤、脑胶质瘤、膀胱癌、多发性骨髓瘤等的预防及治疗。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的致敏的树突状细胞可分泌多种趋化因子、共刺激分子、MHC分子以及携带肿瘤抗原信息。这种新型疫苗，可以有效诱导机体产生高效的抗肿瘤免疫应答，有效激发起特异性和非特异性抗肿瘤免疫，对肿瘤进行治疗以及预防其复发和转移。

(2)这种新型高效的肿瘤疫苗，未经基因修饰和外源基因导入，因此对机体潜在危害作用小，没有伦理的难题，无个体限制性。制备简单易行，是一种极有临床应用前景的新型生物制剂和疫苗，具有重要的应用价值和良好的市场前景，对有效控制肿瘤的发生发展、改善恶性肿瘤治疗现状具有重要意义，将有极大的社会效益和经济效益。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数为重量百分比和重量份数。

实施例1

新型高效肿瘤疫苗的制备

收集培养于RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清)人肿瘤细胞(人结肠癌细胞SW480)，调整浓度至1×10⁶/ml，加入终浓度为1.0×10^-3M的5-Fu，然后在37℃孵箱中孵育12小时，10000rpm离心10分钟，收集上清，作为肿瘤抗原。

将如上获得的由化疗药物诱导性肿瘤抗原，按肿瘤抗原50μg/10⁶DC致敏48h的第6天DC，即获得此种新型高效的用于肿瘤治疗及预防的疫苗。显微镜下观察结果，如图1所示。

实施例2

化疗药物诱导性肿瘤抗原包含免疫刺激分子Hsp70，HMGB1

收集培养于RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清)中的人结肠癌细胞SW480，调整浓度至1×10⁶/ml，1ml/孔置于24孔板中，每孔分别加入0.5×10^-3M，1.0×10^-3M，1.5×10^-3M的5-Fu，于作用后的0、4、12、24小时后收集细胞及上清，用热休克蛋白70(Hsp70)，高速泳动族蛋白B1(HMGB1)Flisa kit(RD公司)，检测细胞上清中免疫刺激分子的浓度。

结果如图2，图3所示。结果表明：化疗药物诱导性肿瘤抗原包含免疫刺激分子Hsp70和HMGB1。

实施例3

化疗药物诱导性肿瘤抗原，可以刺激树突状细胞成熟并表达多种细胞因子和趋化因子

收集培养于RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清)中的人结肠癌细胞SW480，调整浓度1×10⁶/ml，置于培养瓶中，加入终浓度为1.0×10^-3M的5-Fu，然后在37℃孵箱中孵育12小时，10000rpm离心5-10分钟，收集上清。将培养至第六天的DC，用人DC完全培养基(RPMI-1640完全培养基，500U/ml rhGM-CSF、10ng/ml rhIL-4)调整细胞浓度为2×10⁵细胞/ml浓度，加入50μg/ml SW480细胞裂解液来源的抗原，4小时后收集细胞，FACS标记后，于流式细胞仪上记数，如图4所示。收集上清，用细胞因子IL-1β、IL-12、TNF-α和与趋化因子MIP-1α、MIP-3β和IP-10的Elisa kit(RD公司)，检测细胞上清中细胞因子和趋化因子的浓度。

结果如图5-6所示。

图5显示，化疗药物诱导性肿瘤抗原，可以刺激树突状细胞成熟并表达多种细胞因子，包括IL-1β、TNF-α、IL-12。

图6显示，化疗药物诱导性肿瘤抗原，可以刺激树突状细胞成熟并表达多种趋化因子，其中包括：MIP-1a、MIP-3β、IP-10。

实施例4

化疗药物诱导性肿瘤抗原负载的树突状细胞刺激同种异体的T细胞增殖的促进作用

正常人外周血经淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque1077)梯度离心后，收集富含单个核细胞的界面细胞，RPMI1640洗3遍，充分去除Ficoll-Hypaque 1077和血小板，将其重悬于RPMI1640中，置37℃、5％CO₂孵箱培养2小时，收集非贴壁细胞，用5％FBS的RPMI1640重悬，调节细胞浓度为2×10⁶/ml，此悬液中富含T淋巴细胞(反应细胞)。将T淋巴细胞按2×10⁵/100μl/孔加入96孔板，刺激细胞为化疗药物诱导性肿瘤抗原50μg/ml致敏48h的第6天患者的新鲜制备的APDC，经丝裂霉素C(25μg/ml)、37℃、5％CO₂孵育1小时后，用5％FCS的RPMI1640充分洗涤去除丝裂霉素C，设置5×10⁴、1×10⁴、2×10³/100μl/孔的刺激细胞，加入96孔板。每实验组设立3个复孔。设置阳性对照孔，PHA(5μg/ml)+T淋巴细胞；和阴性对照孔，单独T淋巴细胞+1640。每组设3复孔。置37℃、5％CO₂孵箱中孵育96小时，于孵育结束前4小时加入5mg/ml的MTT(10μl/孔)。将培养板200×g离心10分钟，弃去100μl/孔的上清，加入DMSO溶液100μl，37℃放置待甲臜结晶完全溶解后，于570nm处测定光密度值。结果表明，该化疗药物诱导性肿瘤抗原可以直接刺激或增强树突状细胞刺激同种异体T淋巴细胞的增殖反应。

