JP6240083B2 - 樹状細胞癌ワクチンのための小分子エンハンサー - Google Patents

Description

関連出願

本出願は、２０１１年１１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／５６２４９７号に優先権の恩恵を主張するものである。

本発明は、樹状細胞癌ワクチンのための小分子エンハンサーに関する。

癌は、米国の二番目の主な死因である。認可された抗癌剤は、化学療法剤と標的剤の両方とも、毒性のために限定されており、癌死亡の８５％超を占める固形腫瘍、例えば、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、および前立腺癌に対しては最終的には効果的でない。体の免疫系を使用して腫瘍を殺すことが、失敗すると癌を出現させるので、長年に亘り、癌研究の目標となってきた。ＰＴ−１００またはタラボスタットとしても知られているＶａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏは、免疫活性化によりマウス内の腫瘍を縮小させる上で著しい有効性を示したジペプチドボロン酸である。しかしながら、ファスト・トラック第３相臨床試験において、その薬剤は、用量制限毒性のために、その目的を達成しなかった。

米国の食品医薬品局は、２０１０年４月２９日に、最初の癌ワクチンに膵臓癌用のＰｒｏｖｅｎｇｅを認可した。Ｐｒｏｖｅｎｇｅは樹状細胞（ＤＣＴ）である；いくつかの心躍る新たな免疫療法の１つは、ときどき、「癌ワクチン」と呼ばれる。免疫系を強化することによって、そのようなワクチンは、原則として、どこに隠れていようと、一番最後の癌を見つけ、取り除き、それゆえ、一連の治療後の単なる小康状態を除外することができる。その概念は今では立証されているが、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ以外のＤＣＴを含む癌ワクチンは、臨床試験において所望の有効性を達成できておらず、免疫促進剤、またはアジュバントを加える必要を示している。

しかしながら、この手法を臨床的に開発するためには、毒性の低いアジュバントが必要とされている。

本発明の１つの態様は、癌を治療する方法であって、その必要のある哺乳類に、複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する化合物を治療に効果的な量、投与する工程を有してなる方法に関する。

本発明の別の態様は、哺乳類における抗腫瘍免疫力を増加させる方法であって、その必要のある哺乳類に、複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する化合物を治療に効果的な量、投与する工程を有してなる方法に関する。

本発明の別の態様は、哺乳類における免疫応答を促進させるまたは増強する方法であって、その必要のある哺乳類に、複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する化合物を治療に効果的な量、投与する工程を有してなる方法に関する。

本発明のさらに別の態様は、異常細胞増殖により特徴付けられる状態を治療する方法であって、その必要のある哺乳類に、複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する化合物を治療に効果的な量、投与する工程を有してなる方法に関する。

本発明の別の態様は、哺乳類におけるサイトカインおよびケモカイン産生を増加させる方法であって、その必要のある哺乳類に、複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する化合物を治療に効果的な量、投与する工程を有してなる方法に関する。

本発明の別の態様は、哺乳類におけるＴ細胞の産生を促進させるまたは増強する方法であって、その必要のある哺乳類に、複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する化合物を治療に効果的な量、投与する工程を有してなり、前記Ｔ細胞が悪性細胞上の抗原を認識するものである方法に関する。

ある実施の形態において、本発明は、前記化合物が式Ｉ：

により表され、式中、
ＸはＢ（Ｙ¹）（Ｙ²）またはＣＮであり；
Ｙ¹およびＹ²は、独立して、ＯＨであるか、もしくはそれらが結合するホウ素原子と一緒に、ボロン酸に加水分解できる基を表し、またはそれらが結合するホウ素原子と一緒に、ボロン酸に加水分解できる５員から８員の環を形成し；
Ｒ¹は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、カルボニル、カルボキシル、エステル、ホルメート、ケトン、チオカルボニル、チオエステル、チオアセテート、チオホルメート、アミノ、アシルアミノ、アミド、ニトロ、スルフェート、スルホネート、スルホンアミド、−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇、−（ＣＨ₂）_m−ＯＨ、−（ＣＨ₂）_m−Ｏ−低級アルキル、−（ＣＨ₂）_m−Ｏ−低級アルケニル、−（ＣＨ₂）_n−Ｏ−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇、−（ＣＨ₂）_m−ＳＨ、−（ＣＨ₂）_m−Ｓ−低級アルキル、−（ＣＨ₂）_m−Ｓ−低級アルケニル、−（ＣＨ₂）_n−Ｓ−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇、アジド、シアノ、イソシアナート、チオシアナート、イソチオシアナート、シアナート、

および

からなる群より選択され；
Ｒ₇は、置換または未置換アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはヘテロ環を表し；
Ｒ₈は、独立して、ハロゲン、−ＣＨ₃、または−（ＣＨ₂）_n−ＣＨ₃を表し；
ｍは、０、１、２、３、４、５、または６であり；
Ｒ²は、ｎ−プロピル、Ｃ₄〜Ｃ₈アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₈アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₈アルキニル、Ｃ₃〜Ｃ₈シクロアルキル、Ｃ₂〜Ｃ₇ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、および天然に存在する疎水性アミノ酸の側鎖からなる群より選択される疎水性基であり；
ｎは、０、１、または２であり；
ｑは、０、１、２、３、または４である、
上述した方法のいずれか１つに関する。

