CN103260650A - 使用髓源抑制细胞治疗肿瘤的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

提供使用髓源抑制细胞(MDSC)诊断和治疗肿瘤的组合物和方法。更具体地，所述组合物包含标记的MDSC或与溶瘤病毒、纳米颗粒或其它抗肿瘤剂组合的MDSC。

Description

使用髓源抑制细胞治疗肿瘤的方法和组合物

相关申请

本申请要求2010年10月20日提交的美国临时专利申请61/394,950号的权益，在此将其全部内容引入以作参考。

参考序列表

依照37C.F.R.1.821(c)，在此将2011年10月10日制作的命名为“序列表.txt”的ASCII兼容的文本文件经EFS-网络提交为序列表，大小为1,086字节。在此将前述命名为“序列表.txt”的文件的内容全部引入以作参考。

技术领域

本申请涉及使用髓源抑制细胞(MDSC)诊断和治疗肿瘤的组合物和方法。

背景技术

溶瘤病毒优选在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞，而在未转化的正常宿主细胞中不显示活性。已将几种溶瘤病毒用于临床试验，由于溶瘤病毒有限的复制效果和缺乏特异性靶向转移肿瘤部位的有效传递系统而获得有限的结果。两种常用的溶瘤病毒包括水泡型口炎病毒(VSV)和腺病毒。VSV在肿瘤细胞中但不在正常细胞中快速复制并引起凋亡。腺病毒AdlTRAIL-EI为含有病毒复制基因EI以及由人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)驱动的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)基因的重组腺病毒。已显示该病毒仅在端粒酶为组成性活性的细胞(即，肿瘤细胞)中复制，并且已显示在鼠科动物模型中作为溶瘤病毒安全且有效。

肿瘤靶向载体的使用已在增加溶瘤病毒的抗肿瘤作用中显示出一定的良好前景。单核细胞系、T细胞和NKT细胞均已在试图寻找适合的肿瘤靶向载体中使用，但获得的成功有限。当采用T细胞作为溶瘤细胞载体时可消除来自淋巴器官的肿瘤细胞[参见，Ilett等人，2009Gene Ther16(5):689-99]。然而，所得效果却应归于淋巴器官的T细胞趋向性。因此，该方法对于靶向非淋巴器官中的肿瘤细胞是无效的。另外，创建用于肿瘤靶向的基因工程T细胞既耗时又劳动强度大。因此需要其它溶瘤病毒用候选载体和其它抗肿瘤剂来治疗淋巴结和非淋巴器官中的肿瘤。

发明内容

本发明涉及使用髓源抑制细胞(MDSC)诊断和治疗肿瘤的组合物和方法。

在某些实施方案中，提供一种包括分离的髓源抑制细胞(MDSC)和抗肿瘤剂的组合物。在一些实施方案中，所述抗肿瘤剂为溶瘤病毒。在另外的实施方案中，所述溶瘤病毒为选自由水泡型口炎病毒(VSV)、rVSV(MΔ51)-M3突变体VSV、AdlTRAIL-EI、ONYX-015、CV706、JX-584、CGTG-102、痘苗病毒、呼肠孤病毒和脊髓灰质炎病毒组成的组的成员。

在某些实施方案中，提供一种包括分离的MDSC和抗肿瘤剂的组合物，其中所述抗肿瘤剂为溶瘤病毒，所述MDSC感染有所述溶瘤病毒。

在某些实施方案中，提供一种包括分离的髓源抑制细胞(MDSC)和抗肿瘤剂的组合物，其中所述抗肿瘤剂为选自由化学治疗剂、干扰素γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、TGF-β的拮抗剂、IL-10的拮抗剂和抗血管生成因子组成的组的成员。

在具体实施方案中，提供包括分离的髓源抑制细胞(MDSC)和水泡型口炎病毒(VSV)的组合物。

在一个实施方案中，提供包括髓源抑制细胞(MDSC)、抗肿瘤剂和药学上可接受的载体的药物制剂。在某些实施方案中，配制所述药物制剂用于肠胃外传递。在一些实施方案中，在所述药物制剂中的抗肿瘤剂为溶瘤病毒。在某些实施方案中，所述抗肿瘤剂为至少一种化学治疗剂。

在一个实施方案中，提供一种肿瘤治疗方法，所述方法包括将治疗有效量的包括分离的髓源抑制细胞(MDSC)、抗肿瘤剂和药学上载体的药物制剂向需要此类治疗的患者给药的肿瘤治疗方法。在一个实施方案中，所述肿瘤选自由纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤(Wilns’tumor)、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤组成的组。

在某些实施方案中，所述患者为哺乳动物。在一个实施方案中，所述哺乳动物为人类。

在一个实施方案中，提供一种包括将治疗肿瘤有效量的包括分离的髓源抑制细胞(MDSC)和抗肿瘤剂的组合物向需要此类治疗的患者给药的肿瘤治疗方法。在某些实施方案中，所述患者为哺乳动物。在一个实施方案中，所述哺乳动物为人类。

在一个实施方案中，提供一种包括将治疗肿瘤有效量的包括分离的髓源抑制细胞(MDSC)和抗肿瘤剂的组合物的向需要此类治疗的患者传递的肿瘤治疗方法，其中所述患者具有选自由纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤组成的组的肿瘤。

在一个实施方案中，提供一种受试者中肿瘤的诊断方法，所述方法包括：(i)将标记的髓源抑制细胞(MDSC)向受试者给药；和(ii)确定所述标记的MDSC是否集中于所述受试者的至少一个部位。在具体实施方案中，受试者中肿瘤的诊断方法进一步包括对所述受试者进行PET扫描，从而证实所述肿瘤诊断。在一个实施方案中，MDSC标记有菲立磁(ferumoxides)。在另一实施方案中，使用磁共振成像(MRI)在体内检测所述标记的MDSC。

在一个实施方案中，提供一种包括分离的髓源抑制细胞(MDSC)和抗肿瘤剂的试剂盒。在另一实施方案中，在所述试剂盒中的抗肿瘤剂为溶瘤病毒或化学治疗剂。

在一个实施方案中，提供一种包括标记有可在体内检测的标记物的分离的髓源抑制细胞(MDSC)的试剂盒。在另一实施方案中，所述标记物为菲立磁。

在特定的上述实施方案中，所述MDSC表达细胞表面标记物CD11b和CD33。在某些上述实施方案中，所述MDSC还表达选自由CD14、CD15、CD16和CD34组成的组的至少一种细胞表面标记物。

在特定的上述实施方案中，所述MDSC表达细胞表面标记物CD11b、CD115、Gr1和Ly6C。

在某些实施方案中，所述抗肿瘤剂为纳米颗粒。在一些实施方案中，所述纳米颗粒与至少一种佐剂和/或至少一种抗原接合。在具体实施方案中，所述抗原为肿瘤抗原。在另一具体实施方案中，所述佐剂为Toll样受体(TLR)配体佐剂，此类佐剂选自由脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、CpG、PolyIC、单磷酰脂A、鞭毛蛋白和含6个UUAU(SEQ ID NO:5)重复序列的ssRNA，或其组合组成的组。

依照本说明书、权利要求书及附图，本发明的这些及其它实施方案对于本领域普通技术人员将是显而易见的。

附图说明

图1为由MRI确定的示出有效的菲立磁标记的MDSC的标准曲线。

图2A为示出在注射有菲立磁标记的MDSC的小鼠肝脏中逐像素进行以定量信号损失的R2*量化的MRI数据与时间的函数关系图。将数据表示为在指定时间点超过基线的信号损失的增加(转移前值(pre-transfer values))。

图2B为定量存在于指定组织(肿瘤、肝脏或脾脏)中的菲立磁的量的图，该量表示为在指定的注射菲立磁标记的MDSC后的时间点，菲立磁初始注射剂量的百分数(**p<0.001)。

图3A为示出在指定组织(“SP”=脾脏、“BM”=骨髓、“LN”=淋巴结、“TIL”=肿瘤)中MDSC转移后的第2天(“2D”)和第3天(“3D)超过背景信号(由未接受PKH26标记的MDSC的小鼠确定的)的PKH26阳性成倍增加的图。

图3B为示出循环标记的MDSC的数量的图，将该数量表示为在指定的时间点在注射有PKH26标记的MDSC的小鼠中(Ly6C⁺PKH26⁺细胞)每毫升血液的细胞数×10⁵(“CT”=对照(背景)，“min”=分钟，“d”=天)。

图4A为示出肿瘤注射后8天(“8d”)和20天(“20d”)小鼠的肿瘤尺寸与PBS注射的小鼠(“对照”)相比较的图，分别对应于用VSV-GFP感染的Ly6C⁺MDSC注射的小鼠的天数(白色柱))和VSV-MDSC注射后12天(黑色柱)。

图4B为示出VSV-MDSC注射后12天的小鼠中肿瘤重量(g)与PBS注射的小鼠(“对照”)相比较的图。

图5为示出在用VSV-GFP-感染的Ly6C⁺MDSC(“VSV-MDSCs”，黑色柱)或PBS(白色柱)注射小鼠后3天，在肿瘤部位(“肿瘤”)和在指定器官(“SP”=脾脏、“BM”=骨髓、“LN”=淋巴结)中表示为细胞数×10⁵的GFP⁺MDSC数的图。

图6为卡普兰-迈耶存活曲线(Kaplan-Meier survival curve)，示出VSV感染的MDSC与对照相比显著延长了具有肝内MCA26肿瘤的小鼠的存活(**=p<0.002)(“CT”=PBS注射；“VSV”=VSV单独外周注射；“Ly6C+VSV”=感染有VSV的非MDSC；“MDSC”=未感染的MDSC；“MDSC+VSV”=VSV感染的MDSC)。

图7A为示出在指定的MOI下与VSV-GFP组合的MDSC中VSV阳性细胞数(×10⁵)的图，所述细胞已在VSV-G抗体的存在或缺失下温育并培养72小时，随后进行VSV-G染色和FACS分析；图7B为示出在MDSC中每5×10⁶个细胞的(Log10)的病毒颗粒数的图，所述细胞在MOI:300下如图7A处理、裂解并与BKH21细胞培养72小时，然后用于CPE和TCID₅₀分析；图7C为荷肝内MCA26肿瘤的小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线，跟踪用MDSC+抗体(Ab)+VSV(M3)、MDSC+Ab+VSV(GFP)、Ly6C+Ab+VSV(M3)、PBS或MDSC+VSV(M3)处理后的存活(MOI:300；n=15)；p值表示统计学显著性。

图8为示出在指定的MOI下，在非中和抗VSV G蛋白抗体的存在或缺失下，用rVSV-GFP处理后GFP阳性染色的MDSC(×10⁴)的数量的图。

图9包含在将各指定细胞型(CD45.1Ly6C+MDSC(MDSC)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、活化的T-细胞(aT细胞)、肿瘤特异性T细胞(T细胞)、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞(DC))转移至载有肝内LLC肿瘤的小鼠后，定量各指定器官(肿瘤、肝脏、肺、淋巴结(LN)和脾脏)中各指定细胞型的数量(×10⁴)，并与未接受细胞转移的小鼠比较(无转移)的图。在72小时时处死小鼠，收集器官并经FACS分离CD45.1+细胞。

图10A为示出在荷肝内MCA26肿瘤并用游离的VSV、被动载有VSV(M3)而无抗VSV-G抗体的MDSC(VSV-MDSC)或MDSC+抗VSV-G抗体(Ab)+VSV(M3)处理的小鼠的指定部位或器官(肿瘤、脾脏、肝脏、肺、脑)中的TCID₅₀的柱状图。在处理后的96小时处死小鼠，并将肿瘤或器官均质化并用于TCID₅₀分析。图10B为通过qRT-PCR确定的定量每克(g)组织的相对病毒拷贝数的图。分离RNA并经qRT-PCR分析VSV-G。用MDSC+Ab+VSV(M3)处理的小鼠证实，在肿瘤中具有显著多于其它器官的病毒和病毒RNA，还证实在肿瘤中具有比用VSV-MDSC和游离病毒处理的小鼠多的病毒和病毒RNA；在图10A和10B中：*p=0.05、**p=0.03,、***p=0.01。

图11A和图11B为在进行iNOS和Arg的细胞内染色的MDSC+抗VSV-G抗体(Ab)+VSV(M3)中，在指定MOI下定量iNOS(11A)或Arg(11B)阳性细胞×10⁴的数量图。图11C为示出在LLC肿瘤细胞与MDSC+Ab+VSV(M3)、VSV-MDSC、MDSC+Ab或MDSC以12.5:1、25:1、50:1或100:1(MDSC：肿瘤细胞)的比例共培养后的4小时肿瘤杀伤的百分数的柱状图。测量细胞杀伤作为LDH释放。示出统计学显著性(p值)。

图12A和图12B为示出通过从用3×10⁵OVA-B16黑色素瘤细胞激发7天后用指定的传递形式(s.c.-皮下，i.v.-静脉内，或通过MDSC)接种NP-OVA+/-PGN的小鼠中分离的Thy1.2T细胞(图12A)和肺淋巴细胞(图12B)的试验，对OTI、OTII和OVA肽应答的体外增殖(表示为每分钟计数(CPM))的柱状图。

图13为示出接种小鼠的脾脏中纯化的Thy1.2T细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的图，表示为在与图12A、12B中相同的组中具体裂解的百分数(%)。

图14包含在肝内接种4×10⁷OVA-B16黑色素瘤细胞10天，用指定的传递形式(i.v.-静脉内或经MDSC)接种NP-OVA+/-PGN和苹果酸舒尼替尼(sunitinibmalate)的小鼠中定量调节性T细胞(“Treg”)的百分数的图。苹果酸舒尼替尼(“su”)以0.015mg/小鼠/天的剂量每日给予。10天后，通过门设(gating)CD4+CD45.1+T细胞来分析OT-II特异性T细胞的CD25和FoxP3在肿瘤组织中的表达。柱表示在用OTII抗原再刺激后脾脏中的CD4+CD45.1+T细胞产生的CD25+FoxP3+T细胞的百分数(左侧)、IL-17(中间)和IFNγ(右侧)。

图15示出在指定组中在TIL细胞中或在脾脏(SP)或淋巴结(LN)中显示CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的平均值和标准偏差的图。用对照纳米颗粒(NP)、与OVA接合的纳米颗粒(NP-OVA)、或与OVA和PGN接合的纳米颗粒(NP-OVA-PGN)来脉冲纯化的MDSC12小时。指定的荷纳米颗粒的MDSC和CD45.1+CD4+OTII-特异性TCR T细胞(5×10⁶细胞/小鼠)共同过继转移至OVA-B16-肝内荷瘤小鼠中。以0.015mg/天持续给予苹果酸舒尼替尼10天。10天后，分析肿瘤组织、淋巴结和脾脏中OT-II特异性T细胞的表型变化。(A)OT-II-特异性调节性T细胞在试验荷瘤小鼠的不同器官中的发展。**p=0.05；“ns”是指无统计学显著性。

图16为示出如上述图15所示指定处理10天后的肿瘤尺寸的图。

图17为定量T细胞增殖的图。从如上述图15所示并指定的组中回收CD45.1+OT-II-特异性T细胞并纯化，用于对OT-II肽应答的T细胞增殖分析；***p=0.01；“ns”是指无统计学显著性。黑色柱含OT-II肽，白色柱无OT-II肽。

图18包含在从上述所示并指定的组中收集的CD45.1+OT-II-特异性T细胞的培养上清液中定量IL-17、IL-10和IFNγ产生的图。***p=0.01；“ns”是指无统计学显著性。

图19为定量在对OVA蛋白(+OVA)应答和抗原呈递细胞的存在下，在MDSC过继转移后，从接种小鼠的脾脏中纯化的Thy1.2T细胞增殖的图。小鼠静脉注射有OVA-B16黑色素瘤细胞。将荷OVA-B16肿瘤的小鼠分成以下处理组：NP(对照纳米颗粒载体)；与OVA接合的纳米颗粒(NP-OVA)；荷NP-OVA的MDSC和苹果酸舒尼替尼处理的组合(NP-OVA+SU)；与OVA和PGN接合的纳米颗粒(NP-OVA-PGN)；荷NP-OVA-PGN的MDSC和索坦(sutent)处理的组合(NP-OVA-PGN+SU)。每组10只小鼠。7天后，指定的荷纳米颗粒的MDSC过继转移至试验小鼠中。持续注射苹果酸舒尼替尼处理28天(0.015mg/小鼠/天)。***p=0.01；“ns”是指无统计学显著性。无OVA(-OVA)用作体外增殖试验中的对照。

