KR20190015742A - 암에 대한 면역요법 - Google Patents
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Abstract
골수-유래 억제 세포-억제제와 조합하여 편평 세포 암종의 치료에 사용하기 위한 면역원성 조성물을 포함하는 조성물 뿐만 아니라 상응하는 치료 방법이 개시된다.
Description
폐암은 가장 빈번하게 진단되는 암 중 하나에 속하고, 5-15%의 5-년 생존을 갖는 악성 질환 중에서 사망률의 주요 원인이다. 미국에서 비소세포 폐암 (NSCLC)은 폐암 사례의 85% 초과를 차지하고, 흔하게 전이성 질환을 갖는 진행 병기 환자에서 빈번하게 진단된다 (Derman et al., 2015). NSCLC는 조직학에 따라 3개의 하위유형으로 나눠질 수 있다: 선암종 (AC, 50%), 편평 세포 암종 (SCC, 30%) 및 대세포 암종 (5%). 상이한 유형의 NSCLC 종양의 조직학적 분류는 2015년에 세계 보건 기구에 의해 개정된 바 있다 (Travis et al., 2015). 또한, 상이하게 메틸화된 유전자는 AC 및 SCC 사이를 구별하기 위해 기재된 바 있다 (Huang et al., 2016). 소세포 암종은 나머지 15%의 폐암 사례를 포함한다. 폐암의 발생률 및 사망률은 높게 남아있다. 따라서 가능하게는 면역요법제 전략을 사용하여 개선된 요법의 개발에 대한 긴급한 필요가 있다.
면역요법 분야에서의 엄청난 노력에도 불구하고 지금까지 단지 극소수의 치료 양식만이 실제로 시판되고 있다. 이는 종양에서의 면역 세포 침윤 및 암 환자에서 흔하게 관찰되는 면역 억제 이면의 메카니즘의 관련성의 여전히 불완전한 이해로 인한 것일 수 있다.
면역 억제는 골수-유래 억제 세포 (MDSC 또는 MDSC)의 주요 특색이다. MDSC의 주요 표적은 T 세포이다. MDSC-매개 면역 억제에 수반되는 주요 인자는 예를 들어 아르기나제 (ARG1), iNOS, TGFb, IL10, COX2, 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO), 시스테인의 격리, T 세포에 의한 L-셀렉틴 발현의 감소를 포함한다. 단핵구성 MDSC (M-MDSC)는 NO 및 시토카인의 생산과 연관된 메카니즘을 활용하는, 항원-특이적 및 비-특이적 방식 둘 다로 T-세포 반응을 억제한다 (Gabrilovich et al., 2012). 다형핵 MDSC (PMN-MDSC)는 항원-특이적 T-세포 관용을 유도하는, 항원-특이적 방식으로 일차적으로 면역 반응을 억제할 수 있다 (Koehn et al., 2015, Marigo et al., 2010). 반응성 산소 종 (ROS) 생산은 이러한 능력에 대해 필수적이다. NO와 슈퍼옥시드의 반응은 퍼옥시니트라이트 (PNT)를 생성하며, 이는 T-세포 수용체를 니트로화하고 동족 항원-MHC 복합체에 대한 그의 반응성을 감소시킴으로써 T 세포를 직접적으로 억제한다 (Nagaraj et al., 2007). PNT는 또한 종양 세포 상에서 MHC 분자에 대한 항원 펩티드의 결합을 감소시키고 (Lu et al., 2011b), T-세포-특이적 케모카인을 니트로화함으로써 T-세포 이동을 차단한다 (Molon et al., 2011).
종양 미세환경에서의 면역 억제성 세포의 제2 부류는 조절 T 세포 (Treg)이며, 이는 폐암에서 면역 반응의 억제에 중대한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다 (Domagala-Kulawik et al., 2014).
여전히, 다양한 종양 또는 종양 하위유형에서의 종양 미세환경은 불량하게 이해되고 있다. 놀랍게도 실제로 MDSC가 폐암의 하위유형, 즉 SCC에서 면역 억제의 우세한 역할을 하는 것으로 본 발명의 과정에서 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 암의 치료, 보다 구체적으로 SCC를 앓고 있는 환자 또는 NSCLC를 앓고 있는 계층화된 환자에 대한 종양의 면역억제성 미세환경을 제한하는 치료를 위한 면역원성 조성물에 관한 것이다.
정의
"면역원성 조성물"은 개체에서 면역 반응을 유발하는 조성물을 지칭한다. 이러한 면역원성 조성물은 전형적으로 모든 종류의 백신이며, 여기서 항원 조성물 (백신)의 주사는 항원에 대한, 즉 암의 경우에 종양 특이적 항원에 대한 면역 반응을 유발한다. 전형적인 암 백신은 수지상 세포 요법/백신 (DC 백신), 입양 T-세포 요법, 펩티드성, DNA 또는 mRNA 백신 또는 종양용해 바이러스이다. 바람직한 실시양태에서, DC 백신이 사용된다.
"DC 백신"은, 항원 공급원 없이 또는 항원 공급원으로 제조된, 투여될 수 있는 치료 용도를 위한 DC를 지칭한다. 바람직하게는, DC는 종양 연관 펩티드(들), DNA 또는 RNA로부터의 전체 항원, 전체 항원-단백질, 이디오타입 단백질, 종양 용해물/전체 종양 세포 또는 바이러스 벡터-전달 전체 항원으로부터 선택된 항원 공급원으로 제조된 것이다.
"Treg"는 CD4, CD25, 및 Foxp3 전사 인자에 대해 양성인 T-세포를 지칭하며, 이는 종양-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 NK 세포의 기능 및 증식을 억제한다.
"골수-유래 억제 세포" 또는 "MDSC"는 Treg를 유도하고 (Malek et al., 2016) 다양한 면역억제성 분자의 생산에 의하여 이펙터 T-세포 증식을 제한하는 것으로 보고되어 있다. 보다 구체적으로, MDSC는 하기로 명명되는 세포의 2개의 큰 군으로 이루어진다: "다형핵" (PMN-MDSC) - 대안적으로 또한 "과립구성" (G-MDSC), 이는 호중구와 표현형적으로 및 형태학적으로 유사함, 및 "단핵구성" (M-MDSC), 이는 단핵구와 표현형적으로 및 형태학적으로 유사함. 또한, 초기-병기 MDSC (eMDSC)가 존재하고 있다 (Gabrilovich, 2017). 본 출원 내에서, 용어 MDSC는 단독으로 사용될 때 M-MDSC 및 PMN-MDSC를 포괄하는 것으로 이해될 것이다. 인간에서 PMN-MDSC는 CD11b+CD14-CD15+ 또는 CD11b+CD14-CD66b+로서, 및 M-MDSC는 CD11b+CD14+HLA-DR-/loCD15-로서 정의된다. M-MDSC는 MHC 부류 II 분자 HLA-DR의 발현을 기반으로 하여 단핵구로부터 분리될 수 있다. PMN-MDSC는 예를 들어 표준 피콜 구배를 사용하여 구배 원심분리에 의해 호중구로부터 분리될 수 있다. PMN-MDSC는 저밀도 분획 (PBMC)이 풍부화된 반면에, 호중구는 고밀도 세포이다 (Dumitru et al., 2012). 최근에 렉틴-유형 산화된 LDL 수용체 1 (LOX-1)이 PMN-MDSC의 마커로서 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다 (Condamine et al., 2016).
"MDSC-억제제"는 MDSC를 차단, 감소 및/또는 억제하는 분자를 지칭하며, 이는 MDSC의 증식 또는 분화를 억제하며, 예를 들어 올-트랜스-레티노산 (ATRA)은 MDSC의 분화를 억제한다. MDSC-억제제는 MDSC의 분화/성숙을 차단 또는 억제하거나, MDSC의 이동을 차단 또는 억제하거나, 또는 MDSC의 고갈/MDSC의 아폽토시스를 유도하거나, 또는 MDSC의 확장을 억제한다. 대안적으로, MDSC-억제제는 또한 MDSC를 탈활성화시키거나, MDSC의 성숙 세포로의 분화를 억제하거나, MDSC의 발생을 차단하거나, 또는 MDSC를 고갈시키는 분자로 그룹화될 수 있다 (Wesolowski et al., 2013). 이러한 맥락에서, 분자는 바람직하게는 분자량 ≤ 2500 달톤, 특히 ≤ 900 달톤을 갖는 저분자량 분자, 및/또는 생물제약 거대분자, 바람직하게는 재조합 치료 단백질을 지칭한다.
"건강한 개체"는 악성 질환의 병력이 없는 개체를 지칭한다. 유사하게, "건강한 조직"은 치료될 종양이 유래되는 동일한 기관의 악성 질환의 징후가 없는 조직, 예를 들어 폐 조직을 지칭한다.
용어 "포함하는"이 본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 경우에, 이는 다른 요소를 배제하지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "로 이루어진"은 용어 "를 포함하는"의 바람직한 실시양태인 것으로 간주된다. 이하에서 군이 적어도 특정 수의 실시양태를 포함하는 것으로 정의되는 경우에, 이는 또한 바람직하게는 단지 이들 실시양태만으로 이루어진 군을 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
단수형 명사가 사용되는 경우에, 이는 구체적으로 달리 언급되지 않는 한 해당 명사의 복수형을 포함한다.
기술 용어는 그의 통상의 의미로 사용된다. 특정한 의미가 특정 용어로 전달되는 경우에, 용어의 정의는 용어가 사용되는 맥락에서 하기에 주어질 것이다.
클론 생존 및 요법 저항을 가능하게 하는 특징인 암 불균질성은 능동 면역 반응에 의해 구체화된다. 항원-특이적 T 세포는 입양 T-세포 전달 및 체크포인트 차단과 같은 면역요법에 의해 임상적으로 제시된 바와 같이 암을 제어할 수 있다. 그러나, 암 면역요법은 여전히 낮은 성공률 및 누가 이익을 얻을 것인지 및 왜 요구되는지에 대한 상세한 이해를 갖는다 (Harrop, 2013).
본 발명의 기저를 이루는 연구에서, 신보조 수술을 겪은 비소세포 폐암 (NSCLC) 환자의 초기 38개의 선암종 (AC) 및 35개의 편평 세포 암종 (SCC)으로부터의 원발성 종양 (Tu) 및 비-종양 폐 조직 (NTu), 및 13명의 AC 및 12명의 SCC 환자 및 10명의 연령-매치된 대조군/양성 환자로부터의 혈액 샘플 (표 1 참조)에서의 면역 세포 침윤, T 세포 반응 및 시토카인 생산을 비교하였다. 용어 "PBMC"는 PBMC가 다른 공급원으로부터 단리된 것이라는 것을 명백하게 나타내지 않는 한, 통상의 기술자에게 통상적으로 알려진 방법에 의해 혈액 샘플로부터 단리된 각각의 PBMC를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 연구를 완료하려는 노력으로, 샘플 수집은 확장되었고 43개의 AC 및 39개의 SCC 종양 조직 샘플, 32개의 AC, 30개의 SCC 및 17개의 건강한 연령-매치된 혈액 샘플 뿐만 아니라 57개의 AC, 52개의 SCC 및 41개의 건강한 연령-매치된 대조군 혈장 혈액 샘플에 이르렀다 (표 2 참조). 유사하게, NSCLC 환자 및 건강한 연령-매치된 공여자의 PBMC에서의 골수-유래 억제 세포 (MDSC) 및 CD4+CD25+Foxp3+ T 조절 세포의 집단을 비교하였다. 양쪽 종양 하위유형에서 비-종양 조직과 비교하여 다양한 면역 세포 집단에서 유의하게 더 높은 침윤이 관찰되었다. 종양 샘플에서, 연구는 SCC에서보다 AC에서 더 높은 CD4+CD25+Foxp3+ Treg 침윤이 있다는 것을 제시하는 초기 공개된 데이터 (Black et al., 2013)를 확증하였다.