ある実施の形態において、本発明は、前記化合物がｔ−ブチルＧｌｙ−ｂｏｒｏＰｒｏである、上述した方法のいずれか１つに関する。

図１は、Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏ（Ａ−ｂＰ）およびＶａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ（Ｖ−ｂＰ）の両方がプロリルオリゴプロテアーゼを阻害するが、Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏは免疫系を促進しないことを示している。Ｖａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏは強力な免疫促進剤である。 図２は、ＰＴ−１００が初期腫瘍の完全な退縮を生じるが、定着腫瘍の縮退は生じないことを示している。 図３は、ＰＴ−１００＋樹状細胞（ＤＣ）ワクチンが定着腫瘍の縮退を生じることを示している。 図４は、Ｖａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ（図の２０５４）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＧ−ＣＦＳおよびＣＸＣＬ１／ＫＣを促進するが、Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏ（図の２０５４）は促進しないことを示している。Ｇ−ＣＦＳおよびＣＸＣＬ１／ＫＣは、抗癌免疫増強活性のマーカーである。この実験設定と結果が実施例３に記載されている。 図５は、Ａｒｉ−４１７５（図の４１７５−２）が、インビトロのサイトカインの非常に強力な誘導物質であることを示している。この実験設定と結果が実施例３に記載されている。 図６は、Ａｒｉ−４１７５（４１７５−２）が、抗癌免疫増強活性のマーカーである、Ｇ−ＣＦＳおよびＣＸＣＬ１サイトカインを誘導する上で、ＰＴ−１００（２０５４）よりもずっと強力であることを示している。この実験設定と結果が実施例３に記載されている。 図７は、ＡＲＩ−４１７５がＭ３−９−Ｍ ＲＭＳモデルにおける腫瘍の再接種に対して免疫を確立することを示している。この実験設定と結果が実施例４に記載されている。 図８Ａは、ＡＲＩ−４１７５が、横紋筋肉腫（ＲＭＳ）モデルにおいてＤＣワクチンの有効性を増加させて、定着ＲＭＳの成長を阻害することを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに０日目にＲＭＳ細胞を筋肉内注射した。マウスは、実施例１に記載されているように、１０日目に単独皮下ワクチン接種を受け、その後、毎日、１０ｍｇ／ｋｇ（５日間）および５ｍｇ／ｋｇ（１０日間）のＡＲＩ−４１７５、１ｍｇ／ｋｇのＰＴ−１００（１５日間）、またはビヒクルの強制飼養が行われた。 図８Ｂは、ＡＲＩ−４１７５が、横紋筋肉腫（ＲＭＳ）モデルにおいてＤＣワクチンの有効性を増加させて、マウスの生存率を増加させることを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに０日目にＲＭＳ細胞を筋肉内注射した。マウスは、実施例１に記載されているように、１０日目に単独皮下ワクチン接種を受け、その後、毎日、１０ｍｇ／ｋｇ（５日間）および５ｍｇ／ｋｇ（１０日間）のＡＲＩ−４１７５、１ｍｇ／ｋｇのＰＴ−１００（１５日間）、またはビヒクルの強制飼養が行われた。 図９は、実施例１に記載された実験における個々のマウスにおける腫瘍増殖を示している。 図１０は、ＡＲＩ−４１７５（４１７５）が、結腸直腸癌細胞株に対して著しいインビトロ活性を示さないことを示している。４１７５がセツキシマブ（ＣＴＸ）と組み合わされたときでも、活性はない。ＡＲＩ−４１７５およびセツキシマブの抗腫瘍効果は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）により介在されると考えられるので、このことは予測される。 図１１は、ＣＤ１６発現が、ＡＲＩ−４１７５により治療されたヌードマウスから採取したＮＫ細胞上で上方制御されることを示している。 図１２は、ＬＡＭＰ−１（ＣＤ１０７）が、ＡＲＩ−４１７５により治療されたヌードマウスから採取したＮＫ細胞上右で上方制御されることを示している。 図１３Ａは、結腸癌異種移植片のＡＲＩ−４１７５によるインビボ阻害を示しており、単独の、またはセツキシマブ（ＣＴＸ）との組合せのＡＲＩ−４１７５によるＤＬＤ１異種移植片の阻害を示している。 図１３Ｂは、結腸癌異種移植片のＡＲＩ−４１７５によるインビボ阻害を示しており、単独の、またはセツキシマブ（ＣＴＸ）との組合せのＡＲＩ−４１７５によるＨＣＴ−１１６の阻害を示している。 図１４は、ＡＲＩ−４１７５および／またはセツキシマブ（ＣＴＸ）により治療されたＣ５７ＢＩ／６非担癌マウスからの脾細胞の細胞傷害性がＨＣＴ１１６腫瘍細胞に対して増強されることを示している。 図１５は、ＡＲＩ−４１７５がヒトＮＫ細胞上でＣＤ６９を誘導することを示している。示された結果は、１日間のインキュベーション後の２人の健康な提供者からの培養されたヒトＰＢＬに関する。 図１６は、ＡＲＩ−４１７５が、ＰＴ−１００と同じくらい効果的であるが、高用量で毒性が低いことを示している。 図１７のＡおよびＢは、腫瘍感作Ｔ細胞移入に対するアジュバントとして、ＡＲＩ−４１７５は、遅延治療ＲＭＳ Ｍ３−９−Ｍモデルにおける腫瘍縮退を誘導することを示している。 図１８のＡおよびＢは、Ｔａｇｌ^-/-受容者におけるＡＲＩ−４１７５および養子Ｔ細胞移入の併用療法がＲＭＳ Ｍ３−９−Ｍの体積を著しく減少させることを示している。（Ａ）雌のＲａｇ１^-/-マウスは、腫瘍接種から１日後に、ナイーブまたはＲＭＳ感作Ｔ細胞を受けた。（Ｂ）１０日目までに、ＡＲＩ−４１７５で治療したマウスは、生理食塩水で治療したマウスよりも、著しく小さい腫瘍を有した（ナイーブ：ｎ＝５、ｐ＝０．０１５９；刺激：ｎ＝５、ｐ＝０．００７９）。ＡＲＩ−４１７５と組み合わせて腫瘍感作Ｔ細胞で治療したＲａｇ１^-/-マウスは、全体で最も小さい腫瘍を有した。 ＡＲＩ−４１７５は、著しく改善された生存率および減少したＲＭＳ Ｍ３−９−Ｍ体積から明らかなように、ＤＣワクチン接種にとって強力なアジュバントであることを示している。 図２０は、ＳＤラットを使用した最大耐量（ＭＴＤ）研究の結果を示しており、データは、投与の３０分後にとった。 図２１は、ＰＴ−１００およびＡＲＩ−４１７５に関する用量−血漿応答曲線を示している。 図２２は、ＡＲＩ−４１７５の開いた形態対閉じた形態に関する薬物動態データを示している。酸性条件下で、ＡＲＩ−４１７５は、開いた、すなわち線状で存在し；中性または塩基性条件下では、閉じた環化形態が極めて促進される。 図２３−１は、ＲＭＳモデル内の個々のマウスにおける腫瘍増殖を示している。 図２３−２は、図２３−１の続きである。

本発明の１つの態様は、癌を治療する方法であって、その必要のある哺乳類に、複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する化合物を治療に効果的な量、投与する工程を有してなる方法に関する。

本発明の別の態様は、癌を治療する方法であって、その必要のある哺乳類に、複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する化合物を治療に効果的な量、投与する工程を有してなり、その化合物がＶａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏではない方法に関する。

本発明の別の態様は、前記化合物が、ＧＣＳＦおよびＣＸＣＬ１からなる群より選択されるサイトカインの産生を誘導する、上述した方法のいずれか１つに関する。

本発明の別の態様は、前記癌が、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肉腫、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、ＣＮＳ癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭部と頚部の癌、胃癌(gastric cancer)、上皮内腫瘍、腎臓癌(kidney cancer)、喉頭癌、白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、肝臓癌、小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、腎臓癌(renal cancer)、呼吸器系癌、肉腫、皮膚癌、胃癌(stomach cancer)、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、および泌尿器系癌からなる群より選択される、上述した方法のいずれか１つに関する。

他の実施の形態において、癌は、前立腺癌、結腸直腸癌、多発性骨髄腫、および非小細胞性肺癌からなる群より選択される。

ある他の実施の形態において、癌は、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌および前立腺癌からなる群より選択される。

１つの実施の形態において、癌は肺癌である。

別の実施の形態において、癌は非小細胞性肺癌である。

さらに別の実施の形態において、癌は結腸直腸癌である。

ある実施の形態において、癌は乳癌である。

ある他の実施の形態において、癌は膵臓癌である。

別の実施の形態において、癌は前立腺癌である。

ある実施の形態において、癌は転移性である。

本発明の別の態様は、前記哺乳類に、治療に効果的な量の腫瘍感作Ｔ細胞を併用投与する工程をさらに含む、上述した方法のいずれか１つに関する。

ある実施の形態において、腫瘍感作Ｔ細胞は、前記化合物の投与の前に投与される。

ある実施の形態において、腫瘍感作Ｔ細胞は、前記化合物の投与の後に投与される。

ある実施の形態において、腫瘍感作Ｔ細胞は、前記化合物の投与と同時に投与される。

本発明の別の態様は、前記哺乳類に、治療に効果的な量の経口活性腫瘍抗原を併用投与する工程をさらに含む、上述した方法のいずれか１つに関する。

本発明のさらに別の態様は、前記哺乳類に、治療に効果的な量の樹状細胞ワクチンを併用投与する工程をさらに含む、上述した方法のいずれか１つに関する。

本発明のまたさらに別の態様は、アジュバントを投与する工程をさらに含む、上述した方法のいずれか１つに関する。

本発明の別の態様は、前記哺乳類を、外科手術、放射線療法および化学療法からなる群より選択される二次療法で治療する工程をさらに含む、上述した実施の形態のいずれか１つに関する。

１つの実施の形態において、二次療法は外科手術である。

別の実施の形態において、二次療法は放射線療法である。

さらに別の実施の形態において、二次療法は化学療法である。

ある実施の形態において、前記化学療法は、イピリムマブ、ベムラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン硫酸塩、カルボプラチン、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩、エトポシド、エトポシドリン酸塩、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、ヒドロキシ尿素、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、インターフェロン、インターフェロン−α２ａ、インターフェロン−α２ｂ、インターフェロン−αｎ３、インターフェロン−α１ｂ、インターロイキン、イリノテカン、メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、プレドニゾン、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン塩酸塩、タキソール、タキソテレ、テニポシド、トポテカン塩酸塩、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、およびビノレルビン酒石酸塩からなる群より選択される。

ある実施の形態において、化学療法は、ブレオマイシン硫酸塩、カルボプラチン、シスプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、パクリタキセル、タキソール、タキソテレ、ビンブラスチン硫酸塩およびビンクリスチン硫酸塩からなる群より選択される。

