CN109310723A - 癌症的免疫疗法 - Google Patents
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Abstract
公开了组合物，其包含用于与骨髓源性的抑制性细胞抑制剂组合治疗鳞状细胞癌的免疫原性组合物，还公开了相应的治疗方法。
Description
肺癌属于最常被诊断的癌症之一，并且是恶性疾病中死亡的主要原因，其5年存活率为5-15％。在美国，非小细胞肺癌(NSCLC)占超过85％的肺癌病例，并且通常在晚期患者(通常伴有转移性疾病)中被诊断(Derman等人，2015)。可以根据组织学将NSCLC分成三个亚型：腺癌(AC，50％)、鳞状细胞癌(SCC，30％)和大细胞癌(5％)。2015年，世界卫生组织(theWorld Health Organization)已经更新了不同类型的NSCLC肿瘤的组织学分类(Travis等人，2015)。而且已描述了不同甲基化的基因以区分AC和SCC(Huang等人，2016)。小细胞癌包括剩下15％的肺癌病例。肺癌的发生率和死亡率仍然很高。因此，急需要开发可能使用免疫治疗策略的改进的疗法。
尽管在免疫疗法领域进行了巨大的努力，但是到目前为止实际上仅非常少的治疗方式进入市场。这可能是由于对在癌症患者中通常观察到的肿瘤中的免疫细胞浸润与免疫抑制背后的机制关联性仍然不完全了解。
免疫抑制是骨髓源性的抑制性细胞(MDSC)的主要特征。MDSC的主要靶标是T细胞。MDSC介导的免疫抑制中涉及的主要因素包括例如，精氨酸酶(ARG1)、iNOS、TGFb、IL10、COX2、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、半胱氨酸的螯合、T细胞表达的L-选择素的减少。单核细胞MDSC(M-MDSC)利用与NO和细胞因子产生相关的机制，以抗原特异性和非特异性方式抑制T细胞应答(Gabrilovich等人，2012)。多形核MDSC(PMN-MDSC)能够主要以抗原特异性方式抑制免疫应答，诱导抗原特异性T细胞耐受(Koehn等人，2015,Marigo等人，2010)。活性氧类(ROS)的产生对这一能力至关重要。NO与超氧化物的反应产生过氧化亚硝酸盐(PNT)，其通过硝化T细胞受体和降低其对同源抗原–MHC复合物的应答性而直接抑制T细胞(Nagaraj等人，2007)。PNT还减少抗原肽与肿瘤细胞上的MHC分子的结合(Lu等人，2011b)，并通过硝化T细胞特异性趋化因子而阻断T细胞迁移(Molon等人，2011)。
肿瘤微环境中的第二类免疫抑制细胞是调节性T细胞(Treg)，其被报道在抑制肺癌中的免疫应答中起着决定性的作用(Domagala-Kulawik等人，2014)。
尽管如此，人们对各种肿瘤或肿瘤亚型中的肿瘤微环境知之甚少。出人意料地是，在本发明的过程中发现，实际上MDSC在肺癌亚型(即SCC)中起着免疫抑制的主导作用。因此，本发明涉及用于治疗癌症的免疫原性组合物，更具体地，涉及限制患有SCC的患者或患有NSCLC的分层患者的肿瘤的免疫抑制性微环境的治疗。
定义
“免疫原性组合物”是指诱导个体的免疫应答的组合物。此类免疫原性组合物通常是所有种类的疫苗，其中抗原组合物(疫苗)的注射引发针对抗原(即，在针对肿瘤特异性抗原的癌症的情况下)的免疫应答。典型的癌症疫苗为树突细胞疗法/疫苗(DC疫苗)，过继性T细胞疗法，肽类、DNA或mRNA疫苗或溶瘤病毒。在优选的实施方案中，使用DC疫苗。
“DC疫苗”是指在不存在抗原来源或存在抗原来源下制备的、可以施用的用于治疗用途的DC。优选地，用选自以下的抗原来源制备DC：肿瘤相关肽、来自DNA或RNA的完整抗原、完整抗原-蛋白、独特型蛋白、肿瘤裂解物/完整肿瘤细胞或病毒载体递送的完整抗原。
“Treg”是指对CD4、CD25以及Foxp3转录因子呈阳性的T细胞，其抑制肿瘤特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞以及NK细胞的功能和增殖。
“骨髓源性的抑制性细胞”或“MDSC”被报道通过产生各种免疫抑制性分子的方式诱导Treg(Malek等人，2016)并限制效应T细胞增殖。更具体地，MDSC由被称为“多形核的”(PMN-MDSC)–可选地也被称为“粒细胞的”(G-MDSC)(其表型上和形态上类似于中性粒细胞)和被称为“单核细胞的”(M-MDSC)(其表型上和形态上类似于单核细胞)的两个大组的细胞组成。此外，存在早期MDSC(eMDSC)(Gabrilovich,2017)。在本申请中，当单独使用时，术语MDSC被理解为包括M-MDSC和PMN-MDSC。在人类中，PMN-MDSC被限定为CD11b+CD14–CD15+或CD11b+CD14-CD66b+，且M-MDSC被限定为CD11b+CD14+HLA-DR–/loCD15–。可以基于MHC II类分子HLA-DR的表达从单核细胞分离M-MDSC。可以例如通过使用标准Ficoll梯度的梯度离心从中性粒细胞分离PMN-MDSC。PMN-MDSC被富集在低密度级分中(PBMC)，而中性粒细胞为高密度细胞(Dumitru等人，2012)。最近发现，可以将凝集素类型氧化的LDL受体1(LOX-1)用作PMN-MDSC的标志物(Condamine等人，2016)。
“MDSC抑制剂”是指减少、阻断和/或抑制MDSC的分子，其抑制MDSC的增殖或分化，例如全反式视黄酸(ATRA)抑制MDSC的分化。MDSC抑制剂阻断或抑制MDSC的分化/成熟、阻断或抑制MDSC的迁移、或诱导MDSC的消耗/MDSC的细胞凋亡、或抑制MDSC的扩增。可选地，还可以将MDSC抑制剂分组为以下分子：使MDSC失活的分子、抑制MDSC分化为成熟细胞的分子、阻断MDSC发育的分子或消耗MDSC的分子(Wesolowski等人，2013)。在本文中，分子优选是指分子量≤2500道尔顿，尤其是≤900道尔顿的低分子量分子，和/或生物制药大分子，优选重组治疗蛋白。
“健康个体”是指无恶性疾病史的个体。类似地，“健康组织”是指没有来自待治疗的肿瘤所源自的相同器官的恶性疾病病征的组织(例如肺组织)。
当在本说明书和权利要求中使用术语“包含(comprising)”时，其不排除其他元素。为了本发明的目的，术语“由…组成(consisting of)”被认为是术语“包含(comprisingof)”的优选实施方案。如果在下文中，将组限定为包含至少一定数量的实施方案，则这也应理解为公开了这样的组，其优选仅由这些实施方案组成。
当涉及单数名词时，其中使用不定冠词或定冠词(例如“一个/种(a/an)”或“所述(the)”)时，这包括该名词的复数，除非另有特别说明。
将技术术语以其通常含义使用。如果赋予某些术语特定含义，在以下使用术语的上下文中将给出术语的定义。
发明描述
癌症异质性(使得克隆存活和治疗抗性的标志)被通过主动免疫应答形成。抗原特异性T细胞可以如通过免疫治疗(诸如过继性T细胞转移和检查点阻断)临床显示来控制癌症。然而，癌症免疫疗法仍然具有低的成功率，且需要详细理解谁将受益和为何如此(Harrop,2013)。
在基于本发明的研究中，比较了来自接受新辅助疗法手术的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的最初38例腺癌(AC)和35例鳞状细胞癌(SCC)的原发性肿瘤(Tu)和非肿瘤肺组织(NTu)，以及来自13名AC和12名SCC患者和10名年龄匹配的对照/良性患者的血液样品中的免疫细胞浸润、T细胞应答和细胞因子产生(参见表1)。应理解，术语“PBMC”是指通过技术人员通常已知的方法从血液样品中分离的各自的PBMC，除非明确指出PBMC已经被分离自其他来源。在完成该研究的努力中，扩大了样品采集并且达到了43份AC组织样品和39份SCC肿瘤组织样品、32份AC血液样品、30份SCC血液样品和17份健康年龄匹配的对照血液样品，以及57份AC血浆血液样品、52份SCC血浆血液样品和41份健康年龄匹配的对照血浆血液样品(参见表2)。类似地，比较了NSCLC患者和健康年龄匹配的供体的PBMC中的骨髓源性的抑制性细胞(MDSC)和CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的群体。在两种肿瘤亚型中，观察到与非肿瘤组织相比，各种免疫细胞群的显著更高的浸润。在肿瘤样品中，研究证实了早期公布的数据(Black等人，2013)，显示AC中的CD4+CD25+Foxp3+Treg浸润高于SCC中。