그러나, 놀랍게도 SCC 환자에서 혈액 및 종양 샘플로부터의 CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/lo M-MDSC 및 종양 샘플로부터의 CD11b+CD14-CD15+ PMN-MDSC의 집단은 AC 환자 및 대조군과 비교하여 유의하게 증진되었다. 추가적으로 SCC 환자의 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 CD3ζ의 하향-조절 및 PBMC에서의 ARG1 발현의 상향-조절이 관찰되었다. CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다에서의 CD3ζ의 하향조절은 PMN-MDSC의 존재와 음성적으로 상관관계가 있다. 기능 억제 시험은 M-MDSC 및 PMN-MDSC가 SCC 환자에서는 Treg에 대해 주요 억제 역할을 하지만 AC에서는 그렇지 않다는 것을 시사한다.
추가로, 연구는 원발성 NSCLC 종양 및 비-종양 조직에서의 면역 세포 침윤을 분석하고, 자극 후 종양내 IFN-γ 생산 CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 시토카인 생산을 분석하는 것을 목표로 한다. NSCLC 환자 및 연령-매치된 건강한 대조군의 종양 및 말초 혈액에서의 MDSC 및 CD4+CD25+Foxp3+ Treg의 존재가 또한 분석되었다.
SCC 및 AC의 비교 연구를 기반으로 하여, 면역 세포 침윤이 양쪽 하위유형의 비-종양 조직에서보다 종양에서 더 높은 것으로 밝혀졌다. 통상적인 수지상 세포 (DC) (CD11c+HLA-DRhi)를 제외하고는 면역 세포 침윤에서의 차이가 없었다. 이들 DC는 AC와 비교하여 SCC에서 유의하게 감소되었으며, 이는 SCC 종양에서의 더 낮은 항원 제시 능력을 시사한다.
놀랍게도, 말초 혈액 단핵 세포 집단이 분석되었을 때, 단핵구성 CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/lo MDSC 집단, CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 CD3ζ의 하향-조절 및 PBMC에서의 ARG1의 상향-조절은 단지 SCC 환자에서의 혈액에서만 관찰되었다. AC 및 SCC MDSC 둘 다는 T 세포 증식을 억제하지만, T-세포에서의 IL-2 및 IFN-γ의 더 강한 억제는 단지 SCC에 대해서만 관찰되었다. 따라서, SCC로부터의 MDSC는 더 높은 억제성 활성을 가졌다. 게다가, 종양-침윤 MDSC가 분석되었을 때, CD11b+CD14-CD15+ PMN-MDSC 및 CD14+CD33hiHLA-DR-/lo M-MDSC 집단은 AC 종양에서보다 SCC 종양에서 더 높았다. CD4+CD25+Foxp3+ CD127low Treg는 단지 AC 환자의 동결 혈액 샘플에서만 증진되었고 CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/lo MDSC 집단과 음성적으로 상관관계가 있었으며, 이는 NSCLC에서의 AC 및 SCC 히스토타입 사이의 전신 면역억제의 메카니즘에서의 차이를 시사한다. 동일한 결과는 신선한 혈액 샘플이 분석되었을 때 관찰되었다. Treg는 AC에서의 CD11b+CD14-CD15+ PMN-MDSC와 음성적으로 상관관계가 있지만 SCC에서는 그렇지 않다. 이는 동결보존 후 매우 높은 속도의 PMN-MDSC 붕괴로 인해 동결된 샘플에서 검출될 수 없었다. AC 및 SCC 사이의 차이는, 표현형 특징화를 기반으로 하여 신선하든지 또는 동결되든지, CD11b+CD14-CD15+ PMN-MDSC의 양이 환자의 혈액에서 분석되었을 때 관찰되었다. 종양 샘플이 분석되었을 때, Treg는 NSCLC의 양쪽 조직학적 하위유형의 비-종양 조직에서보다 종양에서 더 높은 수로 검출되었다. 그러나 Treg의 침윤은 SCC 종양보다 AC에서 더 높았다.
요약하면, SCC에서 면역억제성 종양 미세환경은 MDSC에 의해 우세한 것으로 제시된 바 있는 반면에, MDSC는 AC를 앓고 있는 대부분의 암 환자에서 단지 부차적인 역할을 갖는다. MDSC가 종양 미세환경에서 강한 면역억제성 활성을 갖는 것으로 제시되어 있으므로 (Umansky et al., 2016), MDSC 표현형을 갖는 SCC 또는 NSCLC와 싸우기 위해 숙주 면역계를 활용하는 해결책은 면역요법제 예컨대 수지상 세포 백신을 MDSC의 억제제와 조합하는 것일 수 있다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 SCC를 앓고 있는 개체에서 편평 세포 암종 (SCC)을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 면역원성 조성물 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 치료는 골수-유래 억제 세포 (MDSC)-억제제 또는 MDSC 이펙터 기능의 억제제 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제2 조성물과 조합한 조성물의 투여를 포함한다.
MDSC가 SCC에서 우세한 면역억제성 세포라는 놀라운 발견을 기반으로 하여, 그의 억제 또는 그의 이펙터 기능의 억제는 종양 미세환경에서의 면역계의 유의하게 감소된 억제를 생성하고, 이에 따라 조합 면역요법을 보다 효과적으로 만든다는 결론이다. 이는 세포독성 T-세포 (CTL)에 의해 인식된 종양-연관 항원을 식별하는데 있어서의 진보에도 불구하고 일반적으로 면역요법의 심각한 도전과제를 극복하고 낮은 임상 효능을 극복하는 중요한 수단일 수 있다 (Ramakrishnan et al., 2010).
SCC를 앓고 있는 이러한 개체는, CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/lo M-MDSC인, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 내 살아있는 세포의 분획이 적어도 0.08%, 바람직하게는 적어도 0.1%라는 것을 추가로 특징으로 할 수 있다. % 값은 PBMC 내 살아있는 세포의 총 수의 %를 지칭한다. M-MDSC의 이들 백분율은 실시예 7에 기재된 바와 같은 세포 분류에 의해 이전에 동결보존된 PBMC 샘플로부터 수득된 측정치에 상응한다. PBMC 내 살아있는 세포의 분획이 신선한 비-동결보존된 샘플 내에서 측정될 때, 개체는, M-MDSC인, PBMC 내 살아있는 세포의 분획이 적어도 0.25%, 바람직하게는 적어도 0.35%라는 것을 특징으로 할 수 있다. PBMC는 환자의 혈액으로부터 수집되고, 피콜-파크 구배 원심분리, 또는 관련 기술분야에 알려진 다른 기술에 의해 단리될 수 있다. 사멸 세포는 DAPI 염색 또는 라이브/데드(LIVE/DEAD)® 픽서블 아쿠아 데드 셀 스테인을 사용하는 세포측정법 또는 관련 기술분야에 알려진 임의의 다른 기술에 의해 살아있는 세포로부터 구별될 수 있다. M-MDSC는 예를 들어 항-CD14 항체, 항-CD33 항체 및 항-HLA-DR 항체를 수반하는 특정한 게이팅 파라미터를 사용하는 유동 세포측정법에 의해 측정될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, M-MDSC의 분획은 실시예 7의 방법에 기재된 바와 같이 결정된다.
SCC를 앓고 있는 개체는, M-MDSC인, 종양 조직 내 살아있는 세포의 분획이 적어도 0.005%, 바람직하게는 적어도 0.008%라는 것을 추가로 특징으로 할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 종양 조직은 신선한 종양 조직, 즉 동결되지 않았던 종양 조직이다. 또 다른 실시양태에서, 종양 조직 샘플은 동결되었다.
SCC를 앓고 있는 개체를 특징화하기 위한 또 다른 수단은 혈청 또는 혈장 내 LOX-1 수준이 적어도 75 pg/ml, 바람직하게는 적어도 100 pg/ml라는 것이다. 혈청 또는 혈장은 관련 기술분야에 알려진 기술에 의해 환자의 혈액으로부터 수득될 수 있다. LOX-1은 렉틴-유형 산화된 저밀도 지단백질 수용체 1 (LOX-1), OLR1, CLEC8A, LOX1, LOXIN, SCARE1, SLOX1 또는 산화된 저밀도 지단백질 수용체 1 (Ox-LDL 수용체 1)을 나타낸다. LOX-1은 내피 세포, 단핵구, 혈소판, 심근세포, 및 혈관 평활근 세포에서 산화된 저밀도 지단백질 (ox-LDL)에 대한 주요 수용체로서 식별된 바 있다. 그의 발현은 생리학적 조건 하에서는 최소이지만 병리학적 조건 하에서는 유도될 수 있다 (Lu et al., 2011a). 이는 절단되고 가용성 형태로 순환으로 방출될 수 있다 (Biocca et al., 2013). 혈액 또는 혈장 내 가용성 LOX-1의 수준은, 예를 들어 ELISA 시험에 의해, 관련 기술분야에 알려진 기술에 의해 측정될 수 있다.
SCC를 앓고 있는 개체를 특징화하기 위한 또 다른 수단은 적어도 5%, 우선적으로 적어도 10%의 CD15+ 말초 혈액 단핵 세포가 LOX-1+ (LOX-1-발현 PMN-MDSC)라는 것이다. LOX-1 양성 세포의 백분율은, CD15에 대해 양성인, 말초 혈액 내 MDSC로부터 실시예 7의 방법에 기재된 바와 같이 측정된다.
SCC를 앓고 있는 개체는 또한, PMN-MDSC인, 종양 조직 내 살아있는 세포의 분획이 적어도 2%, 바람직하게는 적어도 2.5%라는 것을 특징으로 할 수 있다. PMN-MDSC의 분획은 실시예 7에 기재된 바와 같이 결정되었다. 유동 세포측정법에 의해 측정될 때, 카운트된 PMN-MDSC가 또한 동일한 항체에 의해 인식된 호중구의 분획을 함유할 수 있다는 것이 이해된다. 호중구는 피콜 구배에 의한 유동 세포측정법 측정 전에 PMN-MDSC로부터 분리될 수 있다. PMN-MDSC는 저밀도 분획이 풍부화된 반면에, 호중구는 고밀도 세포이다.
또 다른 측면에서, SCC를 앓고 있는 이러한 개체는, Treg 세포인, PBMC 내 살아있는 분획이 최대 1.8%, 바람직하게는 최대 1.5%라는 것을 특징으로 할 수 있다. % 값은 PBMC의 살아있는 세포의 총 수의 %을 지칭한다. Treg 세포의 이들 백분율은 이전에 동결보존된 PBMC 샘플로부터 수득된 측정치에 상응한다. PBMC 내 살아있는 세포의 분획이 신선한 비-동결보존된 샘플 내에서 측정될 때, 개체는, Treg 세포인, PBMC 내 살아있는 세포의 분획이 최대 1%, 바람직하게는 최대 0.8%라는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, Treg의 분획은 실시예 7의 방법에 기재된 바와 같이 결정된다.
종양 조직 내 살아있는 Treg 세포의 분획은 또한 MDSC-우세한 종양 환경을 갖는 개체를 특징화하는데 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 종양 조직 내 Treg 세포인, PBMC 내 살아있는 세포의 분획은 CD4+ 세포의 최대 10%, 바람직하게는 CD4+ 세포의 최대 9%이다. 본 발명자들은 SCC 환자가 일반적으로 면역억제성 종양 환경을 갖고 이것이 종양 조직 내 높은 Treg 세포로 인한 것이 아니라면, 이는 차례로 높은 MDSC를 기반으로 하는 것으로 결론짓는다.