ある実施の形態において、化学療法はジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤である。

ある他の実施の形態において、化学療法は、ＦＡＰ活性化化学療法薬、ＦＡＰ活性化ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤、またはＦＡＰ活性化プロテアソーム阻害剤である。

さらにまた他の実施の形態において、化学療法はＦＡＰ活性化プロテアソーム阻害剤である。

ある実施の形態において、化学療法は抗体である。

ある他の実施の形態において、前記抗体は、トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、およびリツキシマブからなる群より選択される。

本発明の１つの態様は、哺乳類における抗腫瘍免疫力を増加させる方法であって、その必要のある哺乳類に、複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する化合物を治療に効果的な量、投与する工程を有してなる方法に関する。

ある実施の形態において、前記化合物はＶａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏではない。

ある他の実施の形態において、前記化合物は、ＧＣＳＦおよびＣＸＣＬ１からなる群より選択されるサイトカインの産生を誘導する。

さらに他の実施の形態において、前記抗腫瘍免疫力は、肺腫瘍、リンパ腫様、乳房の腫瘍、結腸直腸腫瘍、甲状腺腫瘍、子宮腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍および脳腫瘍からなる群より選択される腫瘍に対して増加させられる。

他の実施の形態において、抗腫瘍免疫力は、肺腫瘍、乳房の腫瘍、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍および前立腺腫瘍からなる群より選択される腫瘍に対して増加させられる。

ある他の実施の形態において、抗腫瘍免疫力は抗体依存性細胞傷害を含む。

本発明の別の態様は、哺乳類における免疫応答を促進させるまたは増強する方法であって、その必要のある哺乳類に、複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する化合物を治療に効果的な量、投与する工程を有してなる方法に関する。

ある実施の形態において、前記化合物はＶａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏではない。

ある他の実施の形態において、前記化合物は、ＧＣＳＦおよびＣＸＣＬ１からなる群より選択されるサイトカインの産生を誘導する。

さらに他の実施の形態において、免疫応答が促進される。

またさらに他の実施の形態において、免疫応答が増強される。

ある実施の形態において、免疫応答は抗体依存性細胞傷害を含む。

ある他の実施の形態において、前記哺乳類は、癌を有するか、または癌を発症する恐れがある。

さらに他の実施の形態において、前記哺乳類は癌の小康状態にある。

またさらに他の実施の形態において、前記哺乳類は難治性癌または耐性癌を有する。

本発明の別の態様は、異常細胞増殖により特徴付けられる状態を治療する方法であって、その必要のある哺乳類に、複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する化合物を治療に効果的な量、投与する工程を有してなる方法に関する。

ある実施の形態において、前記化合物はＶａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏではない。

ある実施の形態において、前記化合物は、ＧＣＳＦおよびＣＸＣＬ１からなる群より選択されるサイトカインの産生を誘導する。

ある実施の形態において、前記異常細胞増殖は、癌、血管増殖性疾患または線維性疾患である。

ある実施の形態において、前記異常細胞増殖は異常血管形成である。

本発明の別の態様は、哺乳類におけるサイトカインおよび／またはケモカイン産生を増加させる方法であって、その必要のある哺乳類に、複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する化合物を治療に効果的な量、投与する工程を有してなる方法に関する。

ある実施の形態において、前記化合物はＶａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏではない。

ある他の実施の形態において、前記化合物は、ＧＣＳＦおよびＣＸＣＬ１からなる群より選択されるサイトカインの産生を誘導する。

本発明の別の態様は、哺乳類におけるＴ細胞の産生を促進させるまたは増強する方法であって、その必要のある哺乳類に、複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する化合物を治療に効果的な量、投与する工程を有してなり、前記Ｔ細胞が悪性細胞上の抗原を認識するものである方法に関する。

ある実施の形態において、前記化合物はＶａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏではない。

ある他の実施の形態において、前記化合物は、ＧＣＳＦおよびＣＸＣＬ１からなる群より選択されるサイトカインの産生を誘導する。

ある他の実施の形態において、Ｔ細胞の産生が促進される。

さらに他の実施の形態において、Ｔ細胞の産生が増強される。

またさらに他の実施の形態において、前記悪性細胞は、癌、肉腫、白血病、リンパ腫または骨髄腫である。

ある実施の形態において、前記哺乳類は、霊長類、イヌ、ウマ、ネコまたはウシである。

ある他の実施の形態において、前記哺乳類はヒトである。

ある実施の形態において、前記化合物は、経口または非経口投与される。

ある他の実施の形態において、前記化合物は非経口投与される。

さらに他の実施の形態において、前記化合物は経口投与される。

ある実施の形態において、前記化合物は固形の剤型で投与される。

ある他の実施の形態において、前記固形の剤型は、錠剤、カプセルまたはピルである。

さらに他の実施の形態において、前記固形の剤型は錠剤である。

ある実施の形態において、前記化合物は、用量制限毒性なく、免疫系を促進するのに十分な量で投与される。

ある実施の形態において、本発明は、前記化合物が式Ｉ：

により表され、式中、
ＸはＢ（Ｙ¹）（Ｙ²）またはＣＮであり；
Ｙ¹およびＹ²は、独立して、ＯＨであるか、もしくはそれらが結合するホウ素原子と一緒に、ボロン酸に加水分解できる基を表し、またはそれらが結合するホウ素原子と一緒に、ボロン酸に加水分解できる５員から８員の環を形成し；
Ｒ¹は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、カルボニル、カルボキシル、エステル、ホルメート、ケトン、チオカルボニル、チオエステル、チオアセテート、チオホルメート、アミノ、アシルアミノ、アミド、ニトロ、スルフェート、スルホネート、スルホンアミド、−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇、−（ＣＨ₂）_m−ＯＨ、−（ＣＨ₂）_m−Ｏ−低級アルキル、−（ＣＨ₂）_m−Ｏ−低級アルケニル、−（ＣＨ₂）_n−Ｏ−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇、−（ＣＨ₂）_m−ＳＨ、−（ＣＨ₂）_m−Ｓ−低級アルキル、−（ＣＨ₂）_m−Ｓ−低級アルケニル、−（ＣＨ₂）_n−Ｓ−（ＣＨ₂）_m−Ｒ₇、アジド、シアノ、イソシアナート、チオシアナート、イソチオシアナート、シアナート、

および

からなる群より選択され；
Ｒ₇は、置換または未置換アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはヘテロ環を表し；
Ｒ₈は、独立して、ハロゲン、−ＣＨ₃、または−（ＣＨ₂）_n−ＣＨ₃を表し；
ｍは、０、１、２、３、４、５、または６であり；
Ｒ²は、ｎ−プロピル、Ｃ₄〜Ｃ₈アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₈アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₈アルキニル、Ｃ₃〜Ｃ₈シクロアルキル、Ｃ₂〜Ｃ₇ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、および天然に存在する疎水性アミノ酸の側鎖からなる群より選択される疎水性基であり；
ｎは、０、１、または２であり；
ｑは、０、１、２、３、または４である、
上述した方法のいずれか１つに関する。

ある実施の形態において、ｑは、０、１、または２である。

ある他の実施の形態において、ｑは０である。

さらに他の実施の形態において、ｎは０である。

またさらに他の実施の形態において、ｎは１である。

ある他の実施の形態において、ｎは２である。

ある実施の形態において、ＸはＢ（Ｙ¹）（Ｙ²）である。

ある他の実施の形態において、ＸはＢ（ＯＨ）₂である。

ある実施の形態において、ｎは１であり、ｑは０であり、ＸはＢ（ＯＨ）₂である。

ある実施の形態において、Ｒ²は、ｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、シクロヘキシル、ベンジル、およびナフチルからなる群より選択される。

ある他の実施の形態において、Ｒ²は、ｔ−ブチル、イソブチル、およびペンチルからなる群より選択される。

またさらに他の実施の形態において、Ｒ²はｔ−ブチルである。

ある実施の形態において、Ｒ²は天然に存在する疎水性アミノ酸の側鎖である。

ある他の実施の形態において、Ｒ²は、ロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、フェニルアラニン、またはトリプトファンの側鎖である。