然而，出人意料地是，与AC患者以及对照相比，在SCC患者中，来自血液和肿瘤样品的CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/lo M-MDSC的群体以及来自肿瘤样品的CD11b+CD14-CD15+PMN-MDSC被显著增强。另外，观察到SCC患者的CD4+T细胞和CD8+T细胞中CD3ζ的下调以及PBMC中ARG1表达的上调。CD4+T细胞和CD8+T细胞两者中CD3ζ的下调与PMN-MDSC的存在呈负相关。功能抑制测试表明M-MDSC和PMN-MDSC在SCC患者而非AC患者中起着超过Treg的主要抑制作用。
此外，该研究旨在分析原发性NSCLC肿瘤和非肿瘤组织中免疫细胞的浸润，以分析刺激后肿瘤内产生IFN-γ的CD4+T细胞和CD8+T细胞及细胞因子的产生。还分析了NSCLC患者以及年龄匹配的健康对照的肿瘤和外周血中MDSC和CD4+CD25+Foxp3+Treg的存在。
基于SCC和AC的比较研究，发现在两种亚型中，肿瘤中的免疫细胞浸润要高于非肿瘤组织中的免疫细胞浸润。除了常规树状细胞(DC)(CD11c+HLA-DRhi)，免疫细胞的浸润无差异。与AC相比，SCC中的这些DC显著降低，这表明SCC肿瘤中的较低的抗原呈递能力。
出人意料地，当分析外周血单个核细胞群时，仅在SCC患者的血液中观察到单核细胞CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/lo MDSC群、CD4+T细胞和CD8+T细胞中CD3ζ的下调以及PBMC中ARG1的上调。AC和SCC MDSC均抑制T细胞增殖，但仅对于SCC观察到T细胞中IL-2和IFN-γ的较强抑制。因此，来自SCC的MDSC具有更高的抑制活性。此外，当分析肿瘤浸润性MDSC时，SCC肿瘤中的CD11b+CD14-CD15+PMN-MDSC和CD14+CD33hiHLA-DR-/lo M-MDSC群要高于AC肿瘤中。CD4+CD25+Foxp3+CD127低Treg仅在AC患者的冷冻血液样品中被增强，并且与CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/lo MDSC群呈负相关，表明NSCLC中AC和SCC组织型之间的系统性免疫抑制机制的差异。当分析新鲜血液样品时，观察到相同的结果。在AC而非SCC中，Treg与CD11b+CD14-CD15+PMN-MDSC呈负相关。这在冷冻样品中不能被检测到，是由于冷冻保存后非常高比例的PMN-MDSC衰减。当基于表型定征分析患者血液(无论新鲜的或冷冻的)中CD11b+CD14-CD15+PMN-MDSC的量时，未观察到AC和SCC之间的差异。当分析肿瘤样品时，在NSCLC的两种组织亚型中，相比非肿瘤组织，在肿瘤中检测到更高数目的Treg。然而，AC肿瘤中Treg的浸润要高于SCC肿瘤中的Treg的浸润。
总之，在SCC中，已经显示免疫抑制性肿瘤微环境受到MDSC的控制，然而在大多数患有AC的癌症患者中MDSC仅具有较小的作用。由于已经显示MDSC在肿瘤微环境中具有强的免疫抑制性活性(Umansky等人，2016)，利用宿主免疫系统以对抗具有MDSC表型的SCC或NSCLC的解决方案可以为将免疫治疗剂(诸如树突细胞疫苗)与MDSC的抑制剂组合。
因此，在第一个方面，本发明涉及包含免疫原性组合物和任选的药学上可接受的载体的组合物，其用于治疗患有SCC的个体的鳞状细胞癌(SCC)或延迟患有SCC的个体的鳞状细胞癌(SCC)的进展。所述治疗包括施用所述组合物与第二组合物的组合，所述第二组合物包含骨髓源性的抑制性细胞(MDSC)抑制剂或MDSC效应器功能的抑制剂以及任选的药学上可接受的载体。
基于MDSC是SCC中主要的免疫抑制性细胞这一出人意料的发现，可以推断它们的抑制或它们的效应器功能的抑制导致肿瘤微环境中免疫系统的显著降低的抑制，并因此使得组合的免疫疗法更有效。这可能是克服总体上免疫疗法的严峻挑战和克服低临床效力的重要方法，尽管其在确定由细胞毒性T细胞(CTL)识别的肿瘤相关的抗原上具有优势(Ramakrishnan等人，2010)。
此类患有SCC的个体的特征还可以在于在外周血单个核细胞(PBMC)中为CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/lo M-MDSC的活细胞的分数为至少0.08％，优选为至少0.1％。％值是指PBMC的活细胞总数的％。M-MDSC的这些百分比对应于如实施例7中所述通过细胞分选从先前冷冻保存的PBMC样品获得的测量值。当在新鲜非冷冻保存的样品中测量PBMC中活细胞的分数时，个体的特征可以在于为M-MDSC的活细胞PBMC的分数为至少0.25％，且优选为至少0.35％。可以从患者的血液收集PBMC，并通过Ficoll-Pague梯度离心或本领域已知的其他技术进行分离。可以使用DAPI染色或可固定水死细胞染色(FixableAqua Dead Cell Stain)或本领域已知的任何其他技术，通过细胞计数法将死细胞与活细胞区分开。可以例如通过使用定设门参数(涉及抗CD14抗体、抗CD33抗体和抗HLA-DR抗体)的流式细胞术测量M-MDSC。在特别优选的实施方案中，如实施例7中的方法所述确定M-MDSC的分数。
患有SCC的个体的特征还可以在于在肿瘤组织中为M-MDSC的活细胞的分数为至少0.005％，优选为至少0.008％。在优选的实施方案中，肿瘤组织为新鲜肿瘤组织(即肿瘤组织还未经冷冻)。在另一实施方案中，肿瘤组织样品是冷冻的。
表征患有SCC的个体的另一方法是血清或血浆水平的LOX-1为至少75pg/ml，优选为至少100pg/ml。可以通过本领域已知的技术从患者的血液获得血清或血浆。LOX-1代表凝集素类型氧化的低密度脂蛋白受体1(LOX-1)、OLR1、CLEC8A、LOX1、LOXIN、SCARE1、SLOX1或氧化的低密度脂蛋白受体1(Ox-LDL受体1)。LOX-1已被鉴定为内皮细胞、单核细胞、血小板、心肌细胞和血管平滑肌细胞中氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL)的主要受体。它的表达在生理条件下是最低的，但在病理条件下可以被诱导(Lu等人，2011a)。它可以被切割并且以可溶形式被释放至循环中(Biocca等人，2013)。可以通过本领域已知的技术(例如通过ELISA测试)测量血液或血浆中的可溶性LOX-1的水平。
表征患有SCC的个体的另一方法是至少5％，优选至少10％的CD15+外周血单个核细胞为LOX-1+(表达LOX-1的PMN-MDSC)。如实施例7的方法中所述的，从外周血中对于CD15为阳性的MDSC测量LOX-1阳性细胞的百分比。
患有SCC的个体的特征还可以在于在肿瘤组织中为PMN-MDSC的活细胞的分数为至少2％，优选为至少2.5％。如实施例7中所述确定PMN-MDSC的分数。应当理解，当通过流式细胞术测量时，所计数的PMN-MDSC还可以含有被相同的抗体识别的一部分中性粒细胞。在进行流式细胞术测量之前，可以通过Ficoll梯度从PMN-MDCS分离中性粒细胞。PMN-MDSC被富集在低密度级分中，而中性粒细胞为高密度细胞。
在另一方面，此类患有SCC的个体的特征可以在于为Treg细胞的活PBMC的分数为最多1.8％，优选为最多1.5％。％值是指PBMC的活细胞总数的％。Treg细胞的这些百分比对应于从先前冷冻保存的PBMC样品获得的测量值。当在新鲜非冷冻保存样品中测量PBMC中活细胞的分数时，个体的特征可以在于为Treg细胞的活PBMC的分数为最多1％，优选为最多0.8％。在特别优选的实施方案中，如实施例7的方法中所述确定Treg的分数。
还可以将肿瘤组织中活Treg细胞的分数用于表征具有MDSC占主导地位的肿瘤环境的个体。在这种情况下，在肿瘤组织中为Treg细胞的活PBMC的分数为最多10％的CD4+细胞，优选为最多9％的CD4+细胞。发明人推断SCC患者通常具有免疫抑制性肿瘤环境，并且如果这不是由于肿瘤组织中的高Treg细胞，则这转而是基于高MDSC。