图20为定量对OVA-B16肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞活性的线状图，表示为从如上图19所述的组中分离的T细胞裂解的百分数(%)。X轴表示T细胞与肿瘤细胞的比。

图21包含示出在如图19所述分离的Thy1.2细胞再刺激的培养上清液中IL-10、IFNγ和IL-17水平的柱状图。***p=0.01；**p=0.05；“ns”是指无统计学显著性。

图22为示出用指定处理所处理的试验小鼠的存活率的普兰-迈耶存活曲线。n=每组10只小鼠。结果是由两个可重复实验组合得到的。处理组如上述图19所述。

图23为示出已存在的OVA-B16肺转移肿瘤模型中从野生型(WT)、CCR2敲除(KO)、CCR7KO、MHC I类KO和MHC II类KO荷瘤小鼠中分离并载有NP-OVA-PGN+SU处理的MDSC的存活率的卡普兰-迈耶存活曲线。这些结果表明MDSC需要迁移至肿瘤部位来介导它们的作用，并充当T细胞活化的直接抗原呈递细胞。

图24为示出用指定处理所处理的试验小鼠存活率的卡普兰-迈耶存活曲线。n=每组8只小鼠，p值的Log秩次分析(rank analysis)。荷TC-1(表达E6/E7的宫颈癌)肺转移瘤的小鼠静脉注射单独载有纳米颗粒的MDSC(NP)、载有NP并另外用苹果酸舒尼替尼处理的MDSC(NP+SU)，或载有接合至E6E7和PGN的NP的MDSC(NP-E6E7PGN)，或者载有接合至E6E7和PGN的NP并另外用SU处理的MDSC(NP-E6E7PGN+SU)。

图25为在抗原呈递细胞的存在下，在应答E6/E7肽(+E6E7)或E6/E7肽缺失(-E6E7)下，定量从MDSC过继转移14天后的接种小鼠的脾脏中纯化的Thy1.2T细胞的增殖(CPM)的柱状图。T细胞所分离的组是指定的，并如图24所述。

图26A和图26B为定量纯化的F4/80+肿瘤巨噬细胞(图26A)和从肿瘤浸润白细胞(TIL)中分离的Thy1.2T细胞(图26B)对TC-1肿瘤细胞的细胞毒性活性线状图。细胞所分离的组如上图24所述。

图27A、27B和27C为示出在MDSC的存在(MDSC+T细胞，黑色柱)或缺失(仅T细胞，灰色柱)下温育并用肽抗原脉冲的OTII转基因T细胞培养上清液中TFNα、IL-17和IFNγ的水平的柱状图。

具体实施方式

本发明有利地提供用于诊断和治疗肿瘤的方法，并部分基于如下发现：在多个癌症模型，例如转移性结肠癌、肝癌、宫颈癌和黑色素瘤癌症模型中，MDSC优选迁移至肿瘤部位并有效地将它们的内含物(cargo)(例如，溶瘤病毒或纳米颗粒)传递至肿瘤。如本文所述，过继转移的标记有纳米颗粒菲立磁的MDSC优选迁移至标记完整的肿瘤，既证实MDSC能够借助有限的吞噬作用以及菲立磁标记的代谢到达肿瘤，还证实MDSC是外源物质(例如，抗肿瘤剂，如纳米颗粒)到达肿瘤部位的有效载体。这里还证实MDSC将接合至肿瘤抗原或TLR配体的铝过氧化物系纳米颗粒传递至肿瘤部位，并且与纳米颗粒的全身传递相比更有效地传递它们。

当与用结合有VSV的其它类型细胞处理的小鼠相比，或与单独用类似剂量的静脉内VSV处理的小鼠相比时，用与VSV结合的MDSC处理的荷瘤小鼠的存活率被显著改进。类似地，用荷有接合至肿瘤抗原或TLR配体PGN的铝过氧化物纳米颗粒的MDSC处理的荷瘤小鼠具有显著增加的存活率，表明荷有纳米颗粒的MDSC可在临床上用于治疗肿瘤和转移瘤(metastases)。

MDSC部分地通过调节性Ｔ细胞的诱导来抑制宿主免疫应答。不受理论约束，与已知方法相比，使用MDSC将溶瘤病毒和/或其它抗肿瘤剂传递，通过延迟或防止用于特异性治疗肿瘤的MDSC和/或抗肿瘤剂(例如，溶瘤病毒)的宿主排斥发作来有利地提供持续治疗。

在某些实施方案中，本发明还部分基于如下发现：负责杀死肿瘤的MDSC具有在病毒性感染和/或含纳米颗粒(NP)的TLR配体传递下的M1表型。

提供受试者中肿瘤的诊断方法。在一个实施方案中，所述肿瘤的诊断方法包括：(i)将标记的髓源抑制细胞(MDSC)向受试者传递；和(ii)确定所述标记的MDSC是否集中于所述受试者的至少一个部位。在具体实施方案中，受试者中肿瘤的诊断方法进一步包括在所述受试者中进行PET扫描，从而证实所述肿瘤诊断。

在某些实施方案中，提供包括MDSC和抗肿瘤剂，如溶瘤病毒或纳米颗粒的组合物，并用于治疗患者中的肿瘤。在某些实施方案中，用于治疗肿瘤的组合物和方法通过提供使用MDSC靶向传递至肿瘤的新型方法来提供显著改善的治疗肿瘤用溶瘤病毒的疗效。此类方法和组合物克服了目前传递至肿瘤部位用有效载体的缺乏，这是溶瘤细胞病毒传递的主要障碍。在具体实施方案中，组合物包括MDSC以及水泡型口炎病毒(VSV)或腺病毒AdlTRAIL-EI。

在某些实施方案中，组合物包括MDSC和其它抗肿瘤剂，例如化学治疗药物或其它小分子。此类组合物对于将化学治疗药物或其它小分子传递至肿瘤是有用的。

在某些实施方案中，组合物包括MDSC和纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒接合至本文所提供的另一抗肿瘤剂。例如，纳米颗粒可接合至一种或多种佐剂和/或接合至一种或多种抗原。在具体实施方案中，抗原为肿瘤抗原。在另一具体实施方案中，佐剂为Toll样受体配体(TLRL)佐剂，例如肽聚糖(PGN)或LPS或CpG。尽管并非必需的，但优选MDSC已容纳(例如，吞噬)纳米颗粒。在另外的实施方案中，纳米颗粒可接合至一种或多种化学治疗剂和/或一种或多种抗原和/或佐剂。

定义

术语“髓源抑制细胞(MDSC)”是指作为造血谱系(hematopoietic lineage)的具有免疫抑制功能的细胞。

术语“MDSC和抗肿瘤剂”和“与抗肿瘤剂组合的MDSC”是指MDSC与抗肿瘤剂偶联和/或结合，以使MDSC和抗肿瘤剂二者到达预期的靶(肿瘤部位)，或者以使至少抗肿瘤剂通过MDSC传递至肿瘤部位。在某些实施方案中，术语“与溶瘤病毒组合的MDSC”和“MDSC和溶瘤病毒”是指MDSC与病毒偶联和/或结合，以使MDSC和病毒二者到达预期的靶(肿瘤部位)，或者以使至少病毒通过MDSC传递至肿瘤部位。MDSC可感染有病毒或接合至病毒(例如，使用抗体或其它适合的接合方法)。在具体实施方案中，使用VSV表面上的G蛋白特异性单克隆抗体将MDSC接合至VSV。MDSC结合至与VSV结合的抗体的Fc部分，从而将MDSC接合至VSV颗粒；因此这种接合为“与溶瘤病毒组合的MDSC”的具体实例。虽然可以，但并不需要MDSC被溶瘤病毒活化感染。

如本文所述，术语“肿瘤”是指包括生长失控的转化细胞的恶性组织。如本文所述，术语“肿瘤”包括癌症。术语“癌症”是指哺乳动物中发现的所有类型的癌症、肿瘤或恶性瘤，包括但不限于白血病、癌和肉瘤。

术语“抗肿瘤剂”是指对治疗肿瘤(包括癌症)具有疗效的任何试剂。抗肿瘤剂的非限制性实例包括溶瘤病毒(例如，VSV、腺病毒)、化学治疗药物(例如，紫杉醇类)、或靶向肿瘤细胞的其它小分子。与抗肿瘤剂相关的术语“靶向肿瘤细胞”是指抗肿瘤剂抑制肿瘤生长。术语“治疗肿瘤”和“抑制肿瘤生长”可相互替换，并且指的是在本发明的组合物的存在下，肿瘤生长速率降低和/或肿瘤尺寸减少，和/或局部或远端肿瘤转移的速率降低，和/或肿瘤生存的任何降低，并可包括治疗癌症。

如本文所述，术语“化学治疗剂”和“化学治疗药物”可相互替换，并且指的是能够抑制、扰乱、防止或干扰细胞生长和/或增殖的化合物。化学治疗剂的实例包括，但不限于诱导凋亡、坏死、有丝分裂细胞死亡的试剂，烷基化剂，嘌呤拮抗剂，嘧啶拮抗剂，植物碱，嵌入型抗生素(intercalating antibiotics)，芳香酶抑制剂，抗代谢剂，有丝分裂抑制剂，生长因子抑制剂，细胞周期抑制剂，酶，拓扑异构酶抑制剂，生物学反应修饰剂，甾类激素和抗雄激素。

本领域所涉及的作为“小分子”化合物的化学试剂，典型地为有机、非肽分子，具有小于10,000Da的分子量，优选小于5,000Da，更优选小于1,000Da，和最优选小于500Da。这类调节剂包括化学合成的分子，例如，来自组合化学库的化合物。可利用筛选方法合理设计或鉴定合成化合物。这类可选择的适当的调节剂为天然产物，特别是来自生物体如植物或真菌的次级代谢物，它们也可通过筛选化合物库来鉴定肿瘤杀死活性。产生并获得小分子的方法是本领域公知的(Schreiber，Science2000；151:1964-1969；Radmann等人，Science2000；151:1947-1948)。

本文所使用的术语“受试者”、“患者”或“个体”是指具有免疫系统的动物，优选哺乳动物(例如，啮齿动物，如小鼠)。具体地，该术语是指人类。如本文所述，术语“哺乳动物”具有其通常含义，并具体包括灵长类动物，更具体地包括人类。因存在肿瘤而被治疗的、或其中肿瘤细胞生长可被抑制的其它哺乳动物包括，但不限于，犬、猫、啮齿动物(拉辛(racine)、鼠、狼等)、马、牛、绵羊、山羊和猪的物种。

本文所使用的术语“分离的”是指从其自然存在的环境中取出的物质，且很大程度上其特征在于，其存在于特定样品中。分离的细胞器、细胞或组织是已从源器官中发现其的解剖部位(细胞、组织或器官)取出的那些。分离的材料可以或不可以被“纯化”(如本文所定义)。本文所使用的术语“纯化”是指已在可检测地降低或消除其它污染物质存在的条件下分离的物质(如细胞)。污染物可以包括或不包括已由其获得纯化物质的原料。纯化的物质优选包含小于约90重量%、小于约75重量%、小于约50重量%、小于约25重量%、小于约10重量%、小于约5重量%，或小于约2重量%的与之原始结合的其它组分。

病情、紊乱或病况的“治疗”包括：(1)防止或延迟在可受到病情、紊乱或病况折磨或易受其感染，但还未经历或显现该病情、紊乱或病况的临床或亚临床症状的人类或其它哺乳动物中发展的病情、紊乱或病况出现临床症状，(2)抑制病情、紊乱或病况，即，停止、降低或延迟疾病或其复发(在维持治疗的情况下)、或其至少一种临床或亚临床症状的发展，或(3)缓解疾病，即，使病情、紊乱或病况或其临床或亚临床症状的至少一种消退。

如本文所述，“联合疗法”或“辅助疗法”是指连同第一组合物或药物，对需要用特定组合物或药物治疗的患者治疗疾病或给予另一种组合物或药物。联合疗法可为序贯疗法(sequential therapy)，患者首先用一种组合物或药物治疗，然后再用另一种治疗，或者可选地，可同时给予患者两种药物。在任一种情况中，这些药物均称为被“共给药”。例如，本发明的MDSC可在治疗肿瘤或转移瘤的联合疗法中与另一种抗肿瘤疗法一起给药。例如，MDSC可在联合疗法中与苹果酸舒尼替尼一起给药。苹果酸舒尼替尼为具有抗肿瘤和抗血管生成活性的口服多靶向酪氨酸激酶抑制剂，目前获得FDA的批准用于治疗疾病恶化后或者对于甲磺酸伊马替尼(imatinib mesilate)疗法不耐受的晚期肾细胞癌和胃肠基质肿瘤。还证实舒尼替尼在治疗其它晚期实体瘤中具有期望的临床活性。参见，Motzer等人(2006)Expert Opin InvestigDrugs;15(5):553-61。

本文所使用的术语“药学上可接受的衍生物”是指在给药至受体(recipient)时能够(直接或间接)提供本发明的化合物的任何药学上可接受的盐、溶剂化物或前药(例如，酯)，或者其活性代谢物或残留物。此类衍生物是本领域技术人员公知的，而无需大量实验。然而，已对Burger的Medicinal Chemistry andDrug Discovery，第5版，第1卷：Principles and Practice的教导进行了参考，将其以达到教导此类衍生物的程度引入本文以作参考。优选的药学上可接受的衍生物为盐、溶剂化物、酯、氨基甲酸酯和磷酸酯。特别优选的药学上可接受的衍生物为盐、溶剂化物和酯。最优选的药学上可接受的衍生物为盐和酯。

本文所使用的、可相互替换的、适用于剂量或量的术语“治疗有效”和“有效量”是指在给药至需要其的动物时，足以产生期望活性的组合物、化合物或药物制剂的量。在本发明的研究范围内，术语“治疗有效”是指足以降低或消除本文所特指的疾病或病况的至少一种症状的组合物、化合物或药物制剂的量。当将活性成分组合给药时，组合的有效量可以包括或不包括单独给药时有效的各成分的量。治疗制剂的剂量将根据疾病或病况的性质、患者的病史、给药频率、给药方式和试剂从宿主的的清除(clearance)等而变化。初始计量可较大，随后为较小的维持剂量。可例如每周、每两周、每天、每半周等给药所述剂量，从而维持有效的剂量水平。

可通过组合如下方法逐步确定治疗有效剂量，例如(i)使用肿瘤细胞生长和/或存活作为示值读数(readout)，在体外细胞培养试验中组合物或化合物的有效剂量的特征，随后(ii)使用肿瘤生长抑制和/或动物存活作为示值读数，在动物研究中的特征，随后(iii)使用增强的肿瘤生长抑制和/或增强的癌症存活率作为示值读数，在人体试验中的特征。

组合物

在某些方面，提供包括分离的MDSC和抗肿瘤剂如溶瘤病毒、化学治疗剂或其它小分子的组合物。在具体实施方案中，组合物包括分离的MDSC和VSV或腺病毒AdlTRAIL-EI。在某些实施方案中，组合物包括MDSC和纳米颗粒。在某些实施方案中，纳米颗粒接合至佐剂和/或抗原。在具体实施方案中，抗原为肿瘤抗原。在另一具体实施方案中，佐剂为Toll样受体配体(TLRL)佐剂，如肽聚糖(PGN)或CpG或LPS。优选地，MDSC已容纳(例如，吞噬)纳米颗粒。

在另一实施方案中，纳米颗粒可接合至多种试剂，如，多种抗原和/或佐剂等。在具体实施方案中，纳米颗粒接合至至少两种不同的TLR配体，如TLR2配体和TLR9配体，或TLR2配体和TLR4配体。本领域技术人员将理解TLR配体的其它组合也是可以的。在另外的实施方案中，MDSC可直接荷有一种或多种TLR配体或抗原，而无纳米颗粒。

髓源抑制细胞(MDSC)

鼠MDSC，也称为髓样抑制细胞(myeloid suppressor cells,，MSCs)，可通过一种或多种细胞表面标记物CD11b、Gr1、CD115、Ly6C和F4/80的表达来鉴定[参见，Li等人，Cancer Res.2004,64:1130-1139]。鼠类MDSC典型地表达例如CD11b、CD115、Gr1和Ly6C。鼠MDSC还可表达CD31、c-kit、血管内皮生长因子(VEGF)-受体和/或CD40。