ある実施の形態において、式Ｉの化合物はｔ−ブチルＧｌｙ−ｂｏｒｏＰｒｏである。

ある実施の形態において、Ｘを担持する炭素での立体化学配置はＬである。

ある他の実施の形態において、Ｘを担持する炭素での立体化学配置はＤである。

ある実施の形態において、Ｒ²を担持する炭素での立体化学配置はＬである。

ある他の実施の形態において、Ｒ²を担持する炭素での立体化学配置はＤである。

ある実施の形態において、Ｘを担持する炭素での立体化学配置はＬであり、Ｒ²を担持する炭素での立体化学配置はＬである。

ある他の実施の形態において、Ｘを担持する炭素での立体化学配置はＬであり、Ｒ²を担持する炭素での立体化学配置はＤである。

さらに他の実施の形態において、Ｘを担持する炭素での立体化学配置はＤであり、Ｒ²を担持する炭素での立体化学配置はＬである。

ある実施の形態において、Ｘを担持する炭素での立体化学配置はＤであり、Ｒ²を担持する炭素での立体化学配置はＤである。

「ＤＡＳＨセリンプロテアーゼ」という用語は、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）ＩＶ活性および／またはその構造的同族体を意味する。これらのタンパク質は、それらの共通のポストプロリン開裂セリンジペプチダーゼ機構により結びつけられる酵素である。例えば、元々は静止細胞プロリンジペプチダーゼ（ＱＰＰ）と命名されたＤＰＰ−ＶＩＩは、ＤＡＳＨセリンプロテアーゼである。

ＰＴ−１００またはタラボスタットとしても知られているＶａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏは、マクロファージにおけるカスパーゼ−１の活性化およびＩＬ−１ベータの誘導によって免疫を促進するようであり、これは、次に、マクロファージおよび間質線維芽細胞におけるサイトカインおよびケモカインを上方制御する。細胞内ＤＰＰ８および／または９活性は、マクロファージにおけるＰＴ−１００の関連標的であるようである。この作用機構は、免疫系における細胞内ＤＰＰのこれまで予見できない規制の役目を示す。

第３ブチル（ｔ−ブチルと省略される）Ｇｌｙ−ｂｏｒｏＰｒｏであるＡＲＩ−４１７５は、癌の治療のための樹状細胞ワクチンのアジュバントとしてセリンプロテアーゼのプロリルペプチダーゼファミリーの６つの構成員全てを強力に阻害するジペプチドボロン酸である。ＰＴ−１００と同様に、ＡＲＩ−４１７５はＤＰＰ８／９活性を阻害する。好ましくは、イソロイシン−ｂｏｒｏＰｒｏ、ブチルグリシン−ｂｏｒｏＰｒｏ、フェニルアラニン−ｂｏｒｏＰｒｏ（Ｐｈｅ−ｂｏｒｏＰｒｏ）、およびシクロヘキシルグリシン−ｂｏｒｏＰｒｏ（Ｃｙｇ−ｂｏｒｏＰｒｏ）などの嵩張る疎水性側鎖を有する、他のジペプチドボロン酸は、同様に機能すると予測される。当業者により日常的な実験により、複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害するどの化合物（例えば、式Ｉの化合物）が、請求項に記載された方法にうまく使用できるかが決定できるであろう。

ＰＴ−１００は、腫瘍および所属(draining)リンパ節におけるサイトカイン／ケモカイン上方制御によってマウスにおける腫瘍免疫を活性化させる。癌ワクチンアジュバントとしてのサイトカインの使用は新しくはない：例えば、Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔに関するＧＭ−ＣＳＦおよび開発中のワクチンに関するＩＬ−２およびＩＦＮ−γ。しかしながら、これらの用途と比べて、経口活性のＤＰＰ８／９阻害剤であるＰＴ−１００およびＡＲＩ−４１７５には、腫瘍関連マクロファージおよび間質細胞を誘導して、協働して腫瘍特異的エフェクターＴ細胞を活性化できるサイトカインとケモカインの組合せを生成する利点がある。ＰＴ−１００により上方制御されるサイトカインとケモカインの中で、ＩＬ−１β、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０が特に注目に値する。腫瘍関連マクロファージにより産生されるＩＬ−１βは、炎症性応答を活性化する上と、腫瘍の微環境におけるＴ_h１７細胞の発生を促進する上で極めて重要な役割を果たす。

強力な前臨床抗腫瘍活性および新規の作用機構に基づいて、ＰＴ−１００は、癌におけるヒトの試験に前進し、ＦＤＡによってファスト・トラック指定が許可された。しかしながら、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、転移性黒色腫および非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）の非ランダム化第２相研究における臨床活性のいくつかの徴候にもかかわらず、ＰＴ−１００は、最終的に、ＮＳＣＬＣにおいて極めて重要な第３相試験の目標を達成できなかった。２つの要因が、この失敗に寄与したようである。最も重要なことに、前臨床研究は、マウスにおけるＰＴ−１００の最適な抗腫瘍活性について、腫瘍に対する内因性免疫応答が要求されることを示した。そのような根本的な腫瘍免疫はいずれも第３相で研究した遅延段階のＮＳＣＬＣ患者に残っていることはありそうもなかった。第２に、癌患者における用量制限毒性により、患者間での一貫した免疫促進のために十分に高いＰＴ−１００用量の投与が妨げられるようであった。Fry等による研究は、ＰＴ−１００の作用機構は、癌ワクチンを高めるために使用された場合、臨床的に最も効果的であるべきことを示唆している。ＰＴ−１００が、腫瘍特異的Ｔ細胞を刺激できる適切なワクチンと共に使用した場合、臨床的に成功するかもしれない；しかし、ヒトにおいて臨床的性抗を達成する、毒性の低い類似体を特定することが、本発明の目的である。

単独で、または樹状細胞療法（ＤＣＴ）、トラスツズマブ、セツキシマブ、イピリムマブ、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、または他の癌免疫療法との組合せで、ＡＲＩ−４１７５または複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する他の化合物（例えば、式Ｉの化合物）は、経口活性である小分子であるので、他の癌免疫療法を上回る著しい利点を有する。それらは、困難で高価なＤＣＴまたは抗体治療と類似の免疫活性化を引き起こすが、ずっと容易に投与できる。ＡＲＩ−４１７５および複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼ（例えば、式Ｉの化合物）を阻害する化合物は、それらの種類の最初の「経口活性である腫瘍抗原」である。

多くの患者は、セツキシマブに応答しない、または治療に対する初期応答後に耐性を生じない。これは、患者の免疫系に対して耐性を生じる癌のためである。その免疫応答はまだ存在するが、もはや腫瘍を殺すのに十分に強力ではないか、または腫瘍が免疫系にとって見えなくなる。一例は、悪性結腸直腸癌の約４０％に見つかるＫＲＡＳ突然変異である。近年の臨床試験（Lievre et al., Cancer Res. 2006, 66 (8), 3992）により、ＫＲＡＳ突然変異が、セツキシマブに対する耐性と相関したのに対し、セツキシマブに応答した患者の全てがＫＲＡＳ突然変異を欠如したことが分かった。セツキシマブが臨床応答を生じる分子機構は依然として知られていないが、ＡＲＩ−４１７５による免疫応答の再活性化は、単独で、またはセツキシマブまたは他の免疫療法との組合せで、その免疫応答が腫瘍を殺すのに不十分である患者または難治性癌を有する患者における臨床転帰を改善する。

ＡＲＩ−４１７５または複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する他の化合物（例えば、式Ｉの化合物）を、Ｔ細胞養子免疫伝達療法と組み合わせて使用してもよい。この治療法では、癌細胞を攻撃するためにＴ細胞に基づく細胞傷害反応を使用する。ＡＲＩ−４１７５のアジュバント特性により、腫瘍浸潤リンパ球、またはＴＩＬの投与前の前治療として、または養子細胞移入の投与後の治療後処置として、ＡＲＩ−４１７５を使用することができるであろう。