또 다른 측면에서, SCC를 앓고 있는 이러한 개체는 PBMC 내 CD4+ T 세포 중에서의 CD3ζ의 분획이 건강한 개체의 대조군 CD4+ T 세포와 비교하여 적어도 0.9배만큼, 바람직하게는 0.8배만큼 감소된다는 것을 특징으로 할 수 있다. CD3ζ의 이들 분획은 이전에 동결보존된 PBMC 샘플로부터 수득된 측정치에 상응한다. PBMC 내 살아있는 세포의 분획이 신선한 비-동결보존된 샘플 내에서 측정될 때, 개체는 PBMC 내 CD4+ T 세포 중에서의 CD3ζ의 분획이 건강한 개체의 대조군 CD4+ T 세포와 비교하여 적어도 0.7배만큼, 바람직하게는 적어도 0.6배만큼 감소된다는 것을 특징으로 할 수 있다. CD4+ T 세포 중에서의 CD3ζ의 분획은 예를 들어 단리된 CD4+ T 세포의 항-CD3ζ 항체로의 면역-염색에 의해 측정될 수 있다. T 세포 상의 CD3ζ의 발현에서의 감소는 증가된 MDSC 억제성 활성과 이전에 상관관계가 있었고, MDSC의 증가된 ARG1 활성으로 인한 L-아르기닌의 부족에 의해 설명될 수 있다 (Gabrilovich and Nagaraj, 2009).
또 다른 실시양태에서, SCC를 앓고 있는 이러한 개체는 PBMC 내 CD8+ T 세포 중에서의 CD3ζ의 분획이 건강한 개체의 대조군 CD8+ T 세포와 비교하여 적어도 0.75배만큼, 바람직하게는 적어도 0.65배만큼 감소된다는 것을 특징으로 할 수 있다. CD3ζ의 이들 분획은 이전에 동결보존된 PBMC 샘플로부터 수득된 측정치에 상응한다. PBMC 내 살아있는 세포의 분획이 신선한 비-동결보존된 샘플 내에서 측정될 때, 개체는 PBMC 내 CD8+ T 세포 중에서의 CD3ζ의 분획이 건강한 개체의 대조군 CD8+ T 세포와 비교하여 적어도 0.7배만큼, 바람직하게는 적어도 0.5배만큼 감소된다는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, SCC를 앓고 있는 개체는 PBMC에서의 ARG1의 상대 발현이 건강한 개체의 PBMC 세포와 비교하여 적어도 2.5배만큼 증가된다는 것을 특징으로 한다. PBMC에서의 ARG1의 상대 발현은 정량적 PCR에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 수준은 실시예 7에 기재된 바와 같은 정량적 PCR에 의해 결정된다.
제3 측면에서 본 발명은 개체에서 비소세포 폐암 (NSCLC)을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 면역원성 조성물 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물로서, 여기서 치료는 골수-유래 억제 세포 (MDSC)-억제제 또는 MDSC 이펙터 기능의 억제제 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제2 조성물과 조합한 조성물의 투여를 포함하고, 여기서 개체는 MDSC의 존재에 의해 야기된 면역억제성 종양 미세환경을 추가로 특징으로 하는 것인 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, MDSC의 존재에 의해 야기된 면역억제성 종양 미세환경은 MDSC에 의한 면역계의 상이한 세포, 주로 T 세포의 억제를 암시한다. MDSC-매개 면역 억제에 수반되는 주요 인자는 ARG1의 증가된 발현, iNOS의 증가된 발현, MDSC에 의한 TGF 베타 및 IL10의 증가된 생산, MDSC 내 COX2의 증가된 활성, MDSC 또는 종양 세포에 의한 증가된 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO) 발현, MDSC에 의한 시스테인의 격리, T 세포에 의한 L-셀렉틴 발현의 감소, 및 다수의 기타를 포함한다 (Bronte et al., 2016, 표 3, 본원에 참조로 포함됨)를 포함한다. 이들 인자에서의 임의의 차이는 건강한 조직과 비교하여 면역억제성 종양 미세환경을 특징화하는데 사용될 수 있다. M-MDSC는 NO 및 시토카인의 생산과 연관된 메카니즘을 활용함으로써 T-세포 반응을 억제하는 것으로 여겨진다 (문헌 [Gabrilovich et al., 2012]에서 검토됨). 다른 한편으로는, PMN-MDSC는 예를 들어 항원-특이적 T-세포 관용을 유도함으로써 항원-특이적 방식으로 일차적으로 면역 반응을 억제한다 (Koehn et al., 2015, Marigo et al., 2010).
일반적으로 SCC 환자가 MDSC의 유의하게 증진된 존재를 갖는 것으로 본 발명의 맥락에서 관찰되었긴 하지만, 또한 유사한 수준의 MDSC를 갖는 다수의 AC 환자도 있었다. 따라서, MDSC의 존재에 의해 야기된 면역억제성 종양 미세환경을 갖는 임의의 NSCLC 환자는 면역원성 조성물 및 MDSC-억제제 또는 MDSC 이펙터 기능의 억제제로의 조합 치료로부터 이익을 얻을 것이라는 결론이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 비소세포 폐암 (NSCLC)을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 면역원성 조성물 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물로서, 여기서 치료는 골수-유래 억제 세포 (MDSC)-억제제 또는 MDSC 이펙터 기능의 억제제 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제2 조성물과 조합한 조성물의 투여를 포함하고, 여기서 MDSC의 존재에 의해 야기된 면역억제성 종양 미세환경을 갖는 개체는, M-MDSC인, PBMC 내 살아있는 세포의 분획이 적어도 0.08%, 바람직하게는 적어도 0.1%라는 것을 특징으로 하는 것인 조성물에 관한 것이다. M-MDSC의 이들 백분율은 이전에 동결보존된 PBMC 샘플로부터 수득된 측정치에 상응한다. PBMC 내 살아있는 세포의 분획이 신선한 비-동결보존된 샘플 내에서 측정될 때, 개체는, M-MDSC인, PBMC 내 살아있는 세포의 분획이 적어도 0.25%, 바람직하게는 0.35%라는 것을 특징으로 할 수 있다.
MDSC의 존재에 의해 야기된 면역억제성 종양 미세환경을 갖는 개체는, M-MDSC인, 종양 조직 내 살아있는 세포의 분획이 적어도 0.005%, 바람직하게는 적어도 0.008%라는 것을 추가로 특징으로 할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 종양 조직은 신선한 종양 조직, 즉 동결/해동에 대한 MDSC의 감수성으로 인해 동결된 적이 없는 종양 조직이다.
MDSC의 존재에 의해 야기된 면역억제성 종양 미세환경을 갖는 개체를 특징화하는 또 다른 수단은 혈청 또는 혈장 내 LOX-1 수준이 적어도 75 pg/ml, 바람직하게는 적어도 100 pg/ml라는 것이다. 혈청 또는 혈장은 관련 기술분야에 알려진 기술에 의해 환자의 혈액으로부터 수득될 수 있다.
MDSC의 존재에 의해 야기된 면역억제성 종양 미세환경을 갖는 개체를 특징화하는 또 다른 수단은 적어도 5%, 우선적으로 적어도 10%의 CD15+ 말초 혈액 단핵 세포가 LOX-1+ (LOX-1-발현 PMN-MDSC)라는 것이다. LOX-1 양성 세포의 백분율은 CD15에 대해 양성인 말초 혈액에서의 MDSC로부터, 실시예 7의 방법에 기재된 바와 같이 측정된다.
MDSC의 존재에 의해 야기된 면역억제성 종양 미세환경을 갖는 개체는 또한, PMN-MDSC인, 종양 조직 내 살아있는 세포의 분획이 적어도 2%, 바람직하게는 적어도 2.5%라는 것을 특징으로 할 수 있다. PMN-MDSC의 분획은 실시예 7에 기재된 바와 같이 결정되었다. 유동 세포측정법에 의해 측정될 때, 카운트된 PMN-MDSC가 또한 동일한 항체에 의해 인식된 호중구의 분획을 함유할 수 있다는 것이 이해된다. 호중구는 피콜 구배에 의한 유동 세포측정법 측정 전에 PMN-MDSC로부터 분리될 수 있다. PMN-MDSC는 저밀도 분획이 풍부화된 반면에, 호중구는 고밀도 세포이다.
MDSC의 존재에 의해 야기된 면역억제성 종양 미세환경을 갖는 개체는 말초 혈액 단핵 세포 내 살아있는 Treg 세포의 분획이 최대 1.8%, 바람직하게는 최대 1.5%라는 것을 특징으로 할 수 있다. Treg 세포의 이들 백분율은 이전에 동결보존된 PBMC 샘플로부터 수득된 측정치에 상응한다. PBMC 내 살아있는 세포의 분획이 신선한 비-동결보존된 샘플 내에서 측정될 때, 개체는, Treg 세포인, PBMC 내 살아있는 세포의 분획이 최대 1%, 바람직하게는 최대 0.8%라는 것을 특징으로 할 수 있다.
종양 조직 내 살아있는 Treg 세포의 분획은 또한 면역억제성 종양 미세환경을 갖는 개체를 특징화하는데 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 종양 조직 내 Treg 세포인, PBMC 내 살아있는 세포의 분획은 CD4+ 세포의 최대 10%, 바람직하게는 CD4+ 세포의 최대 9%이다. 본 발명자들은 NSCLC 환자가 일반적으로 면역억제성 종양 환경을 갖고, 이것이 종양 조직 내 높은 Treg 세포로 인한 것이 아니라면, 이는 차례로 높은 MDSC를 기반으로 하는 것으로 결론짓는다.
CD3ζ에서의 감소는, PBMC 내 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다에 대하여, 아르기닌의 고갈을 통해 T-세포 억제를 야기하는 상승된 ARG1 활성으로 인한 간접 척도이다 (Gabrilovich and Nagaraj, 2009).
따라서, MDSC의 존재에 의해 야기된 면역억제성 종양 미세환경을 갖는 개체를 특징화하는 또 다른 수단은 PBMC 내 CD4+ T 세포 중에서의 CD3ζ의 분획이 건강한 개체의 대조군 세포와 비교하여 적어도 0.9배만큼, 바람직하게는 적어도 0.8배만큼 감소되는 것이다. CD3ζ의 이들 분획은 이전에 동결보존된 PBMC 샘플로부터 수득된 측정치에 상응한다. PBMC 내 살아있는 세포의 분획이 신선한 비-동결보존된 샘플 내에서 측정될 때, 개체는 PBMC 내 CD4+ T 세포 중에서의 CD3ζ의 분획이 건강한 개체의 대조군 세포와 비교하여 적어도 0.7배만큼, 바람직하게는 적어도 0.6배만큼 감소되는 것을 특징으로 할 수 있다. CD4+ T 세포 중에서의 CD3ζ의 분획은 예를 들어 단리된 CD4+ T 세포의 항-CD3ζ 항체로의 면역-염색에 의해 측정될 수 있다.
그리고 추가로, MDSC의 존재에 의해 야기된 면역억제성 종양 미세환경을 갖는 개체를 특징화하는 또 다른 수단은 PBMC 내 CD8+ T 세포 중에서의 CD3ζ의 분획이 건강한 개체의 대조군 세포와 비교하여 적어도 0.75배만큼, 바람직하게는 적어도 0.65배만큼 감소되는 것이다. CD3ζ의 이들 분획은 이전에 동결보존된 PBMC 샘플로부터 수득된 측정치에 상응한다. PBMC 내 살아있는 세포의 분획이 신선한 비-동결보존된 샘플 내에서 측정될 때, 개체는 PBMC 내 CD8+ T 세포 중에서의 CD3ζ의 분획이 건강한 개체의 대조군 세포와 비교하여 적어도 0.7배만큼, 바람직하게는 적어도 0.5배만큼 감소된다는 것을 특징으로 할 수 있다.