结果如图7所示。结果显示了化疗药物诱导性肿瘤抗原负载的树突状细胞刺激同种异体的T细胞增殖的促进作用。

实施例5

化疗药物诱导性肿瘤抗原，负载并活化树突状细胞，制备成肿瘤治疗性疫苗对肿瘤生长的抑制作用

颈椎脱位法处死HLA-A2/Kb小鼠，无菌取股骨，无血清RPMI1640培养基冲洗出骨髓细胞，1000g×5分钟离心后小心吸弃培养基上清，3-5ml的Tris-NH₄Cl溶液溶去红细胞，加入抗Ia、B220、CD4、CD8单抗(终浓度均为10μg/ml)及补体(10∶1稀释)，37℃水浴45分钟溶除T、B及Ia+细胞，洗两次后，以1×10⁶细胞/孔加入24孔板培养，加10ng/ml mGM-CSF、1ng/ml mIL-4，培养3天后，吸弃培养基及悬浮细胞，重新加入新鲜RPMI1640完全培养基及mGM-CSF、mIL-4，继续培养3天后，吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，收集后置新培养瓶培养，3天后收集悬浮细胞即为富集的骨髓来源的树突状细胞。

收集上述培养至第六天的小鼠DC，用小鼠DC培养基(RPMI1640完全培养基，10ng/ml mGM-CSF、1ng/ml mIL-4)调整细胞浓度为2×10⁶细胞/ml浓度，分入24孔板，每孔1ml，孔数与需免疫的小鼠的只数相同，按照实验分组分别加入PBS、50ug/ml的化疗药物诱导性肿瘤抗原，并设置相同孔数的未加任何刺激的DC作为空白对照组，4小时后收集细胞，弃培养基上清，PBS离心洗涤细胞两次以除去原培养基中存在的刺激物，最后用PBS调整细胞浓度为1×10⁶细胞/100μl浓度，共200μl，随即用于免疫小鼠。分别皮下注射1×10⁶PBMC，每只小鼠共免疫三次，间隔一周。末次免疫7天后，从各组随机取三只小鼠，无菌操作摘取小鼠脾脏，作成T细胞，备用。6-8周龄的雌性裸鼠共15只，分为5组，每组5只，在每只小鼠的右侧腹部皮下一点接种体外培养扩增的活力良好的SW480肿瘤细胞，剂量为5×10⁶细胞/鼠。3天后肿瘤长至30-50mm²大小后，尾静脉回输至荷瘤裸鼠体内，数量为1×10⁸细胞/500μl·鼠，第一次回输后7天进行第二次回输。每间隔2天对每只小鼠的肿瘤大小进行测量，记为(mm²)±SD，并观察其存活期。当肿瘤直径达到3cm时，处死小鼠，并在统计生存率时，将当日记为死亡日期，

结果表明：采用本发明提供的新型肿瘤高效疫苗，可以明显抑制肿瘤的生长如图8所示，延长荷瘤小鼠的存活时间如图9所示。

此外，重复实施例1，用人乳腺癌细胞SK-BR3、人前列腺癌细胞PC-3、人宫颈癌细胞HeLa替换结肠癌细胞SW480，制得经化疗药物5-FU诱导的含肿瘤抗原的上清液，以及被所述上清液致敏DC细胞。结果，也获得了类似的结果(抑制肿瘤的生长，并延长存活时间)。

讨论

常规化疗药物均为细胞毒性药物，大多数化疗药物通过诱导凋亡等机制抑制肿瘤细胞的同时，也可杀伤机体正常的细胞，抑制患者的免疫功能。因此传统观念认为，化疗之后机体免疫功能低下，化疗药物在某种程度上抑制免疫系统的功能。随着对化疗药物的研究不断深入，近年来的研究表明化疗可以增强肿瘤细胞的免疫原性、增强肿瘤抗原表达及表面共刺激分子等的表达、增强肿瘤细胞对CTL的敏感性、减少免疫抑制因子和免疫抑制细胞的数量并抑制其功能进而遏抑免疫抑制效应。