ＡＲＩ−４１７５（または複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する他の化合物（例えば、式Ｉの化合物））の低い毒性により、ＡＲＩ−４１７５を、その癌が現在小康状態にある癌患者におけるアジュバントとして使用できる。そのような患者は、再発を避けるために増大した抗腫瘍免疫応答から恩恵を受けるであろう。

ＡＲＩ−４１７５および複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する他の化合物（例えば、式Ｉの化合物）が、免疫活性を増加させる受容体拮抗薬である、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））などのＣＴＬＡ４阻害剤と相乗的に機能するであろう。ＣＤ１５２としても知られているこのＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）は、免疫系を下方制御するタンパク質受容体である。ＡＲＩ−４１７５または複数の哺乳類ＤＡＳＨセリンプロテアーゼを阻害する他の化合物（例えば、式Ｉの化合物）は、ＣＤ２８受容体拮抗薬との組合せで、Ｔ細胞の活性を増加させるために類似の様式で機能するであろう。

本発明をここに一般的に説明してきたが、以下の実施例を参照することにより、本発明はより容易に理解されるであろう。それらの実施例は、本発明の特定の態様および実施の形態を説明する目的のためだけに含まれ、本発明を制限することを意図していない。

実施例１
論理的説明、化合物の合成、およびＲＭＳ腫瘍増殖の阻害
ＡＲＩ−４１７５の合成 ＨＡＴＵを使用して、市販のＬ−ｂｏｒｏＰｒｏ−ｐｎ２をＮ−Ｂｏｃ保護非天然アミノ酸Ｂｏｃ−Ｔｌｅ−ＯＨ３（ＣＡＳ Ｎｏ．６２９６５−３５−９）にカップリングさせて、保護されたジペプチドボロン酸塩Ｂｏｃ−Ｔｌｅ−ｂｏｒｏＰｒｏ−ｐｎを生成した。両方の保護基をトリクロロボラン（ＢＣｌ₃）により同時に除去し、その後、逆相ＨＰＬＣ精製によって、ＨＣｌ塩として所望の生成物１（ＡＲＩ−４１７５）を生成した。

ＰＴ−１００の合成 ＰＴ−１００を先に記載したように、以下の実施例に記載される研究にとって十分な量、合成した。

ＡＲＩ−４１７５は、ＰＴ−１００の免疫の作用機構における指定標的であるＤＰＰ８および９（表１）を含む、ＤＰＰ−ＩＶ様セリンプロテアーゼのナノモル阻害剤である。ＤＰＰ−ＩＶおよびＦＡＰ活性の阻害も、ＤＰＰ−ＩＶまたはＦＡＰ活性の選択的抑止が腫瘍増殖を遅延させるようであるので、ＰＴ−１００の抗腫瘍効果に寄与するであろう。

定着ＲＭＳを持っているＣ５７ＢＬ／６マウスを、腫瘍接種後の１０日目にＲＭＳ ＤＣワクチンを後肢に筋肉内ワクチン接種した。ここに記載したように、１０日目以降、各５日間の３周期について、強制飼養によって、ＡＲＩ−４１７５、ＰＴ−１００またはビヒクルを毎日投与した：ＡＲＩ−４１７５、１０ｍｇ／ｋｇ、周期１および５ｍｇ／ｋｇ、周期２および３；ＰＴ−１００、１ｍｇ／ｋｇ、周期１から３。別のマウスの群は、ワクチン接種を受けたが、化合物は受けず、ワクチン接種しなかったマウスの群は、化合物またはビヒクルを受けた。各投与計画において、８匹の複製マウスを治療した。

図８に示されるように、ＡＲＩ−４１７５単独の投与が、腫瘍増殖を著しく遅延させ（図８Ａ）、２５日目までに３／８のマウスにおいて腫瘍の退縮を生じた（図９）。ワクチンとの組合せでは、ＡＲＩ−４１７５は、６／８のマウスにおいて退縮を生じ（図９）、マウスの生存率を著しく増加させた（Ｐ＝０．００４５；図８Ｂ）。対照的に、ＤＣワクチン接種の有無にかかわらず、１ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたＰＴ−１００は、２５日目までに腫瘍の退縮（図２）または腫瘍増殖の著しい阻害（図８Ａ）を生じることができず、腫瘍増殖は、ＰＴ−１００およびワクチンで治療した６匹のマウスの内で２匹でしか減少しなかった（図９）。ＰＴ−１００の１ｍｇ／ｋｇの用量は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける腫瘍免疫の活性化にとって最適であることが以前に示されたが、その用量は、ＰＴ−１００のＭＴＤがＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて〜２ｍｇ／ｋｇであるので、それよりずっと多く増加させることができない。したがって、ＡＲＩ−４１７５の１０／５−ｍｇ／ｋｇの用量の著しいワクチンアジュバント効果は、ＡＲＩ−４１７５がＰＴ−１００よりも毒性が弱いこと、およびより大きい腫瘍退縮およびより高いマウスの生存率を達成するために、ＡＲＩ−４１７５の用量を、ＲＭＳマウスモデルにおいて耐性用量でＰＴ−１００に可能であるよりも増加させられることを示唆している。

実施例２
ＲＭＳ ＤＣ腫瘍ワクチンモデルにおけるＡＲＩ−４１７５の有効性
図１７のＡは、Ｔ細胞供与体およびＴ細胞受容体の初回刺激のための実験設定を示している。図１７のＢは、腫瘍体積曲線（平均±標準偏差）および生存率曲線を示している。ＡＲＩ−４１７５のみを受けたマウスは、生理食塩水と比べて、著しく小さい腫瘍を有した（ｎ＝１０、ｐ＝０．００１９）。ＡＲＩ−４１７５＋刺激したＴ細胞受容体は小さい腫瘍を有したが、ＡＲＩ−４１７５＋ナイーブＴ細胞受容体と比べると、差は有意ではなかった（ｎ＝１０、ｐ＝０．０７５５）。１０匹のＡＲＩ−４１７５＋刺激したＴ細胞受容体の内の８匹は８０日目まで生存したが、これは、ＡＲＩ−４１７５＋ナイーブＴ細胞受容体の４０％の生存率と比べて、有意ではなかった（ｎ＝１０、ｐ＝０．０６５８）。

図１８のＡおよびＢは、Ｒａｇ１^-/-受容体におけるＡＲＩ−４１７５と養子Ｔ細胞移入の併用療法は、ＲＭＳ Ｍ３−９−Ｍの体積を著しく減少させることを示している。（Ａ）雌のＲａｇ１^-/-マウスは、腫瘍接種から１日後に、ナイーブまたはＲＭＳ感作Ｔ細胞を受けた。（Ｂ）１０日目までに、ＡＲＩ−４１７５で治療したマウスは、生理食塩水で治療したマウスよりも、著しく小さい腫瘍を有した（ナイーブ：ｎ＝５、ｐ＝０．０１５９；刺激：ｎ＝５、ｐ＝０．００７９）。ＡＲＩ−４１７５と組み合わせて腫瘍感作Ｔ細胞で治療したＲａｇ１^-/-マウスは、全体で最も小さい腫瘍を有した。

ＡＲＩ−４１７５は、著しく改善された生存率および減少したＲＭＳ Ｍ３−９−Ｍ体積から分かるように、ＤＣワクチン接種にとって強力なアジュバントである（図１９）。図１９のＡは、ＤＣワクチン接種およびＡＲＩ−４１７５治療に関する晩期治療モデルを示している。図１９のＢは、腫瘍体積曲線（平均＋標準偏差）および生存率曲線を示している。ＡＲＩ−４１７５で治療した両方の群は、対照と比べて、著しく改善された生存率を有した（偽ワクチン：ｎ＝７、ｐ＜０．００１、ＤＣワクチン：ｎ＝７、ｐ＜０．００１）。ＡＲＩ−４１７５およびＤＣワクチンを使用した併用治療により治療したマウスは、ＡＲＩ−４１７５単独で治療したマウスと比べて、著しく小さい腫瘍を有した（ｎ＝７、ｐ＝０．０４８１）。