在另一方面，此类患有SCC的个体的特征可以在于与健康个体的对照CD4+T细胞相比，在PBMC中CD3ζ在CD4+T细胞中的分数降低了至少90％，优选至少80％。CD3ζ的这些分数对应于从先前冷冻保存的PBMC样品获得的测量值。当在新鲜的非冷冻保存的样品中测量PBMC中活细胞的分数时，个体的特征可以在于与健康个体的对照CD4+T细胞相比，在PBMC中CD3ζ在CD4+T细胞中的分数降低了至少70％，优选至少60％。可以例如通过用抗CD3ζ抗体对分离的CD4+T细胞进行免疫染色来测量CD3ζ在CD4+T细胞中的分数。先前已经将T细胞上CD3ζ表达的降低与增加的MDSC抑制活性相关联，并且可以通过由于MDSC的ARG1活性增加而缺乏L-精氨酸来解释，这是(Gabrilovich和Nagaraj,2009)。
在另一实施方案中，此类患有SCC的个体的特征可以在于与健康个体的对照CD8+T细胞相比，在PBMC中CD3ζ在CD8+T细胞中的分数降低了至少75％，优选至少65％。CD3ζ的这些分数对应于从先前冷冻保存的PBMC样品获得的测量值。当在新鲜的非冷冻保存的样品中测量PBMC中活细胞的分数时，个体的特征可以在于与健康个体的对照CD8+T细胞相比，在PBMC中CD3ζ在CD8+T细胞中的分数降低了至少70％，优选至少50％。
在另一实施方案中，患有SCC的个体的特征在于与健康个体的PBMC细胞相比，PBMC的ARG1的相对表达增加了至少2.5倍。可以通过定量PCR测量PBMC的ARG1的相对表达。在优选的实施方案中，如实施例7中所述通过定量PCR确定水平。
在第三方面，本发明涉及包含免疫原性组合物和任选的药学上可接受的载体的组合物，其用于治疗个体中的非小细胞肺癌(NSCLC)或延迟个体中的非小细胞肺癌(NSCLC)的进展，其中所述治疗包括施用所述组合物与第二组合物的组合，所述第二组合物包含骨髓源性的抑制性细胞(MDSC)抑制剂或MDSC效应器功能的抑制剂以及任选的药学上可接受的载体，其中所述个体的特征还在于由于MDSC的存在而造成的免疫抑制性肿瘤微环境。在本发明的上下文中，由于MDSC的存在而造成的免疫抑制性肿瘤微环境涉及MDSC对免疫系统的不同细胞(主要是T细胞)的抑制。MDSC介导的免疫抑制中涉及的主要因素包括：ARG1表达增加、iNOS表达增加、MDSC的TGFβ和IL10产生增加、MDSC中的COX2活性增加、MDSC或肿瘤细胞的吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)表达增加、MDSC的半胱氨酸螯合、T细胞的L-选择素表达减少，以及许多其他的因素(Bronte等人，2016，表3，在此通过引用并入)。与健康组织相比，可以将这些因素的任何差异均用于表征免疫抑制性肿瘤微环境。据信M-MDSC通过利用与NO和细胞因子产生相关的机制而抑制T细胞应答(综述于Gabrilovich等人，2012中)。在另一方面，PMN-MDSC主要以抗原特异性方式，通过例如诱导抗原特异性T细胞耐受性而抑制免疫应答(Koehn等人，2015，Marigo等人，2010)。
然而，在本发明的上下文中通常观察到SCC患者具有显著增强的MDSC的存在，还有许多AC患者具有类似的MDSC水平。因此，可以推断具有由于MDSC的存在而造成的免疫抑制性肿瘤微环境的任何NSCLC患者，将从采用免疫原性组合物和MDSC-抑制剂或MDSC效应器功能的抑制剂的组合治疗受益。
在另一方面，本发明涉及包含免疫原性组合物和任选的药学上可接受的载体的组合物，其用于治疗个体的非小细胞肺癌(NSCLC)或延迟个体的非小细胞肺癌(NSCLC)进展，其中所述治疗包括施用所述组合物与第二组合物的组合，所述第二组合物包含骨髓源性的抑制性细胞(MDSC)抑制剂或MDSC效应器功能的抑制剂以及任选的药学上可接受的载体，其中具有由于MDSC的存在而造成的免疫抑制性肿瘤微环境的个体的特征在于在PBMC中为M-MDSC的活细胞的分数为至少0.08％，优选为至少0.1％。M-MDSC的这些百分比对应于从先前冷冻保存的PBMC样品获得的测量值。当在新鲜的非冷冻保存的样品中测量PBMC中活细胞的分数时，个体的特征可以在于为M-MDSC的活细胞PBMC的分数为至少0.25％，优选为0.35％。
具有由于MDSC的存在而造成的免疫抑制性肿瘤微环境的个体的特征还可以在于在肿瘤组织中为M-MDSC的活细胞的分数为至少0.005％，优选为至少0.008％。在优选的实施方案中，肿瘤组织为新鲜肿瘤组织(即未经冷冻的肿瘤组织)，这是由于MDSC对冷冻/解冻的敏感性。
表征具有由于MDSC的存在而造成的免疫抑制性肿瘤微环境的个体的另一种方法是血清或血浆水平的LOX-1为至少75pg/ml，优选为至少100pg/ml。可以通过本领域已知的技术从患者的血液获得血清或血浆。
表征具有由于MDSC的存在而造成的免疫抑制性肿瘤微环境的个体的另一种方法是至少5％，优选至少10％的CD15+外周血单个核细胞为LOX-1+(表达LOX-1的PMN-MDSC)。如实施例7的方法中所述的，从外周血中对于CD15为阳性的MDSC测量LOX-1阳性细胞的百分比。
具有由于MDSC的存在而造成的免疫抑制性肿瘤微环境的个体的特征还可以在于在肿瘤组织中为PMN-MDSC的活细胞的分数为至少2％，优选为至少2.5％。如实施例7中所述确定PMN-MDSC的分数。应当理解，当通过流式细胞术测量时，所计数的PMN-MDSC还可以含有被相同的抗体识别的一部分中性粒细胞。在进行流式细胞术测量之前，可以通过Ficoll梯度从PMN-MDCS分离中性粒细胞。PMN-MDSC被富集在低密度级分中，而中性粒细胞为高密度细胞。
具有由于MDSC的存在而造成的免疫抑制性肿瘤微环境的个体的特征可以在于在外周血单个核细胞中活Treg细胞的分数为最多1.8％，优选为最多1.5％。Treg细胞的这些百分比对应于从先前冷冻保存的PBMC样品获得的测量值。当在新鲜的非冷冻保存的样品中测量PBMC中活细胞的分数时，个体的特征可以在于为Treg细胞的活PBMC的分数为最多1％，优选为最多0.8％。
还可以将肿瘤组织中活Treg细胞的分数用于表征具有免疫抑制性肿瘤微环境的个体。在这种情况下，在肿瘤组织中为Treg细胞的活PBMC的分数为最多10％的CD4+细胞，优选为最多9％的CD4+细胞。发明人推断NSCLC患者通常具有免疫抑制性肿瘤环境，并且如果这不是由于肿瘤组织中的高Treg细胞，这转而是基于高MDSC。
对于PBMC中的CD4+T细胞和CD8+T细胞，CD3ζ的减少是间接的测量，这是由于升高的ARG1活性，其通过消耗精氨酸而造成T细胞抑制(Gabrilovich和Nagaraj,2009)。
因此，表征具有由于MDSC的存在而造成的免疫抑制性肿瘤微环境的个体的另一方法是与健康个体的对照细胞相比，在PBMC中CD3ζ在CD4+T细胞中的分数降低了至少90％，优选至少80％。CD3ζ的这些分数对应于从先前冷冻保存的PBMC样品获得的测量值。当在新鲜的非冷冻保存的样品中测量PBMC中活细胞的分数时，个体的特征可以在于与健康个体的对照细胞相比，在PBMC中CD3ζ在CD4+T细胞中的分数降低了至少70％，优选至少60％。可以例如通过用抗CD3ζ抗体对分离的CD4+T进行免疫染色来测量CD3ζ在CD4+T细胞中的分数。
此外，表征具有由于MDSC的存在而造成的免疫抑制性肿瘤微环境的个体的另一方法是与健康个体的对照细胞相比，在PBMC中CD3ζ在CD8+T细胞中的分数降低了至少75％，优选至少65％。CD3ζ的这些分数对应于从先前冷冻保存的PBMC样品获得的测量值。当在新鲜的非冷冻保存的样品中测量PBMC中活细胞的分数时，个体的特征可以在于与健康个体的对照细胞相比，在PBMC中CD3ζ在CD8+T细胞中的分数降低了至少70％，优选至少50％。
具有由于MDSC的存在而造成的免疫抑制性肿瘤微环境的个体的特征还可以在于与健康个体的PBMC相比，PBMC中ARG1的相对表达增加了至少2.5倍。可以通过定量PCR测量PBMC中ARG1的相对表达。