人MDSC可通过一种或多种细胞表面标记物CD11b、CD33、CD34、CD14、CD15和/或CD16的表达根据特定亚型(subset)来鉴定。人MDSC典型地单独表达例如CD11b和CD33或者组合表达CD34、CD14、CD15和/或CD16和/或其它细胞表面标记物中的一种或多种。人MDSC的4种亚型的非限制性实例包括CD11b+CD33+CD14+MDSC、CD11b+CD33+CD14+CD16+MDSC、CD11b+CD33+CD115+HLA-DRlowIL-4R+MDSC和CD11b+CD33+CD15+MDSC。鼠和人MDSC以及这些细胞上表达的细胞表面标记物详细记载于Chen等人的国际专利申请PCT/US09/65981中。

MDSC在适当细胞因子混合物的存在下培养时可诱导分化成成熟粒细胞、巨噬细胞和树突细胞[Apolloni等人，2000,J.Immunol.165:6723-6730；Bronte等人，2000Blood96:3838-46；Kusmartsev等人，2003,Cancer Res.63:4441-4449；Li等人，2004,Cancer Res.64:1130-1139]。MDSC还可在培养中自发分化并表达谱系标记物如CD11c、MHC分子(I类和II类)、F4/80、辅助刺激分子(如，CD80和CD86)、M1或M2巨噬细胞。目前发现，肿瘤-趋向的(tumor-trophic)MDSC可由M2(前肿瘤和前血管原)转化为M1(抗肿瘤剂)表型，随后用作肿瘤靶向载体来传递治疗性病毒，从而抑制原发瘤和转移瘤的生长。M1功能性表型包括高iNOS、TNFα、CCR7、IL-6表达，相比之下，M2功能性表型例如CD206、精氨酸酶I(Arg)、CD36、IL-10、IL-4受体(IL-4R)、Tie2表达。参见，Umemura N.等人(2008)J Leukoc Biol;83:1136-44；Ma等人(2011)Paired immunoglobin-like receptor-B regulates the suppressive functionand fate of myeloid-derived suppressor cells.Immunity;34:385-95。

用于本发明组合物的MDSC的分离或体外生成详细记载于Chen的国际专利申请公布WO2010/062990中。“分离的MDSC”包括可通过任何适当方法获得的从其自然环境中取出或已取出(如果MDSC从活体来源中分离)的或体外衍生的MDSC。已从其自然环境中取出的分离的MDSC可恢复到该环境中或继分离之后的另一场所。

在本发明的一些实施方案中，MDSC为自身衍生细胞。例如，MDSC可从正常成人骨髓中或从正常造血部位如脾脏中分离。MDSC在外周缺乏，在健康个体的骨髓中少量存在。然而，它们在发生强烈造血作用时，在外周累积。在由于例如移植物抗宿主疾病(GVHD)、环磷酰胺注射或γ-照射等引起的缺乏下，可在成人脾脏中发现MDSC。因此，在某些实施方案中，MDSC可从成人脾脏中分离。MDSC还可从荷瘤或新生小鼠的骨髓和脾脏中分离。

在某些实施方案中，通过使用干细胞剥离器(mobilizer)如G-CSF(R&D

Minneapolis,MN)、GM-CSF(R&D Systems,Minneapolis,MN)、AMD3100(Tocris Bioscience,Ellisville,MO)[参见，Larochelle,A.等人，(2006)Blood,Vol.107(9):3772-3778]，CTCE-9908(Chemokine Therapeutics Corp.)、FTY720(Cayman Chemical,Ann Arbor,MI)[参见，Kimura,T.等人(2004)Blood；Jun15;103(12):4478-86]，M-CSF和/或Flt3配体(R&D)，从造血干细胞(HSC)或骨髓中剥离MDSC来在体内分离MDSC。预期将任意适合的干细胞剥离器或剥离器的组合用于本发明。然后可例如通过单采血液成分术、细胞分选和磁纯化步骤从血液中收集MDSC。

在某些实施方案中，MDSC可体外来源于例如患者的造血干细胞(HSC)、MHC匹配的胚胎干(ES)细胞和/或诱导的多能干(iPS)细胞[参见，Baker,Monya(2007).“Adult cells reprogrammed to pluripotency,without tumors”.Nature Reports Stem Cells.在线发布]。体外扩张MDSC的方法详细记载于Chen.的美国公布2008/0305079。具体地，分离的HSC可通过在可增加MDSC群的干细胞因子(SCF)或含肿瘤因子的SCF的存在下培养HSC而受到刺激分化成Gr-1⁺/CD11b⁺、Gr-1⁺/CD11b⁺/CD115⁺、Gr-1⁺/CD11b⁺/F4/80⁺或Gr-1⁺/CD11b⁺/CD115⁺/F4/80⁺MDSC。将HSC分化成MDSC的鼠和人HSC培养条件详细记载于Chen的美国公布2008/0305079。

在进一步的实施方案中，可使用其它细胞因子，例如GM-CSF、M-CSF或G-CSF(所有商购可得的，例如来自R&D

)在体外刺激MDSC从HSC中分化。可单独使用任一种细胞因子，或与SCF或其它细胞因子一起使用。还在另一实施方案中，肿瘤条件培养基可在含有或不含有SCF下使用，从而刺激HSC分化成MDSC。

在另外的实施方案中，MDSC为同种异基因细胞，例如从供体或细胞系获得或分离的MDSC。MDSC细胞系和它们的典型生产方法是本领域公知的，并记载于文献中。[参见，例如Apolloni等人，(2000)“Immortalized myeloidsuppressor cells trigger apoptosis in antigen-activated T lymphocytes.”J.Immunol.165:6723；Mazzoni等人，(2002)“Myeloid Suppressor Lines Inhibit TCell Responses by an NO-Dependent Mechanism;”J.Immunol.168:689-695.]

预期将可通过任何方法或从任何适合来源获得的MDSC用于本文所提供的组合物和方法中。

溶瘤病毒

预期将任何适合的溶瘤病毒用于本发明的组合物。例如，水泡型口炎病毒(VSV)为具有溶瘤细胞性质的会感染广泛的哺乳动物细胞的弹状病毒。VSV由于其避免宿主干扰素应答的能力而优选在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞，干扰病毒复制，使宿主免疫清除[参见，Thomsen AR等人，Cooperationof B cells and T cells is required for survival of mice infected with vesicularstomatitis virus.Int Immunol.1997;9(11):1757-66]。当在转移性MCA26肿瘤模型中瘤内注射时，VSV已显示出对延长小鼠的存活有效[参见，Huang TG等人，Oncolysis of hepatic metastasis of colorectal cancer by recombinant vesicularstomatitis virus in immune-competent mice.Mol Ther.2003;8(3):434-40]。因此，病毒可通过瘤内给药来给予。病毒还可通过外周给药来给予。外周给药降低与外科手术(例如，瘤内给药)相关的风险。通过静脉简单注射游离病毒典型地造成仅小部分病毒到达肿瘤部位，迫使外周注射大剂量病毒，来实现与经瘤内给药所能获得的剂量相似的剂量。VSV突变体，rVSV(MΔ51)-M3突变体，已被工程构建(engineered)为在其表面表达γ疱疹病毒蛋白M3，导致通过宿主免疫系统显著降低的抗病毒清除。M3病毒引起肿瘤中潜在的溶瘤细胞应答[参见，Wu L等人，rVSV(M Delta51)-M3is an effective and safe oncolytic virusfor cancer therapy.Hum Gene Ther.2008;19(6):635-47]。还预期将VSV突变体如M3病毒等用于本发明的组合物和方法。然而，可以理解的是，本文所述的组合物和方法不限于VSV和VSV突变体。如本文所述，其它溶瘤病毒也可与MDSC组合使用。

腺病毒为一类溶瘤病毒。迄今为止，已发现大约50种不同血清型的人腺病毒。腺病毒具有线性、双链、未折叠的DNA基因组。腺病毒的生命周期涉及的整合蛋白与柯萨奇腺病毒受体(CAR)结合，随后病毒进入肿瘤细胞。一旦进入细胞内，病毒进一步迁移至细胞核，开始表达早区基因产物并防止多种凋亡机制的活化。此时，病毒封闭宿主细胞蛋白质的合成，相反，开始自身-DNA复制和蛋白质合成。病毒基因组的E3区编码辅助回避宿主免疫应答的多种蛋白质(Wold等人，1995；Dimitrov等人，1997)。具体地，gp19kD蛋白防止MHC-I类在细胞表面表达，有助于避开细胞毒性T淋巴细胞介导的杀伤和E310.4/14.5kD和14.7kD蛋白下调FasL-或TNF-介导的凋亡途径(Dimitrov等人，1997,Shisler等人，1996)。腺病毒包括，例如AdlTRAIL-EI；P53溶瘤病毒ONYX-015，其是工程构建为在p53-缺陷的癌细胞中选择性复制并裂解的、E1B-55kDa基因缺失的腺病毒，可用于靶向头颈癌[参见，Kutler,D.等人，Molecular Therapy;(2006)13,S168]，前列腺特异性腺病毒CV706，OncoVEX^GM-CSF(BioVex)，JX-584(Jennerex)，CGTG-102(昂科斯疗法(OncosTherapeutics))，呼肠孤病毒和脊髓灰质炎病毒。

溶瘤病毒可直接接合至MDSC，以便增加偶联效率并增加接合至各细胞的病毒颗粒的数量。在某些实施方案中，利用直接抗VSV表面上的G蛋白的非中和性单克隆抗体。在结合病毒时，抗体与存在于MDSC表面上的Fc受体结合，因而增加病毒和细胞之间的结合效率。病毒表面抗原特异性抗体是本领域已知的，并且如本文对VSV所描述的，可用于将其它溶瘤病毒偶联至MDSC。

抗肿瘤剂

为了治疗肿瘤，包括治疗癌症和其它高增生性疾病(hyperproliferativedisorder)，抗肿瘤剂(例如，肿瘤生长抑制剂)，除了上述公开的溶瘤病毒以外，包括但不限于化学治疗剂，例如：紫杉烷类如紫杉醇、泰索帝(taxotere)或它们的类似物；烷基化剂类如环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、六甲三聚氰胺、塞替派或达卡巴嗪；抗代谢物如嘧啶类似物，例如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、卡培他滨和吉西他滨，或其类似物如2-氟脱氧胞苷；叶酸类似物如甲氨蝶呤、依达曲沙(idatrexate)或曲美沙特；纺锤体抑制剂，包括长春花生物碱类如长春花碱、长春新碱、长春瑞滨和长春地辛，或它们的合成类似物如去甲长春碱(navelbine)或雌莫司汀，以及紫杉类(taxoid)；铂化合物如顺铂；表鬼臼毒素类(epipodophyllotoxins)如依托泊苷或替尼泊苷；抗生素类如道诺霉素、阿霉素、博来霉素或丝裂霉素；酶类如L-天冬酰胺酶、拓扑异构酶抑制剂如拓扑替康或吡啶并苯并吲哚衍生物；和各种试剂如甲基苄肼、米托蒽醌，以及生物反应调节剂或生长因子抑制剂如干扰素或白介素。其它化学治疗剂包括，但不限于，p38/JAK激酶抑制剂，如SB203580；磷脂酰肌醇-3激酶(P13K)抑制剂，如LY294002；MAPK抑制剂，如PD98059；JAK抑制剂，如AG490；优选的化学治疗药物如UCN-01、NCS、丝裂霉素C(MMC)、NCS和茴香霉素；除上述那些以外的紫杉类，如美国专利4,857,653；4,814,470；4,924,011；5,290,957；5,292,921；5,438,072；5,587,493；欧洲专利0253738；和PCT公布WO91/17976、WO93/00928、WO93/00929和WO96/01815中所公开的。

在另外的实施方案中，抗肿瘤剂包括但不限于干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β和类似的细胞因子。可选地，抗肿瘤剂可为肿瘤生长因子的拮抗剂。此类拮抗剂包括，但不限于肿瘤生长因子(TGF)-β和IL-10的拮抗剂。

抗肿瘤剂可通过任何适合的方法接合至MDSC。借助非限制性实例，可使用与MDSC结合的抗体接合此类试剂。此类MDSC-抗肿瘤剂-接合抗体可结合至任何在MDSC上表达的细胞表面标记物，例如，抗-Gr-1、抗-CD116或抗-Ly6C。MDSC-抗肿瘤剂接合抗体还可结合至在MDSC上表达的Fc受体。作为具体实例，MDSC可经Fc受体接合至与DM-1(其为靶向微管的化学治疗剂)接合的Her2-neu抗体[参见，例如，http://news.oneindia.in/2010/10/09/newtherapy-shows-promising-result-for-her2-positivemetasta.html]。Her-2neu抗体还可接合至另一种或不同的抗肿瘤剂，例如抑制肿瘤细胞分裂的抗肿瘤剂。

在另外的实施方案中，抗肿瘤剂可为抗血管生成因子，其为具体通过封闭内皮细胞迁移来抑制血管生成的分子。此类因子包括起到抑制作用的血管生成蛋白的片段(例如尿激酶的ATF)，血管生成抑制因子，如血管生长抑制素和内皮抑素；血管生成因子的可溶性受体，如尿激酶受体或FGF/VEGF受体；封闭内皮细胞生长因子受体的分子(O'Reilly等人，Cell1997,88:277-285；和O'Reilly,Nat.Med.1996,2:689-692)，和Tie-1或Tie-2抑制剂。通常，用于本发明的抗血管生成因子为蛋白质或多肽。抗血管生成因子的实例包括，但不限于，包含EGF样结构域的尿激酶的氨基末端片段(ATF)(例如，约1至约135个ATF的氨基酸残基)；例如与免疫球蛋白或人血清白蛋白一起作为融合蛋白而提供的ATF(PCT公布WO93/15199)；血管生长抑制素(O'Reilly等人，Cell1994,79:315-328)；组织抑制的金属蛋白酶(Johnson等人，J.Cell.Physiol.1994,160:194-202)；或FGF或VEGF的抑制剂，如可溶形式的血管生成因子受体，包括但不限于可溶性VGF/VEGF受体，和可溶性尿激酶受体(Wilhem等人，FEBS Letters1994,337:131-134)。本发明预期全身地或任选通过基因疗法或任何其它适合的方法给药抗血管生成因子。

本实施例中已示出，MDSC有效地吞噬菲立磁纳米颗粒并特异地将溶瘤病毒传递至肿瘤部位。本实施例还证实，MDSC将接合至蛋白质抗原和TLR配体(如OVA、肿瘤抗原和PGN)的其它铝过氧化物系纳米颗粒传递至肿瘤和转移部位。此类铝过氧化物系纳米颗粒详细记载于Li等人的(2011)NatNanotechnol.;6(10):645-50中。目前存在多个致力于将各种处理载入纳米颗粒的群组，从化学治疗剂[参见，Kang KW等人，Doxorubicin loaded solid lipidnanoparticles to overcome multidrug resistance in cancer therapy.Nanomedicine.2010Apr;6(2):210-3]到siRNA[参见，Li L等人，Evaluation of specific deliveryof chimeric phi29pRNA/siRNA nanoparticles to multiple tumor cells.MolBiosyst.2009;5(11):1361-8]；这些试剂和小分子及其组合可根据目前所描述的方法载入MDSC。通过对肿瘤特异的靶向处理，可使这些治疗剂获得较高的瘤内浓度，同时保持全身剂量低。因此，在优选的实施方案中，本发明通过将包括纳米颗粒的MDSC向受试者给药来提供治疗肿瘤和/或转移瘤的方法。纳米颗粒可接合至任何期望的用于治疗肿瘤或转移瘤的试剂，例如对诱发抗肿瘤免疫应答有用的肿瘤抗原、TLRL佐剂或本领域已知的其它佐剂，或化学治疗剂。在某些实施方案中，组合物包括MDSC和纳米颗粒。在某些实施方案中，纳米颗粒接合至佐剂和/或接合至抗原。在一个具体实施方案中，抗原为肿瘤抗原。在另一具体实施方案中，佐剂为Toll样受体配体(TLRL)佐剂，如肽聚糖(PGN)或LPS或CpG。在另一实施方案中，纳米颗粒接合至多个试剂，例如，多个TLR配体等。在一个优选实施方案中，纳米颗粒包括，例如接合至PGN和CpG。此类纳米颗粒还可接合至另外的试剂，或与之结合，例如肽抗原，如肿瘤抗原。

