CN118086203A - 冻存脐带血nk细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种冻存脐带血NK细胞的培养方法，涉及生物技术领域。本发明提供的冻存脐带血NK细胞的培养方法，将复苏后的脐带血去掉冻存液后直接进行NK细胞的激活和扩增，而不经过常规的单个核细胞分离过程，简化了操作过程，提高了冻存脐带血单个核细胞和NK细胞的回收率，而对NK细胞的体外扩增能力和杀伤活性没有影响，因此，本发明可以显著提高一份冻存脐带血体外扩增NK细胞的最终产量。本发明通过在激活培养的培养基中添加小分子组合CEPT(Chroman 1、Emricasan、Trans‑ISRIB和Polyamine Solution)，能够显著提高冻存脐带血NK细胞扩增倍数和NK细胞纯度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种冻存脐带血NK细胞的培养方法。
背景技术
现有技术方案对于用于NK细胞扩增的单个核细胞通常采用Ficoll或淋巴细胞分离液分离获得，然而该方法存在以下问题：
首先，一份脐带血中NK细胞的数量有限，脐带血冻存后NK细胞活率降低导致NK细胞数量进一步减少；其次，冻存脐带血分离单个核细胞会出现NK细胞回收率低、红细胞残留多等问题；另外，相对于新鲜脐带血NK细胞，冻存脐带血NK细胞激活扩增前期增殖较为缓慢。
以上问题极大的限制了NK细胞的最终产量。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种冻存脐带血NK细胞的培养方法，以解决上述问题。
第一方面，本发明提供了一种冻存脐带血NK细胞的培养方法，包括以下步骤：
将复苏后的冻存脐带血去除冻存液后依次进行激活培养和扩增培养，获得NK细胞；
所述激活培养的培养基主要由动物细胞培养基A和添加在动物细胞培养基A中的人AB血清、重组人IL-2细胞因子、重组人IL-15细胞因子、重组人IL-21细胞因子、Chroman1、Emricasan、Trans-ISRIB和Polyamine Solution组成；所述人AB血清的加入量为动物细胞培养基A体积的2％-10％；所述重组人IL-2细胞因子的终浓度为200-1000IU/mL；所述重组人IL-15细胞因子的终浓度为20-60ng/mL；所述重组人IL-21细胞因子的终浓度为20-60ng/mL；所述Chroman 1的终浓度为20-80nM；所述Emricasan的终浓度为2-8uM；所述Trans-ISRIB的终浓度为0.2-1uM；所述Polyamine Solution的终浓度为2-8ug/mL；
所述动物细胞培养基A包括GMP SCGM培养基、NK/>BasalMedium培养基或X-VIVOTM-15培养基。
作为进一步技术方案，所述激活培养的时间为4-6天。
作为进一步技术方案，激活培养过程中，激活培养2-3天后，补充激活培养的培养基。
作为进一步技术方案，所述扩增培养的培养基主要由动物细胞培养基B和添加在动物细胞培养基B中的人AB血清、重组人IL-2细胞因子和重组人IL-15细胞因子组成；所述人AB血清的加入量为动物细胞培养基B体积的2％-10％；所述重组人IL-2细胞因子的终浓度为200-1000IU/mL；所述重组人IL-15细胞因子的终浓度为20-60ng/mL；
所述动物细胞培养基B包括GMP SCGM培养基、NK/>BasalMedium培养基或X-VIVOTM-15培养基。
作为进一步技术方案，扩增培养过程中，每隔1-3天补充扩增培养的培养基。
作为进一步技术方案，扩增培养过程中，维持细胞密度为0.8×106-2.5×106/mL。
作为进一步技术方案，复苏后的冻存脐带血去除冻存液后，于重组人抗CD16单抗包被的培养容器中依次进行激活培养和扩增培养。
作为进一步技术方案，复苏冻存脐带血的方法包括：
将冻存脐带血水浴加热至融化，然后与复苏液混合，获得复苏的冻存脐带血。
作为进一步技术方案，冻存脐带血中冻存液的去除方法包括：