(一)化疗药物可以抑制免疫抑制细胞和免疫抑制性细胞因子的产生：

①化疗减少Treg细胞的数量并抑制其功能

研究表明在卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌等多种肿瘤患者外周血中和肿瘤局部，Treg细胞比例增高，且数量与患者肿瘤进展程度和预后，生存率呈负相关。Curiel等证明在卵巢癌患者中，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg抑制肿瘤特异性T细胞的免疫活性，有助于肿瘤的生长、进展。另外，Treg数目增多也与死亡危险率增高以及生存率降低有关。Lutsiak等发现小剂量的CTX不仅能减少Treg细胞的数量，还能通过下调GITR和Foxp3的表达而抑制Treg细胞的功能。除CTX外，迄今还发现其他一些化疗药物可以对Treg细胞起抑制作用，如Beyer等检测73例接受氟达拉滨化疗方案的B细胞慢性淋巴性白血病患者化疗前、后(化疗后第7天)的外周血，结果显示化疗后，Treg抑制功能明显减弱，Treg数目明显减少。吉西他滨与OXA等多药联合治疗转移性结肠癌患者也可明显降低Treg细胞的数量

②消除髓样来源抑制细胞(myeloid derived suppressor cells，MDSCs)

髓样来源抑制细胞MDSCs是一组由粒细胞，单核/巨噬细胞和处于早期分化阶段的髓系前体细胞组成的细胞群。肿瘤患者的外周血及肿瘤组织中MDSCs数量和比例均有大幅度的增加，贯穿肿瘤发生的整个过程，且与肿瘤的大小和恶性程度有一定的相关性。MDSCs一方面可以表达多种促血管形成因子，如VEGF和MMPs，促进肿瘤血管的形成。另一方面MDSCs可以通过表达高水平的ARGI、iNOS和ROS抑制T细胞介导的特异性抗肿瘤免疫及NK和巨噬细胞介导天然抗肿瘤免疫。研究报道部分化疗药物可以选择性的消除MDSC并保留T细胞亚群进而增强肿瘤免疫和肿瘤疫苗的效应。吉西他滨在建立的小鼠肿瘤模型中，吉西他滨可以有效的减少在荷瘤小鼠脾脏中MDSC的数量，但并不减少CD4和CD8T细胞，还可以增强肿瘤特异性T细胞介导的免疫反应，激活NK细胞，提高疫苗效应。另外，还有一类分化诱导剂也可以作用于肿瘤病人减少MDSC的积聚。全反式维甲酸ATRA，维生素A的衍生物，调节细胞分化促MDSC成熟，减弱免疫抑制效应。用ATRA治疗荷瘤小鼠，可以恢复T细胞反应，减少在脾脏、淋巴结和骨髓中MDSC的数量并诱导其分化为成熟的DC，巨噬细胞和中性粒细胞。此外，对转移性肾细胞癌病人给于ATRA治疗可以减少MDSC的数量并增强肿瘤特异性T细胞应答

(二)化疗药物可以增强肿瘤细胞的免疫原性

化疗药物可以诱导肿瘤细胞死亡促进各种内源性免疫刺激分子的释放。这些分子在正常状态下存在于活细胞内的一群分子，维持细胞内各种功能，肿瘤细胞经过外界刺激时，如化疗药物处理过后，可形成特殊的诱导免疫原性的细胞死亡，主要特点是刺激细胞免疫刺激分子表达至细胞膜上，或释放至细胞外，从而增强肿瘤细胞的免疫原性，激活抗原提呈细胞，诱导肿瘤免疫效应。这些免疫刺激分子主要包括热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)，高速泳动族蛋白B1(highmobility group box 1，HMGB1)，钙网织蛋白(calreticulin，CRT)等。

化疗药物还可以促进肿瘤抗原的表达、诱导肿瘤细胞增强其MHC-Ⅰ类分子、共刺激分子的表达，从而改变肿瘤细胞的免疫原性。MHCⅠ类分子是抗原提呈系统中的重要成分，肿瘤细胞MHCⅠ类分子及共刺激分子是效应T细胞识别、杀伤肿瘤细胞所必须。而CEA抗原被认为是鉴定结肠癌等癌症的重要指标，且作为促进机体的免疫应答的肿瘤相关抗原疫苗已应用于多种临床试验中。

本发明研制了一种新型高效树突状细胞肿瘤治疗性疫苗，其可以有效诱导机体产生高效的抗肿瘤免疫应答，有效激发起特异性和非特异性抗肿瘤免疫，对肿瘤进行治疗以及预防其复发和转移。