可以理解的是，本文所描述的纳米颗粒意指纳米颗粒的非限制性实例。本发明预期使用任何适用于将期望试剂传递至肿瘤细胞的纳米颗粒，例如，但不限于抗肿瘤剂(化学治疗剂、佐剂(例如，TLR配体)、肿瘤抗原等)。优选地，根据本发明，纳米颗粒通过MDSC传递至肿瘤部位和/或转移部位。

TLRL佐剂和激动剂是本领域公知的。预期在此处使用的非限制性实例包括所有TLR激动剂(病原体相关的分子模式(PAMP)激活剂)：例如，但不限于，脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、和CpG、PolyIC、TLR4激动剂-单磷酰脂A、重组鞭毛蛋白和含6个UUAU(SEQ ID NO:5)重复序列的ssRNA/LyoVec，等等。

配制

组合物可配制为以用于人类医学或兽医学的任何便利方式给药。MDSC可结合到脂质体、微乳液、微胶粒、单层或多层囊胚泡、红细胞血影或球浆体(spheroblasts)中。在一个实施方案中，MDSC可在一个或多个包括脂质体的囊胚泡中传递(参见，Langer,Science,1990;249:1527-1533；Treat等人，inLiposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein andFidler(eds.),Liss:New York,pp.353-365(1989);Lopez-Berestein,同上，pp.317-327；基本同上)。

MDSC还可以控释的形式(controlled release form)传递。例如，MDSC可在聚合物基质如聚(丙交酯-co-乙交酯)(PLGA)中、在皮下植入的微球体或脂质体中、或通过另一传递形式(参见，Cao等人，1999,Biomaterials,Feb;20(4):329-39)传递。传递的另一方面包括组合物在海藻酸盐水凝胶中的悬浮液。

MDSCS和抗肿瘤剂可配制成可注射或可吸入的溶液，例如包含PBS的含有或不含其它成分的溶液。

本发明还提供用于向需要其的哺乳动物给药的药物制剂或剂型。

本发明还考虑MDSC在制备药物制剂中的用途。药物制剂可包括，例如MDSC及一种或多种抗肿瘤剂，例如上述的那些(如，溶瘤病毒和/或化学治疗剂)。

虽然可使用自身状态的组合物用于治疗，但可优选将组合物作为药物制剂，例如以与根据预期的给药途径和标准医药实践所选择的适当的药学上赋形剂、稀释剂或载体的混合物的状态给药。药物制剂包括与药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体结合的至少一种活性化合物、或其药学上可接受的衍生物。从与制剂的其它成分相容和对其受体无毒的意义上来说，所述赋形剂、稀释剂和/或载体必须是“可接受的”。

如本文所述，短语“药学上可接受的”是指当向人类给药时，通常被认为是生理上可容许的，并且通常对反应不产生过敏或类似的麻烦(例如胃部不适和头晕等)的分子实体和组合物。术语“载体”是指与化合物一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载工具(vehicle)。此类药学上载体可为无菌液体，如水和油包括那些石油，动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等。优选采用水或水性溶液、盐水溶液和水性葡聚糖和甘油溶液作为载体，特别用于可注射溶液。可选地，载体可为固体剂型载体，包括但不限于一种或多种粘结剂(用于压缩片剂)、助流剂、包封剂(encapsulatingagent)、增香剂和着色剂。适合的药学上载体记载于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”。

药物制剂可包括，例如，但不限于，分离的MDSC和抗肿瘤剂以及药学上载体。药物制剂还可包括，例如分离的MDSC和溶瘤病毒，例如但不限于VSV、AdlTRAIL-EI和/或rVSV(MΔ51)-M3，以及药学上载体。在优选的实施方案中，药物制剂包括分离的MDSC和化学治疗剂，以及药学上载体。在某些方面，MDSC和抗肿瘤剂各自分别给药至需要治疗的患者而作为单独的药物制剂。药物制剂可在相同的或不同的时间在相同或不同的部位单独或一起给药。

肿瘤诊断

在某些实施方案中，提供受试者中肿瘤的诊断方法。该方法利用目前过继转移的MDSC优选迁移至肿瘤的发现。可通过，例如将标记的MDSC向受试者给药并检测体内MDSC标记以确定肿瘤的存在和位置来诊断肿瘤。MDSC标记有可在体内追踪的标记，例如放射性同位素或其它可根据已知医学技术如磁共振成像(MRI)或X-射线而可视化的适合的标记等。在一个具体实施方案中，所述标记为菲立磁(如，

Berlex;蒙特维尔,NJ)，其为FDA批准的人用可检测标记。其它标记方法包括使用，例如铟(In111)标记，其已在临床上和在pet扫描中使用。可使用抗体标记的同位素，例如碘131或125。此类抗体-同位素共轭物可结合至MDSC，从而追踪MDSC迁移并定位微小转移瘤。任何适合的标记方法可用于体内追踪MDSC。

因此，此类方法可用于诊断肿瘤、微小转移瘤或转移瘤，其中在某部位处高浓度的标记的MDSC能诊断肿瘤的存在。诊断方法还可与例如通过给药已标记的MDSC和抗肿瘤剂的治疗结合，其中进行诊断步骤，与此同时，抗肿瘤剂处理肿瘤。

治疗方法

本发明提供包括MDSC和抗肿瘤剂的组合物用于将抗肿瘤剂靶向肿瘤细胞，例如用于治疗肿瘤(如，抑制肿瘤生长)的用途。

肿瘤包括但不限于白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和浆细胞瘤等；以及实体瘤。可根据本发明治疗的实体瘤的实例包括肉瘤和癌，例如，但不限于：纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

另外，如上所述，术语肿瘤包括癌症。示例性癌症包括但不限于乳腺癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和成神经管细胞瘤。另外的实例包括霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑瘤、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌(malignant carcinoid)、尿膀胱癌、癌变前皮肤损伤、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高血钙症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌和外分泌胰腺的肿瘤以及前列腺癌。

含MDSC的组合物可通过，例如将溶瘤病毒或化学治疗剂靶向肿瘤而用于治疗肿瘤。包括MDSC和溶瘤病毒的组合物或药物制剂典型地，不限于向需要治疗的患者(即，肿瘤或癌症患者)给药。因此，包括MDSC和化学治疗剂的组合物或药物制剂可向需要此类治疗的患者给药。在某些实施方案中，抗肿瘤剂为抑制肿瘤生长的小分子。

给药含MDSC的组合物的患者可以利用，例如，其它抗肿瘤治疗形式，如放射疗法和/或外科手术和/或化学疗法(如上述那些的任一种)等，或者利用其它治疗形式以联合疗法共同治疗。

例如，如上所述，MDSC可以与苹果酸舒尼替尼一起以联合疗法给药。苹果酸舒尼替尼为具有抗肿瘤和抗血管生成活性的口服多靶向酪氨酸激酶抑制剂，目前获得FDA的批准用于治疗疾病恶化后或者对甲磺酸伊马替尼疗法不耐受的晚期肾细胞癌和胃肠基质肿瘤。还证实舒尼替尼在治疗其它晚期实体瘤中具有期望的临床活性。参见，Motzer等人，(2006)Expert Opin InvestigDrugs;15(5):553-61。下文中，本实施例中证实，用本发明的MDSC(例如，荷有承载纳米颗粒的抗原或TLR配体或荷有溶瘤病毒的MDSC)治疗的荷瘤小鼠可用苹果酸舒尼替尼有利地给药，从而为宿主获得甚至更加改进的疗效。当然，可以理解的是，本实施例还证实本发明的MDSC即使在不进行苹果酸舒尼替尼共给药的情况下也具有治疗肿瘤和/或转移的优异疗效。不意于受理论或具体作用机制的约束，MDSC可用于治疗肿瘤和转移瘤，例如因为在本文中发现它们是高度肿瘤趋向性细胞，成功地将抗肿瘤剂直接传递至靶肿瘤和/或转移部位。如本文所述，它们还抑制溶瘤病毒的宿主排斥。

含MDSC的组合物与其它治疗形式的共同给药可以在相同或不同的部位，在相同或不同的时间，和/或相同或不同的持续时间、用量和频率下进行。技术人员将理解，取决于患者和肿瘤类型，何时使用联合疗法例如苹果酸舒尼替尼将是适合或期望的。

给药

组合物和制剂可局部、肠道外、口服、借助吸入、作为栓剂或借助本领域已知的其它方法给药。术语“肠道外”包括注射(例如，静脉内、腹膜内、硬膜外、鞘内、肌肉内、管腔内、气管内或皮下)。优选的MDSC给药途径为静脉内(i.v.)。然而，MDSC还可腹腔内、皮下或粘膜(如，通过口服或鼻腔粘膜给药)给药。抗肿瘤剂与MDSC分别给药时的优选给药途径为静脉内(i.v.)。本发明的MDSC和抗肿瘤剂可以本领域已知的任何方式给药。

组合物可每天一次、每天两次或更经常地给药。可在疾病或紊乱的治疗维持期降低频率，例如每两天或三天一次来代替每天一次或每天两次。剂量和给药频率将取决于临床症状，在本领域技术人员已知的急性期临床症状减少或缺乏至少一种或多种、优选超过一种的情况下，确认维持缓解期。更一般地说，剂量和频率将部分取决于预期用本化合物治疗的疾病病况或紊乱的病理学症状以及临床和亚临床症状的减退。

可以理解的是，MDSC和/或抗肿瘤剂用于治疗的所需量将根据给药途径、需要治疗的病况的性质、以及患者的年龄、体重和病况而变化，并基本上将依据巡诊医师或兽医师的判断。组合物将典型地单独或组合包含有效量的活性剂。初始计量可根据动物试验来确定，人给药剂量比例可根据本领域普遍接受的惯例来进行。

用于人给药的MDSC的示例性剂量的范围为约5×10⁶至约5×10⁸以上，尽管较低或较高数量的MDSC也是可以的。其中将自身固有的MDSC给药的方法是有利的，因为几乎无毒。在优选的实施方案中，患者可获得例如5×10⁷-5×10¹⁰的MDSC。

将由医师容易地确定治疗患者的治疗时长，即天数，然而治疗天数可从1天至约20天变化。MDSC优选以约每7天一次至每天一次的频率给药。更优选地，MDSC以约每天一到两次的频率给药。

试剂盒

在某些实施方案中，提供用于治疗受试者或患者中的肿瘤的试剂盒。所述试剂盒包括分离的MDSC和至少一种抗肿瘤剂。MDSC和抗肿瘤剂可一起包含在试剂盒中(例如预接合)，或者在具体实施方案中，MDSC可预先感染有溶瘤病毒，或可单独提供各组分以在使用(给药至受试者或患者)前或使用时结合。可选地，试剂盒提供使用说明。

试剂盒可包括用于诊断受试者或患者中的肿瘤的材料。此类试剂盒包括，例如标记有可在体内检测的标记物的分离的MDSC。在一个具体实施方案中，标记物为菲立磁，尽管其它标记物也是预期的。试剂盒还可包括使用说明。

根据本发明，可采用本领域技术中的常规分子生物学、微生物学、重组DNA、免疫学、细胞生物学和其它相关技术。参见，例如，Sambrook等人，(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第三版Cold Spring HarborLaboratory Press:Cold Spring Harbor,N.Y.；Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual.第二版.Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,N.Y.；Ausubel等人编辑(2005)Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Bonifacino等人编辑(2005)Current Protocols in Cell Biology.John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Coligan等人编辑(2005)Current Protocols in Immunology,John Wileyand Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Coico等人编辑(2005)Current Protocols inMicrobiology,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.;Coligan等人编辑(2005)Current Protocols in Protein Science,John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Enna等人编辑(2005)Current Protocols in Pharmacology John Wiley and Sons,Inc.:Hoboken,N.J.；Hames等人编辑(1999)Protein Expression:A PracticalApproach.Oxford University Press:Oxford；Freshney(2000)Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique.第四版Wiley-Liss；等等。上述所列实验室指南(Current Protocols)每年更新数次。

借助以下实施例进一步描述本发明。这些实施例的使用仅为示例性的，并不意欲限制本发明或任何所例举的术语的范围或含义。本发明也不受限于本文所描述的任何具体的优选实施方案。实际上，本发明的许多修改和变型在本领域技术人员阅读本说明书时是显而易见的，并可在不偏离本发明的精神或范围下得到此类“等同物”。因此，本发明仅受限于所附权利要求的范围，以及权利要求所赋予的等同物的全部范围。

实施例

在以下实施例中，使用下述材料和方法。

实验动物

野生型(WT)BALB/c小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)(BarHarbor,ME)。根据西奈山医学院的指南进行所有动物实验。

同类系CD45.1+C57BL/6、卵清蛋白(OVA)–特异性MHC II类–限制性TCR-转基因(OT-II)C57BL/6、CCR2敲除(KO)C57BL6、MHC I类KO C57BL/6、MHC II类KO C57BL/6购自美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)和杰克逊实验室。CCR7敲除(KO)C57BL/6小鼠为格温伦道夫(Gwen Randolph)博士(西奈山医学院)所赠礼物。

抗体和流式细胞术

抗-Ly6C-FITC、抗-Ly6C-PE、抗-CD11b-APC、抗-Gr-1-PE-Cy5和同型匹配的mAb购自eBioscience(圣地亚哥，CA)。PKH26荧光膜连接器染料(linker dye)购自Sigma Aldrich(圣路易斯，MO)。使用FACSCanto II和FACSDiVa软件(BD Biosciences；圣何塞，CA)进行流式细胞术分析。

鼠抗-CD4荧光素异硫氰酸盐(FITC)、鼠抗-CD25PE-Cy7、鼠抗-CD115藻红蛋白(PE)、鼠抗-F4/80别藻蓝蛋白(APC)、鼠抗-Foxp3PE、鼠抗-CD36APC、鼠抗-CD11c PerCP-Cy5.5、鼠抗-Thy1.2-FITC和同型匹配的mAb购自eBioscience(圣地亚哥，CA)，抗-CD206-生物素购自AbDSerotec(罗利，NC)。抗-鼠Siglec-1/CD169生物素购自R&D Systems(明尼阿波利斯，MN)。抗-iNOS(诱导型一氧化氮合酶)FITC购自BD Pharmingen,精氨酸酶1抗体(圣地亚哥，CA)，同型匹配的单克隆抗体购自eBioscience(圣地亚哥，CA)。

PKH26细胞迁移

对于PKH26分析，根据制造商说明书将MDSC用PKH26染色，并经尾静脉过继转移至在接种后14天产生肝内MCA26结肠癌的BALB/c小鼠。每日处死代表性小鼠，并收集脾脏、骨髓、淋巴结、肝脏、肺和肿瘤。将器官均质化并分离免疫细胞，MDSC标记物染色，并经FACS分析。鼠科动物的器官还用O.C.T.化合物(Tissue-Tek;Torrence,CA)固定，切片，并用Perl的普鲁士蓝染色以指示铁的存在。

单核细胞的MDSC的分离

(分别)用5×10⁵MCA26鼠结肠癌细胞或5×10⁵Lewis肺癌(LLC)细胞皮下注射WT BALB/c或C57Bl/6小鼠。当肿瘤达到1×1cm尺寸时处死小鼠，并将脾细胞和骨髓处理为单细胞悬浮液。用ACK裂解缓冲液(Gibco;Carlsbad,CA)裂解红细胞。然后从珀可(percoll)密度梯度(GE Healthcare,UK)的级分2中分离单核细胞。在FcγR封闭Ab的存在下用Ly6C-FITC将细胞染色，并结合至抗-FITC微球(Miltenyi;Auburn,CA)。经AutoMACS细胞分选仪(Miltenyi)分选Ly6C+和Ly6C-细胞，并在使用前经台盼蓝(trypan blue)(Gibco)染色来计数。肝转移瘤的小鼠模型和细胞迁移

MCA26肿瘤系为具有低免疫原性的BALB/c源的化学诱导的结肠癌[参见，Corbett TH等人，Tumor induction relationships in development oftransplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays,with a noteon carcinogen structure.Cancer Res.1975;35(9):2434-9]。肿瘤注射后14天，当肿瘤约1×1cm尺寸时，小鼠被过继转移单核细胞MDSC，该MDSC已与

(菲立磁,Berlex;蒙特维尔,NJ)在11.2μg/ml浓度下共培养4小时，随后根据制造商说明书用PKH26膜连接器染料染色。每日处死小鼠，并收集脾脏、骨髓、淋巴结、肝脏、肺和肿瘤。将器官均质化成单细胞悬浮液，并经珀可密度梯度分离免疫细胞。收集级分2，MDSC标记物染色，并经FACS分析PKH26阳性。在多个时间点收集其它小鼠器官并用O.C.T.化合物(Tissue-Tek;Torrence,CA)固定。然后器官切片并用Perl的普鲁士蓝染色以鉴定铁的存在。