将复苏后的冻存脐带血离心去上清，然后进行清洗，完成对冻存脐带血中冻存液的去除。
作为进一步技术方案，所述清洗的清洗液包括生理盐水。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明将复苏后的脐带血去掉冻存液后直接进行NK细胞的激活和扩增，而不经过常规的单个核细胞分离过程，简化了操作过程，提高了冻存脐带血单个核细胞和NK细胞的回收率，而对NK细胞的体外扩增能力和杀伤活性没有影响，因此，本发明可以显著提高一份冻存脐带血体外扩增NK细胞的最终产量。
2.本发明通过在激活培养的培养基中添加小分子组合CEPT(Chroman1、Emricasan、Trans-ISRIB和Polyamine Solution)，能够显著提高冻存脐带血NK细胞扩增倍数和NK细胞纯度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1和对比例1分离得到的单个核细胞和NK细胞回收率；
图2为实施例1和对比例2扩增得到的NK细胞的纯度；
图3为实施例1和对比例2NK细胞的扩增倍数。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了一种冻存脐带血NK细胞的培养方法，包括以下步骤：
将复苏后的冻存脐带血去除冻存液后依次进行激活培养和扩增培养，获得NK细胞；
所述激活培养的培养基主要由动物细胞培养基A和添加在动物细胞培养基A中的人AB血清、重组人IL-2细胞因子、重组人IL-15细胞因子、重组人IL-21细胞因子、Chroman1、Emricasan、Trans-ISRIB和Polyamine Solution组成。其中，人AB血清的加入量为动物细胞培养基A体积的2％-10％，例如可以为，但不限于2％、5％、8％或10％；重组人IL-2细胞因子的终浓度例如可以为，但不限于200IU/mL、500IU/mL、800IU/mL或1000IU/mL；重组人IL-15细胞因子的终浓度例如可以为，但不限于20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL或60ng/mL；重组人IL-21细胞因子的终浓度例如可以为，但不限于20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL或60ng/mL；Chroman 1的终浓度例如可以为，但不限于20nM、40nM、60nM或80nM；Emricasan的终浓度例如可以为，但不限于2uM、4uM、6uM或8uM；Trans-ISRIB的终浓度例如可以为，但不限于0.2uM、0.4uM、0.6uM、0.8uM或1uM；Polyamine Solution的终浓度例如可以为，但不限于2ug/mL、4ug/mL、6ug/mL或8ug/mL；
所述动物细胞培养基A包括GMP SCGM培养基、NK/>BasalMedium培养基或X-VIVOTM-15培养基。
本发明提供的培养方法，将复苏后的脐带血去掉冻存液后直接进行NK细胞的激活和扩增，简化了操作过程，提高了冻存脐带血单个核细胞和NK细胞的回收率，且对NK细胞的体外扩增能力和杀伤活性没有影响，有助于提高冻存脐带血体外扩增NK细胞的最终产量；通过在激活培养的培养基中添加小分子组合CEPT，能够显著提高冻存脐带血NK细胞扩增倍数和NK细胞纯度。
在一些可选的实施方式中，所述激活培养的时间为4-6天，优选为5天。
在一些可选的实施方式中，所述激活培养的条件包括：饱和湿度、37℃、5％CO2。
在一些可选的实施方式中，激活培养过程中，激活培养2-3天后，补充激活培养的培养基。
在一些可选的实施方式中，所述扩增培养的培养基主要由动物细胞培养基B和添加在动物细胞培养基B中的人AB血清、重组人IL-2细胞因子和重组人IL-15细胞因子组成。其中，人AB血清的加入量为动物细胞培养基A体积的2％-10％，例如可以为，但不限于2％、5％、8％或10％；重组人IL-2细胞因子的终浓度例如可以为，但不限于200IU/mL、500IU/mL、800IU/mL或1000IU/mL；重组人IL-15细胞因子的终浓度例如可以为，但不限于20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL或60ng/mL。