ＲＭＳ細胞株は、悪性ＲＭＳを高い浸透度で発生させる肝細胞増殖因子／散乱係数（ＨＧＦ／ＳＦ）について遺伝子組換えされたＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ^-/-マウスに由来した。ＤＣワクチンは、前述したように、骨髄由来ＤＣをＲＭＳから生成したアポトーシス小体とインキュベーションすることによって調製される。腫瘍増殖は、２日に一度、キャリパー測定した。

実施例３
ＩＬ−１βの誘導、並びにＡｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏ（２２４３）、
Ｖａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ（ＰＴ−１００、２０５４）、および
ｔ−ＢｕＧｌｙ−ｂｏｒｏＰｒｏ（ＡＲＩ−４１７５）による腫瘍および
所属リンパ節におけるサイトカインおよびケモカインの発現の上方制御
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるサイトカインアッセイのための方法 雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、経口強制飼養（ＰＯ）および腹腔内（ＩＰ）注射により、様々な用量のＰＴ−１００またはＡＲＩ−４１７５で治療し、血清をケモカインについて分析した（図４、５、および６）。投与後の様々な時点で心穿刺により血液を採取し、ＥＬＩＳＡによる分析のために血清を調製した。マウスサイトカインＧ−ＣＳＦおよびマウスＣＸＣＬ１について、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社からのＥＬＩＳＡキット（それぞれ、カタログ番号ＭＣＳ００およびＭＫＣ００Ｂ）を使用して、これらのサンプルを分析した。全ての測定は二重に行った。アッセイの範囲内の値を得るために、血清サンプルを必要に応じて希釈した。要求される最適な希釈は、検査薬に応じて様々であり、対照サンプルまたは活性を有さない試験薬についての無希釈から、活性の非常に高いサンプルについての１：１０００の希釈までに及び得る。肯定応答を生じる試験薬について、最強のシグナルが、ＣＸＣＬ１については、投与後２時間で、Ｇ−ＣＳＦについては、投与後６時間で観察された。用量反応は、試験薬により異なるが、２０μｇ／マウスの用量が、反応評価のための許容できる基準用量である。典型的に、各時点で各試験薬について、６匹の動物を測定する。

図４は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、Ｖａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ（２０５４）は、Ｇ−ＣＳＦおよびＣＸＣＬ１／ＫＣを促進したが、Ａｌａ−ｂｏｒｏＰｒｏ（２２４３）は、促進しないことを示している。Ｇ−ＣＳＦおよびＣＸＣＬ１／ＫＣは、抗癌免疫増強活性のマーカーである。

ＡＲＩ−４１７５（図５および６における４１７５−２）は、サイトカインの非常に強力な誘導物質である。Ｇ−ＣＦＳの促進は、投与から６時間後まで増加した；ＣＸＣＬ１は、投与から３時間後に急激に誘導されたが、６時間までに消失した（図５）。ＡＲＩ−４１７５（４１７５−２）は、Ｇ−ＣＳＦおよびＣＸＣＬ１サイトカインを誘導するのに、ＰＴ−１００（２０５４）よりも少なくとも５倍強力である（図６）。ＡＲＩ−４１７５治療マウスからの血清も、ビヒクルと比べて、ＩＬ−１８、ＩＬ−１βおよびＩＦＮ−γを増加させたが、Ｇ−ＣＳＦおよびＣＸＣＬ１よりもずっと低いレベルでしか増加させなかった。

ＰＴ−１００は、担癌マウスに経口投与してから２時間後に、炎症性サイトカインおよびケモカインｍＲＮＡの発現を促進する。このＰＴ−１００反応は、腫瘍およびリンパ節組織におけるＩＬ−１β、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０の上方制御により特徴付けられる。ＡＲＩ−４１７５は、ＩＬ−１７の発生を促進して、インビトロでＴ_h１７細胞を産生することが最近分かった（V.Kuchroo、未公表データ）。Ｔ_h１７細胞は、特定の癌における効果的な抗腫瘍免疫力に寄与するようである；したがって、ＩＬ−１７は、ＲＭＳ−ＤＣワクチン接種マウスへのＡＲＩ−４１７５およびＰＴ−１００の投与後に調査する、ＰＴ−１００に対する反応を特徴付けるサイトカイン／ケモカインパネルと共に含まれる。ＲＮＡ発現は、最適用量での化合物の投与の２時間後に、ＲＭＳ腫瘍および所属リンパ節組織において分析される。Ａ５４９肺癌異種移植片を持つマウスにおけるＰＴ−１００によるサイトカインおよびケモカインの上方制御を分析するために以前に使用したＲＴ−ＰＣＲ手法を使用する。ｃＤＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ（カリフォルニア州、カールズバッド所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により抽出された全ＲＮＡから、ｉＳｃｒｉｐｔキット（カリフォルニア州、ハーキュリーズ所在のＢｉｏｒａｄ社）により合成し、水中で１：１０に希釈し、２Ｘ ｉＱ Ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ社）内で１０−μＭの非標識プライマー対を使用して、サーマルサイクラー（ｃＤＮＡ変性、９５℃／１５秒；アニーリングおよび伸展、６０°／３０秒）内で４０周期に亘り増幅した。反応は、ＨＥＸ、ＦＡＭまたはＴｅｘａｓ Ｒｅｄで５’標識されたＴａｑｍａｎプローブおよびブラックホール消光剤（カリフォルニア州、ナヴァト所在のＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で３’標識されたＴａｑｍａｎプローブを使用する。Ｂｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア（カリフォルニア州、パロアルト所在のＰｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）を使用して、サイトカイン／ケモカイン標的ｍＲＮＡおよび１８ｓ ＲＮＡ基準対照順方向／逆方向プライマー対およびＴａｑｍａｎプローブを設計する。ｍＲＮＡコピー数は、サイズ特徴付け基準ｃＤＮＡに関する標準曲線を使用して、周期閾値から計算される。このｃＤＮＡは、マウス組織ＲＮＡから合成され、増幅され、電気泳動およびゲル精製キット（カリフォルニア州、バレンシア所在のＱｉａｇｅｎ社）によって精製され、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（カリフォルニア州、カールスバッド所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により定量される。

図１１および１２に示されるように、ＡＲＩ−４１７５によるマウスの治療で、ＦｃγＲＩＩＩ受容体、ＣＤ１６および脱顆粒マーカーＬＡＭＰ−１のＮＫ細胞発現が増加した。ヒトＮＫ細胞のインビトロ治療によっても、活性化マーカーのＣＤ６９が増加した（図１５）。ＡＲＩ−４１７５の治療効果は、ある程度は、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）の発現の上昇およびＮＫ細胞の活性化（ＣＤ６９の上方制御に基づく）によるＡＤＣＣの増大によるものであったかもしれない。

実施例４
腫瘍退縮および拒絶が生じる、ワクチン接種したマウスの
腫瘍再接種による免疫記憶
癌の効果的なワクチンには、初期治療に対する臨床反応後に播種性転移または腫瘍再増殖を防ぐことができる免疫記憶を確立するという利点があるであろう。実施例１におけるＲＭＳ ＤＣワクチン接種とそれに続くＡＲＩ−４１７５またはＰＴ−１００治療の後に、筋肉内ＲＭＳ腫瘍が拒絶されるマウスに、原発性腫瘍の拒絶から少なくとも２０〜３０日後に１０×１０⁶のＲＭＳ細胞の筋肉内注射によって、再接種を行った。マウスを、どのような追加の治療処置もせずに、さらに２０〜３０日間に亘り、二次性腫瘍についてモニタした。保護の免疫学的特異性を明らかにするために、マウスにＣ５７ＢＬ／６腫瘍細胞株のＥＬ４（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−３９）も接種する。４匹のマウスの群を免疫記憶について試験した。ＰＴ−１００治療後の腫瘍特異的記憶を明らかにする同様の実験を記載する。

図７に示されるように、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、０日目に１×１０⁶のＲＭＳ Ｍ３−９−Ｍを筋肉内に接種した。マウスに、３〜７、１７〜２１、２４〜２８、および３１〜３５日目に、２００μｇのＡＲＩ−４１７５を経口強制飼養した。腫瘍のない生存マウスに、５６日目に５×１０⁵のＲＭＳ Ｍ３−９−Ｍを再接種し、追加の４１７５治療を行わずにモニタした。再接種後、ＲＭＳ Ｍ３−９−Ｍは、全てのマウスにおいて初期の増殖とそれに続く拒絶を示した（ｎ＝７、ｐ＝０．０１７５）。