黑色素瘤和转移瘤模型

B16肿瘤细胞系(ATCC CRL-6475^TM)为具有低免疫原性的C57BL/6源的黑色素瘤细胞系。所使用的表达卵清蛋白(OVA)的B16肿瘤系为稳定的OVA转染的克隆体，以便追踪体内肿瘤抗原特异性T细胞应答。TC-1源自C57BL/6的原发性肺上皮细胞。产生表达HPV E6/E7的TC-1肿瘤细胞，从而测试各种E6/E7特异性疫苗的效力。为了建立转移性肺癌和肝癌的肿瘤模型，C57Bl/6小鼠用3×10⁵的肿瘤细胞静脉内激发或用7×10⁴的肿瘤细胞肝内植入。

在肝内OVA-B16/C57BL/6肿瘤模型中，当肿瘤达到5×5mm²的尺寸时，或对于OVA-B16肺转移肿瘤模型，在已存在肿瘤的小鼠中，荷有纳米颗粒的5×10⁶MDSC过继转移至这些荷瘤小鼠中。确定实验小鼠的存活。对于一些实验，在14天后MDSC过继转移后处死小鼠。评价在辐射的天然脾细胞的存在下，在对OT-I OVA肽、OT-II OVA肽或OVA蛋白(5mg/mL)的应答中，纯化的脾T细胞和肺淋巴细胞的增殖。对于苹果酸舒尼替尼(Sutent,Pfizer)处理，每日给予0.015mg/天，共28天，作为临床方案。TC-1肿瘤模型使用相同的方案。菲立磁标记和摄取

MDSC与Ferridex(菲立磁,Berlex;蒙特维尔,NJ)在11.2mg/ml下共培养4小时，并送至电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS,Cantest,本拿比,BC)来确定铁总含量。然后基于通过ICP-MS在细胞中所检测到的铁量与温育期间所添加的菲立磁的总浓度来确定菲立磁吸收百分比。通过将2×10⁴个细胞在300μLPBS中稀释来制备细胞离心涂片(cytospin)。使用Cytospin3离心机(Shandon,UK)使细胞旋转降落到(spun down)显微镜载玻片上。通过用4%多聚甲醛固定样品10分钟，随后用2%亚铁氰化钾在2%盐酸中温育来进行Perl染色。用蒸馏水洗涤载玻片，用核固红复染并在乙醇(90、95和100%)中脱水。使用专用软件(SOFT,Diagnostic Instruments,MI)用尼康显微镜获取图像。然后使用透射电子显微镜(TEM，型号CX-100；JEOL，东京，日本)根据既定方案来评价菲立磁在细胞内的位置。

菲立磁标记细胞的体外磁共振(MR)成像

通过在0.5ml塑料管中将已知数量的菲立磁标记的MDSC添加到0.2ml温热的2%琼脂糖凝胶中制备体内细胞模型(cell phantom)。混合样品并在干冰中骤冷以使细胞在凝胶中均质分布。然后使用400MHz的质子频率下操作的89mm孔系统(Bruker Instruments,Billerica,MA)，将所有模型在9.4特斯拉下成像。还将用于体内成像的相同的30mm鼠线圈(mouse coil)用于模型测试。为了评价作为细胞数的函数的MR信号(作为有效的横向弛豫速率，R2*)和菲立磁浓度，多回波(echo)梯度回波(GRE)序列与以下参数一起应用：TR=29.1ms，TE=5.1ms-10ms(n=5)，30片，翻转角=30°，信号数平均值(NEX)=8，面内分辨率=0.098mm²，和100%z-重聚焦梯度(rephasing gradient)。使用常规Matlab程序(The Mathworks,R2007b,Boston,MA)在逐像素的基础上产生R2*图。在信噪比与回波时间(TE)的线性拟合之前将与各像素相关的信号强度归一化为相邻噪音的标准偏差。对于GRASP序列，除了z-重聚焦梯度减为50%以外，所有序列参数与用于GRE序列的那些相同。

MRI的体内检测

经尾静脉注射对荷瘤BALB/c小鼠(n=7)给药5×10⁶菲立磁标记的MDSC。在即将注射之前和在注射后1周的时间间隔中获得肝脏、脾脏和肿瘤的MR图像。使用离体模型中所述的脉冲序列参数在9.4特斯拉下进行所有体内MR成像。使用呼吸门控系统(SA Instruments,Inc.,Stony Brook,NY)在成像期间门控序列并监控动物。如上所述使用Matlab程序在逐像素的基础上进行R2和R2*-映像。另外，为了说明在4天的时间间隔中的肿瘤生长，使用GRE序列将所有获得的数据的信噪比(SNR，其中SNR=信号强度除以噪音的标准偏差)除以肿瘤区域(mm³)。在最后的MR扫描后即刻处死小鼠，灌注盐水，并分离肝脏和肿瘤。使用Perl的普鲁士蓝将部分组织染上铁，并将剩余的组织再称重。将肝脏送至弛豫时间测定(relaxometry)，将肿瘤送至ICP-MS，从而确定铁含量。

肝脏和肿瘤-弛豫时间测定中的铁含量

通过用已知浓度的菲立磁(0-1mM Fe，n=6)加标(spiking)离体组织匀浆来产生剂量响应曲线。在60MHz(40℃)下使用布鲁克小核磁分光仪(BrukerMinispec spectrometer)(Bruker Medical GmbH,埃特林根，德国)测定横向弛豫时间(T2)。基于回波振幅与时间的单指数拟合计算T2值。观察加标样品(spiked sample)的下述横向弛豫速率(表示为y)和菲立磁浓度(表示为x)之间的关系：对于肝匀浆，y=246x+14(R²=0.997)。定量限确定为0.038mM Fe。

重组水泡性口炎载体和侵袭(transwell)试验

之前已记载了rVSV-GFP和rVSV(MΔ51)-M3的构建[参见，Ebert O.等人，Oncolytic vesicular stomatitis virus for treatment of orthotopic hepatocellularcarcinoma in immune-competent rats.Cancer Res.2003;63(13):3605-11；Wu等人，2008，如上]。将1×10⁴的肿瘤细胞在24mm侵袭板(Corning Costar)的下层上培养24小时。如前所述分离MDSC，并在不同MOI下与rVSV-MDSC一起置于冰上的VP-SFM培养基

中4小时。之后，用冰冷的PBS洗涤细胞3-5次，并将1.5×10⁵的细胞置于上层(0.4μm孔径)。将板培养24小时，并用莱卡DMRA2荧光显微镜分析。

治疗方案

如前所述诱导转移性结肠癌[参见，Caruso M.等人，Adenovirus-mediatedinterleukin-12 gene therapy for metastatic colon carcinoma.Proc Natl Acad Sci US A.1996;93(21):11302-6]。肿瘤注射后8-9天，检查肿瘤尺寸，肿瘤为5×5mm-6×6mm的小鼠过继转移5×10⁶的单核细胞MDSC，该MDSC已在1×聚凝胺(海地美溴铵，Millipore；比尔里卡，MA)的存在下，在MOI为100下，在冰上的VP-SFM培养基(Gibco)中与rVSV-GFP共培养4小时。细胞用冰冷的PBS洗涤三次，并经尾静脉注射过继转移。在过继转移前类似地处理Ly6C-细胞。将5×10⁷pfu rVSV-GFP在250μl PBS中重悬并经尾静脉注射。为了将抗体与病毒颗粒接合，抗-VSV-G抗体在rVSV-GFP或rVSV(MΔ51)-M3(MOI:1000)以及聚凝胺的存在下，在冰上温育1小时，然后添加5×10⁶MDSC或Ly6C^-细胞，并在洗涤和转移前再在冰上温育1个小时。每日监控小鼠的治疗副作用，并当它们的肿瘤尺寸大到足够引起严重的残疾尺寸时，将其处死。处死时，收集肿瘤和脾脏。将肿瘤在4%多聚甲醛中固定和VSV-G抗原染色(α诊断法；圣安东尼奥，TX)。

细胞迁移比较

如上所述从CD45.1 C57BL/6荷瘤小鼠中分离MDSC。根据既定方案(参见，Thorne等人(2006)Science311(5768):1780-1784)从CD45.1小鼠中分离CIK细胞。通过Thy1.2-FITC经染色从荷瘤CD45.1C57BL/6小鼠的脾脏中分离T细胞，并通过AutoMACS细胞分选器，使用抗-FITC微球分离。类似地分离活化的T细胞，并与200U/ml的IL-2(Peprotech；落基山，NJ)培养3天。通过与30ng/ml的MCSF(Peprotech)培养天然CD45.1小鼠的骨髓7天来分离巨噬细胞，收集贴壁细胞。通过利用1%GMCSF条件培养基(来自J558L细胞系)培养天然CD45.1小鼠的骨髓7天分离树突细胞，收集悬浮细胞。从来自天然CD45.1小鼠的骨髓的珀可级分2来分离单核细胞。在经尾静脉植入肿瘤后，细胞过继转移至荷肝内LLC肿瘤的CD45.2C57Bl/6小鼠14天。72小时后处死小鼠，将器官均质化成为单细胞悬浮液，将CD45.1细胞染色，并经FACS分析。

病毒结合的TCID₅₀分析

使用组织研磨机(TissueLyser)(Qiagen,Valencia,CA)裂解器官和细胞。连续稀释细胞裂解产物，并将等分的小份与BHK21细胞于37℃下在VP-SFM培养基中温育72小时。然后在光学显微镜下检查细胞的致细胞病变效应(CPE)。采用Wechsler和Luedke(1991)J Clin Microbiol.29(1):212–214中记载的史丕曼-卡伯法(Spearman-Karber method)测定TCID₅₀浓度。

qPCR

使用Trizol(Invitrogen;卡尔斯巴德，CA)根据制造商说明书从器官中分离RNA。用DNAse I(Invitrogen)消化DNA，使用RT2First Strand Kit(Qiagen；巴伦西亚，CA)由RNA制备cDNA，并在ABI PRISM 7900HT(AppliedBiosystems；福斯特市，CA)上使用下述引物序列在384-孔板中使用RT2Real-Time SYBR Green/Rox PCR master Mix(SABiosciences;弗雷德里克，MD)进行qPCR：5’-TTCTTGGTTCTCCGAGTTGG-3’(SEQ ID NO:1)和5’-AACAGGAGGATGCAGCATTT-3’(SEQ ID NO:2)。

细胞毒性分析

在聚凝胺的存在下，在如上所述的VSV-G Ab和rVSV(MΔ51)-M3(MOI:300)的存在或缺失下培养MDSC，并与LLC肿瘤细胞以12.5:1、25:1、50:1和100:1共培养4小时。收集悬浮液用于测量乳酸脱氢酶(LDH)的释放(CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit;Promega,Madison,WI)。将特异性杀伤(Specific killing)(百分比)计算为实验LDH释放/最大LDH释放。

肽和纳米颗粒

OT-I OVA肽、OT-II OVA肽、OVA蛋白质购自AnaSpec(菲蒙，CA)。HPVE6肽EVYDFAFRDL(48-57)(SEQ ID NO:3)和HPV E7肽RAHYNIVTF(49-57)(SEQ ID NO:4)(GENSCRIPT USA,INC(菲蒙，CA))。由Hong-Ming Hu博士(波特兰)合成铝过氧化物纳米颗粒。所使用的铝过氧化物系纳米颗粒(α-Al₂O₃纳米颗粒)详细记载于Li等人(2011)Nat Nanotechnol 6(10):645-50。铝过氧化物纳米颗粒(NP)接合至OVA，并以OVA-NP为10μg/ml的浓度添加至10×10⁶MDSC/ml。

纳米颗粒实验用MDSC的制备

处死肿瘤尺寸超过10×10mm²的小鼠并收集脾脏、胫骨和股骨。在裂解红细胞(RBC)后，过夜培养骨髓细胞和脾细胞。第二天，收集松开的贴壁细胞(loosened attached cells)并在珀可(GE Healthcare,皮斯卡塔韦,NJ)密度梯度上分级。由抗-CD115-PE或抗Ly6C-PE以及抗-PE微球(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)以50%–60%从细胞级分(cell fraction)纯化MDSC。如通过流式细胞术所测定的，分选的细胞群的纯度>95%均质化CD11+/Gr-1+。用PGN(肽聚糖，Sigma)和/或苹果酸舒尼替尼处理纯化的MDSC2天或装载各种纳米颗粒12小时，然后过继转移至试验小鼠中。

MDSC抑制分析

在如前所述的TCR转基因T细胞的肽介导的增殖试验中评价MDSC的抑制活性。参见，Huang B.等人，(2006)Cancer Res.15;66(2):1123-31。在重组鼠OT-II OVA肽(0.25mg/mL,R&D Systems)的存在下，将来自天然OT-II转基因小鼠的纯化的CD4+T细胞与从WT或各种敲除的荷瘤小鼠脾脏中分离的MDSC以4:1(T细胞/MDSC)的比例共培养。PGN(1mg/ml)和/或苹果酸舒尼替尼(250nM)添加到培养基。在5天刺激后，收集细胞并用抗-CD4-FITC、抗-CD25-PE-Cy7、抗-Tbet-PerCP-Cy5.5、抗-RORγt-APC和抗-Foxp3-PE，或同种型对照(eBioscience)染色。

T细胞致敏(priming)

从天然小鼠中纯化Thy1.2+T细胞，并用单独的纳米颗粒(NP)、与OVA接合的纳米颗粒(NP-OVA)和与OVA和PGN接合的纳米颗粒处理与纯化的CD115+MDSC的共培养物。

ELISA的细胞因子检测

在培养上清液上使用小鼠TNFa、IL-10、IL-13、干扰素γ(IFN-γ)、IL-17ELISA试剂盒(R&D Systems)根据制造商说明书进行细胞因子ELISA。

T细胞扩增分析

将分选的脾Thy1.2+T细胞(2×10⁵)与作为APC的已辐射的(2,000rad)天然脾细胞(1×10⁴)在OT-I OVA肽、OT-II OVA肽、OVA蛋白质或HPV E6和E7肽(5mg/mL)存在或不存在下，在96孔微板中共培养。在72小时培养的最后8小时期间添加[³H]胸苷。

细胞毒性T淋巴细胞分析和巨噬细胞依赖的细胞毒性分析

在已辐射的脾细胞存在下，用5mg/ml OVA肽或5mg/ml HPV型16E6/E7肽(HPV E6肽：EVYDFAFRDL(48-57)(SEQ ID NO:3)和HPV E7肽RAHYNIVTF(49-57)(SEQ ID NO:4)(GENSCRIPT USA,INC(菲蒙，CA))再刺激转移模型中的来自OVA-B16-荷瘤小鼠或TC-1-荷瘤小鼠的纯化的脾Thy1.2+T细胞3天(还参见，Manuri等人(2007)Vaccine25(17):3302-10))。用抗-F4/80PE和抗-PE微球纯化在转移模型中的来自TC-1-荷瘤小鼠的肺F4/80+巨噬细胞。活化的T细胞或纯化的F4/80+巨噬细胞与IFN-γ处理的B16-OVA或TC-1肿瘤细胞(靶细胞)以12.5:1、25:1、50:1和100:1的比例共培养4hr。收集上清液用于测量乳酸脱氢酶(LDH)的释放(CytoTox96Non-RadioactiveCytotoxicity Assay Kit,Promega)。如下计算作为实验LDH释放/最大LDH释放的特异性杀伤(百分比)：%细胞毒性=100(实验释放-效应物自发释放-靶自发释放)/(总靶释放-靶自发释放)。

统计分析

利用单向方差分析(One-way ANOVA)与邦费罗尼事后检验(Bonferronipost hoc tests)评价与作为注射后时间的函数的R2*值变化相关的显著性。学生t检验(Student's t-test)用于比较肿瘤尺寸和重量的差异。时序检验(log ranktest)用于确定存活数据的显著性。对于具有等方差的样品，使用等方差用配对学生t检验。对于具有不等方差的样品，使用威氏符号秩次检验(Wilcoxiansigned-rank test)用于统计分析。p<0.05被认为是统计学上显著的。