所述动物细胞培养基B包括GMP SCGM培养基、NK/>BasalMedium培养基或X-VIVOTM-15培养基。
通过对扩增培养的培养基的组分配比的进一步优化和调整，更好的促进NK细胞的扩增。
在一些可选的实施方式中，所述扩增培养的条件包括：饱和湿度、37℃、5％CO2。
在一些可选的实施方式中，扩增培养过程中，每隔1-3天补充扩增培养的培养基。
在一些可选的实施方式中，扩增培养过程中，维持细胞密度为0.8×106-2.5×106/mL。
在一些可选的实施方式中，复苏后的冻存脐带血去除冻存液后，于重组人抗CD16单抗包被的培养容器中依次进行激活培养和扩增培养。
在一些可选的实施方式中，复苏冻存脐带血的方法包括：
将冻存脐带血水浴加热至融化，然后与复苏液混合，获得复苏的冻存脐带血。
其中，所述水浴加热的温度优选为37-40℃；
本发明对于复苏液的选择不作具体限制，能够实现冻存脐带血的复苏即可。例如，复苏液的配制可以为：将1.5mL的人血白蛋白注射液(20％)、50mL的右旋糖酐40氯化钠注射液(6％)和250mL的氯化钠注射液(0.9％)在配液瓶中充分混匀，并于2-8℃冰箱预冷。
在一些可选的实施方式中，冻存脐带血中冻存液的去除方法包括：
将复苏后的冻存脐带血离心去上清，然后进行清洗，完成对冻存脐带血中冻存液的去除。
在一些可选的实施方式中，所述清洗的清洗液包括但不限于生理盐水，或者本领域技术人员所熟知的其他能够用于细胞清洗的溶剂。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
以下实施例或对比例中所用到的试剂包括：
Ficoll-Paque PLUS：Cytiva(GE)，货号：17144002；
GMP SCGM：CellGenix，货号：20802-0500；
NKBasal Medium：Miltenyi Biotec，货号：130-114-429；
X-VIVOTM-15：Lonza，货号：BEBP02-054Q；
人AB血清：GeminiBio，货号：100-512；
重组人抗CD16单抗：近岸蛋白质科技有限公司，货号：GMP-A091；
重组人IL-2细胞因子：近岸蛋白质科技有限公司，货号：GMP-CD66；
重组人IL-15细胞因子：近岸蛋白质科技有限公司，货号：GMP-C016；
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FITC anti-human CD45：Biolegend，货号：304006；
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7-AAD：BD生物科学，货号：559925；
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FITC Mouse IgG1：Biolegend，货号：400108；
APC Mouse IgG1：Biolegend，货号：400120；
右旋糖酐40氯化钠注射液(6％)，石家庄四药有限公司，货号：国药准字H13022493；
人血白蛋白注射液(20％)：瑞士杰特贝林生物制品有限公司，货号：国药准字SJ20170005；
氯化钠注射液(0.9％)：石家庄四药有限公司，货号：国药准字H20066533。
实施例1
1)冻存脐带血复苏
A1.复苏稀释液配制：复苏稀释液包含1.5mL的人血白蛋白注射液(20％)，50mL的右旋糖酐40氯化钠注射液(6％)和250mL的氯化钠注射液(0.9％)，将所有成分在配液瓶中充分混匀，并于2-8℃冰箱预冷，保证使用前预冷至2-8℃。