MDSC의 존재에 의해 야기된 면역억제성 종양 미세환경을 갖는 개체는 또한 PBMC에서의 ARG1의 상대 발현이 건강한 개체의 PBMC와 비교하여 적어도 2.5배만큼 증가된다는 것을 특징으로 할 수 있다. PBMC에서의 ARG1의 상대 발현은 정량적 PCR에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, M-MDSC는 CD14+CD15-CD33hiHLA-DR-/lo 표현형을 갖는 것으로서 특징화되고, PMN-MDSC는 억제성 CD14-CD15+CD11b+ 표현형을 갖는 것으로, 바람직하게는 LOX-1을 발현하는 것으로 특징화된다. 유동 세포측정법 또는 관련 기술분야에 알려진 다른 기술은 이들 세포를 표현형적으로 특징화하는데 사용될 수 있다. CD14-CD15+CD11b+로서의 PMN-MDSC의 표현형 특징화는 또한 호중구에 적용될 수 있다. 그러나, 이러한 연구의 종양 환자에서의 호중구 오염은 무시할만한 것으로 간주된다. 다른 한편으로는, 호중구는 피콜 구배에 의해 유동 세포측정법 측정 전에 PMN-MDSC로부터 분리될 수 있다 (Scapini and Cassatella, 2014). PMN-MDSC는 저밀도 분획 (PBMC)이 풍부화된 반면에, 호중구는 고밀도 세포이다. 게다가, 호중구는 억제성 능력을 보유하지 않으며, 이는 전형적으로 PMN-MDSC에 기인한다. 억제는 예를 들어 항-CD3/CD28 (또는 폴리히드록시알카노에이트) 유도된 T-세포 증식 또는 IL-2 및 IFN-γ 생산의 억제에 의해 제시될 수 있다. 3H-티미딘 혼입 또는 CFSE 희석을 사용하여 T-세포 증식을 측정할 수 있고 ELISPOT 또는 세포내 염색을 사용하여 IFN-γ 생산을 측정할 수 있다.
또 다른 측면에서, 조성물은 폐의 SCC를 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키는 것을 목표로 한다. 폐의 편평 세포 암종은 비소세포 폐암의 하나의 형태이다. SCC는 폐 내 공기 통로에 라이닝된 조직에서 시작한다. 이는 또한 표피양 암종으로도 알려져 있다. 폐의 대부분의 SCC는 통상적으로 기관을 폐에 연결하는 더 큰 기관지 내에서 중추적으로 위치된다. SCC는 비소세포 폐암의 다른 형태보다 더 강하게 흡연과 연계되어 있고, 여성에서보다 남성에서 더 흔하다. 이들은 느리게 성장하는 경향이 있고, 그의 위치로 인해 종종 폐암의 다른 형태보다 더 초기에 발견된다. 폐암의 흔한 증상은 지속성 기침, 각혈, 및 천명을 포함한다. SCC는 큰 기도 근처에서 위치되는 경향이 있으므로, 이들은 종종 폐암의 다른 형태보다 더 초기에 증상을 야기한다. 기도의 폐쇄는 폐렴, 또는 폐의 부분의 붕괴 (무기폐)와 같은 감염으로 이어질 수 있다. SCC는 팬코스트 증후군 또는 상구 증후군의 가장 흔한 원인이다. 팬코스트 증후군은 폐의 상단 근처에서 시작하고 근방의 구조물을 침습하는 폐암에 의해 야기된다. 증상은 종종 팔의 내부를 아래로 방산하는 어깨 통증, 손의 약화 또는 꺼끌꺼끌한 느낌, 얼굴의 한 면에서의 홍조 또는 발한, 및 처진 눈꺼풀 (호르너 증후군)을 포함한다. SCC를 갖는 개체는 또한 근육 약화 및 경련을 초래할 수 있는 고칼슘혈증을 경험할 가능성이 더 있다. 고칼슘혈증은 부신생물성 증후군의 증상 중 하나이고 혈액 내 칼슘 수준을 상승시키는 호르몬-유사 물질을 분비하는 종양에 의해 야기된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 조성물은 SCC로 진단된 개체를 치료하는 것을 목표로 한다. SCC의 진단은 관련 기술분야에 널리 알려져 있다 (Travis et al., 2015). 폐의 SCC는 이상이 X선 상에서 보여질 때 종종 먼저 의심된다. 추가의 평가는 흉부 CT 스캔, 객담 세포검사, 기관지경검사, PET 스캔, 기관지내 초음파를 포함할 수 있다. 결과에 따라, 폐 생검을 수득하여 진단을 확증할 수 있다 (Travis et al., 2013). 폐의 SCC는 4개의 병기로 분류된다:
병기 I: 암은 폐 내에서 국부화되고 어떠한 림프절로도 확산되어 있지 않음
병기 II: 암은 림프절 또는 폐의 내벽으로 확산되어 있거나, 또는 주기관지의 특정 면적에 있음
병기 III: 암은 폐 근처에서 조직으로 확산되어 있음
병기 IV: 암은 신체의 또 다른 부분으로 확산되어 있음 (전이되어 있음).
본 발명의 또 다른 측면에서, 폐의 SCC을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키는 것을 목표로 하는 조성물은 관리의 표준 치료 (이는 현재 SCC 및 AC 사이를 구별하지 않음), 바람직하게는 병기 IV NSCLC의 치료를 위한 카르보플라틴 플러스 파클리탁셀, 병기 IV EGFR 야생형 NSCLC의 치료를 위한 페메트렉세드 플러스 카르보플라틴, 병기 IIIB 내지 IV, EGFR 야생형 NSCLC의 치료를 위한 겜시타빈 플러스 시스플라틴 또는 페메트렉세드 플러스 시스플라틴 또는 병기 IIIA-IV NSCLC의 치료를 위한 비노렐빈 플러스 카르보플라틴과 조합하여 투여될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 MDSC-억제제 또는 MDSC 이펙터 기능의 억제제와 조합한 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기서 면역원성 조성물은 수지상 세포 요법/백신 (DC 백신), 입양 T-세포 요법, 펩티드성, DNA 또는 mRNA 백신 및 종양용해 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것, 바람직하게는 DC 백신이다. 입양 T-세포 요법의 상이한 기술은 본원에 참조로 포함된 문헌 [Houot R et al. (2015)]에 기재된 바 있다. 펩티드성 백신의 상이한 기술은 본원에 참조로 포함된 문헌 [Xiao YF et al. (2015)]에 기재된 바 있다. DNA 백신의 상이한 기술은 본원에 참조로 포함된 문헌 [Yang B et al. (2014)]에 기재된 바 있다. mRNA 백신의 상이한 기술은 본원에 참조로 포함된 문헌 [McNamara MA et al. (2015)]에 기재된 바 있다. 종양용해 바이러스 백신의 상이한 기술은 본원에 참조로 포함된 문헌 [Aitken AS et al. (Aitken et al., 2017)]에 기재된 바 있다. 수지상 세포 백신의 상이한 기술은 본원에 참조로 포함된 문헌 [Turnis and Rooney, (2010)]에 기재된 바 있다.
바람직한 실시양태에서, DC 백신은 본원에 참조로 포함된 문헌 [Turnis and Rooney, (2010)]의 표 1에 예시된 바와 같은, 종양 연관 펩티드(들), DNA 또는 RNA로부터의 전체 항원, 전체 항원-단백질, 이디오타입 단백질, 종양 용해물/전체 종양 세포 또는 바이러스 벡터-전달 전체 항원으로부터 선택된 항원 공급원으로 제조된다.
특히 바람직한 실시양태에서 미성숙 DC 상에의 로딩을 위해 사용되는 이러한 전체 종양 세포는 본원에 참조로 포함된 WO 2013/004708 및 WO 2015/097037에 기재된 바와 같은, 높은 유체정역학적 압력 (HHP)에 의해 제조된 바 있다. 전체 종양 세포를 HHP로 치료하는 것은 아폽토시스의 특정한 유형인 면역원성 세포 사멸 (ICD)을 유도하는 것을 가능하게 한다. ICD의 종양 세포 사멸은 매우 강력한 "이트-미(eat-me)" 신호, 예컨대 칼레티쿨린, HSP70 및 HSP90을 나타낼 것이다. 이들 "이트-미" 신호는 미성숙 DC에 의한 아폽토시스 종양 세포의 효율적인 식세포작용 및 성숙 DC에 의한 종양 항원의 효율적인 제시를 촉발할 것이다. HHP를 사용하여 강력한 NSCLC 또는 SCC DC 백신을 생성하기 위한 바람직한 조건은 NCI-H520 또는 NCI-H522 폐암 세포주를, 조합하여 또는 단일로, 10분 동안 250 MPa의 압력에 적용하고, 면역원성 세포 사멸을 겪은 생성된 세포의 미성숙 DC에의 로딩이다.
바람직한 실시양태에서, MDSC-억제제는 MDSC의 분화/성숙을 차단 또는 억제하거나, MDSC의 이동을 차단 또는 억제하거나, 또는 MDSC의 고갈/MDSC의 아폽토시스를 유도하거나, 또는 MDSC의 확장을 억제한다. MDSC를 표적화하는 전임상 및 임상 화합물은 문헌 [Draghiciu et al., 2015] (본원에 참조로 포함됨)의 표 1에, 문헌 [Ko and Kim, 2016] (본원에 참조로 포함됨)의 표 2에, 및 문헌 [Talmadge and Gabrilovich, 2013] (본원에 참조로 포함됨)의 표 1 및 박스 2에 열거되어 있다.
MDSC의 분화/성숙의 억제제의 바람직한 예는 올-트랜스-레티노산 (ATRA) 및 쿠르쿠민 유도체이다. ATRA는 150 mg/m2로 백신접종 며칠 전에 투여될 수 있다. MDSC의 이동의 억제제의 바람직한 예는 졸렌드론산, 항-글리칸 항체 및 CSF-1R 억제제이다. MDSC의 고갈 또는 아폽토시스의 유도제의 바람직한 예는 티로신 키나제 억제제, 바람직하게는 수니티닙, 항-Gr1 항체, IL4Rα 압타머, 겜시타빈, 시스플라틴, 파클리탁셀, 17-디메틸아미노에틸아미노-17-데메톡시겔다나마이신 (17-DMAG) 및 5-플루오로우라실 (5-FU)이다. MDSC의 확장의 억제제의 바람직한 예는 베바시주맙, 셀레콕시브 및 피모지드이다. MDSC 이펙터 기능의 억제제의 바람직한 예는 산화성 스트레스의 유도제, 바람직하게는 N-히드록실-L-아르기닌 (NOHA), 니트로아스피린, N-아세틸 시스테인 (NAC), CpG 올리고데옥시-뉴클레오티드, 바르독솔론 메틸 (CDDO-Me), 위타페린 A 및 스타틱이다.
ATRA, 파클리탁셀, 겜시타빈 또는 시스플라틴과의 조합이 특히 바람직하다.
도면의 설명
도 1: 종양 및 건강한 조직에 존재하는 세포의 생존율 및 기원.