在本发明的一个方面，M-MDSC的特征在于具有CD14+CD15-CD33hiHLA-DR-/lo表型，和PMN-MDSC的特征在于具有抑制性CD14-CD15+CD11b+表型，优选地表达LOX-1。可以将流式细胞术或本领域已知的其他技术用于根据表型表征这些细胞。PMN-MDSC为CD14-CD15+CD11b+的表型表征也可以应用于中性粒细胞。然而，本研究的肿瘤患者的中性粒细胞污染物被认为是可以忽略的。在另一方面，在进行流式细胞术测量之前，可以通过Ficoll梯度从PMN-MDCS分离中性粒细胞(Scapini和Cassatella,2014)。PMN-MDSC被富集在低密度级分(PBMC)中，而中性粒细胞为高密度细胞。此外，中性粒细胞不具有抑制能力，通常归因于PMN-MDSC。可以例如通过抑制抗CD3/CD28(或聚羟基烷酸酯)诱导的T细胞增殖或IL-2和IFN-γ产生来显示抑制。可以将3H-胸苷掺入或CFSE稀释用于测量T细胞增殖，和可以将ELISPOT或者细胞内染色用于测量IFN-γ产生。
在另一个方面，组合物旨在治疗肺的SCC或延迟肺的SCC进展。肺的鳞状细胞癌是非小细胞肺癌的一种形式。SCC开始于肺内排列成气道的组织中。它也被称为表皮样癌。肺的大多数SCC位于中心，通常在连接气管与肺的较大支气管内。与其他形式的非小细胞肺癌相比，SCC与吸烟联系更强，并且与女性相比，在男性中更为常见。它们倾向于为缓慢生长的，并且由于它们的位置，通常比其他形式的肺癌发现得更早。肺癌的常见症状包括持续的咳嗽、咳血和气喘。因为SCC倾向于位于大的气道附近，它们常常比其他形式的肺癌引起更早的症状。气道的阻塞可以导致引起感染，诸如肺炎或部分肺的萎陷(肺不张)。SCC是潘科斯特综合征(Pancoast syndrome)或上沟综合征的最常见病因。潘科斯特综合征由肺癌引起，其开始于肺的顶部附近并侵入附近结构。症状通常包括向下辐射至手臂内侧的肩痛、手的无力或刺痛感、脸的一侧上的脸红或出汗和眼睑下垂(霍纳氏综合征(Horner’ssyndrome))。患有SCC的个体也更可能经历血钙过多，其可以导致肌无力和痉挛。血钙过多是副肿瘤综合征的一种症状，并且由分泌提高血液中的钙水平的激素样物质的肿瘤而引起的。
在本发明的另一方面，组合物旨在治疗已经被诊断患有SCC的个体。SCC的诊断为本领域众所周知的(Travis等人，2015)。当在X射线上看见异常情况时，通常首先怀疑为肺的SCC。其他的评估可以包括：胸部CT扫描、痰细胞学检查、支气管镜检、PET扫描、支气管内超声。根据结果，可以获得肺活组织检查切片来确认诊断(Travis等人，2013)。将肺的SCC分为4个阶段：
第I阶段：癌症被定位在肺内，并且未扩散至任何淋巴结
第II阶段：癌症已经扩散至淋巴结或肺的内层，或者在主支气管的某一区域
第III阶段：癌症已经扩散至肺附近组织
第IV阶段：癌症已经扩散(转移)至身体的另一部分。
在本发明的另一方面，可以将旨在治疗肺的SCC或延迟肺的SCC进展的组合物与标准护理治疗(其目前不能区分SCC和AC)组合施用，所述标准护理治疗优选卡铂加紫杉醇用于治疗第IV阶段的NSCLC，培美曲赛加卡铂用于治疗第IV阶段EGFR野生型NSCLC，吉西他滨加顺铂或培美曲赛加顺铂用于治疗第IIIB至第IV阶段的EGFR野生型NSCLC，或者长春瑞滨加卡铂用于治疗第IIIA-IV阶段的NSCLC。
在另一方面，本发明涉及免疫原性组合物与MDSC抑制剂或MDSC效应器功能的抑制剂的组合，其中所述免疫原性组合物选自：树突细胞疗法/疫苗(DC疫苗)，过继性T细胞疗法，肽类、DNA或mRNA疫苗和溶瘤病毒，优选DC疫苗。过继性T细胞疗法的不同技术已经被描述于Houot R等人(2015)中，其通过引用并入本文中。肽类疫苗的不同技术已经被描述于Xiao YF等人(2015)中，其通过引用并入本文中。DNA疫苗的不同技术已经被描述于Yang B等人(2014)中，其通过引用并入本文中。mRNA疫苗的不同技术已经被描述于McNamara MA等人(2015)中，其通过引用并入本文中。溶瘤病毒疫苗的不同技术已经被描述于Aitken AS等人(Aitken等人，2017)中，其通过引用并入本文中。树突细胞疫苗的不同技术已经被描述于Turnis和Rooney,(2010)中，其通过引用并入本文中。
在优选的实施方案中，如Turnis和Rooney(2010)(其通过引用并入本文中)的表1中所例示的，用选自以下的抗原来源制备DC疫苗：肿瘤相关的肽、来自DNA或RNA的完整抗原、完整抗原-蛋白、独特型蛋白、肿瘤裂解物/完整肿瘤细胞或病毒载体递送的完整抗原。
在特别优选的实施方案中，如WO 2013/004708和WO 2015/097037(其通过引用并入本文中)中所述，通过高流体静压力(HHP)制备用于加载至未成熟DC上的此类完整肿瘤细胞，。用HHP处理的完整肿瘤细胞允许诱导免疫原性细胞死亡(ICD)，其为特定的细胞凋亡类型。死于ICD的肿瘤细胞将表达非常强的“吃我”信号，诸如钙网蛋白、HSP70和HSP90。这些“吃我”信号将引发未成熟DC对凋亡肿瘤细胞的有效吞噬，以及成熟DC对肿瘤抗原的有效呈递。使用HHP产生有效NSCLC或SCC DC疫苗的优选条件是使组合的或单一的NCI-H520或NCI-H522肺癌细胞系经受至250MPa的压力10min，并将未成熟DC加载产生的经历免疫原性细胞死亡的细胞。
在优选的实施方案中，MDSC抑制剂阻断或抑制MDSC的分化/成熟、阻断或抑制MDSC的迁移或诱导MDSC的消耗/MDSC的细胞凋亡，或抑制MDSC的扩增。靶向MDSC的临床前和临床化合物被列于Draghiciu等人(2015，在此通过引用并入)的表1、Ko和Kim(2016，在此通过引用并入)的表2，以及Talmadge和Gabrilovich(2013，在此通过引用并入)的表1和框2中。
MDSC分化/成熟的抑制剂的优选实例是全反式视黄酸(ATRA)和姜黄素衍生物。可以在接种疫苗前几天以150mg/m2施用ATRA。MDSC迁移的抑制剂的优选实例是唑来膦酸(Zolendronic acid)、抗聚糖抗体和CSF-1R抑制剂。MDSC的消耗或细胞凋亡的诱导物的优选实例是酪氨酸激酶抑制剂，优选舒尼替尼、抗Gr1抗体、IL4Rα适配子、吉西他滨、顺铂、紫杉醇、17-二甲基氨乙基氨基-17-去甲氧格尔德霉素(17-DMAG)和5-氟尿嘧啶(5-FU)。MDSC扩增的抑制剂的优选实例是贝伐单抗、塞来昔布和匹莫齐特。MDSC效应器功能的抑制剂的优选实例是氧化应激的诱导物，优选N-羟基-L-精氨酸(NOHA)、硝基阿司匹林、N-乙酰基半胱氨酸(NAC)、CpG寡脱氧核苷酸、甲基巴多索隆(CDDO-Me)、醉茄素A和Stattic。
特别优选的是与ATRA、紫杉醇、吉西他滨或顺铂的组合。
附图说明
图1：存在于肿瘤和健康组织中的细胞的活力和起源。
(A)通过DAPI染色以及随后的流式细胞术测量从肿瘤(Tu)和非肿瘤健康肺组织(NTu)分离的所有分离的细胞的活力(上图)。在针对细胞角蛋白免疫染色之后，通过流式细胞术测量AC或SCC肿瘤(Tu)和非肿瘤健康肺组织(NTu)中的上皮细胞的百分比(下图)。
(B)在针对CD45免疫染色之后，通过流式细胞术测量肿瘤(Tu)和非肿瘤健康肺组织(NTu)中的淋巴细胞的百分比。
(C)流式细胞术的门控策略。
图2：腺癌(AC)和鳞状细胞癌(SCC)中的NSCLC肿瘤和非肿瘤组织的免疫细胞浸润。
(A)通过流式细胞术估计了来自AC或SCC肿瘤(Tu)和非肿瘤健康肺组织(NTu)中的活细胞的cDC(CD11c+HLA-DR+，左上图)、单核细胞(CD14+HLA-DR+，右上图)、肥大细胞(CD117+，左下图)和B细胞(CD19/20+，右下图)的百分比。
(B)通过流式细胞术估计了来自AC或SCC肿瘤(Tu)和非肿瘤健康肺组织(NTu)中的活细胞的NK细胞(CD3-CD56+，左上图)、T reg(CD4+CD25+FoxP3+，右上图)、CD4+T细胞(CD4+，左下图)和CD8+T细胞(CD8+，右下图)的百分比。
(C)通过流式细胞术估计了来自AC或SCC肿瘤(Tu)和非肿瘤健康肺组织(NTu)中的活细胞的来自CD3+细胞的CD4+T细胞(CD4+，左上图)、来自CD3+细胞的CD4+T细胞(CD8+，右上图)、记忆CD4+T细胞(CD45RO+CD4+，左下图)和记忆CD8+T细胞(CD45RO+CD8+，右下图)的百分比。
图3：与AC患者中的非肿瘤组织和肿瘤相比，在SSC肿瘤中肿瘤内产生INF-γ的CD4