実施例５
ＲＭＳ ＤＣワクチン接種マウスにおける腫瘍特異的ＣＴＬの分析
実施例１に記載された、ＲＭＳ ＤＣワクチンおよびＡＲＩ−４１７５またはＰＴ−１００治療を受けたＲＭＳ腫瘍を持つマウスの腫瘍所属リンパ節および脾臓において、ＣＴＬを⁵¹Ｃｒ−放出試験によって、生体外で分析する。この試験は、ＥＬ４腫瘍接種Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＰＴ−１００により促進された腫瘍特異的ＣＴＬ反応の測定について先に記載したように行われる。ＣＴＬの特異性は、ＲＭＳ対ＥＬ４細胞に対する細胞毒性を比較することによって調査される。

実施例６
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＲＩ−４１７５およびＰＴ−１００のＭＴＤ
以前、ＭＴＤ（〜２ｍｇ／ｋｇ／日）を超えた用量でＰＴ−１００が投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、死亡する前に、明白な毒性の兆候は観察されなかった；したがって、ＭＴＤを決定するための端点は、この実験において死亡率であった。毒性の原因を見抜くために、組織病理を調査して、血漿サイトカインおよびケモカインのレベルの用量反応を決定した。サイトカイン／ケモカイン試験を使用して、毒性が、ＰＴ−１００の推定作用機構に関連付けられるか否かを決定した。予備実験は、サイトカイン／ケモカインの阻害は、ＩＬ−１Ｒ拮抗薬であるアナキンラと反応し、ラットにおけるＰＴ−１００の毒性を変えず、ＰＴ−１００の毒性は、系統サイトカイン／ケモカイン産生によるものではないであろうことを示した。

ラット毒性の概要 最大耐量（ＭＴＤ）研究を行って、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（登録商標）ラットにおいて、ＡＲＩ−４１７５（ｔ−ＢｕＧｌｙ−ｂｏｒｏＰｒｏ）およびＰＴ−１００（Ｖａｌ−ｂｏｒｏＰｒｏ、ＡＲＩ−２０５４）のＭＴＤを比較した。これらの動物に、皮下注射（ＳＱ）または経口強制飼養（ＰＯ）のいずれかにより投与を行った。各投与に、６匹の動物を使用した。血液サンプルを、投与の３０分後に尻尾から採血し、これを使用して、血漿薬物濃度を測定した。両方の化合物の出発用量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重であり、次いで、各薬物について、用量を増減により調節して、１００％の生存率の最大用量を決定した。０．０５ｍｇ／ｋｇ体重のＳＱの出発用量で、ＡＲＩ−４１７５およびＰＴ−１００治療の両方とも、最初の２４時間以内で少なくとも１匹の動物が死亡した。０．０１ｍｇ／ｋｇ体重の用量では、ＳＱでは、死には至らず、投与後４８時間に亘り悪影響は観察されなかった。第３の実験は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で行い、これにより、ＡＲＩ−４１７５の群では１匹が死亡したが、ＰＴ−１００の群では死亡しなかった。この研究を、再び０．０５ｍｇ／ｋｇ体重で開始する経口投与について繰り返した。両方の薬物は明らかに、経口投与によってより許容された。何故ならば、０．０５ｍｇ／ｋｇのＰＯで、この実験においては悪影響は観察されなかったからである。用量を０．１ｍｇ／ｋｇのＰＯに増やすと、ＰＴ−１００の群においては２匹が死亡したが、ＡＲＩ−４１７５には悪影響は観察されなかった。０．２５ｍｇ／ｋｇのＡＲＩ−４１７５のＰＯでは、１匹が死亡した。したがって、ＳＱに観察されたＭＴＤは、ＰＴ−１００については０．０２５ｍｇ／ｋｇであり、ＡＲＩ−４１７５については０．０１ｍｇ／ｋｇであった。経口経路では、ＭＴＤは、ＰＴ−１００については０．０５ｍｇ／ｋｇであり、ＡＲＩ−４１７５については０．１ｍｇ／ｋｇであった。血漿薬物濃度の評価は、投与の経路にかかわらず、同等の血漿薬物濃度で毒性結果をを示す。毒性は、１００±５０ｎＭの血漿薬物濃度となる薬物の用量について観察される。このデータが図２０に纏められている。

マウスの毒性血漿対用量の図面 Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、５日間に亘り毎日、４０ｍｇ／ｋｇまでの様々な用量のＡＲＩ−４１７５および１０ｍｇ／ｋｇまでの様々な用量のＰＴ−１００（ＡＲＩ−２０５４）で経口強制飼養により治療した。５日目に、投与前と、投与の３０分後に採血し、血漿薬物濃度をＬＣＭＳによって測定した。１０ｍｇ／ｋｇの用量での血漿濃度から分かるように、ＰＴ−１００の経口利用能は、ＡＲＩ−４１７５のものより３〜４倍大きい。血漿濃度は、試験した範囲に亘る用量に対してほぼ比例する。この実験において生存率は１００％であったが、全ての群は、５日間の治療期間に亘り著しい体重減少を示した。その結果が図２１に示されている。

マウスにおける４１７５のＰＫ 経口強制飼養（ＰＯ）により、腹腔内（ＩＰ）、皮下（ＳＱ）および静脈内（ＩＶ）注射により、薬物の開いた（線状）形態および閉じた（環状）形態の両方で、ＡＲＩ−４１７５の薬物動態学を正常なＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて測定した。この薬物の開いた形態は、ｐＨ２で一晩の室温での薬物のインキュベーションによって調製した。閉じた形態は、ｐＨ７．４（ＰＢＳ中）での一晩のインキュベーションによって調製した。開いた（線状）サンプルは、投与前に、ＰＢＳ中への希釈によって中和した。治療群が下記に列挙されている（表２）。

ＩＶ群を除いた全ての群について、尾静脈から採血した。ＩＶ注射は尾静脈に行い、したがって、血液は、遠位部位（顎下腺）から採取した。血漿サンプルを調製し、各サンプル中のＡＲＩ−４１７５の濃度をＬＣ−ＭＳによって測定した。その結果が図２２に示されている。

実施例７
高まる用量のＡＲＩ−４１７５およびＰＴ−１００を受ける
マウスにおける組織病理の調査
３匹のマウスの群に、ＲＭＳ細胞を筋肉内接種し、実施例１において決定したＭＥＤから、実施例６において決定したＭＴＤまで増加する用量で強制飼養によって、ＰＴ−１００およびＡＲＩ−４１７５を投与した。腫瘍の接種後の１０日目から１４日目に、各化合物の１回の５日周期を与え、１８日目に、腫瘍、所属リンパ節、脾臓、肝臓、肺および腎臓の組織の検体をホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋した。試験マウスからのＨ＆Ｅ染色組織切片を、対照マウスの切片と組織学的に比較する。ＰＴ−１００は、固形腫瘍の白血球浸潤を促進することが示された。腫瘍浸潤は、腫瘍と間質組織の境界で濃縮された好中球により特徴付けられる。ＡＲＩ−４１７５治療マウスからの腫瘍切片を、ＰＴ−１００治療マウスからの切片と比較することにより、ＡＲＩ−４１７５も腫瘍浸潤を促進させるか否かが決定される。ＰＴ−１００の毒性が、非腫瘍組織の白血球浸潤から生じ、臓器不全を生じる炎症反応がもたらされる可能性がある。したがって、ＰＴ−１００およびＡＲＩ−４１７５により治療したマウスにおける白血球の存在について、非腫瘍組織サンプルを調査する。