A2.将冻存脐带血从液氮罐中取出，在37-40℃水浴中融化至无冰晶时取出；用酒精喷洒脐带血采集袋表面及软管接口处以及剪刀，用无菌纱布进行擦拭后，用剪刀剪开密封接口处，将血样转移至50mL离心管中。
A3.向脐带血中缓慢加入等体积预冷的稀释液进行稀释，边加边轻柔晃动，混匀后室温下静置5分钟；根据脐带血体积将脐带血平均分至5-8个50mL离心管，再次加入稀释液进行4倍稀释，每50mL离心管液体体积不超过45mL，最终将原始脐带血进行8倍体积的稀释。
2)单个核细胞的分离
B1.采用托盘天平将上一步离心管配平，以18℃、400g、20min、升速9、降速1的条件离心；
B2.吸弃上清，将所有管中的细胞沉淀合并至一个50mL离心管中，补充氯化钠注射液(0.9％)至40mL，混匀后以18℃、400g、20min、升速9、降速1的条件离心；
B3.吸弃上清，加入5-10mL NK细胞激活培养基(培养基配方参见步骤3))重悬细胞，并将细胞悬液转移至15mL离心管中，并补充NK细胞激活培养基至13mL，以18℃、300g、10min、升速9、降速1的条件离心；
B4.吸弃上清，加入10mL NK细胞激活培养基重悬沉淀，即为回收的冻存脐带血单个核细胞。
3)NK细胞激活培养
C1.NK细胞激活培养基配制：GMP SCGM培养基中加入5％人AB血清以及重组人IL-2细胞因子、重组人IL-15细胞因子、重组人IL-21细胞因子、Chroman 1、Emricasan、Trans-ISRIB和Polyamine Solution，配制完成后，培养基中含有500IU/mL重组人IL-2细胞因子，40ng/mL重组人IL-15细胞因子，40ng/mL重组人IL-21细胞因子，50nMChroman 1，5uM Emricasan，0.6uM Trans-ISRIB，5ug/mL Polyamine Solution。
C2.培养瓶包被、润洗：将10mL含有1-5μg/mL重组人抗CD16单抗的氯化钠注射液平铺至75cm2培养瓶，前后左右轻轻摇动使包被液铺满瓶底，置于水平桌面室温静置1-2h。用移液枪吸弃培养瓶中的包被液，向培养瓶底部缓慢加入10mL氯化钠注射液缓慢洗掉残余的重组人抗CD16单抗。
C3.细胞接种：将培养瓶直立或倾斜，取10-20mL(含活细胞数3E7-4E7)单个核细胞悬液缓慢加入包被完成的75cm2培养瓶(TC)底部，缓缓将培养瓶放平前后左右轻轻摇动使细胞均匀平铺至包被好的培养瓶中，置于饱和湿度、37℃、5％ CO2的培养箱中静置培养，记录为NK细胞激活培养Day 0。
C4.细胞补液：细胞激活培养至Day 3，向培养瓶中缓慢加入10-20mL NK细胞激活培养基，尽量不要吹起细胞，置于饱和湿度、37℃、5％CO2的培养箱中继续培养2天。
4)NK细胞扩增培养
D1.NK细胞扩增培养基配制：GMP SCGM培养基中加入5％人AB血清以及重组人IL-2细胞因子和重组人IL-15细胞因子，配制完成后，培养基中含有500IU/mL重组人IL-2细胞因子，40ng/mL重组人IL-15细胞因子。
D2.Day 5到Day21每两天进行细胞计数并补充适量NK细胞扩增培养基调整细胞密度至1E6/mL培养。
实施例2
1)冻存脐带血复苏
同实施例1。
2)单个核细胞的分离
同实施例1。
3)NK细胞激活培养
C1.NK细胞激活培养基配制：NKBasal Medium培养基中加入2％人AB血清以及重组人IL-2细胞因子、重组人IL-15细胞因子、重组人IL-21细胞因子、Chroman 1、Emricasan、Trans-ISRIB和Polyamine Solution，配制完成后，培养基中含有1000IU/mL重组人IL-2细胞因子，20ng/mL重组人IL-15细胞因子，60ng/mL重组人IL-21细胞因子，20nMChroman 1，8uM Emricasan，0.2uM Trans-ISRIB，8ug/mL Polyamine Solution。