+T细胞和CD8+T细胞被显著抑制。
通过流式细胞术测量了来自AC或SCC肿瘤(Tu)和非肿瘤健康肺组织(NTu)中的活细胞的来自CD4+T细胞的IFN-γ+细胞(上图)和来自CD8+T细胞的IFN-γ+细胞的百分比。
图4：在NSCLC患者的肿瘤和非肿瘤组织中的细胞因子的产生。
在用PMA+离子霉素刺激细胞24h后，通过Luminex确定AC或SCC肿瘤(Tu)和非肿瘤健康肺组织(NTu)中的GM-CSF、IL-1β、IL-2(A)和TNF-α、IL-23、IL-10(B)的产生。
图5：肿瘤中M-MDSC和Treg的存在以及它们对肿瘤微环境的影响。T细胞中CD3ζ的
表达和PBMC中ARG1的mRNA的抑制。
(A)通过流式细胞术测量了在来自健康的年龄匹配的对照患者、AC患者和SCC患者的活的PBMC中的M-MDSC(CD15-CD14+CD33hi HLA-DR-/lo，左图)和Treg(右图)的百分比。
(B)通过流式细胞术测量了在来自健康的年龄匹配的对照患者、AC患者和SCC患者的活的PBMC中的CD3ζ+CD4+T细胞(左图)和CD3ζ+CD8+T细胞(右图)的量。
(C)通过qPCR从提取自来自健康对照、AC患者和SCC患者的PBMC的mRNA测量了ARG1的相对表达。
图6：在AC和SCC中的不同类型的免疫抑制性细胞之间的相关性分析。
来自AC患者(左上)、SCC患者(右上)和健康的年龄匹配的对照患者(左下)的PBMC中的M-MDSC(CD15-CD14+CD33hi HLA-DR-/lo)的数量与Treg数量之间的相关性分析。
图7：实验方案
图8：在SCC NSCLC患者中肿瘤内T细胞和NK细胞在功能上比在AC NSCLC患者中更
受抑制。
以PMA和离子霉素刺激肿瘤和非肿瘤细胞悬浮液1h，之后加入Brefelden持续另外3h。然后针对细胞内IFN-γ将细胞染色，并通过流式细胞术进行分析；
(A)检测产生的IFN-γ的CD8+T细胞和CD4+T细胞的门控策略。
(B)在以PMA+离子霉素刺激24h之后通过luminex确定细胞因子产生。图表示n＝43名AC和n＝39名SCC的平均值(*p<0.05；**p<0.01，***p<0.005或****p<0.005)。
图9：检测肿瘤内Treg、多形核MDSC(PNM-MDSC)(CD14-CD15+CD11b+)和单核细胞
MDSC(M-MDSC)(CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/低)的门控策略。
图10：在AC患者的血液中的Treg更为丰富，而在SCC患者的血液中MDSC的数量更
高。
A)检测在NSCLC患者的血液中的Treg、PNM-MDSC(CD14-CD15+CD11b+)和M-MDSC(CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/低)的门控策略。从冷冻保存的PBMC中定量分析PBMC中的MDSC。
(B-C)NSCLC患者的来自冷冻保存的(B)和新鲜的(C)样品的PBMC中的Treg和PMN-MDSC的量之间的相关性。
图11：在AC NSCLC患者和SCC NSCLC患者的血液中的Treg而非MDSC的抑制功能是
相当的。
(A)Treg抑制测定。
(B)M-MDSC抑制测定-磁珠分离，或
(C)细胞分选，包括通过ELISA检测的IL-2和IFN-γ分泌。
(D)在来自NSCLC患者的新鲜样品的T细胞中的CD3ζ表达的流式细胞术检测。
(E)通过ELISA检测血浆样品中的LOX-1蛋白。图表示n＝56名AC、n＝52名SCC和n＝41名对照的平均值(*p<0.05；**p<0.01，***p<0.005或****p<0.005)。
(F)通过流式细胞术定量LOX-1阳性PMN-MDSC。图表示n＝3名AC、n＝1名SCC和n＝2名对照的平均值。
实施例
表1：肿瘤样品
实施例1
分离自NSCLC肿瘤的细胞显示出高活力，然而与分离自非肿瘤组织的细胞相比，分离自肿瘤的细胞的活力显著更低(参见图1A，上图)。与腺癌(AC)相比，鳞状细胞癌(SCC)含有较高水平的上皮细胞(通过FITC标记的人上皮抗原和广谱细胞角蛋白确定)(参见图1A，下图)。在肿瘤中CD45+淋巴细胞的浸润显著高于非肿瘤组织中(参见图1B)。细胞确定为DAPI阴性总细胞计数的％(参见图1C门控策略)。
实施例2
在AC和SCC组织学亚型之间，测试的所有免疫细胞群的浸润是相当的(参见图2)。肿瘤组织中的免疫细胞浸润高于非肿瘤组织中。当未说明时，从活的(DAPI阴性)总细胞计数确定免疫细胞群的百分比。
实施例3
与AC患者的非肿瘤组织和肿瘤相比，在SSC肿瘤中肿瘤内产生INF-γ的CD4+T细胞和CD8+T细胞(参见图3，分别是上图和下图)被显著抑制。
实施例4
用PMA+离子霉素刺激细胞悬浮液24h，并通过Luminex确定细胞因子。在来自AC患者的肿瘤中的促炎性细胞因子(诸如GM-CSF、IL-1β、IL-2和TNF-α)的产生显著高于各自的非肿瘤组织(参见图4A和4B)。类似地，在来自AC患者的肿瘤中的GM-CSF和TNF-α产生高于来自SCC患者的肿瘤。对于IL-23也观察到了这一现象(参见图4A和4B)。在来自两种NSCLC亚型的肿瘤中IL-10被显著增强(参见图4B)。与非肿瘤组织相比，未观察到肿瘤相关的IFN-γ、IL-12p70、IL-13、IL-17、IL-22、IL-9、IL-21、IL-4、IL-6产生。
实施例5
在SCC患者血液中的M-MDSC(CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/lo)是丰富的，而在AC患者中调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+CD127低)是升高的(参见图5A)。在SCC患者而非AC患者中，诱导了T细胞中CD3ζ链的下调(参见图5B)和ARG1水平的升高(参见图5C)。
实施例6
M-MDSC(CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/lo)群的百分比与AC患者而非SCC患者或年龄匹配的健康对照的血液中的Treg(CD4+CD25+Foxp3+CD127低)的百分比呈负相关(参见图6)。这些数据表明CD4+CD25+Foxp3+CD127低Treg可能代表了患有AC的NSCLC患者中的主要的免疫抑制性群体。
实施例7：材料和方法
表2：NSCLC患者概况
在图7中概述了实验方案。
处理来自NSCLC患者的原发性肿瘤和非肿瘤组织
肿瘤(Tu)和非肿瘤组织(NTu)获自接受新辅助疗法手术的82名NSCLC患者。在表2中描述了NSCLC患者的特征。将在手术当天获得的组织样品切成小块，并在具有100ng/ml脱氧核糖核酸酶I和20ng/ml胶原酶D(均来自Roche)的RMPI 1640培养基(Gibco)中，于37℃下在搅动下孵育45分钟。然后将细胞悬浮液通过100μm过滤器至50ml falcon管，以获得单细胞悬浮液。如下文所述，在4℃用特异性抗体染色30min后，立即通过流式细胞术分析浸润的免疫细胞群。对于进一步刺激，将淋巴细胞计数并在补充有10％热灭活胎牛血清(PAA)、2mMGlutaMAX ICTS(Gibco)和100U/ml青霉素+100mg/ml链霉素(Gibco)的RPMI-1640培养基中，以1x106个淋巴细胞/ml的浓度接种至96孔板。在37℃用50ng/ml PMA和10ng/ml离子霉素(均来自Sigma-Aldrich)刺激细胞1h，然后加入布雷菲德菌素A(BioLegend,1000x)持续3h，以检测CD8+T细胞和CD4+T细胞中的细胞内IFN-γ。在一些实验中，向细胞培养物中加入重组IL-15(Peprotech,13ng/ml)，并且在37℃孵育3和7天后通过流式细胞术检测增殖性CD8+T细胞和NK细胞。通过DAPI(Thermo Fisher Scientific)或通过可固定水死细胞染色试剂盒405nm激发(Invitrogen)检测细胞活力。
PBMC分离和血浆收集