(a) 종양 (Tu) 및 비-종양 건강한 폐 조직 (NTu)으로부터 단리된 모든 단리된 세포의 생존율은 DAPI 염색 이어서 유동 세포측정법에 의해 측정되었다 (상단 패널). AC 또는 SCC 종양 (Tu) 및 비-종양 건강한 폐 조직 (NTu) 내 상피 세포의 백분율은 시토케라틴에 대한 면역-염색 후 유동 세포측정법에 의해 측정되었다 (하단 패널).
(b) 종양 (Tu) 및 비-종양 건강한 폐 조직 (NTu) 내 림프구의 백분율은 CD45에 대한 면역-염색 후 유동 세포측정법에 의해 측정되었다.
(c) 유동 세포측정법을 위한 게이팅 전략.
도 2: 선암종 (AC) 및 편평 세포 암종 (SCC) 내 NSCLC 종양 및 비-종양 조직에서의 면역 세포 침윤.
(a) AC 및 SCC 종양 (Tu) 및 비-종양 건강한 폐 조직 (NTu) 내 살아있는 세포로부터의 cDC (CD11c+ HLA-DR+, 상단 좌측 패널), 단핵구 (CD14+ HLA-DR+, 상단 우측 패널), 비만 세포 (CD117+, 하단 좌측 패널) 및 B 세포 (CD19/20+, 하단 우측 패널)의 백분율은 유동 세포측정법에 의해 추정되었다.
(b) AC 또는 SCC 종양 (Tu) 및 비-종양 건강한 폐 조직 (NTu) 내 살아있는 세포로부터의 NK 세포 (CD3- CD56+, 상단 좌측 패널), T reg (CD4+ CD25+FoxP3+, 상단 우측 패널), CD4+ T 세포 (CD4+, 하단 좌측 패널) 및 CD8+ T 세포 (CD8+, 하단 우측 패널)의 백분율은 유동 세포측정법에 의해 추정되었다.
(c) AC 또는 SCC 종양 (Tu) 및 비-종양 건강한 폐 조직 (NTu) 내 살아있는 세포로부터의, CD3+ 세포로부터의 CD4+ T 세포 (CD4+, 상단 좌측 패널), CD3+ 세포로부터의 CD4+ T 세포 (CD8+, 상단 우측 패널), 메모리 CD4+ T 세포 (CD45RO+ CD4+, 하단 좌측 패널) 및 메모리 CD8+ T 세포 (CD45RO+CD8+, 하단 우측 패널)의 백분율은 유동 세포측정법에 의해 추정되었다.
도 3: 종양내 INF-γ 생산 CD4
+
및 CD8
+
T 세포는 AC 환자에서의 비-종양 조직 및 종양과 비교하여 SSC 종양에서 유의하게 억제되었다.
AC 또는 SCC 종양 (Tu) 및 비-종양 건강한 폐 조직 (NTu) 내 살아있는 세포로부터의, CD4+ T 세포로부터의 IFN-γ+ 세포 (상단 패널) 및 CD8+ T 세포로부터의 IFN-γ+ 세포의 백분율은 유동 세포측정법에 의해 측정되었다.
도 4: NSCLC 환자의 종양 및 비-종양 조직에서의 시토카인 생산.
24시간 동안 PMA+ 이오노마이신으로의 세포 자극 후, AC 또는 SCC 종양 (Tu) 및 비-종양 건강한 폐 조직 (NTu)에서의 GM-CSF, IL-1β, IL-2 (a) 및 TNF-α, IL-23, IL-10 (b)의 생산은 루미넥스(Luminex)에 의해 결정되었다.
도 5: 종양 내 M-MDSC 및 Treg의 존재, 및 종양 미세환경 내 그의 영향. T 세포 내 CD3ζ 발현 및 PBMC 내 ARG1에 대한 mRNA의 억제.
(a) 건강한 연령-매치된 대조군 환자, AC 환자 및 SCC 환자로부터의 살아있는 PBMC 내 M-MDSC (CD15- CD14+ CD33hi HLA-DR-/lo, 좌측 패널) 및 Treg (우측 패널)의 백분율은 유동 세포측정법에 의해 측정되었다.
(b) 건강한 연령-매치된 대조군 환자, AC 환자 및 SCC 환자로부터의 살아있는 PBMC 내 CD3ζ+ CD4+ T 세포 (좌측 패널) 및 CD3ζ+ CD8+ T 세포 (우측 패널)의 양은 유동 세포측정법에 의해 측정되었다.
(c) ARG1의 상대 발현은 건강한 대조군, AC 환자 및 SCC 환자로부터의 PBMC로부터 추출된 mRNA로부터 qPCR에 의해 측정되었다.
도 6: AC 및 SCC에서의 상이한 유형의 면역 억제성 세포 사이의 상관관계 분석.
AC 환자 (상단 좌측), SCC 환자 (상단 우측) 및 건강한 연령-매치된 대조군 환자 (하단 좌측)로부터의 PBMC 내 M-MDSC (CD15- CD14+ CD33hi HLA-DR-/lo)의 수 및 Treg 수 사이의 상관관계 분석.
도 7: 실험 프로토콜
도 8: 종양내 T 세포 및 NK 세포는 AC NSCLC 환자에서보다 SCC에서 기능적으로 더 억제된다.
종양 및 비-종양 세포 현탁액은 브레펠딘이 추가의 3시간 동안 첨가되기 전에 1시간 동안 PMA 및 이오노마이신으로 자극되었다. 이어서 세포는 세포내 IFN-γ로 염색되고 유동 세포측정법에 의해 분석되었다;
(a) IFN-γ-생산 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 검출하기 위한 게이팅 전략.
(b) 루미넥스에 의해 PMA+이오노마이신으로의 24시간 자극 후 결정된 시토카인 생산. 그래프는 n= 43개의 AC 및 n= 39개의 SCC의 평균을 나타낸다 (* p < 0.05; ** p < 0.01, *** p < 0.005 또는 **** p < 0.005).
도 9: 종양내 Treg, 다형핵-MDSC (PNM-MDSC) (CD14
-
CD15
+
CD11b
+
) 및 단핵구성-MDSC (M-MDSC) (CD15
-
CD14
+
CD33
hi
HLA-DR
-/low
)를 검출하기 위한 게이팅 전략.
도 10: Treg는 AC 환자의 혈액에서 더 풍부하지만 MDSC의 수는 SCC 환자에서의 혈액에서보다 더 높다.
(a) NSCLC 환자의 혈액에서 Treg, PNM-MDSC (CD14-CD15+CD11b+) 및 M-MDSC (CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/low)를 검출하기 위한 게이팅 전략. 동결보존된 PBMC로부터의 PBMC 내 MDSC의 정량 분석.
(b-c) 동결보존된 샘플 (b) 및 신선한 (c) 로부터의 NSCLC 환자의 PBMC 내 Treg 및 PMN-MDSC의 양 사이의 상관관계.
도 11: Treg의 억제성 기능은 AC 및 SCC NSCLC 환자의 혈액에서 필적할만하지만, MDSC의 억제성 기능은 그렇지 않다
(a) Treg 억제 검정.
(b) M-MDSC 억제 검정 - 자기 비드 단리, 또는
(c) ELISA에 의해 검출된 IL-2 및 IFN-γ 분비를 포함한, 세포 분류.
(d) NSCLC 환자의 신선한 샘플로부터의 T 세포에서의 CD3ζ 발현의 유동 세포측정 검출.
(e) LOX-1 단백질은 ELISA에 의해 혈장 샘플에서 검출되었다. 그래프는 n= 56개의 AC, n= 52개의 SCC 및 n=41개의 대조군의 평균을 나타낸다 (* p < 0.05; ** p < 0.01,*** p < 0.005 또는 **** p < 0.005).
(f) LOX-1 양성 PMN-MDSC는 유동 세포측정법에 의해 정량화되었다. 그래프는 n=3개의 AC, n=1개의 SCC 및 n=2개의 대조군의 평균을 나타낸다.
실시예
표 1: 종양 샘플
실시예 1
NSCLC 종양으로부터 단리된 세포는 높은 생존율을 나타내지만, 그러나 종양으로부터 단리된 세포는 비-종양 조직으로부터 단리된 세포와 비교하여 유의하게 덜 생존가능하였다 (도 1a 상단 패널 참조). 편평 세포 암종 (SCC)은 선암종 (AC)과 비교하여 (FITC 표지된 인간 상피 항원 및 팬-시토케라틴에 의해 결정된) 상피 세포의 더 높은 수준을 함유하였다 (도 1a 하단 패널 참조). CD45+ 림프성 세포의 침윤은 비-종양 조직에서보다 종양에서 유의하게 더 높았다 (도 1b 참조). 세포는 DAPI 음성 총 세포 카운트의 %로서 결정되었다 (도 1c 게이팅 전략 참조).
실시예 2
시험된 모든 면역 세포 집단의 침윤은 AC 및 SCC 조직학적 하위유형 사이에서 필적할만하였다 (도 2 참조). 면역 세포 침윤은 비-종양 조직보다 종양에서 더 높았다. 명시되지 않은 경우에 면역 세포 집단의 백분율은 생존가능한 (DAPI 음성) 총 세포 카운트로부터 결정되었다.
실시예 3
종양내 INF-γ 생산 CD4+ 및 CD8+ T 세포 (각각, 도 3 상단 및 하단 패널 참조)는 AC 환자에서 비-종양 조직 및 종양과 비교하여 SSC 종양에서 유의하게 억제되었다.
실시예 4
세포 현탁액을 24시간 동안 PMA+ 이오노마이신으로 자극하고 시토카인을 루미넥스에 의해 결정하였다. 각각의 비-종양 조직 대비 AC 환자로부터의 종양 내 염증유발 시토카인 예컨대 GM-CSF, IL-1β, IL-2 및 TNF-α의 유의하게 더 높은 생산이 있었다 (도 4a 및 b 참조). 유사하게, GM-CSF 및 TNF-α 생산은 SCC 환자로부터의 종양에서보다 AC 환자로부터의 종양에서 더 높다. 이는 또한 IL-23에 대해 관찰되었다 (도 4a 및 b 참조). IL-10은 양쪽 NSCLC 하위유형으로부터의 종양에서 유의하게 증진되었다 (도 4b 참조). IFN-γ, IL-12p70, IL-13, IL-17, IL-22, IL-9, IL-21, IL-4, IL-6의 종양-연관 생산은 비-종양 조직과 비교하여 관찰되지 않았다.
실시예 5
M-MDSC (CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/lo)는 SCC 환자에서의 혈액에서 풍부하지만 T 조절 세포 (CD4+CD25+Foxp3+ CD127low)는 AC 환자에서 상승된다 (도 5a 참조). T 세포에서의 CD3ζ 쇄의 하향-조절 (도 5b 참조) 및 ARG1의 상승된 수준은 SCC 환자에서는 유도되지만 AC 환자에서는 그렇지 않다 (도 5c 참조).
실시예 6
M-MDSC (CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/lo) 집단의 백분율은 AC 환자의 혈액 내 Treg (CD4+CD25+Foxp3+CD127low)의 백분율과는 음성적으로 상관관계가 있지만 SCC 환자 또는 연령-매치된 건강한 대조군에서는 그렇지 않다 (도 6 참조). 이들 데이터는 CD4+CD25+Foxp3+CD127low Treg가 AC를 갖는 NSCLC 환자에서 주요 면역억제성 집단을 나타낼 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 7: 물질 및 방법
표 2: NSCLC 환자의 개관
실험 프로토콜은 도 7에 요약된다.