C2.培养瓶包被、润洗：将10mL含有1-5μg/mL重组人抗CD16单抗的氯化钠注射液平铺至75cm2培养瓶，前后左右轻轻摇动使包被液铺满瓶底，置于水平桌面室温静置1-2h。用移液枪吸弃培养瓶中的包被液，向培养瓶底部缓慢加入10mL氯化钠注射液缓慢洗掉残余的重组人抗CD16单抗。
C3.细胞接种：将培养瓶直立或倾斜，取10-20mL(含活细胞数3E7-4E7)单个核细胞悬液缓慢加入包被完成的75cm2培养瓶(TC)底部，缓缓将培养瓶放平前后左右轻轻摇动使细胞均匀平铺至包被好的培养瓶中，置于饱和湿度、37℃、5％ CO2的培养箱中静置培养，记录为NK细胞激活培养Day 0。
C4.细胞补液：细胞激活培养至Day 2，向培养瓶中缓慢加入10-20mL NK细胞激活培养基，尽量不要吹起细胞，置于饱和湿度、37℃、5％CO2的培养箱中继续培养2天。
4)NK细胞扩增培养
D1.NK细胞扩增培养基配制：NKBasal Medium培养基中加入2％人AB血清以及重组人IL-2细胞因子和重组人IL-15细胞因子，配制完成后，培养基中含有200IU/mL重组人IL-2细胞因子，60ng/mL重组人IL-15细胞因子。
D2.Day 4到Day21每三天进行细胞计数并补充适量NK细胞扩增培养基调整细胞密度至0.8E6/mL培养。
实施例3
1)冻存脐带血复苏
同实施例1。
2)单个核细胞的分离
同实施例1。
3)NK细胞激活培养
C1.NK细胞激活培养基配制：X-VIVOTM-15培养基中加入10％人AB血清以及重组人IL-2细胞因子、重组人IL-15细胞因子、重组人IL-21细胞因子、Chroman 1、Emricasan、Trans-ISRIB和Polyamine Solution，配制完成后，培养基中含有200IU/mL重组人IL-2细胞因子，60ng/mL重组人IL-15细胞因子，20ng/mL重组人IL-21细胞因子，80nM Chroman 1，2uMEmricasan，1uM Trans-ISRIB，2ug/mL Polyamine Solution。
C2.培养瓶包被、润洗：将10mL含有1-5μg/mL重组人抗CD16单抗的氯化钠注射液平铺至75cm2培养瓶，前后左右轻轻摇动使包被液铺满瓶底，置于水平桌面室温静置1-2h。用移液枪吸弃培养瓶中的包被液，向培养瓶底部缓慢加入10mL氯化钠注射液缓慢洗掉残余的重组人抗CD16单抗。
C3.细胞接种：将培养瓶直立或倾斜，取10-20mL(含活细胞数3E7-4E7)单个核细胞悬液缓慢加入包被完成的75cm2培养瓶(TC)底部，缓缓将培养瓶放平前后左右轻轻摇动使细胞均匀平铺至包被好的培养瓶中，置于饱和湿度、37℃、5％ CO2的培养箱中静置培养，记录为NK细胞激活培养Day 0。
C4.细胞补液：细胞激活培养至Day 3，向培养瓶中缓慢加入10-20mL NK细胞激活培养基，尽量不要吹起细胞，置于饱和湿度、37℃、5％CO2的培养箱中继续培养3天。
4)NK细胞扩增培养
D1.NK细胞扩增培养基配制：X-VIVOTM-15培养基中加入10％人AB血清以及重组人IL-2细胞因子和重组人IL-15细胞因子，配制完成后，培养基中含有200IU/mL重组人IL-2细胞因子，60ng/mL重组人IL-15细胞因子。
D2.Day 6到Day21每一天进行细胞计数并补充适量NK细胞扩增培养基调整细胞密度至2.5E6/mL培养。
对比例1
与实施例1的区别在于，单个核细胞的分离方法不同，单个核细胞的分离如下：
B1.在50mL离心管中加入15mL Ficoll-Paque PLUS，冻存脐带血与氯化钠注射液(0.9％)以1:1混合稀释，将冻存脐带血稀释液匀速缓慢沿离心管壁加入Ficoll-PaquePLUS上层，Ficoll-Paque PLUS与冻存脐带血稀释液比例为1:2，以18℃/600g/低速升降离心30min。
B2.取A中的白膜层至50mL离心管，用细胞悬液4-6倍体积的氯化钠注射液(0.9％)洗涤，离心条件为18℃/400g/10min。重复洗涤步骤2次。
B3.吸弃上清，将细胞沉淀转移至15mL离心管，加入5-10mL NK细胞激活培养基平衡细胞，18℃/300g/6min离心。