从接受新辅助疗法手术的60名NSCLC患者和17-30名无恶性疾病史的年龄匹配的志愿者获得了于9ml K3EDTA中收集的2-3管的外周血。在将外周血于3000rpm离心5分钟后收集2–4ml的血浆，并储存于-80℃。通过Ficoll-Pague梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)。如上文所述，将PBMC计数，并在完全培养基中以1x106PBMC/ml的浓度接种至96孔板，或在RLT缓冲液中裂解以用于mRNA保存。如下文所述，在4℃用特异性抗体染色30min后，立即通过流式细胞术分析新鲜分离的PBMC的Treg和MDSC含量。在分析前，将一些PBMC冷冻保存于在液氮中的CS10(BioLife Solution)中。
用于免疫细胞分析和染色方案的抗体
上皮肿瘤细胞-CD45PE-DyLight594(Exbio)、抗广谱细胞角蛋白AlexaFluor 488(eBioscience)、抗人上皮抗原-FITC(DAKO)。
树状细胞：Lin阴性(CD3-FITC、CD19-FITC、CD20-FITC、CD56-FITC)、CD45-PE-DyLight594、CD11c-APC(全部来自Exbio)、HLA-DR-PE-Cy7(BD PharmingenTM)。
淋巴细胞/NK细胞：CD3-AlexaFluor 700、CD8-PE-Cy7、CD19-FITC、CD20-FITC(全部来自Exbio)、CD4-ECD(Beckman Coulter)、CD56-PerCP/Cy5.5(eBioscience)。
幼稚/记忆T细胞：CD3-AlexaFluor 700、CD8-PE-Cy7、CD45RA-PE、CD45RO-APC、CD62L-FITC(全部来自Exbio)、CCR7-PerCP/Cy5.5(BioLegend)、CD4-ECD(BeckmanCoulter)。
产生IFN-γ的T细胞：CD3-Alexa 700、CD8-PE-Cy7(均来自Exbio)、CD4-ECD(Beckman Coulter)、IFN-γ-FITC(BD Pharmingen)。
肿瘤中的调节性T细胞：CD8-PE-Cy7(Exbio)、CD4-ECD(Beckman Coulter)、Foxp3-AlexaFluor 488(eBioscience)。
PBMC中的调节性T细胞：CD4-PE-Cy7、CD8-eFluor 450、CD25-PerCP-Cy5.5、CD127-APC、Foxp3-AlexaFluor 488、CD3ζ-PE(全部来自eBioscience)、Ki-67-AlexaFluor 700(BDPharmingen)。
MDSC：CD14-BD Horizon V450(BD Horizon)、HLA-DR-Alexa Fluor700、CD33-PE-Cy7(BioLegend)、CD11b-FITC、CD15-APC(eBioscience)+可能的LOX1-PE(BioLegend)。
在4℃用在PBS中的合适的抗体的混合物将细胞胞外染色30min。对于IFN-γ、Foxp3、CD3ζ和Ki-67的细胞内染色，使用固定缓冲液(eBioscience)将细胞固定30min，用透性化缓冲液(eBioscience)透性化，并在4℃下细胞内染色30min。用PBS洗涤细胞，并通过LSRFortessa(BD Biosciences)分析。用FlowJo软件(Tree Star)分析数据。可以将流式细胞术数据表示为平均荧光强度(MFI)。
细胞因子产生和LOX-1血浆检测
为了测定细胞因子产生，如上所述，在用PMA和离子霉素刺激后24h收获细胞上清液，或者在用IL-15刺激后第3天和第7天收获细胞上清液。将细胞培养物上清液储存于-80℃。使用Luminex测定(MILLIPLEXTM MAP人类Th17磁珠面板，Merck Millipore)，通过MagPix(XMAP Technology,Luminex)测定GM-CSF、IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17、IL-22、IL-9、IL-1β、IL-2、IL-21、IL-4、IL-23、IL-6、TNFα。通过ELISA(RD System)检测了来自NSCLC患者的血浆样品(以1:10或1:50稀释)中的作为PMN-MDSC存在的标志物的LOX-1蛋白。
利用磁性微珠分离CD33+HLADR-MDSC
使用MACS微珠和柱(Miltenyi Biotec)，从获自NSCLC患者的白细胞去除术的PBMC分离CD33+HLADR-细胞。简而言之，将解冻的PBMC重悬于冷的MACS缓冲液中，并在冰上与HLA-DR微珠(Miltenyi Biotec)一起孵育15min。然后用冷的MACS缓冲液洗涤细胞以去除未结合的珠，并且随后根据制造商的说明书进行MACS柱上的HLA-DR+细胞的消耗。收集阴性细胞级分，洗涤，然后与CD33微珠一起孵育。将MACS柱用于CD33+HLA-DR-细胞的阳性选择。CD33+通过流式细胞术评估细胞群的纯度并且超过90％。
通过细胞分选分离CD33+CD14+HLA-DR-MDSC
简而言之，通过使用Ficoll Paque从NSCLC患者的白细胞去除术分离PBMC，并储存于-80℃。将解冻的PBMC重悬于冷的MACS缓冲液中，并在冰上与CD33微珠(MiltenyiBiotec)一起孵育15min。然后用冷的MACS缓冲液洗涤细胞以去除未结合的珠，并且随后根据制造商的说明书在MACS柱上进行CD33阴性细胞的消耗。收集CD33+细胞级分，洗涤，并在4℃用抗CD14和抗HLA-DR Ab染色20min。然后用PBS洗涤细胞，并且随后使用S3e细胞分选器(Biorad)分选CD33+CD14+HLADR-/低MDSC。
MDSC抑制测定
用CFSE标记纯化的自体T细胞(50000个细胞/孔)，使用抗CD3/CD28扩增珠(2.5×105个珠子/孔)激活，并在不同比例的经磁珠纯化的或分选的MDSC(1:1、1:2、1:4T细胞/MDSC比例)存在下孵育。在第6天，使用流式细胞术测量T细胞增殖作为CFSE稀释度。抑制计算为对照的％＝(分析的样品的增殖–非增殖性细胞的增殖)/(对照的增殖–非增殖性细胞的增殖)。通过ELISA(RD System)评估细胞培养上清液中IFN-γ和IL-2的产生。
调节性T细胞的分离和抑制测定
将解冻的来自NSCLC白细胞去除术的PBMC重悬于冷的PBS中，并通过30μm过滤器以去除细胞团块，然后分离。使用EasySep人CD4+CD127低CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Stemcell Technologies)分离CD25+CD4+CD127低Treg。通过使用EasySep人T细胞富集试剂盒(Stemcell Technologies)分离效应CD3+细胞，并用CFSE(1μM,Invitrogen)染色。通过流式细胞术证实纯度和CFSE染色。对于抑制测定，将CFSE染色的效应CD3+T细胞(50000个细胞/孔)单独接种于96孔板(阴性对照)，使用仅抗CD3/CD28扩增珠(16.7×103个免疫磁珠/孔–3:1T细胞/珠的比例)激活(阳性对照)，或用珠激活并在不同比例的经纯化的Treg(2:1、1:1、0.25:1、0.125:1Treg/Teff的比例)存在下进行孵育。在补充有10％的人AB血清的完全RPMI 1640(200μl/孔)中孵育细胞。在第3天分析T细胞增殖(任选的对照增殖–60-80％，至少3代)。如上文所述，计算MDSC抑制测定的抑制。通过ELISA(RD System)评估细胞培养上清液中IL-2的产生。
qPCR和蛋白质组学分析