NSCLC 환자로부터의 원발성 종양 및 비-종양 조직의 가공
종양 (Tu) 및 비-종양 조직 (NTu)을 신보조 수술을 겪은 82명의 NSCLC 환자로부터 수득하였다. NSCLC 환자의 특징은 표 2에 도시된다. 수술 당일에 수득된 조직 샘플을 작은 조각으로 세단하고, 37℃에서 45분 동안 100 ng/ml DNAse I 및 20 ng/ml 콜라게나제 D (둘 다 로슈(Roche)로부터)를 갖는 RMPI 1640 배지 (깁코(Gibco)) 중에서 교반 하에 인큐베이션하였다. 이어서 세포 현탁액을 100 μm 스트레이너 통해 50 ml 팔콘 튜브로 통과시켜 단세포 현탁액을 수득하였다. 침윤된 면역 세포 집단을 하기 기재된 바와 같은 4℃에서 30분 동안 특이적 항체로의 염색 직후에 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 추가의 자극을 위해 림프구를 카운트하고, 10% 열-불활성화 태아 소 혈청 (PAA), 2 mM 글루타맥스 I CTS (깁코) 및 100 U/ml 페니실린 + 100 mg/ml 스트렙토마이신 (깁코)으로 보충된 RPMI-1640 배지 중에 1x106개 림프구/ml의 농도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 50 ng/ml PMA 및 10 ng/ml 이오노마이신 (둘 다 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))으로 37℃에서 1시간 동안 자극한 후 브레펠딘 A (바이오레전드(BioLegend), 1000x)를 3시간 동안 첨가하여 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서의 세포내 IFN-γ를 검출하였다. 일부 실험에서 재조합 IL-15 (페프로테크(Peprotech), 13 ng/ml)를 세포 배양물에 첨가하고, 증식성 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 37℃에서 3 및 7일의 인큐베이션 후에 유동 세포측정법에 의해 검출하였다. 세포 생존율을 DAPI (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에 의해 또는 라이브/데드® 픽서블 아쿠아 데드 셀 스테인 키트 405 nm 여기 (인비트로젠(Invitrogen))에 의해 검출하였다.
PBMC 단리 및 혈장 수집
바큐엣(VACUETTE)® 9 ml K3 EDTA에 수집된 말초 혈액의 2-3개 튜브를 신보조 수술을 겪은 60명의 NSCLC 환자 및 악성 질환의 병력이 없는 17-30명의 연령-매치된 지원자로부터 수득하였다. 혈장 2 - 4 ml를 5분 동안 3000 rpm으로 말초 혈액의 원심분리 후 수집하고, -80℃에서 저장하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜-파크 구배 원심분리에 의해 단리하였다. PBMC를 카운트하고, 완전 배지 내 1x106개 PBMC/ml의 농도로 96-웰 플레이트에 시딩하거나 또는 상기 기재된 바와 같은 mRNA 보존을 위해 RLT 완충제 중에 용해시켰다. 신선하게 단리된 PBMC를 하기 기재된 바와 같은 4℃에서 30분 동안 특이적 항체로의 염색 직후에 유동 세포측정법에 의해 Treg 및 MDSC 함량에 대해 분석하였다. 일부 PBMC를 분석 전에 액체 질소 중에 크리오스토르(CryoStor)® CS10 (바이오라이프 솔루션(BioLife Solution))에서 동결보존하였다.
면역 세포 분석에 사용되는 항체 및 염색 프로토콜
상피 종양 세포 - CD45 PE-DyLight594 (엑스바이오(Exbio)), 항-팬 시토케라틴 알렉사플루오르(AlexaFluor) 488 (이바이오사이언스(eBioscience)), 항-인간 상피 항원-FITC (다코(DAKO)).
수지상 세포: Lin neg (CD3-FITC, CD19-FITC, CD20-FITC, CD56-FITC), CD45-PE-DyLight594, CD11c-APC (모두 엑스바이오로부터), HLA-DR-PE-Cy7 (비디 파밍겐(BD Pharmingen)™).
림프구/NK 세포: CD3-알렉사플루오르 700, CD8-PE-Cy7, CD19-FITC, CD20-FITC (모두 엑스바이오로부터), CD4-ECD (베크만 쿨터(Beckman Coulter)), CD56-PerCP/Cy5.5 (이바이오사이언스).
나이브/메모리 T 세포: CD3-알렉사플루오르 700, CD8-PE-Cy7, CD45RA-PE, CD45RO-APC, CD62L-FITC (모두 엑스바이오로부터), CCR7-PerCP/Cy5.5 (바이오레전드), CD4-ECD (베크만 쿨터).
IFN-γ 생산 T 세포: CD3-알렉사 700, CD8-PE-Cy7 (둘다 엑스바이오로부터), CD4-ECD (베크만 쿨터), IFN-γ-FITC (비디 파밍겐).
종양 내 T 조절 세포: CD8-PE-Cy7 (엑스바이오), CD4-ECD (베크만 쿨터), Foxp3-알렉사플루오르 488 (이바이오사이언스).
PBMC 내 T 조절 세포: CD4-PE-Cy7, CD8-이플루오르 450, CD25-PerCP-Cy5.5, CD127-APC, Foxp3-알렉사플루오르 488, CD3ζ-PE (모두 이바이오사이언스로부터), Ki-67-알렉사플루오르 700 (비디 파밍겐).
MDSC: CD14-BD 호리즌 V450 (비디 호리즌(BD Horizon)), HLA-DR-알렉사 플루오르 700, CD33-PE-Cy7, (바이오레전드), CD11b-FITC, CD15-APC (이바이오사이언스) + 가능한 LOX1- PE (바이오레전드).
세포를 4℃에서 30분 동안 PBS 중 적절한 항체의 혼합물로 세포외로 염색하였다. IFN-γ, Foxp3, CD3ζ 및 Ki-67의 세포내 염색을 위해, 세포를 고정 완충제 (이바이오사이언스)를 사용하여 30분 동안 고정시키고, 투과화 완충제 (이바이오사이언스)로 투과화하고, 4℃에서 30분 동안 세포내로 염색하였다. 세포를 PBS로 세척하고, LSR포르테사 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))에 의해 분석하였다. 데이터를 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (트리 스타(Tree Star))로 분석하였다. 유동 세포측정법 데이터는 평균 형광 강도 (MFI)으로 표현될 수 있다.
시토카인 생산 및 LOX-1 혈장 검출
시토카인 생산을 결정하기 위해, 세포 상청액을 PMA 및 이오노마이신으로의 자극 후 24시간째에 수확하거나 또는 상기 기재된 바와 같은 IL-15로의 자극 후 제3일 및 제7일에 수확하였다. 세포 배양 상청액을 -80℃에서 저장하였다. GM-CSF, IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17, IL-22, IL-9, IL-1β, IL-2, IL-21, IL-4, IL-23, IL-6, TNFα를 매그픽스(MagPix) (엑스엠에이피 테크놀로지(XMAP Technology), 루미넥스)에 의해 루미넥스 검정 (밀리플렉스(MILLIPLEX)™ MAP 인간 Th17 자기 비드 패널, 머크 밀리포어(Merck Millipore))을 사용하여 결정하였다. PMN-MDSC 존재의 마커로서의 LOX-1 단백질을 ELISA (알디 시스템(RD System))에 의해 NSCLC 환자로부터의 혈장 샘플 (1:10 또는 1:50 희석됨)에서 검출하였다.
자기 마이크로비드를 사용하는 CD33
+
HLADR
-
MDSC의 단리
CD33+HLADR- 세포를 MACS 마이크로비드 및 칼럼 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))을 사용하여 NSCLC 환자의 백혈구분리반출술로부터 수득된 PBMC로부터 단리하였다. 간략하게, 해동시킨 PBMC를 냉 MACS 완충제 중에 재현탁시키고, 얼음 상에서 15분 동안 HLA-DR 마이크로비드 (밀테니 바이오텍)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 냉 MACS 완충제로 세척하여 미결합 비드를 제거하고 후속적으로 제조업체의 지침서에 따라 MACS 칼럼 상의 HLA-DR+ 세포의 고갈에 적용하였다. 음성 세포 분획을 수집하고, 세척하고 이어서 CD33 마이크로비드와 함께 인큐베이션하였다. MACS 칼럼을 CD33+HLA-DR- 세포의 양성 선택에 사용하였다. CD33+ 세포 집단의 순도를 유동 세포측정법에 의해 평가하였고 90%를 초과하였다.
세포 분류에 의한 CD33
+
CD14
+
HLA-DR
-
MDSC의 단리
간략하게, PBMC를 피콜 파크를 사용함으로써 NSCLC 환자의 백혈구분리반출술로부터 단리하고, -80℃에서 저장하였다. 해동시킨 PBMC를 냉 MACS 완충제 중에 재현탁시키고, 얼음 상에서 15분 동안 CD33 마이크로비드 (밀테니 바이오텍)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 냉 MACS 완충제로 세척하여 미결합 비드를 제거하고 후속적으로 제조업체의 지침서에 따라 MACS 칼럼 상의 CD33 음성 세포의 고갈에 적용하였다. CD33+ 세포 분획을 수집하고, 세척하고 4℃에서 20분 동안 항-CD14 및 항-HLA-DR Ab로 염색하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, CD33+ CD14+ HLADR-/low MDSC를 후속적으로 S3e 세포 분류기 (바이오라드(Biorad))를 사용하여 분류하였다.
MDSC 억제 검정
정제된 자가 T 세포 (웰당 50,000개 세포)를 CFSE로 표지하고, 항-CD3/CD28 익스팬더 비드 (웰당 2.5 x 105개 비드)를 사용하여 활성화시키고, 자기 비드-정제된 또는 분류된 MDSC의 상이한 비 (1:1, 1:2, 1:4 T 세포/MDSC 비)의 존재 하에 인큐베이션하였다. T-세포 증식을 제6일에 유동 세포측정법을 사용하여 CFSE 희석으로서 측정하였다. 억제는 대조군의 % = (분석된 샘플의 증식 - 비-증식성 세포의 증식) / (대조군의 증식 - 비-증식성 세포의 증식)으로서 계산된다. 세포 배양 상청액 중 IFN-γ 및 IL-2의 생산을 ELISA (알디 시스템)에 의해 평가하였다.