B4.吸弃上清，加入10mL NK细胞激活培养基重悬沉淀，即为回收的冻存脐带血单个核细胞。
对比例2
与实施例1的区别在于，激活培养的培养基中未添加CEPT。
试验例1
对实施例1和对比例1-2方法筛选得到的单个核细胞和NK细胞，以及扩增得到的NK细胞进行检测：
E1.细胞活率计数
将20μL细胞悬液与20μL Countstar全自动荧光细胞计数仪配套的AO/PI双染试剂盒(Countstar，RE010213)AO/PI染液混合均匀，吸取20μL混悬液缓慢加至Countstar全自动荧光细胞计数板，水平静置1-2分钟，将全自动荧光细胞计数板放至Countstar全自动荧光细胞计数仪，用CBMC程序进行细胞活率计数。
E2.冻存脐带血NK细胞扩增能力的检测
根据CBMC接种时和收获时细胞AO/PI计数的活细胞计数结果和NK细胞纯度鉴定结果计算NK细胞扩增倍数。计算公式：扩增倍数＝收获活细胞数×收获NK细胞纯度/接种活细胞数×接种NK细胞纯度。
E3.冻存脐带血NK细胞纯度的检测
将细胞悬液混匀后取1×106个细胞每检测管，300g离心6分钟收集细胞。吸弃上清后用每检测管100μL的1×PBS重悬细胞，分别加入对应的抗体，NK细胞检测管：FITC anti-human CD45，APC anti-human CD3，PE anti-human CD56(NCAM)，7-AAD；NK细胞同型检测管：FITC Mouse IgG1，APC Mouse IgG1，PE Mouse IgG1。细胞在室温下孵育抗体20分钟，每管加入2mL 1×PBS终止染色，400g离心5分钟，倒扣检测管弃掉上清，每管加入200-300μL 1×PBS，涡旋混匀后用BD FACSCelesta流式细胞仪检测。
E4.冻存脐带血NK细胞杀伤活性的检测
将脐带血NK细胞与CFSE染色的K562细胞分别以1:1，2.5:1，5:1，10:1，20:1的比例共培养4小时，收集细胞进行7-AAD染色，随后用BD FACSCelesta流式细胞仪检测NK细胞杀伤活性。
实施例1和对比例1分离得到的单个核细胞和NK细胞回收率如表1和图1(图中CB洗涤法为实施例1的结果，Ficoll分离法为对比例1的结果)所示。结果表明，本发明方法相对于常规的Ficoll分离法能够显著提高单个核细胞回收率和NK细胞回收率。
表1
| 实施例1 | 对比例1 | |
| 单个核细胞回收率 | 97.0±13.8％ | 47.4±5.0％ |
| NK细胞回收率 | 84.8±13.1％ | 54.0±5.4％ |
实施例1和对比例1分离得到的NK细胞的扩增效果如表2和表3所示。结果表明，实施例1和对比例1分离获得的NK细胞经过体外扩增，细胞质量(细胞活率和杀伤活性)无显著差异，但是实施例1扩增得到的NK细胞数远高于对比例1，说明本发明方法能够显著提高NK细胞的产量。
表2
| 实施例1 | 对比例1 | |
| NK细胞扩增倍数 | 3014±1109 | 2070±202 |
| 细胞活率 | 93.1±0.5 | 94.5±1.1 |
| 杀伤活性(效靶比＝10(NK):1(K562)) | 71.5±6.6 | 67.3±1.6 |
表3
二、NK细胞激活体系
分别检测实施例1和对比例2扩增得到的NK细胞的纯度和扩增倍数，结果如图2-图3(图中对照组为对比例2的结果，CEPT为实施例1的结果)所示，研究数据表明本发明方法可显著提高冻存脐带血NK细胞扩增倍数和NK细胞纯度。
此外，参照上述方法对实施例2-3进行检测，发现实施例2-3的单个核细胞回收率、NK细胞回收率、NK细胞扩增倍数、细胞活率、杀伤活性、NK细胞纯度等结果同样优于对比例1，与实施例1相近。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种冻存脐带血NK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
将复苏后的冻存脐带血去除冻存液后依次进行激活培养和扩增培养，获得NK细胞；