使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)分离总RNA。将每个含有RLT缓冲液和细胞裂解物的样品快速解冻，并根据制造商的方案(其包脱氧核糖核酸酶I消化步骤)进行处理。使用NanoDrop 2000c(Thermo Scientific)测定RNA浓度和纯度，并使用Agilent 2000生物分析仪(Agilent)评估RNA完整性。将纯化的RNA样品储存于-80℃，直到进一步使用。使用iScript cDNA合成试剂盒(BioRad)，从100ng的总RNA合成cDNA。在CFX96TouchTM实时PCR检测系统(BioRad)上通过qPCR测定ARG1基因的表达。每10μl反应含有5μl的KAPA PROBE FASTqPCR主混合物(Kapa Biosystems)、0.5μl的每种正向引物和反向引物(每种500nM；TIBMolbiol)、0.5μl的TaqMan探针(200nM；TIB Molbiol)、1.5μl的无核糖核酸酶的水和2μl的5x稀释的cDNA。每个反应进行3个重复。温度循环方案如下：95℃3分钟，接着45个循环(95℃15s和60℃60s)。通过琼脂糖凝胶电泳证实预期长度的PCR产物的形成。使用CFX Manager软件(BioRad)测定Cq值，并利用GenEx软件(MultiD Analyses)计算研究的基因的相对表达(在36个循环处切断)。从癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas)中公布的NSCLC癌症肿瘤样品中的基因进行蛋白质组学分析。使用Becht等人(2016)引入的基于转录组计算的微环境细胞群-计数器(MCP计数器)方法，从n＝508名AC和n＝495名SCC患者的肿瘤样品分析免疫细胞群。
统计分析
使用GraphPad PRISM 6(San Diego,California,USA)，将双尾配对t检验或未配对的非参数曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)用于数据分析。如果*p<0.05、**p<0.01或***p<0.001，则认为结果是具有统计显著性。将数据表示为平均值±SEM。
实施例8：AC和SCC肿瘤中的T细胞、B细胞和NK细胞浸润类似，但SCC肿瘤中的骨髓
DC(CD11c+HLA-DRhi)被显著降低
在NSCLC肿瘤中的免疫细胞浸润高于临近的非肿瘤组织中的。分析了腺癌(AC)NSCLC患者和鳞状细胞癌NSCLC患者(SCC)中的两种组织学上不同的肿瘤之间的T细胞、B细胞和NK细胞或树突细胞浸润的可能差异。通过流式细胞术分析了来自获自42名AC和39名SCC新辅助疗法NSCLC患者的肿瘤和非肿瘤组织的单细胞悬浮液(表2)。在非肿瘤组织中的细胞活力高于肿瘤组织中的细胞活力，但肿瘤细胞活力平均为约85％(参见图1A，上图)。当与非肿瘤组织相比时，观察到在肿瘤中具有占主导地位的记忆表型的CD8+T细胞和CD4+T细胞、B细胞、NK细胞和DC的较高的浸润(参见表3)。在AC肿瘤和SCC肿瘤之间，这些免疫细胞群的浸润率无统计差异。
表3：肿瘤浸润性细胞的百分比(来自43份AC和39份SCC样品的平均值)
实施例9：在SCC NSCLC患者中的肿瘤内T细胞和NK细胞在功能上比在AC NSCLC患
者中更受抑制
由于肿瘤浸润的免疫细胞的表型分析仅提供免疫细胞浸润的定量评估，用PMA和离子霉素刺激肿瘤和非肿瘤细胞悬浮液1h，然后加入布雷菲德菌素A持续另外的3h。随后通过流式细胞术测定CD8+T细胞和CD4+T细胞中的IFN-γ产生。图8A中显示了门控策略。非特异性刺激后，来自AC患者和SCC患者的T细胞中肿瘤和非肿瘤CD8+T细胞和CD4+T细胞产生IFN-γ的能力类似(参见表4)。然而，当与来自临近健康组织的T细胞相比时，SCC肿瘤CD8+T细胞和CD4+T细胞的IFN-γ产生能力受损，表明SCC肿瘤中的T细胞在其IFN-γ介导的效应器功能上比AC肿瘤中的T细胞可能更受抑制(参见表4)。在未刺激的组织中的T细胞中未观察到默认的IFN-γ产生。
表4：IFNγ+肿瘤浸润性细胞的百分比
此外，通过Luminex分析来自刺激24h的组织的细胞因子产生(参见图8B)。当与临近的非肿瘤组织相比时，在AC肿瘤中的GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-23、IL-6和TNF-α的产生显著更高。这可能是由于AC肿瘤组织中的淋巴细胞(参见图1B)和上皮细胞(参见图1A下图和表5)含量高于非肿瘤组织中。然而，在SCC肿瘤中，细胞因子产生(其大多数为促炎性免疫细胞因子)与非肿瘤组织相当，表明当于AC相比时，在SCC肿瘤中刺激后促炎性细胞因子的较高抑制，因为肿瘤中的白细胞浸润和上皮细胞的数量相当。在未刺激的组织中未观察到细胞因子产生(参见图8B)。
表5：肿瘤中上皮细胞的百分比
由于PMA和离子霉素代表免疫细胞的强的非特异性刺激，将IL-15用于主要激活的NK细胞和CD8+T细胞，其在抗肿瘤免疫中起主要作用。将肿瘤细胞悬浮液单独或与IL-15一起孵育7天。在第0天、第3天和第7天通过Ki67+染色及随后的流式细胞术分析CD8+T细胞和NK细胞的增殖。虽然在AC肿瘤中在孵育的第3天增殖的T细胞和NK细胞分别为68％和79％，在SCC肿瘤中增殖的T细胞和NK细胞仅分别为23％和8％，证实了在SCC肿瘤的免疫抑制性环境比在AC肿瘤中高(参见表6)。
表6：T细胞增殖
从TCGA数据库(癌症基因组图谱、国家癌症研究所和国家人类基因组研究所(TheCancer Genome Atlas,National Cancer Institute and National Human GenomeResearch Institute),https://cancergenome.nih.gov,参见表7)分析的免疫基因表达显示在AC中抗肿瘤相关的免疫基因表达比在SCC中的高，这再次支持了在SCC中比在AC中高的免疫抑制性微环境。有趣地是，在SCC中比在AC中表达更多的抗原。
表7：NSCLC患者中的调节性T细胞/T细胞和MDSC相关的基因的表达
实施例10：在AC肿瘤中的调节性T细胞浸润更大，而SSC肿瘤被骨髓源性的抑制性
细胞浸润更多
考虑到AC患者和SCC患者的免疫抑制性肿瘤微环境之间的差异，分析了两种主要的免疫抑制性免疫细胞群–CD4+CD25+Foxp3+CD127低Treg和MDSC，这里具体为PMN-MDSC和M-MDSC。通过流式细胞术分析新鲜的组织样品。门控策略如图9所示，并与来自Walter等人(2012)和Bronte等人(2016)采用的MDSC抗体染色一起进行。。在NSCLC的两种组织学亚型中，在肿瘤中检测到的Treg群和MDSC群的数量均高于非肿瘤组织(参见表8)。然而，在AC肿瘤中的Treg的浸润高于在SCC肿瘤中的Treg的浸润(参见表8)。相反，相比AC肿瘤，在SCC肿瘤中检测到的PMN-MDSC和M-MDSC的数量均高于在AC肿瘤中的数量(参见表8)。由于不能仅通过表型标志物来限定MDSC，且从肿瘤内MDSC进行抑制测定在技术上具有挑战性，分析了如Bronte等人(2016)中所述的与MDSC表征相关的基因表达(参见表7)。还评估了来自TCGA数据库的与Treg和/或T细胞功能相关的基因表达(n＝508名AC患者和n＝495名SCC患者)。表7显示在SCC中大多数基因的较高表达中的大部分与MDSC有关，在AC肿瘤中基因的较高表达优选与Treg/T细胞有关，证实了表型观察。
表8：肿瘤浸润性抑制细胞的百分比(43份AC和39份SCC样品的平均值)
实施例11：在AC患者的血液中Treg更丰富，而在SCC患者的血液中MDSC的数量更高
由于在AC中的Treg浸润更高，且在SCC肿瘤中的MDSC浸润更高，还分析了在NSCLC患者的血液中这些细胞的存在。通过流式细胞术定量测量了分离自NSCLC患者和年龄匹配的无恶性疾病史的供体的PBMC中的免疫抑制性群体(参见表2，图5A)。还通过抑制测定，在功能上测试了PBMC(参见图11)。门控策略如图10A中所示。分析了来自冷冻的PBMC(参见图5A和表9)和来自新鲜分离的PBMC(参见表10)的Treg(CD4+CD25+Foxp3+CD127低)、PMN-MDSC(CD14-CD15+CD11b+)和M-MDSC(CD15-CD14+CD33hiHLA-DR-/低)。相比，在AC患者的血液中的Treg比在SCC患者和年龄匹配的对照中的Treg更丰富。此外，Treg检测不受冷冻保存的影响。Treg抑制测定还显示，来自两种组织学亚型的Treg类似地能够减少CD8+T细胞和CD4+T细胞增殖(参见图11A)。这表明在AC患者和SCC患者之间，血液中的Treg仅存在定量差异。有趣地是，仅在AC患者的血液中，Treg的数量与两种MDSC群呈负相关(对于M-MDSC参见图6，对于PMN-MDSC参见图10B、图10C)。