实验证实化疗药物一方面诱导了肿瘤细胞的凋亡和大量免疫刺激分子的释放，其诱导了后续的固有免疫和获得性免疫效应：这些分子可以促进DC等抗原递呈细胞(antigen presentation cell，APC)的成熟、诱导这些细胞分泌大量的趋化因子和细胞因子。一方面招募NK、巨噬细胞等固有免疫效应细胞，杀伤肿瘤细胞，另一方面进一步招募非成熟DC等具有摄取抗原能力的APC，摄取被递呈化疗诱导的凋亡释放的肿瘤抗原，从而诱导后续的获得性免疫应答。另一方面化疗药物诱导肿瘤细胞高表达肿瘤相关抗原、MHC-Ⅰ类分子和fas，增强肿瘤细胞对免疫效应细胞的敏感性，去除免疫抑制细胞的效应，从而增强诱发的固有和获得性免疫效应，起到杀伤肿瘤细胞抑制肿瘤生长的作用。

由于这种新型高效树突状细胞肿瘤治疗性疫苗，携带有肿瘤抗原，又有几乎所有目前研制的高效肿瘤疫苗所必须的共刺激信号的特性，未经基因修饰和外源基因导入，因此对机体潜在危害作用小，没有伦理的难题，无个体限制性，且制备简单易行，因而可成为一种极有临床应用前景的新型生物制剂和疫苗，具有重要的应用价值和良好的市场前景，对有效控制肿瘤的发生发展、改善恶性肿瘤治疗现状具有重要意义，将有极大的社会效益和经济效益。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种含肿瘤抗原的上清液，其特征在于，所述的上清液是由肿瘤细胞经化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导培养后的，经离心去除肿瘤细胞和固态杂质后获得的上清液，并且所述的上清液具有以下特征：

(a)包含以下免疫刺激分子：HMGB1；

(b)含有选自下组的免疫分子：肿瘤抗原、MHC分子、粘附分子或共刺激分子；和

(c)含有热休克蛋白分子；

其中，所述的上清液是用如下方法制备的：

(a)将所述的肿瘤细胞在37±3℃下用化疗药物5-FU诱导培养0.5-48小时，获得培养液；和

(b)对步骤(a)的培养液进行离心，从而获得培养上清。

2.如权利要求1所述的含肿瘤抗原的上清液，其特征在于，所述的上清液还具有以下特性：

(d)可以刺激树突状细胞分泌选自下组的细胞因子和趋化因子：IL-1β、IL-12、TNF-α和MIP-1α(CCL3)、MIP-3β(CCL19)和IP-10(CXCL10)；

(e)所述的含肿瘤抗原的上清液在体外可以趋化和激活树突状细胞、T细胞，诱导抗原特异性和非特异性的免疫应答反应。

3.如权利要求1所述的含肿瘤抗原的上清液，其特征在于，是用如下方法制备的：

(a)将所述的肿瘤细胞在37℃下用化疗药物5-FU诱导培养0.5-48小时，获得培养液；和

(b)对步骤(a)的培养液进行离心，从而获得培养上清。

4.如权利要求1所述的含肿瘤抗原的上清液，其特征在于，所述的肿瘤细胞是选自下组肿瘤的细胞：肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、恶性淋巴瘤、白血病、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、口腔癌、骨肉瘤、脑胶质瘤、膀胱癌、多发性骨髓瘤。

5.一种致敏的树突状细胞，其特征在于，所述的树突状细胞是用权利要求1所述的含肿瘤抗原的上清液致敏的。

6.如权利要求5所述的致敏的树突状细胞，其特征在于，所述的致敏的树突状细胞具有以下特性：

(i)分泌选自下组的细胞因子和趋化因子：IL-1β、IL-12、TNF-α和MIP-1α(CCL3)、MIP-3β(CCL19)和IP-10(CXCL10)；

(ii)分泌MHCⅡ分子HLA-DR；

(iii)分泌共刺激分子CD80，CD86；

(iv)刺激同种异体的T细胞增殖。

7.一种药物组合物，其特征在于，含有有效量的权利要求5所述的致敏的树突状细胞，和药学上可接受的载体。

8.一种制备含肿瘤抗原的上清液的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将所述的肿瘤细胞在37±3℃下用化疗药物5-FU诱导培养0.5-48小时，获得培养液；和

(b)对步骤(a)的培养液进行离心，从而获得培养上清。

9.一种制备权利要求5所述的致敏的树突状细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

用权利要求1所述的含肿瘤抗原的上清液，按50μg/10⁶个树突状细胞的剂量或按50μg/ml树突状细胞培养液的剂量致敏树突状细胞，从而获得致敏的树突状细胞。

10.如权利要求1所述的含肿瘤抗原的上清液或权利要求5所述的致敏的树突状细胞的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗肿瘤药物。