実施例８
ＩＬ−１受容体欠損マウスを使用した毒性における
全身的なサイトカインの役割の調査
ＰＴ−１００に対するサイトカイン／ケモカインの反応が、ＩＬ−１Ｒ１欠損Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｉｌ１ｒ１^tmlImx／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において抑止されている；したがって、毒性が全身のサイトカイン／ケモカインの活性のためである場合、ＭＴＤは、類似遺伝子型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対してＩＬ−Ｒ１突然変異マウスにおいて、著しく増加しているはずである。したがって、血清Ｇ−ＣＳＦおよびＣＸＣＬ１サイトカインの用量反応がＥＬＩＳＡ（Ｓ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）により比較され、Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｉｌ１ｒ１^tmlImx／Ｊマウス対Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＡＲＩ−４１７５およびＰＴ−１００のＭＴＤが比較される。ＭＴＤは、増加する用量レベルで治療された３匹のマウスの群において決定される。Ｇ−ＣＳＦおよびＣＸＣＬ−１のレベルは、化合物の投与から３時間後と８時間後でサンプリングされた血清中で決定される。ＩＬ−１Ｒ１欠損マウスが毒性に耐性がある場合、および実施例６における病理組織学が非腫瘍組織の白血球浸潤を明らかにする場合、ＩＬ−１Ｒ１欠損マウスおよび十分マウスが病理組織的に比較されて、毒性が臓器機能の炎症性破壊に関連つけられるか否かが決定される。

実施例９
ＫＲＡＳ突然変異結腸直腸癌細胞株におけるＡＲＩ−４１７５の見込みがある
抗腫瘍作用および免疫作用；ＡＲＩ−４１７５のセツキシマブとの併用投与
セツキシマブ（ＣＴＸ）は、多数の悪性腫瘍における効果的な治療薬である。現行のデータは、突然変異Ｋ−ｒａｓを有する結腸直腸癌患者の約４０％がこの薬から恩恵を受けないことを示している。セツキシマブの抗腫瘍効果の可能な機構は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を通じて媒介される。この研究では、単剤として、またはセツキシマブとの併用で、Ｋ−ｒａｓ突然変異結腸直腸癌異種移植片の治療において、ＡＲＩ−４１７５の活性の可能性を調査した。

単独で、またはセツキシマブとの併用のＡＲＩ−４１７５の効果をインビトロとインビボの両方で評価した。インビトロでは、Ｋ−ｒａｓ突然変異結腸癌細胞株のＤＬＤ−１およびＨＣＴ−１１６の増殖を、様々な濃度のＡＲＩ−４１７５またはセツキシマブを含有する培地中での３日間の培養後に検出した（図１０）。ＡＲＩ−４１７５（１０ｎＭ〜２００μＭ）単独でまたはセツキシマブとの併用で、細胞培養においてＤＬＤ−１またはＨＣＴ−１１６いずれにおいても著しい細胞毒性は示さなかった（図１０）。インビボにおいて、ＤＬＤ−１およびＨＣＴ−１１６異種移植片腫瘍を持つヌードマウスを、対照、ＡＲＩ−４１７５単独、セツキシマブ単独およびＡＲＩ−４１７５とセツキシマブの４つの群に無作為に分けた。ＡＲＩ−４１７５は、１００μｇ、１日１回(q.d)または１日２回(b.i.d)、経口投与し、セツキシマブは、毎週２００μｇで腹腔内注射した。腫瘍測定は、毎週２回行った。マウスにおいて、ＤＬＤ−１およびＨＣＴ−１１６腫瘍両方の増殖は、用量依存様式でのＡＲＩ−４１７５の投与によって著しく妨げられた（図１３Ａおよび１３Ｂ）。ＡＲＩ−４１７５のセツキシマブとの併用により、腫瘍サイズはさらに減少したが、おそらく動物の数が少ないために、統計的には有意ではなかった。セツキシマブ単独では、ＨＣＴ−１１６異種移植片にどのような治療効果も示さなかったが、ＤＬＤ−１腫瘍には穏やかな有効性を有した。

実施例１０
ＰＴ−１００およびＡＲＩ−４１７５の薬物動態プロファイルの比較；
２つの化合物の間の他の違い
図１６に示されるように、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに１×１０⁶のＭＢ４９を皮下で投与した。マウスに３〜７および１０〜１４日目に経口強制飼養した。腫瘍体積をキャリパー測定によりモニタした。２０μｇの用量で、ＰＴ−１００およびＡＲＩ−４１７５の両方とも抗腫瘍活性を誘導した。２００μｇでのＡＲＩ−４１７５の投与で、５匹のマウスの内の５匹において完全な退縮を誘導したのに対し、ＰＴ−１００は同じ用量で毒性であった。

ＰＴ−１００およびＡＲＩ−４１７５の間の化学構造の小さな違いにもかかわらず、これら２つの化合物の薬物動態（ＰＫ）プロファイルにおいて予期せぬ大きい違いがある。特に、ＡＲＩ−４１７５の毒性はずっと低い。

引用
ここに挙げられた米国特許および米国特許出願公開の全ては、引用によりここに含まれる。

同等物
当業者には、ただの日常的な実験を使用して、ここに記載された本発明の特定の実施の形態に対する多くの同等物を認識する、または解明できるであろう。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図されている。

Claims (15)

1. 患者において腫瘍細胞に対するＴ細胞免疫を増強するための組成物であって、（ｉ）腫瘍に対するＴ細胞免疫を増強し、および（ｉｉ）Ｇ−ＣＳＦおよびＣＸＣＬ１サイトカインの血清レベルを増加させるために治療的効果量のＤＡＳＨ阻害剤を含み、前記ＤＡＳＨ阻害剤は下記式により表される、組成物。
   

   
2. 前記ＤＡＳＨ阻害剤が、癌ワクチン療法の一部として投与される、請求項１記載の組成物。
3. 前記癌ワクチン療法が樹状細胞ワクチン療法である、請求項２記載の組成物。
4. 前記ＤＡＳＨ阻害剤が、抗体治療の抗体依存性細胞傷害を増強する、請求項１記載の組成物。
5. 前記抗体治療が、トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、およびリツキシマブからなる群より選択される、請求項４記載の組成物。
6. 前記ＤＡＳＨ阻害剤が、１つ以上の化学療法剤と共に投与される、請求項１記載の組成物。
7. 前記１つ以上の化学療法剤が、イピリムマブ、ベムラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン硫酸塩、カルボプラチン、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩、エトポシド、エトポシドリン酸塩、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、ヒドロキシ尿素、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、インターフェロン、インターフェロン−α２ａ、インターフェロン−α２ｂ、インターフェロン−αｎ３、インターフェロン−α１ｂ、インターロイキン、イリノテカン、メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、プレドニゾン、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン塩酸塩、タキソール、タキソテレ、テニポシド、トポテカン塩酸塩、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、およびビノレルビン酒石酸塩からなる群より選択される、請求項６記載の組成物。
8. 前記ＤＡＳＨ阻害剤が、癌、肉腫、白血病、リンパ腫および骨髄腫からなる群より選択される腫瘍に対するＴ細胞免疫を増強する、請求項１記載の組成物。
9. 前記ＤＡＳＨ阻害剤が、肺腫瘍、リンパ腫、乳房の腫瘍、結腸直腸腫瘍、甲状腺腫瘍、子宮腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、腎臓腫瘍、肝臓腫瘍および脳腫瘍からなる群より選択される腫瘍に対するＴ細胞免疫を増強する、請求項１記載の組成物。
10. 前記ＤＡＳＨ阻害剤が、腫瘍細胞の再攻撃に対して免疫記憶を誘導する、請求項１記載の組成物。
11. 前記患者がヒトである、請求項１記載の組成物。
12. 前記ＤＡＳＨ阻害剤が経口投与される、請求項１記載の組成物。
13. 再発を回避するために腫瘍の寛解状態にある患者を治療するための組成物であって、（ｉ）腫瘍に対するＴ細胞免疫を増強し、および（ｉｉ）Ｇ−ＣＳＦおよびＣＸＣＬ１サイトカインの血清レベルを増加させるために治療的効果量のＤＡＳＨ阻害剤を含み、前記ＤＡＳＨ阻害剤は下記式により表される、組成物。
    

    
14. 前記患者がヒトである、請求項１３記載の組成物。
15. 前記ＤＡＳＨ阻害剤が経口投与される、請求項１３記載の組成物。

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