表9：来自冷冻样品的PBMC中的MDSC的百分比
与Treg相反，两种类型的MDSC的数量均受到冷冻保存的影响。然而，新鲜的PBMC样品的分析显示，在SCC患者的血液中的M-MDSC细胞多于在AC患者和年龄匹配的对照的血液中的M-MDSC细胞(参见表10)。在AC患者和SCC患者之间的PMN-MDSC的数量相当，并且高于年龄匹配的对照。由于不能将PMN-MDSC与无抑制功能的中性粒细胞区分开来，我们通过流式细胞术分析了这些细胞上的LOX1表达(参见图11F)。与AC患者和健康对照相比，在SCC患者中的LOX-1阳性PMN-MDSC的存在大大增加。此外，与AC患者以及健康的年龄匹配的对照相比，在来自SCC患者的血浆中的与PMN-MDSC的存在相关的LOX-1蛋白显著增加(参见图11E)。类似地，在SCC患者中的ARG1(主要表达于PMN-MDSC中的效应器分子)的表达增加(图5C)。显示MDSC的免疫抑制作用抑制T细胞中的CD3ζ表达。确实，当与AC患者或年龄匹配的对照相比时，仅在SCC患者中的CD8+T细胞和CD4+T细胞中的CD3ζ链表达被抑制(图5B和图11D)。
表10：来自新鲜样品的PBMC中的Treg细胞和MDSC的百分比
为了证明在SCC患者中发现的MDSC可能比在AC患者中发现的MDSC更具抑制性，进行了MDSC抑制测定(参见图11A-C)。将M-MDSC用磁珠(CD33+HLA-DR-/低)(参见图11B)或通过细胞分选(CD33+CD14+HLA-DR-/低)(参见图11C)纯化，并与刺激的CFSE标记的自体T细胞混合。有趣地是，来自两种组织学亚型的M-MDSC抑制CD8+T细胞和CD4+T细胞增殖至相同的程度。然而，与来自AC患者的M-MDSC相比，仅来自SCC患者的M-MDSC显著减少了来自刺激的T细胞的IL-2和IFN-γ的产生(参见图11A-B)。这些结果表明M-MDSC不仅在SCC患者的血液中增加，而且展现出比来自AC患者的血液中的M-MDSC更高的对T细胞的抑制活性。
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WO 2013/004708
WO 2015/097037
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1.包含免疫原性组合物和任选的药学上可接受的载体的组合物，其用于治疗个体的鳞状细胞癌(SCC)或延迟个体的鳞状细胞癌(SCC)的进展，其中所述治疗包括施用所述组合物与第二组合物的组合，所述第二组合物包含骨髓源性的抑制性细胞(MDSC)抑制剂或MDSC效应器功能的抑制剂，以及任选的药学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述个体的特征还在于：
-在外周血单个核细胞中为单核细胞MDSC(M-MDSC)的活细胞的分数为至少0.08％，优选为至少0.1％，
-在肿瘤组织中为M-MDSC的活细胞的分数为至少0.005％，优选为至少0.008％，
-在血清或血浆中LOX-1的水平超过75pg/ml，优选超过100pg/ml。
-表达LOX-1的多形核MDSC(PMN-MDSC)在所有PMN-MDSC中的百分比为至少5％，优选为10％。
-在肿瘤组织中为PMN-MDSC的活细胞的分数为至少2％，优选为至少2.5％，
-在外周血单个核细胞中活Treg细胞的分数为最多1.8％，优选为最多1.5％，
-在肿瘤组织中活Treg细胞的分数为最多10％的CD4+T细胞，优选为最多9％的CD4+T细胞，
-与健康个体的对照CD4+T细胞相比，在外周血单个核细胞中CD3ζ在CD4+T细胞中的分数降低了至少90％，优选至少80％，
-与健康个体的对照CD8+T细胞相比，在外周血单个核细胞中CD3ζ在CD8+T细胞中的分数降低了至少75％，优选至少65％，和/或
-与健康个体的对照外周血单个核细胞相比，在患者的外周血单个核细胞中精氨酸酶1的相对表达增加了至少2.5倍。
3.包含免疫原性组合物和任选的药学上可接受的载体的组合物，其用于治疗个体的非小细胞肺癌(NSCLC)或延迟个体的非小细胞肺癌(NSCLC)的进展，其中所述治疗包括施用所述组合物与第二组合物的组合，所述第二组合物包含骨髓源性的抑制性细胞(MDSC)抑制剂或MDSC效应器功能的抑制剂，以及任选的药学上可接受的载体，其中所述个体的特征还在于由于MDSC的存在而造成的免疫抑制性肿瘤微环境。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述具有免疫抑制性肿瘤微环境的个体的特征还在于：
-在外周血单个核细胞中为单核细胞MDSC(M-MDSC)的活细胞的分数为至少0.08％，优选为至少0.1％，
-在肿瘤组织中为M-MDSC的活细胞的分数为至少0.005％，优选为至少0.008％，
-在血清或血浆中LOX-1的水平超过75pg/ml，优选超过100pg/ml。
-表达LOX-1的PMN-MDSC在所有PMN-MDSC中的百分比为至少5％，优选为10％。
-在肿瘤组织中为PMN-MDSC的活细胞的分数为至少2％，优选为至少2.5％，
-在外周血单个核细胞中活Treg细胞的分数为最多1.8％，优选为最多1.5％，
-在肿瘤组织中活Treg细胞的分数为最多10％的CD4+细胞，优选为最多9％的CD4+细胞，
-与健康个体的对照细胞相比，在外周血单个核细胞中CD3ζ在CD4+T细胞中的分数降低了至少90％，优选至少80％，
-与健康个体的对照细胞相比，在外周血单个核细胞中CD3ζ在CD8+T细胞中的分数降低了至少75％，优选至少65％，和/或
-与健康个体的对照外周血单个核细胞相比，在患者的外周血单个核细胞中精氨酸酶1的相对表达增加了至少2.5倍。
5.如权利要求2或4所述的组合物，其中M-MDSC具有CD14+CD15-CD33hiHLA-DR-/lo表型。
6.如权利要求2或4至5所述的组合物，其中所述PMN-MDSC具有抑制性CD14-CD15+CD11b+表型，优选地表达LOX-1。
7.如权利要求1、2、5或6所述的组合物，其中所述SCC为肺癌。
8.如权利要求1、2或5至7所述的组合物，其中所述个体已被诊断患有SCC，优选为肺的SCC。
9.如权利要求1至8所述的组合物，其中所述免疫原性组合物选自：树突细胞疗法/疫苗(DC疫苗)，过继性T细胞疗法，肽类、DNA或mRNA疫苗和溶瘤病毒，并且优选为DC疫苗。
10.如权利要求9所述的组合物，其中用选自以下的抗原来源制备所述DC疫苗：肿瘤相关的肽、来自DNA或RNA的完整抗原、完整抗原-蛋白、独特型蛋白、肿瘤裂解物/完整肿瘤细胞或病毒载体递送的完整抗原。
11.如权利要求10所述的组合物，其中通过高流体静压力制备所述完整肿瘤细胞。
12.如权利要求1至11所述的组合物，其中所述MDSC抑制剂阻断或抑制MDSC的分化/成熟、阻断或抑制MDSC的迁移、或诱导MDSC的消耗/MDSC的细胞凋亡、或抑制MDSC的扩增。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述MDSC分化/成熟的抑制剂选自：全反式视黄酸、姜黄素衍生物。
14.如权利要求12所述的组合物，其中所述MDSC迁移的抑制剂选自：唑来膦酸、抗聚糖抗体和CSF-1R抑制剂。
15.如权利要求12所述的组合物，其中所述MDSC消耗或细胞凋亡的诱导物选自：酪氨酸激酶抑制剂，优选舒尼替尼、抗Gr1抗体、IL4Rα适配子、吉西他滨、顺铂、紫杉醇、17-二甲基氨乙基氨基-17-去甲氧格尔德霉素(17-DMAG)或5-氟尿嘧啶(5-FU)。
16.如权利要求12所述的组合物，其中所述MDSC扩增的抑制剂选自：贝伐单抗、塞来昔布和匹莫齐特。
17.如权利要求12所述的组合物，其中所述MDSC效应器功能的抑制剂为氧化应激的诱导物，优选N-羟基-L-精氨酸(NOHA)、硝基阿司匹林、N-乙酰基半胱氨酸(NAC)、CpG寡脱氧核苷酸、甲基巴多索隆(CDDO-Me)、醉茄素A和Stattic。
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