所述激活培养的培养基主要由动物细胞培养基A和添加在动物细胞培养基A中的人AB血清、重组人IL-2细胞因子、重组人IL-15细胞因子、重组人IL-21细胞因子、Chroman 1、Emricasan、Trans-ISRIB和Polyamine Solution组成；所述人AB血清的加入量为动物细胞培养基A体积的2％-10％；所述重组人IL-2细胞因子的终浓度为200-1000IU/mL；所述重组人IL-15细胞因子的终浓度为20-60ng/mL；所述重组人IL-21细胞因子的终浓度为20-60ng/mL；所述Chroman 1的终浓度为20-80nM；所述Emricasan的终浓度为2-8uM；所述Trans-ISRIB的终浓度为0.2-1uM；所述Polyamine Solution的终浓度为2-8ug/mL；
所述动物细胞培养基A包括GMP SCGM培养基、NK/>Basal Medium培养基或X-VIVOTM-15培养基。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述激活培养的时间为4-6天。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，激活培养过程中，激活培养2-3天后，补充激活培养的培养基。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述扩增培养的培养基主要由动物细胞培养基B和添加在动物细胞培养基B中的人AB血清、重组人IL-2细胞因子和重组人IL-15细胞因子组成；所述人AB血清的加入量为动物细胞培养基B体积的2％-10％；所述重组人IL-2细胞因子的终浓度为200-1000IU/mL；所述重组人IL-15细胞因子的终浓度为20-60ng/mL；
所述动物细胞培养基B包括GMP SCGM培养基、NK/>Basal Medium培养基或X-VIVOTM-15培养基。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，扩增培养过程中，每隔1-3天补充扩增培养的培养基。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，扩增培养过程中，维持细胞密度为0.8×106-2.5×106/mL。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，复苏后的冻存脐带血去除冻存液后，于重组人抗CD16单抗包被的培养容器中依次进行激活培养和扩增培养。
8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，复苏冻存脐带血的方法包括：
将冻存脐带血水浴加热至融化，然后与复苏液混合，获得复苏的冻存脐带血。
9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，冻存脐带血中冻存液的去除方法包括：
将复苏后的冻存脐带血离心去上清，然后进行清洗，完成对冻存脐带血中冻存液的去除。
10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述清洗的清洗液包括生理盐水。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202410255808.8A CN118086203A (zh) | 2024-03-06 | 2024-03-06 | 冻存脐带血nk细胞的培养方法 |
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- 2024-03-06 CN CN202410255808.8A patent/CN118086203A/zh active Pending
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