实施例1

含氧化铁颗粒的MDSC的标记

本实施例证实过继转移的MDSC可通过在菲立磁的存在下共培养MDSC来有效地标记，还证实可追踪标记的MDSC迁移，所述菲立磁是FDA批准的SPIO(Feridex

)，已在美国和欧洲用于体内临床细胞追踪。

为了在单一小鼠中以纵向方式鉴定过继转移的MDSC的体内运输模式，采用诊断成像法。目前多个研究组已使用超顺磁氧化铁颗粒(SPIOs)来标记多种不同的细胞，他们接下来可进行MRI[参见，Arbab AS等人(2004)Blood104(4):1217-23;Hamm J.等人，NMR Biomed.2008;21(2):120-8;Beduneau A等人，PLoS One.2009;4(2):e4343]。这些技术适合于用菲立磁标记MDSC，这能够使用MRI检测肿瘤和其它器官中作为注射后时间的函数的标记的MDSC的存在，而无需处死动物进行分离细胞的FACS分析。如本实施例所进行的，MRI成像的另一好处是，精确显现标记细胞已迁移到各器官中的位置的能力。

从荷瘤小鼠的脾和骨髓中分离MDSC。首先，细胞进行珀可分级来选择单核细胞，然后从该群体中使用靶向Ly6C的抗体来选择单核细胞MDSC。该群体超过90%为MDSC的典型标记物CD11b+GR1+。这些细胞的细胞离心涂片及随后的普鲁士蓝染色显示出，与菲立磁共培养的>90%的MDSC对铁呈阳性染色。接下来建立已知铁浓度的MRI模型，并经MRI分析琼脂糖凝胶中MDSC的数量。从这些模型中，观察细胞数和MRI信号损失之间的线性关系(R2=0.9251)(图1)。

实施例2

体内MDSC迁移至肿瘤

本实施例证实在体内过继转移的标记的MDSC迁移至肿瘤部位。

将菲立磁标记的MDSC给药至小鼠，所述小鼠已预先肝内注射MCA26结肠癌细胞以刺激结直肠癌的肝转移瘤，并且注射后已经过一周。小鼠在MDSC转移前进行MRI，然后每天进行(n=7)。获得T2*-加权的图像(GRE图像)和GRASP图像并分析。在转移后的第3天在肿瘤中观察到增加的信号损失，肿瘤周围以及血管结构均高亮。已研发白色标记物序列如GRASP来增加标记细胞检测的精确性[参见，Mani V.等人Gradient echo acquisition forsuperparamagnetic particles with positive contrast(GRASP):sequencecharacterization in membrane and glass superparamagnetic iron oxide phantomsat 1.5T and3T.Magn Reson Med.2006;55(1):126-35]。在该序列中，z-重聚焦梯度降低，以便由荷铁的细胞产生的偶极场(dipolar field)重聚(re-phased)并观察到阳性信号。观察到GRE和GRASP之间的良好相关性。如图2A所示，R2*值的相对变化显著示在注射后3天细胞损伤的最大吸收(39±2%注射剂量(ID)，如通过离体的ICP-MS所测定)。

由于铁在肝中的高内源浓度，ICP-MS不能用于评价体内菲立磁铁浓度。因此，将弛豫时间测定(一种能够从生理性铁中单独鉴定超顺磁铁的NMR技术)用于确定组织内的菲立磁浓度。内源顺磁铁对偶极横向弛豫时间(T2)的贡献与菲立磁的贡献相比很小(<5%)[参见Briley-Saebo K.等人Hepatic cellulardistribution and degradation of iron oxide nanoparticles following singleintravenous injection in rats:implications for magnetic resonance imaging.CellTissue Res.2004;316(3):315-23]。处死小鼠，灌注盐水，并除去肿瘤、肝脏和脾脏。通过ICP-MS(肿瘤，脾脏)或弛豫时间测定(肝脏)确定菲立磁的存在，并基于图1中测定的标准曲线，将结果与注射到小鼠中的菲立磁的已知量相比较。仅观察到有限的肝脏和脾脏吸收(17±1%ID)，而在菲立磁标记的MDSC注射后48小时和72小时，均观察到肿瘤中铁吸收的显著增加，表明MDSC将菲立磁特异地传递至肿瘤细胞的趋向性(图2B)。Perl染色确认，在注射后3天，转移的细胞内存在铁。标记的MDSC迁移至损伤处并包含菲立磁的观察证实，MDSC在有限的吞噬作用和有限的菲立磁标记代谢下能够到达肿瘤。

为了评价体内R2*值预测肝脏和脾脏中菲立磁浓度的能力，构建校正曲线来比较体内R2*值和离体的菲立磁浓度(通过弛豫时间测定或ICP-MS获得)。与数据(n=10数据点)的线性拟合相关联的所得相关系数为R2=0.7022。该方法的检测限为0.031mM Fe(约7%注射剂量)。结果，体内R2*值可用于粗略估计组织中的菲立磁浓度，只要该浓度大于0.031mM Fe即可。在较低浓度下，可观察到信号损失，但体内R2*值可能无法用于粗略估计菲立磁浓度。采用这些方法可靠地示出，使用MRI细胞追踪，过继转移的MDSC靶向肿瘤部位，在转移后2-3天到达，并在外周和血管周分布。

流式细胞术用于确认MRI的发现。选择后，MDSC用红膜连接器染料PKH26标记，并过继转移至已预先肝内注射MCA26肿瘤细胞的BALB/c小鼠。每日处死小鼠，收集它们的肝脏、肺、骨髓、脾脏、淋巴结、血液和肿瘤。切除肿瘤，均质化，并经珀可提取将免疫细胞分离，对抗Ly6C的抗体染色，并经FACS分析PKH26阳性(每个时间点n=3)。这些细胞的FACS分析示出在过继转移后的两天，PKH26信号在肿瘤中增加至背景的4倍。该水平在第3天成为背景的8倍时达到峰值，并在转移后的第4天下降。这与脾PKH26信号在第4天增加至其之前水平的两倍相对应，可能与此时脾脏的转移细胞清除相对应。观察到PKH26信号在任何时间点在其它淋巴富集器官中都几乎不增加。特别地，肝脏除了其邻近肿瘤部位以外不显示信号增加。图3A示出，在MDSC在指定组织中转移后的第2天和第3天，相对于从未接受PKH26标记的MDSC的小鼠中测定的背景信号，PKH26阳性增加的倍数(每个时间点n=3)。当分析转移后的血液时，MDSC的循环水平相应于MDSC的组织分布下降，血液水平在转移后的第2天达到它们最低点(图3B)(每个时间点n=2).

实施例3

MDSC可在体外和体内将溶瘤病毒转移至肿瘤细胞

该实施例证实MDSC传递肿瘤特异性治疗的效力。为了试验荷有VSV的MDSC(VSV-MDSC)将病毒传递至肿瘤细胞的效力，用表达绿色荧光蛋白的复制感受型(replication competent)VSV载体rVSV-GFP感染MDSC[参见，EbertO.等人，Oncolytic vesicular stomatitis virus for treatment of orthotopichepatocellular carcinoma in immune-competent rats.Cancer Res.2003;63(13):3605-11]。MDSC与rVSV-GFP以不同的感染复数(MOI)(10、300、1000)共培养，洗涤数次以来从其中除去游离病毒，并接种到侵袭板的上层孔中上层孔。下层孔中包含培养中的下层孔MCA26肿瘤细胞。24小时后检查板的致细胞病变效应(CPE)和GFP表达。期望显示CPE的细胞表达最低的GFP，因为它们应该已经裂解并释放出它们的GFP。所有MOI下的MDSC显示出高水平的GFP表达且CPE最低，表明在24小时时，细胞吸收并翻译病毒基因组，但还未屈从于VSV感染的裂解效应。然而，肿瘤细胞显示CPE以及GFP表达。而在所有MOI下均存在高水平的GFP表达，24小时时观察的CPE在MOI300组中是最高的。该效应可归因于表面结合的VSV，这是由于侵袭试验限制了感染的MDSC与肿瘤细胞之间的接触，还由于MDSC在该时间点不裂解释放病毒。为了显示VSV在治疗不同肿瘤类型中的适用性，使用4T1乳腺癌细胞系和Lewis肺癌细胞系(LLC)重复本实验，结果类似。

为了试验VSV-MDSC在体内的效力和安全性，使用MCA26转移结肠癌模型。在肿瘤接种后8天，测量肿瘤并用5×10⁶的VSV-MDSC或PBS注射小鼠。在肿瘤注射的第20天，处死小鼠，测量肿瘤并称重。接受VSV-MDSC的小鼠具有比对照显著小尺寸的肿瘤(410mm³对1710mm³；p=0.04,图4A)，且它们的肿瘤重量显著轻(0.85g对3.22g；p=0.002，图4B)。

然而，用VSV-MDSC处理的小鼠均没有经受有时与VSV治疗相关联的神经性副作用[参见，Plakhov IV等人，The earliest events in vesicular stomatitisvirus infection of the murine olfactory neuroepithelium and entry of the centralnervous system.Virology.1995;209(1):257-62]，证实VSV-MDSC治疗的安全性和效力。为了确认VSV-MDSC保持其肿瘤特异性，使用VSV-MDSC重复之前使用PKH26标记的MDSC的迁移实验(实施例2，图3A和3B)。Ly6C⁺MDSC感染有VSV-GFP(VSV-MDSC)并置于侵袭试验的上层孔中，下层孔中装有MCA26肿瘤细胞。将细胞温育24小时，并在光学和荧光显微镜下检验致细胞病变效应和GFP表达。然后在肿瘤注射后8天，将VSV-MDSC(MOI:300)过继转移至肝内MCA26荷瘤小鼠。12天后处死小鼠，除去肿瘤，测量(图4A)并称重(图4B)，与仅接受PBS注射的荷瘤小鼠(“对照”)相比较。在肿瘤注射后的第20天注射有VSV-MDSC的小鼠与对照小鼠相比，具有显著小的肿瘤尺寸(mm³)(图4A，p=0.04)。在肿瘤注射后的第20天，VSV-MDSC注射的小鼠与对照小鼠相比，还具有显著降低肿瘤重量(图4B，p=0.02)。在转移后的第3天观察到，与背景以及其它器官相比，在肿瘤部位处的VSV-MDSC数量大量增加，表明用VSV感染MDSC不改变它们对肿瘤部位的亲和性，并且荷VSV的MDSC有效地靶向肿瘤(图5)。

实施例4

VSV-MDSC治疗延长存活并优于外周注射VSV

前述实施例证实了用VSV-MDSC的治疗对于缩小转移结肠癌肿瘤的尺寸是安全有效的。本实施例证实VSV-MDSC治疗延长存活并且用VSV-MDSC的治疗优于外周注射VSV。用VSV-MDSC治疗含有肝内MCA26肿瘤的小鼠(MOI:300；n=9)，并与PBS对照比较存活(p<0.0004；n=10)。接受VSV-MDSC的小鼠比仅接受PBS注射的小鼠(p<0.0004；n=10)、仅接受MDSC的小鼠(p<0.002，n=3)、接受在MDSC获得且在MOI:300下感染VSV期间所获得的Ly6C^-细胞级分的小鼠(非-MDSC)(p<0.002，n=5)，或接受当量的游离VSV-GFP病毒的小鼠(p<0.0001；n=10)活得显著地更久(图6)。为了确保所观察到的作用可归因于MDSC的肿瘤靶向能力和VSV的肿瘤裂解作用，单独用MDSC处理(n=6)和与VSV培养的Ly6C^-细胞(n=10)处理小鼠。再一次，如所期望的，VSV-MDSC处理的小鼠比其它处理组活得更久(MDSC p<0.0002；Ly6C-p<0.002)，而仅用MDSC处理的小鼠倾向于比PBS对照较早死亡。

还确定是否VSV-MDSC优于类似剂量的外周注射的rVSV-GFP。为了确定VSV-MDSC的病毒感染剂量，首先使用史丕曼-卡伯法将病毒感染细胞裂解来获得TCID₅₀。从这一点上，在最优条件下确定，对每5×10⁶VSV-MDSC，至多约5×10⁷pfu的VSV被有效地传递。然而，当将该剂量外周给药时(n=10)，确定显著劣于VSV-MDSC处理(p<0.0001)，并且不优于PBS对照(图6)。因此，在转移肿瘤模型中，荷有VSV的MDSC在延长存活上是有效的，证明比单独给药VSV更有效。

为了证实MDSC的肿瘤特异性病毒传递，在处理和VSV-G抗原染色后收集小鼠肿瘤和肝脏。用VSV-MDSC处理的小鼠比任一个对照、含VSV的Ly6C^-细胞或单独的rVSV-GFP均显示出较强的免疫染色。在这些组的每个中，在肝脏中背景以上的染色非常少，证明VSV特异感染肿瘤细胞而不感染正常宿主细胞的特异性。在用感染有VSV的Ly6C^-细胞或单独的rVSV-GFP处理的肿瘤中观察到一些阳性，表明一些注射的病毒到达了肿瘤部位；然而，这些组中传递至肿瘤部位的VSV剂量对治疗肿瘤是无效的。

实施例5

VSV-MDSC治疗的疗效的优化

本实施例证明MDSC与病毒的直接接合可增加MDSC的病毒装载效力，并且具有增加的治疗肿瘤的潜力的突变病毒可与MDSC组合使用来治疗肿瘤。

为了进一步改进含VSV的MDSC的病毒装载，利用直接抗VSV表面上的G蛋白的非中和单克隆抗体。在结合病毒时，抗体接着结合至存在于MDSC表面上的Fc受体，因此使病毒和细胞之间的结合效力增加了约80倍。优化荷VSV的MDSC疗效的另一策略是改变针对肿瘤细胞的病毒类型。例如，rVSV(MΔ51)-M3(“M3”)为第二代VSV病毒，已工程构建为在其表面表达γ疱疹病毒蛋白M3，导致显著降低由宿主免疫系统所引起的抗病毒清除[Wu等人2008，如上]。

通过先后采用这两种策略，甚至进一步优化了用于癌症治疗的溶瘤病毒与MDSC接合的效力。而对于被动荷有VSV的MDSC，已证实了存活上的益处(survival benefit)，VSV不易于与大量MDSC相结合，甚至在最优条件下，平均每个细胞接合超过一个VSV颗粒也是困难的。

为了增强MDSC的病毒载量，试验直接抗VSV G蛋白的非中和单克隆抗体，以确定其作为存在于MDSC上的病毒和Fc受体之间的稳定桥梁，是否可增加VSV接合水平。

将rVSV-GFP(1.5×10¹⁰⁹)与最优量的抗体(15μg)、500ml聚凝胺(10微克/ml)结合，然后与5×10e6MDSC混合。证实荷有抗体结合病毒的MDSC在VSV染色(图7A)和GFP表达(图8)上比在各种MOI下被动偶联所产生的VSV-MDSC增加超过30倍(MOI:30且含抗体下的6.95×10⁴病毒颗粒，相对于MOI:1000且无抗体下的5.72×10⁴病毒颗粒，p=0.003；图7A)。然后使用含有或不含有抗体所产生的VSV-MDSC，在病毒与MDSC的比为300下，在BHK-21细胞上进行TCID₅₀试验。当将抗体接合的VSV-MDSC与被动偶联的VSV-MDSC比较时，观察到病毒滴度增加70倍(每5×10⁶个细胞为3.9×10⁷±1.1×10⁷相对于5.6×10⁵±8.6×10⁴TCID₅₀，p<0.01；图7B)。

改进疗效的另一策略为以不使安全性恶化的方式增加病毒的溶瘤潜力。rVSV(MΔ51)-M3(VSV(M3))为工程构建有含改变的病毒基质蛋白工程构建的第二代VSV，通过减弱rVSV的抑制细胞蛋白合成的能力而改进了rVSV的安全性，因此致使病毒对正常细胞的干扰素应答更易感。为了对抗强烈的宿主抗病毒免疫应答(限制肿瘤中的病毒复制)，已将该重组VSV工程构建为表达与各种细胞因子高度亲和地结合的鼠γ疱疹病毒M3蛋白，导致抗病毒清除显著降低[Wu，2008，如上]。