T 조절 세포의 단리 및 억제 검정
NSCLC 백혈구분리반출술로부터의 해동시킨 PBMC를 냉 PBS 중에 재현탁시키고, 30 μm 스트레이너를 통해 통과시켜 세포괴를 단리 전에 제거하였다. CD25+CD4+CD127low Treg를 이지셉(EasySep) 인간 CD4+CD127lowCD25+ 조절 T 세포 단리 키트 (스템셀 테크놀로지스(Stemcell Technologies))를 사용하여 단리하였다. CD3+ 이펙터 세포를 이지셉 인간 T 세포 풍부화 키트 (스템셀 테크놀로지스)를 사용함으로써 단리하고, CFSE (1 μM, 인비트로젠)로 염색하였다. 순도 및 CFSE-염색을 유동 세포측정법에 의해 확증하였다. 억제 검정을 위해 CFSE-염색된 CD3+ T 이펙터 세포 (웰당 50,000개 세포)를 96-웰 플레이트 단독 (음성 대조군)에 시딩하고, 항-CD3/CD28 익스팬더 비드 (웰당 16.7 x 103개 디나비즈 - 비 3:1 T 세포/비드) 단독 (양성 대조군)을 사용하여 활성화시키거나 또는 비드로 활성화시키고, 정제된 Treg의 상이한 비 (2:1, 1:1, 0.25:1, 0.125:1 Treg/Teff 비)의 존재 하에 인큐베이션하였다. 세포를 10% 인간 AB 혈청 (200 μl/웰)으로 보충된 완전 RPMI 1640 중에서 인큐베이션하였다. T 세포 증식을 제3일에 분석하였다 (대조군의 최적 증식 - 60-80%, 적어도 3회 생성). 억제는 MDSC 억제 검정에 대해 상기 기재된 바와 같이 계산된다. 세포 배양 상청액에서의 IL-2의 생산을 ELISA (알디 시스템)에 의해 평가하였다.
qPCR 및 단백질체학 분석
총 RNA를 RNeasy 미니 키트 (퀴아젠)를 사용하여 단리하였다. RLT 완충제 및 세포 용해물을 함유하는 각각의 샘플을 신속하게 해동시키고 DNase I 소화 단계가 포함된 제조업체의 프로토콜에 따라 가공하였다. RNA 농도 및 순도를 나노드롭 2000c (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 사용하여 결정하고, RNA 완전성을 애질런트 2000 바이오애널라이저 (애질런트(Agilent))를 사용하여 평가하였다. 정제된 RNA 샘플을 추가의 사용까지 -80℃에서 저장하였다. cDNA를 iScript cDNA 합성 키트 (바이오라드)를 사용하여 총 RNA의 100 ng으로부터 합성하였다. ARG1 유전자의 발현을 CFX96 터치(Touch)™ 실시간 PCR 검출 시스템 (바이오라드) 상에서 qPCR에 의해 결정하였다. 각각의 10 μl 반응물은 카파 프로브 패스트 qPCR 마스터 믹스 (카파 바이오시스템즈(Kapa Biosystems)) 5 μl, 각각의 정방향 및 역방향 프라이머 (각각 500 nM; 티아이비 몰바이올(TIB Molbiol)) 0.5 μl, 택맨 프로브 (200 nM; 티아이비 몰바이올) 0.5 μl, RNase-무함유 물 1.5 μl 및 5x 희석된 cDNA 2 μl를 함유하였다. 각각의 반응을 삼중으로 수행하였다. 온도 순환 프로토콜은 하기와 같았다: 95℃에서 3분 이어서 45회 사이클 (15초 동안 95℃ 및 60초 동안 60℃). 예상된 길이의 PCR 생성물의 형성을 아가로스 겔 전기영동에 의해 확증하였다. Cq 값을 CFX 매니저 소프트웨어 (바이오라드)를 사용하여 결정하고, 연구된 유전자의 상대 발현을 36 사이클에서 컷 오프를 갖는 GenEx 소프트웨어 (멀티디 애널리시즈(MultiD Analyses))로 계산하였다. 단백질체학 분석을 캔서 게놈 아틀라스(Cancer Genome Atlas)에서 NSCLC 암 종양 샘플 중 공개된 유전자로부터 수행하였다. 면역 세포 집단을 문헌 [Becht et al. (2016)]에 의해 도입된 트랜스크립톰-기반 컴퓨터 미세환경 세포 집단-카운터 (MCP-카운터) 방법을 사용하여 n= 508개의 AC 및 n= 495개의 SCC 환자의 종양 샘플로부터 분석하였다.
통계적 분석
양측 대응표본 t-검정 또는 독립표본, 비-파라미터 만-휘트니 검정을 그래프패드 프리즘 6 (미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 데이터 분석을 위해 적용하였다. 결과를 * p < 0.05, ** p < 0.01 또는 *** p < 0.001인 경우에 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 데이터를 평균 ± SEM으로서 표현하였다.
실시예 8: T 세포, B 세포 및 NK 세포 침윤은 AC 및 SCC 종양에서 유사하지만, 골수성 DC (CD11c
+
HLA-DR
hi
)는 SCC 종양에서 유의하게 감소된다
면역 세포 침윤은 인접한 비-종양 조직에서보다 NSCLC 종양에서 더 높다. 선암종 (AC) 및 편평 세포 암종 NSCLC 환자 (SCC)에서 2개의 조직학적으로 별개의 종양 사이의 T 세포, B 세포 및 NK 세포 또는 수지상 세포 침윤에서의 가능한 차이를 분석하였다. 42명의 AC 및 39명의 SCC 신보조 NSCLC 환자로부터 수득된 종양 및 비-종양 조직 (표 2)으로부터의 단세포 현탁액을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 세포 생존율은 종양 조직에서보다 비-종양 조직에서 더 높았지만, 종양 세포 생존율은 평균 대략 85%였다 (도 1a 상단 패널 참조). 종양에서의 우세하게 메모리 표현형을 갖는 CD8+ 및 CD4+ T 세포, B 세포, NK 세포 및 DC의 더 높은 침윤은 비-종양 조직과 비교했을 때 관찰되었다 (표 3 참조). AC 및 SCC 종양 사이의 이들 면역 세포 집단의 침윤 속도는 통계적으로 상이하지 않았다.
표 3: 종양-침윤 세포의 백분율 (43개의 AC 및 39개의 SCC 샘플로부터의 평균)
실시예 9: 종양내 T 세포 및 NK 세포는 AC NSCLC 환자에서보다 SCC에서 기능적으로 더 억제된다
종양-침윤 면역 세포의 표현형 분석은 단지 면역 세포 침윤의 정량적 평가만을 제공하므로, 종양 및 비-종양 세포 현탁액을 PMA 및 이오노마이신으로 1시간 동안 자극하고, 이어서 추가의 3시간 동안 브레펠딘 A를 첨가하였다. CD8+ 및 CD4+ T 세포에서의 IFN-γ 생산을 후속적으로 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 게이팅 전략은 도 8a에 제시된다. 비-특이적 자극 후 IFN-γ를 생산하기 위한 종양 및 비-종양 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 능력은 AC 및 SCC 환자로부터의 T 세포에서 유사하였다 (표 4 참조). 그러나, SCC 종양 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 IFN-γ 생산 능력은 인접한 건강한 조직에서 비롯된 T 세포와 비교했을 때 손상되었으며, 이는 SCC 종양에서의 T 세포가 AC 종양에서의 T 세포보다 그의 IFN-γ-매개 이펙터 기능에서 더 억제될 수 있다는 것을 시사한다 (표 4 참조). 디폴트 IFN-γ 생산은 비-자극된 조직 내 T 세포에서 관찰되지 않았다.
표 4: IFNγ
+
종양-침윤 세포의 백분율
게다가, 24시간 동안 자극된 조직으로부터의 시토카인 생산 (도 8b 참조)을 루미넥스에 의해 분석하였다. GM-CSF, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-23, IL-6 및 TNF-α의 생산은 인접한 비-종양 조직과 비교했을 때 AC 종양에서 유의하게 더 높았다. 이는 비-종양 조직에서보다 AC 종양 조직에서의 더 높은 림프구 (도 1b 참조) 및 상피 세포 (도 1a 하단 패널 및 표 5 참조) 함량으로 인한 것일 수 있다. 그러나, SCC 종양에서 대부분이 염증 유발 면역 시토카인인 시토카인 생산은 비-종양 조직과 필적할만하였으며, 이는 SCC 종양에서의 자극 후 염증유발 시토카인의 더 높은 억제가 종양 내 백혈구 침윤 및 상피 세포의 수로서 AC와 비교될 때 필적할만하였다. 비-자극된 조직에서 관찰된 시토카인 생산은 없었다 (도 8b 참조).
표 5: 종양 내 상피 세포의 백분율
PMA 및 이오노마이신은 면역 세포의 강한 비특이적 자극을 나타내므로, IL-15를 사용하여 항종양 면역에서 주요 역할을 하는 NK 세포 및 CD8+ T 세포를 우세하게 활성화시켰다. 종양 세포 현탁액을 단독으로 또는 IL-15와 함께 7일 동안 인큐베이션하였다. CD8+ T 세포 및 NK 세포의 증식을 Ki67+ 염색 이어서 유동 세포측정법에 의해 제0일, 제3일 및 제7일에 분석하였다. 각각 68% 및 79%의 T 세포 및 NK 세포가 AC 종양에서 인큐베이션의 제3일에 증식한 반면에, 단지 각각 23% 및 8%의 T 세포 및 NK 세포가 SCC 종양에서 증식하였으며, 이는 AC 종양보다 SCC에서의 더 높은 면역억제성 환경을 확증하였다 (표 6 참조).
표 6: T 세포 증식
TCGA 데이터베이스 (The Cancer Genome Atlas, National Cancer Institute and National Human Genome Research Institute, https://cancergenome.nih.gov, 표 7 참조)로부터 분석된 면역 유전자 발현은 SCC에서보다 AC에서 항종양-관련 면역 유전자의 더 높은 발현을 제시하며, 이는 AC 대비 SCC에서 더 높은 면역억제성 미세환경을 다시 지지한다. 흥미롭게도, 더 많은 항원이 AC 보다 SCC에서 발현된다.
표 7: NSCLC 환자에서의 T 조절/T 세포 및 MDSC-관련 유전자의 발현
실시예 10: T 조절 세포 침윤은 AC 종양에서 더 크지만 SSC 종양은 골수-유래 억제 세포에 의해 더 침윤된다
AC 및 SCC 환자의 면역억제성 종양 미세환경 사이의 차이를 고려하여, 2개의 주요한 면역억제성 면역 세포 집단 - CD4+CD25+ Foxp3+CD127low Treg 및 MDSC, 여기서 구체적으로 PMN-MDSC 및 M-MDSC를 분석하였다. 신선한 조직 샘플을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 게이팅 전략은 9에 제시되고, MDSC를 위한 항체 염색과 함께, 문헌 [Walter et al. (2012) 및 Bronte et al. (2016)]으로부터 채택되었다. Treg 및 MDSC 집단 둘 다는 NSCLC의 양쪽 조직학적 하위유형 중 비-종양 조직에서보다 종양에서 더 높은 수로 검출되었다 (표 8 참조). 그러나 Treg의 침윤은 SCC 종양보다 AC에서 더 높았다 (표 8 참조). 반대로, 더 높은 수의 PMN-MDSC 및 M-MDSC가 AC 종양에서보다 SCC에서 검출되었다 (표 8 참조). MDSC는 표현형 마커에 의해 단독으로 정의될 수 없고 이는 종양내 MDSC로부터 억제 검정을 수행하기 위해 기술적으로 도전하고 있으므로, 문헌 [Bronte et al. (2016)]에 기재된 바와 같은 MDSC 특징과 연관된 유전자의 발현을 분석하였다 (표 7 참조). (n= 508명의 AC 및 n= 495명의 SCC 환자)에 대한 TCGA 데이터베이스로부터의 Treg 및/또는 T 세포 기능과 관련된 유전자의 발현을 또한 평가하였다. 표 7은 대부분의 유전자의 더 높은 발현 중 대부분이 SCC에서의 MDSC와 연관되며, 더 높은 발현의 유전가가 AC 종양에서의 Treg/T 세포와 우선적으로 연관되는 것을 제시하며, 이는 표현형 관찰을 확증한다.
표 8: 종양-침윤 억제 세포의 백분율 (43개의 AC 및 39개의 SCC 샘플의 평균)
실시예 11: Treg는 AC 환자의 혈액에서 더 풍부하지만 MDSC의 수는 SCC 환자에서의 혈액에서 더 높다
Treg 침윤은 AC에서 더 높았고 MDSC 침윤은 SCC 종양에서 더 높았으므로, 이들 세포의 존재를 또한 NSCLC 환자의 혈액에서 분석하였다. 면역억제성 집단을 NSCLC 환자 및 악성 질환의 병력이 없는 연령-매치된 기증자로부터 단리된 PBMC에서 유동 세포측정법에 의해 정량적으로 측정하였다 (표 2, 도 5a 참조). PBMC를 또한 억제 검정에 의해 기능적으로 시험하였다 (도 11 참조). 게이팅 전략은 도 10a에 제시된다. Treg (CD4+CD25+Foxp3+ CD127low), PMN-MDSC (CD14-CD15+CD11b+) 및 M-MDSC (CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/low)를 동결된 PBMC (도 5a 및 표 9 참조) 및 신선하게 단리된 PBMC (표 10 참조)로부터 분석하였다. Treg는 SCC 환자 및 연령-매치된 대조군에서보다 AC 환자의 혈액에서 더 풍부하였다. 더욱이, Treg 검출은 동결보존에 의해 영향받지 않았다. Treg 억제 검정은 양쪽 조직학적 하위유형으로부터의 Treg가 CD8+ 및 CD4+ T 세포 증식을 감소시키는데 유사하게 유능하였다는 것을 추가로 제시한다 (도 11a 참조). 이는 AC 및 SCC 환자 사이의 혈액 내 Treg에서의 단지 정량적인 차이만을 시사한다. 흥미롭게도, Treg의 수는 단지 AC 환자의 혈액에서만 양쪽 MDSC 집단과 음성적으로 상관관계가 있었다 (M-MDSC에 대하여 도 6 및 PMN-MDSC에 대하여 10b, 10c 참조).
표 9: 동결된 샘플로부터의 PBMC 내 MDSC의 백분율
Treg와는 반대로, MDSC의 양쪽 유형의 수는 동결보존에 의해 영향받는다. 그러나, 신선한 PBMC 샘플의 분석은 AC 환자 및 연령-매치된 대조군보다 SCC의 혈액에서 더 많은 M-MDSC 세포를 제시하였다 (표 10 참조). PMN-MDSC의 수는 AC 및 SCC 환자 사이에 필적할만하고, 연령-매치된 대조군에서보다 더 높았다. PMN-MDSC는 억제성 기능이 없는 호중구와 구별될 수 없으므로 본 발명자들은 이들 세포 상의 LOX1 발현을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다 (도 11f 참조). LOX-1 양성 PMN-MDSC의 존재는 AC 환자 및 건강한 대조군과 비교하여 SCC 환자에서 크게 증가하였다. 게다가, PMN-MDSC의 존재와 연관된 LOX-1 단백질은 AC 환자 및 건강한 연령-매치된 대조군과 비교하여 SCC 환자로부터의 혈장에서 유의하게 증가하였다 (도 11e 참조). 유사하게, PMN-MDSC에서 우세하게 발현된 이펙터 분자인 ARG1의 발현은 SCC 환자에서 증가하였다 (도 5c). MDSC의 면역억제성 작용은 T 세포에서 CD3ζ 발현을 억제하는 것으로 제시되었다. 사실상, CD3ζ 쇄 발현은 AC 환자 또는 연령-매치된 대조군와 비교될 때 단지 SCC 환자에서 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서만 억제되었다 (도 5b 및 도 11d).
표 10: 신선한 샘플로부터의 PBMC 내 Treg 세포 및 MDSC의 백분율
SCC 환자에서 발견된 MDSC가 AC 환자에서 발견된 MDSC보다 더 억제성일 수 있다는 것을 입증하기 위해 MDSC 억제 검정을 수행하였다 (도 11a-c 참조). M-MDSC를 자기 비드 (CD33+ HLA-DR-/low) (도 11b 참조)로 또는 세포 분류 (CD33+CD14+HLA-DR-/low) (도 11c 참조)에 의해 정제하고, 자극된 CFSE-표지된 자가 T 세포와 혼합하였다. 흥미롭게도, 양쪽 조직학적 하위유형으로부터의 M-MDSC는 동일한 정도로 CD8+ 및 CD4+ T 세포 증식을 억제하였다. 그러나, 단지 SCC 환자로부터의 M-MDSC만이 AC 환자로부터의 M-MDSC와 비교하여 자극된 T 세포로부터 실질적으로 IL-2 및 IFN-γ 생산을 감소시켰다 (도 11a-b 참조). 이들 결과는 M-MDSC가 SCC 환자에서의 혈액에서 증가될 뿐만 아니라 AC 환자로부터의 혈액에서의 M-MDSC보다 T 세포에 대한 더 높은 억제성 활성을 나타낸다는 것을 제시한다.
참고문헌
Claims (17)
- 개체에서 편평 세포 암종 (SCC)을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한
면역원성 조성물 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물로서,
여기서 치료는 골수-유래 억제 세포 (MDSC)-억제제 또는 MDSC 이펙터 기능의 억제제 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제2 조성물과 조합한 조성물의 투여를 포함하는 것인
조성물. - 제1항에 있어서, 개체가 하기를 추가로 특징으로 하는 것인 조성물:
- 단핵구성 MDSC (M-MDSC)인, 말초 혈액 단핵 세포 내 살아있는 세포의 분획은 적어도 0.08%, 바람직하게는 적어도 0.1%임,
- M-MDSC인, 종양 조직 내 살아있는 세포의 분획은 적어도 0.005%, 바람직하게는 적어도 0.008%임,
- 혈청 또는 혈장 내 LOX-1의 수준은 75 pg/ml 초과, 우선적으로 100 pg/ml 초과임,
- 모든 PMN-MDSC 중에서의 LOX-1-발현 다형핵 MDSC (PMN-MDSC)의 백분율은 적어도 5%, 우선적으로 10%임,
- PMN-MDSC인, 종양 조직 내 살아있는 세포의 분획은 적어도 2%, 바람직하게는 적어도 2.5%임,
- 말초 혈액 단핵 세포 내 살아있는 Treg 세포의 분획은 최대 1.8%, 바람직하게는 최대 1.5%임,
- 종양 조직 내 살아있는 Treg 세포의 분획은 CD4+ T 세포의 최대 10%, 바람직하게는 CD4+ T 세포의 최대 9%임,
- 말초 혈액 단핵 세포 내 CD4+ T 세포 중에서의 CD3ζ의 분획은 건강한 개체의 대조군 CD4+ T 세포와 비교하여 적어도 0.9배만큼, 바람직하게는 적어도 0.8배만큼 감소됨,
- 말초 혈액 단핵 세포 내 CD8+ T 세포 중에서의 CD3ζ의 분획은 건강한 개체의 대조군 CD8+ T 세포와 비교하여 적어도 0.75배만큼, 바람직하게는 적어도 0.65배만큼 감소됨, 및/또는
- 환자의 말초 혈액 단핵 세포에서의 아르기나제 1의 상대 발현은 건강한 개체의 대조군 말초 혈액 단핵 세포와 비교하여 적어도 2.5배만큼 증가됨. - 개체에서 비소세포 폐암 (NSCLC)을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한
면역원성 조성물 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물로서,
여기서 치료는 골수-유래 억제 세포 (MDSC)-억제제 또는 MDSC 이펙터 기능의 억제제 및 임의적인 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제2 조성물과 조합한 조성물의 투여를 포함하고,
여기서 개체는 MDSC의 존재에 의해 야기된 면역억제성 종양 미세환경을 추가로 특징으로 하는 것인
조성물. - 제3항에 있어서, 면역억제성 종양 미세환경을 갖는 개체가 하기를 추가로 특징으로 하는 것인 조성물:
- 단핵구성 MDSC (M-MDSC)인, 말초 혈액 단핵 세포 내 살아있는 세포의 분획은 적어도 0.08%, 바람직하게는 적어도 0.1%임,
- M-MDSC인, 종양 조직 내 살아있는 세포의 분획은 적어도 0.005%, 바람직하게는 적어도 0.008%임,
- 혈청 또는 혈장 내 LOX-1의 수준은 75 pg/ml 초과, 우선적으로 100 pg/ml 초과임,
- 모든 PMN-MDSC 중에서 LOX-1-발현 PMN-MDSC의 백분율은 적어도 5%, 우선적으로 10%임,
- PMN-MDSC인, 종양 조직 내 살아있는 세포의 분획은 적어도 2%, 바람직하게는 적어도 2.5%임,
- 말초 혈액 단핵 세포 내 살아있는 Treg 세포의 분획은 최대 1.8%, 바람직하게는 최대 1.5%임,
- 종양 조직 내 살아있는 Treg 세포의 분획은 CD4+ 세포의 최대 10%, 바람직하게는 CD4+ 세포의 최대 9%임,
- 말초 혈액 단핵 세포 내 CD4+ T 세포 중에서의 CD3ζ의 분획은 건강한 개체의 대조군 세포와 비교하여 적어도 0.9배만큼, 바람직하게는 적어도 0.8배만큼 감소됨,
- 말초 혈액 단핵 세포 내 CD8+ T 세포 중에서의 CD3ζ의 분획은 건강한 개체의 대조군 세포와 비교하여 적어도 0.75배만큼, 바람직하게는 적어도 0.65배만큼 감소됨, 및/또는
- 환자의 말초 혈액 단핵 세포에서의 아르기나제 1의 상대 발현은 건강한 개체의 대조군 말초 혈액 단핵 세포와 비교하여 적어도 2.5배만큼 증가됨. - 제2항 또는 제4항에 있어서, M-MDSC가 CD14+CD15-CD33hiHLA-DR-/lo 표현형을 갖는 것인 조성물.
- 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, PMN-MDSC가 억제성 CD14-CD15+CD11b+ 표현형을 갖는 것, 바람직하게는 LOX-1을 발현하는 것인 조성물.
- 제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, SCC가 폐 암종인 조성물.
- 제1항, 제2항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 SCC, 바람직하게는 폐의 SCC로 진단된 것인 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 수지상 세포 요법/백신 (DC 백신), 입양 T-세포 요법, 펩티드성, DNA 또는 mRNA 백신 및 종양용해 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것, 바람직하게는 DC 백신인 조성물.
- 제9항에 있어서, DC 백신이 종양 연관 펩티드(들), DNA 또는 RNA로부터의 전체 항원, 전체 항원-단백질, 이디오타입 단백질, 종양 용해물/전체 종양 세포 또는 바이러스 벡터-전달 전체 항원으로부터 선택된 항원 공급원으로 제조된 것인 조성물.
- 제10항에 있어서, 전체 종양 세포가 높은 유체정역학적 압력에 의해 제조된 것인 조성물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, MDSC-억제제가 MDSC의 분화/성숙을 차단 또는 억제하거나, MDSC의 이동을 차단 또는 억제하거나, 또는 MDSC의 고갈/MDSC의 아폽토시스를 유도하거나, 또는 MDSC의 확장을 억제하는 것인 조성물.
- 제12항에 있어서, MDSC의 분화/성숙의 억제제가 올-트랜스-레티노산, 쿠르쿠민 유도체로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제12항에 있어서, MDSC의 이동의 억제제가 졸렌드론산, 항-글리칸 항체 및 CSF-1R 억제제로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제12항에 있어서, MDSC의 고갈 또는 아폽토시스의 유도제가 티로신 키나제 억제제, 바람직하게는 수니티닙, 항-Gr1 항체, IL4Rα 압타머, 겜시타빈, 시스플라틴, 파클리탁셀, 17-디메틸아미노에틸아미노-17-데메톡시겔다나마이신 (17-DMAG) 또는 5-플루오로우라실 (5-FU)로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제12항에 있어서, MDSC의 확장의 억제제가 베바시주맙, 셀레콕시브 및 피모지드로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제12항에 있어서, MDSC 이펙터 기능의 억제제가 산화성 스트레스의 유도제, 바람직하게는 N-히드록실-L-아르기닌 (NOHA), 니트로아스피린, N-아세틸 시스테인 (NAC), CpG 올리고데옥시-뉴클레오티드, 바르독솔론 메틸 (CDDO-Me), 위타페린 A 또는 스타틱인 조성물.
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