我们接下来先后试验了这两种策略，用经抗VSV-G蛋白的Fc受体结合的抗体接合至VSV(M3)的MDSC(MDSC+Ab+VSV(M3))来处理荷肝MCA26肝脏肿瘤的BALB/c小鼠。MDSC+Ab+VSV(M3)处理导致15只小鼠中有4个长期存活(26.3%)。这些小鼠与PBS对照相比(n=15,52.9天相对于24.6天，p<0.0001；图7C)，以及与用Ly6C^-细胞+接合至VSV(M3)的抗体处理的小鼠相比(n=15,生存中值=24.0天，p<0.0001；图7C)，生存中值显著增加。MDSC+Ab+VSV(M3)小鼠的生存中值还显著长于用VSV(M3)全身处理的小鼠(n=15,生存中值=24.9天，p<0.0001；图7C)。类似地，用MDSC+Ab+VSV(M3)处理的小鼠比用接合至rVSV-GFP病毒的MDSC(MDSC+Ab+VSV(GFP)处理的小鼠活得长；(n=15，生存中值=29.8天，p=0.0009；图7C)，表明存活益处来自改进的病毒载体与抗体介导的MDSC上病毒装载的改进的组合效应，并且提供存活益处的关键元素在于MDSC介导的肿瘤靶向。

实施例6

MDSC具有强肿瘤趋向性

本实施例证明MDSC比其它试验的免疫细胞具有更强的肿瘤趋向性。

为了确定免疫细胞的哪个亚型具有最强的肿瘤趋向性，进行了一系列实验，其中CD45.1+MDSCs、CIK(细胞因子诱导的杀伤细胞)、肿瘤特异性T细胞、活化T细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞过继转移至荷LLC肝肿瘤的CD45.2+小鼠中，模拟转移性肺癌(图8)。72小时后，处死小鼠，并在各种器官中鉴定CD45.1细胞。观察到MDSC与脾脏和肝脏相比对肿瘤部位的显著回归性(homing)(1.28×10⁵±2.15×10⁴个细胞相对于3.78×10⁴±1.17×10⁴(p=0.03)相对于1.04×10⁴±6.71×10³(p=0.0003))。MDSC还证实比CIK(6.45×10³±4.12×10³，p=0.001)、肿瘤特异性T细胞(603±244，p=0.0008)、活化T细胞(1.13×10³±350，p=0.0009)、单核细胞(5.32×10³±1.23×10³，p=0.001)、巨噬细胞(546±197，p=0.0008)和树突细胞(666±239，p=0.005)更强的肿瘤趋向性，表明MDSC具有比所分析的所有其它细胞类型更强的传递肿瘤特异性治疗的潜力(图9)。

实施例7

VSV-MDSC肿瘤特异性传递的确认

本实施例证明MDSC介导的VSV传递显示比用游离病毒的全身处理更强的肿瘤特异性。

在处理后的96小时处死各处理组的代表小鼠并收集它们的肿瘤和器官。对VSV-G进行染色。来自用MDSC(MDSC+Ab+VSV(M3)、MDSC+Ab+VSV(GFP)和VSV-MDSC(被动感染有VSV(M3)，但无抗体))各种介导治疗处理的肿瘤，其表明比对照或用游离病毒处理的动物的肿瘤更强的染色。另一方面，在用游离的VSV(M3)处理的小鼠中，而不是在MDSC-靶向治疗处理的小鼠中，在脾和肺中观察到强染色，肝中程度较低，表明游离病毒缺乏MDSC介导治疗的肿瘤的靶向特异性。还检验这些小鼠的脑的VSV-G染色作为已知复杂VSV治疗的潜在神经性效应的替代标志。游离VSV处理产生一些脑阳性，这在MDSC靶向的VSV组中未观察到，表明MDSC靶向治疗也比游离病毒治疗更安全，可能是由于血脑屏障阻止了细胞迁移以及MDSC的肿瘤特异性趋向性。

用MDSC+Ab+VSV(M3)处理获得长期存活的小鼠的脑和脊髓的病理检查表明无畸形或病变。具体地，在中枢或外周神经系统组织的髓鞘形成、神经元密度、或者大脑皮层形态或小脑内浦肯野细胞浓度中未注意到畸形。另外，没有缺血性损伤或组织坏死的迹象。在用MDSC+Ab+VSV(M3)处理的小鼠的肿瘤中观察到坏死，但在该时间点的其它MDSC靶向的病毒治疗中未观察到，表明该传递方法不仅特异性靶向病毒，而且还促进更有效的溶瘤细胞的病毒复制。

为了证实这些发现，收集接受游离VSV(M3)、VSV-MDSC和MDSC+Ab+VSV(M3)的小鼠的器官，并进行TCID₅₀实验。接受VSV-MDSC或MDSC+Ab+VSV(M3)的小鼠的肿瘤具有比接受游离VSV(M3)的小鼠的肿瘤具有显著多的病毒(26.2±1.6TCID₅₀/器官相对于44.3±7.0相对于16.5±1.2；p=0.03)。接受MDSC+Ab+VSV(M3)的小鼠还证实，肿瘤中的病毒显著多于脾脏(2.4±0.25；p=0.05)、肝脏(3.7±1.6，p=0.03)、肺(3.2±0.89，p=0.02)和脑(2.0±0.43，p=0.02)中的病毒。有趣的是，还证实用VSV-MDSC和MDSC+Ab+VSV(M3)处理的小鼠的脑的病毒显著显著低于接受VSV(M3)的小鼠的脑的病毒(3.2±.050相对于2.0±0.43相对于4.7±0.63；p=0.03和p=0.01)(图10A)。

进一步的确认通过用游离VSV(M3)、VSV-MDSC和MDSC+Ab+VSV(M3)处理的小鼠的器官的细胞裂解物的qPCR得到了证实(图10B)。此外，证实接受VSV-MDSC和MDSC+Ab+VSV(M3)的小鼠中的肿瘤比接受游离VSV(M3)的小鼠中的肿瘤具有显著多的病毒RNA(23.4±3.6拷贝#/g组织相对于37.3±7.4相对于5.9±1.7；p=0.008和p=0.05。还证实接受MDSC+Ab+VSV(M3)的小鼠的病毒RNA在肿瘤中显著多于在脾脏(7.0±2.3；p=0.03)、肝脏(15.6±1.6，p=0.05)、肺(10.8±4.6，p=0.05)和脑(5.5±2.6，p=0.05)中(图10B)。

实施例8

暴露于VSV(M3)的MDSC表现M1样表型

本实施例证实暴露于VSV(M3)的MDCS表现M1样表型。

由于MDSC已显示出促进M2样促肿瘤(pro-tumor)环境，因此直觉上其可使用该细胞型杀伤肿瘤。然而，M2样表型是可塑的，并且在一定条件下可显示M1样特性。为了确定暴露于VSV(M3)的MDSC是否转变为M1表型，分析MDSC的M1标记物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和M2标记物精氨酸酶(Arg)在不同VSV感染的MOI下的表达。用VSV(M3)培养后的iNOS阳性染色的细胞数随病毒量从无任何病毒的1.4×10⁴±1.3×10³iNOS+细胞增加至在MOI为10下的3.0×10⁴±1.4×10³iNOS+细胞(p<0.0002)，在MOI为1000下多达1.0×10⁵±1.0×10⁴iNOS+细胞(p=0.0001)(图11A)。同时，在用VSV(M3)培养后，Arg+细胞从无任何病毒的1.3×10⁵±2.3×10⁴Arg+细胞降低至在MOI为10下的9.9×10⁴±5.2×10³Arg+细胞(p=0.04)，在MOI为1000下低至7.7×10⁴±1.1×10⁴Arg+细胞(p=0.01)(图11B)。

为了进一步证实暴露于VSV(M3)的MDSC表现M1样表型，在肿瘤细胞的存在下进行细胞裂解试验，将MDSC与同单独的VSV-G抗体(Ab)共培养的MDSC(MDSC+Ab)、VSV-MDSC和MDSC+Ab+VSV(M3)进行比较(图11C)。感染的MDSC培养48小时后，通过在4小时内测量在MDSC存在下乳酸脱氢酶(LDH)的释放来分析肿瘤杀伤(裂解)。所观察的任何肿瘤细胞裂解都直接归因于MDSC介导的细胞杀伤，这是由于肿瘤细胞仅暴露于病毒4小时，而病毒诱导细胞裂解需要花费48-72小时。与未暴露于病毒的MDSC相比，在MDSC已暴露于病毒下的组中，观察到在所有MDSC:肿瘤细胞的比例下都显著增加的肿瘤杀伤(图11C)。观察到暴露于抗体和病毒二者中的MDSC的iNOS上调，Arg下调。因此，当暴露于病毒和抗体时，MDSC表现M1样表型，包括上调iNOS、下调Arg和杀伤肿瘤细胞。

实施例9

MDSC介导纳米颗粒传递至作为直接抗原呈递细胞的转移瘤部位

本实施例示出荷有抗原接合的纳米颗粒的MDSC与全身传递或皮下注射相比，对于将纳米颗粒传递至肿瘤转移靶位更有效。

为了确定何种传递策略可诱导肿瘤微环境中的有效免疫应答，在B16-OVA黑色素瘤转移瘤模型中测试将接合有OVA的纳米颗粒在TLR配体肽聚糖(PGN)的存在或不存在下传递的不同策略，包括静脉和皮下全身注射或装载MDSC。OVA+/-PGN接合的纳米颗粒(NP-OVA和NP-OVA-PGN)通过全身注射或通过MDSC来传递，显著增加了脾脏中应答OTI、OTII或OVA的T细胞的增殖(图12A)。有趣的是，仅当NP-OVA或NP-OVA-PGN载入MDSC时，在靶转移部位(肺)中应答OTI、OTII或OVA的白血球增殖才增强(图12B)。此外，在B16-OVA细胞中，接种有荷NP-OVA-PGN的MDSC引发脾中最高的细胞毒性T细胞活性(图13)。

在肝内黑色素瘤细胞中比较NP-OVA-PGN的全身传递(静脉注射)或使用MDSC并与苹果酸舒尼替尼组合处理的疗效。B16-OVA细胞肝内接种同源C57BL/6小鼠(7×10⁴B16-OVA细胞/小鼠)。所有小鼠都接受含有CD45.1同类系标记物的过继转移OTII-TCR T细胞(5×10⁶/小鼠)以及持续的苹果酸舒尼替尼处理(0.015mg/小鼠/天)。观察到，与全身传递相比，荷NP-OVA-PGN的MDSC有效地降低OTII-特异性调节性T细胞(CD25+Foxp3+细胞)在肿瘤部位的百分比(分别为4.73%相对于15.1%)，并增加了从脾中纯化的OTII特异性T细胞中产生IL-17和IFN(图14)。这些结果表明MDSC是将抗原以及TLR信号特异性呈递至肿瘤部位的纳米颗粒的理想载体，并且比纳米颗粒的全身传递更有效。

实施例10

肝转移的黑色素瘤模型中的荷纳米颗粒-OVA-PGN的MDSC

本实施例证实，在载有接合至PGN和OVA并给药至小鼠的纳米颗粒的MDSC与苹果酸舒尼替尼在肝内转移OVA-B16黑色素瘤模型中具有疗效。

为了评价荷NP-OVA-PGN的MDSC对肝内黑色素瘤中的疗效，在同源C57BL/6小鼠中肝内接种B16-OVA细胞(7×10⁴B16-OVA细胞/小鼠)。当肿瘤达到3×3×3mm²的尺寸时，将荷瘤小鼠随机分成5组：NP(空纳米颗粒载体)；接合有OVA的纳米颗粒(NP-OVA)；荷NP-OVA的MDSC与苹果酸舒尼替尼处理的组合(NP-OVA+SU)；接合有OVA和PGN的纳米颗粒(NP-OVA-PGN)；荷NP-OVA-PGN的MDSC和苹果酸舒尼替尼处理的组合(NP-OVA-PGN+SU)(n=2～5/组)。所有小鼠都接受过继转移的OTII-TCR T细胞，含有CD45.1同源标记物(5×10⁶/小鼠)和指定的MDSC(5×10⁶/小鼠)。持续提供苹果酸舒尼替尼处理(0.015mg/小鼠/天)。过继转移10天后，处死小鼠，并从脾脏纯化CD45.1+T细胞用于T细胞增殖和细胞因子产生试验。通过门设CD4+CD45.1+细胞来检测脾脏、淋巴结和肿瘤中过继转移的CD45.1+OTII-TCR T细胞的表型变化。当与NP组(76.6%)相比时，在NP-OVA-PGN(7.54%)、NP-OVA+SU(16.6%)、NP-OVA-PGN+SU(5.17%)组中，小鼠肿瘤组织中的FoxP3+CD25+Treg显著降低(图15)。从脾脏和淋巴结中获得的结果与从肿瘤组织中获得的结果类似。观察到在存在苹果酸舒尼替尼处理(NP-OVA-PGN+SU)或不存在苹果酸舒尼替尼处理(NP-OVA-PGN)下，荷NP-OVA-PGN的MDSC使肿瘤生长显著降低(图16)。

如所期望的，从这两个组(NP-OVA-PGN+SU和NP-OVA-PGN)中纯化的CD45.1+OTII-TCR T细胞，与阴性对照(无OTII肽)相比，显示显著水平的应答OTII肽的T细胞增殖(图17)。在存在苹果酸舒尼替尼处理(NP-OVA+SU)或不存在苹果酸舒尼替尼处理(NP-OVA)，在用荷NP-OVA的MDSC处理的小鼠中观察到较少的T细胞增殖(图17)。在来自NP-OVA-PGN和NP-OVA-PGN+SU组中小鼠的CD45.1+OTII-TCR T细胞中检测到高水平的IFNγ和IL-17以及低水平的IL-10(图18)。另一方面，NP-OVA-PGN+SU处理的组合协同降低了IL-10的表达。这些结果表明，荷NP-OVA-PGN的MDSC的过继转移和苹果酸舒尼替尼处理可通过不同机制有效地控制B16-OVA肿瘤。使MDSC载有PGN接合的NP-OVA显著降低了Treg(从63.8%至7.54%)、增加IFNγ和IL-17的产生(分别为NP-OVA组的7.3倍和10.3倍)，减少肿瘤尺寸(NP-OVA组的66%)并增加抗原-特异性T细胞增殖(图18)。因此，苹果酸舒尼替尼不仅充当免疫调节剂来将Treg转化为Th1/Th17，还增强抗原特异性T细胞增殖，使MDSC直接分化成M1巨噬细胞，从而将致耐受性微环境转换为促炎性微环境；苹果酸舒尼替尼还可充当对抗肿瘤细胞的化学治疗药物。

实施例11

肺转移的黑色素瘤模型中的荷纳米颗粒-OVA-PGN的MDSC

本实施例证实，载有接合至PGN和OVA的纳米颗粒并传递至小鼠的MDSC在肺转移的黑色素瘤模型中具有疗效。

将动物肺转移模型用于评价MDSC和苹果酸舒尼替尼治疗的组合疗效。在过继转移荷纳米颗粒的MDSC(5×10⁶细胞/小鼠)之前，用B16-OVA细胞(3×10⁵细胞/小鼠)静脉注射激发小鼠7天。持续注射苹果酸舒尼替尼处理28天(0.015mg/小鼠/天)。为了评价PGN和苹果酸舒尼替尼的联合疗法是否可增加特异性T细胞增殖并诱导抗B16-OVA黑色素瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞活性，在MDSC过继转移后的第14天，从所有组的小鼠脾脏中纯化Thy1.2T细胞。接合有NP-OVA的PGN在存在或不存在苹果酸舒尼替尼处理下，均大量增加OVA特异性T细胞增殖(刺激指数：分别为9.82和8.73)(图19)。为了确定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性，进一步在体内用OVA再刺激纯化的Thy1.2T细胞3天，并用作效应细胞。将IFNγ预处理的B16-OVA肿瘤细胞用作靶细胞。荷NP-OVA-PGN的MDSC与苹果酸舒尼替尼的组合激发了最高的CTL活性(图20)。在单独用荷NP-OVA-PGN的MDSC或用荷NP-OVA的MDSC加上苹果酸舒尼替尼处理的小鼠中，检测到显著但较低的CTL活性(图20)。

为了评价靶转移部位中的特异性效应T细胞的细胞因子谱，分离转移性肺组织中的总淋巴细胞并用OVA再刺激3天。其后，收集来自纯化的Thy1.2T细胞和分离的肺淋巴细胞的上清液用于IFNγ和IL-17产生的分析。结果示出，在脾脏中，荷NP-OVA-PGN的MDSC和/或苹果酸舒尼替尼大量且显著地增强了IFNγ和IL-17的产生，但降低了IL-10的产生(图21)。单独的荷NP-OVA-PGN的MDSC对增加脾中IL-17的产生具有最强的作用(图21)。另一方面，苹果酸舒尼替尼处理显著增加了转移性肺淋巴细胞中IFNγ的产生。对试验小鼠的长期存活率进行追踪(图22)。用荷NP-OVA-PGN的MDSC+苹果酸舒尼替尼处理的小鼠示出比用荷NP-OVA-PGN的MDSC(P=0.0378)或荷NP-OVA的MDSC+苹果酸舒尼替尼(P=0.0074)处理的小鼠显著高的延长的存活曲线。当与NP-OVA组相比时，接合有NP-OVA的PGN显著改善了处理小鼠的存活(P=0.0092)。因此，PGN可通过增加抗原特异性T细胞增殖和CTL活性并促进Th1和Th17细胞，特别是Th17细胞来增强对肿瘤的免疫应答。相反，苹果酸舒尼替尼可能通过在转移器官和脾中将MDSC转换成特异性M1表型并增加IFNγ的产生来发挥其抗肿瘤作用。在PGN和苹果酸舒尼替尼的组合下，从显著降低Treg活化、增加的Th1和Th17应答、延迟肿瘤生长和延长存活率来增加获得期望的疗效。因此，PGN和苹果酸舒尼替尼的组合为强化化学疗法和免疫疗法提供坚实的基础。最重要的是，从MHC II类、I类或趋化因子受体KO小鼠中分离的MDSC(CCR2、CCR7)显著削弱存活益处，表明MDSC需要迁移至肿瘤部位并充当肿瘤特异性T细胞的抗原呈递细胞(图23)。

实施例12

转移性宫颈癌模型中的MDSC介导纳米颗粒传递

本实施例证实，在转移性宫颈癌模型中，MDSC有效地将接合至肿瘤抗原的纳米颗粒传递至肿瘤部位并增加荷瘤小鼠的存活。

在TC-1转移性宫颈癌模型中评价使用原生肿瘤相关抗原(E6/E7抗原)的MDSC-纳米颗粒免疫方案。在同源C57BL/6小鼠静脉内接种TC-1肿瘤细胞(3×10⁵TC-1细胞/小鼠)10天，从而使肺转移瘤发展。从荷瘤小鼠收集MDSC并随机分成4组：NP(空纳米颗粒载体)；纳米颗粒(NP)；荷NP的MDSC和苹果酸舒尼替尼处理的组合(NP+SU)；接合有E6/E7和PGN的纳米颗粒(NP-E6E7-PGN)；荷NP-E6E7-PGN的MDSC和苹果酸舒尼替尼处理的组合(NP-E6E7-PGN+SU)(n=3～7/组)。在指定条件下过夜培养MDSC，并将MDSC(5×10⁶/小鼠)过继转移至受体小鼠中。持续给予苹果酸舒尼替尼处理(0.015mg/小鼠/天)。在该E6/E7阳性转移性肿瘤模型的情况下，接受与苹果酸舒尼替尼处理组合的载有NP-E6E7-PGN的MDSC的小鼠，与接受不存在苹果酸舒尼替尼的载有NP-E6/E7-PGN的MDSC的小鼠相比，具有显著(p<0.01)改进的存活(图24)。当从脾中分离的T细胞在体内受到E6/E7肽刺激时显示显著的增殖水平(图25)，并观察到针对从肿瘤浸润白细胞中分离的F4/80+巨噬细胞(图26A)和T细胞(图26B)的亲代肿瘤细胞的细胞裂解活性。这些结果表明，荷NP+PGN+E6/E7抗原的MDSC在苹果酸舒尼替尼的存在下，可诱导最强的针对表达E6/E7的亲代肿瘤细胞的T细胞细胞裂解活性，调节肿瘤微环境并产生M1样功能巨噬细胞来介导直接的肿瘤杀伤。

实施例13

结合的Toll样受体配体对MDSC介导的T细胞活化的作用

本实施例证实，用TLR配体处理的、特别是与TLR配体组合的MDSC，与单独的TLR配体相比，诱导T细胞从而分泌水平升高的促炎性细胞因子TNF-α、IL-17和IFNγ。从OVA TCR转基因小鼠C57BL/6小鼠的脾脏中分离的天然OTII CD4T细胞与OVA肽，在预先温育的MDSC的存在或不存在下、在指定的TLR配体或它们的组合的存在下培养。如图27所示，TLR2+4的配体的组合(PGN+LPS)诱导高水平的TNF-α和IFNγ。TLR2+9的组合(PGN+CpG)诱导高水平的IL-17和IFNγ。因此，TLR配体的组合对MDSC活化T细胞的能力具有协同效应。

讨论

在过去的几年中，肿瘤特异性治疗的细胞介导的传递已成为比较感兴趣的课题。对于被认为用于该种治疗的细胞，其必须显示出多种性质：细胞必须能够接受处理而不死亡，其必须能够将治疗直接传递至肿瘤，促进有效的肿瘤杀伤，并且其必须不具有有害的全身副作用或亲瘤性(protumor)副作用。如本文所证实的，证明MDSC是满足这些标准的优异候选者。

本文证实，MDSC显示出非常强的肿瘤趋向性。另外，可对MDSC进行磁性和荧光标记，并且在荷瘤宿主中追踪它们的迁移，因此可以利用它们用于诊断和成像目的。本文还证实，MDSC在48小时转移后离开循环，在72小时转移后达到峰值。然而，标记细胞在转移后多达一周还可见其存在于肿瘤细胞中。MDSC在肿瘤外周和血管周围累积。在血管周围区域内存在可能是由于MDSC经脉管系统运至肿瘤，然而，这也表明已报道的它们在血管生成中的作用。

菲立磁标记提供免疫学标记技术方面优势，包括在同一个体中体内纵向追踪迁移的能力，可很好地应用于人。对于MRI鉴定，细胞需要很少的菲立磁，并且MRI检测需要非常少的细胞存在。之前已示出，单独的SPIO标记的细胞可经MRI在体内鉴定。然而，当鉴定树突细胞时，检测125个细胞时已获得可靠的结果，所述树突细胞与MDSC尺寸相似，并且似乎吸收菲立磁也类似。由于其右旋糖酐包衣，菲立磁保持完好且比荧光标记可检测更长时间，其存在可经ICP-MS、弛豫时间测定和组织学证实。菲立磁还是无毒的，且以被FDA批准用于人类。

有效的VSV治疗中所存在的挑战使其在证实MDSC如何能够改进目前的肿瘤治疗中非常有用。VSV抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的存活。典型地瘤内或肝内注射VSV来实现该应答。还没有关于全身浸润VSV促进体内强烈的抗肿瘤应答或长期存活的报道。全身给药治疗提供瘤内给药方面的优势：其能够避免术后并发症，并可到达外科手术无法接近的位置。2008年，美国有超过1,450,000种新诊断的癌症病例，570,000例由于该疾病而死亡。这些死亡主要是由于该疾病的转移扩散，而不是基本肿瘤的生长。MDSC迁移至炎性介质存在的位置，例如转移部位。因此，本文所提供的MDSC治疗可导致消除目前还未确定的转移损害。

VSV治疗提供MDSC治疗以及使用第二代VSV(M3)突变体所尝试克服的多种独特的挑战。免疫耐受宿主能够进行快速的细胞免疫应答，在几天后停止病毒复制。VSV的溶瘤细胞的潜能可通过载体介导的NK和NKT细胞的抑制而增强[Altomonte等人(2009)Cancer Gene Ther.16(3):266–278]。通过采用VSV(M3)突变体(已改变了基质蛋白并表达鼠γ疱疹病毒M3蛋白)，病毒复制延长，导致强有力的溶瘤细胞应答[Wu，2008如上]。不幸的是，VSV还有神经病变的风险，包括麻痹或致命的脑炎。与本文所公开的治疗方案所相通的是，用VSV-MDSC处理的小鼠没有经受此类影响。在组织学上以及通过TCID₅₀也证实，用VSV-MDSC处理的小鼠的中枢神经系统相对免受VSV的感染。另外，根据本发明，通过使用MDSC将病毒直接靶向肿瘤，可减少药理学剂量，因而增加治疗指数。

虽然VSV可与哺乳动物细胞被动结合，但其以低拷贝数进行，因此优选在MDSC上载荷病毒的替代方法。为此，可使用抗VSV-G表面蛋白的抗体。该抗体为非中和的，且通过在所有单核细胞上发现的高亲和性FcγRI来结合。本文证实，该抗体可用于增加结合至MDSC并最终由MDSC传递的病毒的量。最终，当将第二代病毒与抗体接合组合时，证实了一群荷瘤小鼠的长期存活。该改善的存活归因于肿瘤内增加的病毒浓度以及避免细胞抗病毒应答的组合。

之前，巨噬细胞、T细胞和NK细胞已用作VSV的肿瘤特异性传递的载体。这些方法有许多不足。从非实验模型如之前已使用的OT-II模型中分离肿瘤特异性T细胞已知是具有挑战性的。NK细胞和T细胞二者均显著小于MDSC，并且不具吞噬作用，限制了其可吸收OV的量和方法。这些细胞都不具有MDSC所具有的高亲和性FcγR，在此将其用于增加病毒载量。大且具有吞噬作用的巨噬细胞缺乏本文中MDSC所发现的肿瘤特异性。事实上，所有试验的细胞类型都缺乏MDSC所固有的肿瘤趋向性。

MDSC治疗的另一优势在于其不必限于VSV。还有许多其它根据肿瘤类型而提供优势的溶瘤病毒。

目前，存在多种进行中的研究，研究涉及包括化学治疗药物和siRNA的荷纳米颗粒治疗剂，所有这些都可载入MDSC上。如本文所示，MDSC可将纳米颗粒有效地运输至肿瘤部位，并对肿瘤杀伤有效。特别地，接合至TLR配体(PGN)或肿瘤相关抗原(E6E7肽)的纳米颗粒通过MDSC有效地传递至肿瘤部位，并使荷瘤小鼠的存活率增加。通过肿瘤特异性靶向治疗，有利地获得较高的治疗剂瘤内浓度，同时保持全身剂量低。此外，与苹果酸舒尼替尼的组合也特别有效。

虽然MDSC因其致癌特性而知名，但之前已证实它们的表型是可塑的，并且在不同条件下，MDSC可显现抗肿瘤、M1样表型。本文确实证实了，由于天然MDSC为M2样，当将其暴露于病毒时，细胞向M1致敏，上调iNOS、下调Arg，并积极杀伤肿瘤细胞。MDSC的这一独特性质使其成为细胞介导疗法的优异候选物。

人MDSC类别的通用表位的鉴定已证明比鼠MDSC的更具挑战性，然而，研究已向在多类癌症患者中发现统一表型的方向进展。参见,Mandruzzato,S.等人，J Immunol 182,6562-6568(2009);Hoechst,B.等人，Hepatology 50,799-807(2009);Rodriguez,P.C.等人，Cancer Res 69,1553-1560(2009);Liu,C.Y.等人，J Cancer Res Clin Oncol(2009)。基于本文所述的发现，由癌症患者的血液或骨髓可产生的MDSC，可用癌症特异性疗法来进行强化，并在治疗上转回至患者。此类治疗方法可对具有低全身毒性阈值的治疗有用。

在人类和小鼠中，已发现MDSC实质上在每种形式的癌症中都增加，包括结肠癌、肾细胞癌、乳腺癌、黑色素瘤和肝细胞癌(HCC)。在MDSC中，免疫系统已提供了靶向治疗的优异载体，其为在治疗癌症和可能治疗其它多种疾病中利用的神奇作用因子(Trojan horse)。

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可以理解的是，本发明不仅限于本文所例举的具体类型的肿瘤。本方法和组合物对于将抗肿瘤剂，例如溶瘤病毒、化学治疗药物和其它小分子靶向任何肿瘤都是有效的。

本发明不限于本文所描述的具体实施方案的范围。当然，除了本文所描述的那些以外，从前述描述和附图中，本发明的各种修改对于本领域技术人员都将变得显而易见。此类修改将落入所附权利要求的范围内。

此外，可以理解的是，所有值都是近似的，并用于描述。

本申请引用了专利、专利申请、公报、产品说明书和技术方案，出于不同目的，而将其公开的内容全部引入于此以作参考。

Claims (40)

1.一种组合物，其包括分离的髓源抑制细胞(MDSC)和抗肿瘤剂。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗肿瘤剂为溶瘤病毒。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述溶瘤病毒为选自由水泡型口炎病毒(VSV)、rVSV(MΔ51)-M3突变体VSV、AdlTRAIL-EI、ONYX-015、CV706、JX-584、CGTG-102、痘苗病毒、呼肠孤病毒和脊髓灰质炎病毒组成的组的成员。

4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述MDSC感染有所述溶瘤病毒。

5.根据权利要求2所述的组合物，其中所述MDSC接合至所述溶瘤病毒。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗肿瘤剂为选自由化学治疗剂、干扰素γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、TGF-β的拮抗剂、IL-10的拮抗剂和抗血管生成因子组成的组的成员。

7.一种组合物，其包括分离的髓源抑制细胞(MDSC)和水泡型口炎病毒(VSV)。

8.一种药物制剂，其包括髓源抑制细胞(MDSC)、抗肿瘤剂和药学上可接受的载体。

9.根据权利要求8所述的药物制剂，其中配制所述制剂用于肠胃外给药。

10.根据权利要求8所述的药物制剂，其中所述抗肿瘤剂为溶瘤病毒。

11.根据权利要求8所述的药物制剂，其中所述抗肿瘤剂为至少一种化学治疗剂。

12.一种肿瘤治疗方法，其包括将治疗有效量的根据权利要求8所述的药物制剂向需要此类治疗的患者给药，从而治疗所述肿瘤。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述肿瘤选自由纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤组成的组。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述患者为哺乳动物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述哺乳动物为人类。

16.一种肿瘤治疗方法，其包括将治疗肿瘤用有效量的组合物向需要此类治疗的患者给药，所述组合物包括分离的髓源抑制细胞(MDSC)和抗肿瘤剂。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述患者为哺乳动物。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述哺乳动物为人类。

19.根据权利要求16所述的方法，其中所述肿瘤选自由纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤组成的组。

20.一种受试者中肿瘤的诊断方法，所述方法包括：(i)将标记的髓源抑制细胞(MDSC)向受试者给药；和(ii)确定所述标记的MDSC是否集中于所述受试者的至少一个部位。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述MDSC标记有菲立磁。

22.根据权利要求20所述的方法，其中使用磁共振成像(MRI)在体内检测所述标记的MDSC。

23.一种试剂盒，其包括分离的髓源抑制细胞(MDSC)和抗肿瘤剂。

24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述抗肿瘤剂为溶瘤病毒或化学治疗剂。

25.一种试剂盒，其包括标记有可在体内检测的标记物的分离的髓源抑制细胞(MDSC)。

26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述标记物为菲立磁。

27.根据权利要求20所述的方法，其进一步包括在所述受试者中进行PET扫描，从而确认所述肿瘤诊断。

28.根据权利要求1或7所述的组合物，其中所述MDSC表达细胞表面标记物CD11b和CD33。

29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述MDSC还表达选自由CD14、CD15、CD16、CCR2、CCR7和CD34组成的组的至少一种细胞表面标记物。

30.根据权利要求12、16或20任一项所述的方法，其中所述MDSC表达细胞表面标记物CD11b和CD33。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述MDSC还表达选自由CD14、CD15、CD16、CCR2、CCR7和CD34组成的组的至少一种细胞表面标记物。

32.根据权利要求1或7所述的组合物，其中所述MDSC表达细胞表面标记物CD11b、CD115、Gr1和Ly6C。

33.根据权利要求12、16或20任一项所述的方法，其中所述MDSC表达细胞表面标记物CD11b、CD115、Gr1、CCR7、CCR2和Ly6C。

34.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗肿瘤剂为纳米颗粒。

35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述纳米颗粒与至少一种佐剂接合。

36.根据权利要求34所述的组合物，其中所述纳米颗粒与至少一种抗原接合。

37.根据权利要求34所述的组合物，其中所述纳米颗粒与佐剂和抗原接合。

38.根据权利要求36所述的组合物，其中所述至少一种抗原为肿瘤抗原。

39.根据权利要求35所述的组合物，其中所述至少一种佐剂为Toll样受体(TLR)配体。

40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述至少一种TLR配体选自由脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、CpG、PolyIC、单磷酰脂A、鞭毛蛋白和含6个UUAU(SEQ ID NO:5)重复序列的ssRNA组成的组。

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