CA2460377A1 - Procede de vaccination therapeutique, peptides mutes de la transcriptase inverse de vih et leur utilisation a des fins de vaccination et en diagnostic - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet un traitement des pathologies infectieuse s et tumorales comprenant une phase de traitement par chimiothérapie anti- infectieuse et/ou anti-tumorale inductrice de mutations de résistance et une phase de vaccination thérapeutique dirigée contre ces mutations de résistanc e et aux agents utilisés dans le cadre de ce traitement. La présente invention a plus particulièrement pour objet des peptides de 8 à 80 acides aminés de la séquence de la transcriptase inverse du VIH et comportant au moins une mutation par rapport à la séquence sauvage de cette enzyme, mutation induite en réponse à des traitements par des analogues nucléosidiques ou non- nucléosidiques de la transcriptase inverse du VIH. La présente invention à également pour objet une composition pharmaceutique ou vaccin à base de ces peptides, afin d'induire une réponse immunitaire spécifique de ces séquences et de renforcer ou prolonger l'efficacité des traitements par des analogues nucléosidiques ou non-nucléosidiques de la transcriptase inverse du VIH. La présente invention à également pour objet des épitopes issus de ces séquence s peptidiques afin d'évaluer la réponse immunitaire spécifique suite à l'injection d'un vaccin.
Description
Procédés de vaccination thérapeutique, peptides mutés de la transcriptase inverse de VIH et leur utilisation à des fins de vaccination et en diagnostic La présente invention a pour objet un traitement des pathologies infectieuses et tumorales comprenant une phase de traitement par chimiothérapie anti-infectieuse et/ou anti-tumorale inductrice de mutations de résistance et une phase de vaccination thérapeutique dirigée contre ces mutations de résistance et aux agents utilisés dans le cadre de ce traitement.
La présente invention a plus particulièrement pour objet des peptides de 8 à
80 acides aminés de la séquence de la transcriptase inverse du VIH et comportant au moins une mutation par rapport à la séquence sauvage de cette enzyme, mutation induite en réponse à des traitements par des analogues nucléosidiques ou non-nucléosidiques de la transcriptase inverse du VIH.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique ou vaccin à base de ces peptides, afin d'induire une réponse immunitaire spécifique de ces séquences mutées et de renforcer ou prolonger l'efficacité des traitements par des analogues nucléosidiques ou non-nucléosidiques de la transcriptase inverse du VIH. .
La présente invention a également pour objet des épitopes issus de ces séquences peptidiques afin d'évaluer la réponse immunitaire spécifique suite à
l'injection d'un vaccin.
L'identification d'un vaccin efficace contre le VIH est capitale. Une immunisation effective serait efficace, abordable au niveau pécuniaire et constituerait une approche à long terme de cette infection. Cependant, l'obstacle le plus grand au développement de vaccins efficaces est la variabilité du VIH. Les données actuelles suggèrent que les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs) sont responsables du contrôle du pic initial de la virémie, de la réplication virale à bas bruit lors de la phase asymptomatique de la maladie, et de l'élimination de la plupart des variants viraux.
La reconnaissance d'un agent infectieux comme étranger suppose que le système immunitaire reconnaisse certaines structures spécifiques étrangères, les
La présente invention a plus particulièrement pour objet des peptides de 8 à
80 acides aminés de la séquence de la transcriptase inverse du VIH et comportant au moins une mutation par rapport à la séquence sauvage de cette enzyme, mutation induite en réponse à des traitements par des analogues nucléosidiques ou non-nucléosidiques de la transcriptase inverse du VIH.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique ou vaccin à base de ces peptides, afin d'induire une réponse immunitaire spécifique de ces séquences mutées et de renforcer ou prolonger l'efficacité des traitements par des analogues nucléosidiques ou non-nucléosidiques de la transcriptase inverse du VIH. .
La présente invention a également pour objet des épitopes issus de ces séquences peptidiques afin d'évaluer la réponse immunitaire spécifique suite à
l'injection d'un vaccin.
L'identification d'un vaccin efficace contre le VIH est capitale. Une immunisation effective serait efficace, abordable au niveau pécuniaire et constituerait une approche à long terme de cette infection. Cependant, l'obstacle le plus grand au développement de vaccins efficaces est la variabilité du VIH. Les données actuelles suggèrent que les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs) sont responsables du contrôle du pic initial de la virémie, de la réplication virale à bas bruit lors de la phase asymptomatique de la maladie, et de l'élimination de la plupart des variants viraux.
La reconnaissance d'un agent infectieux comme étranger suppose que le système immunitaire reconnaisse certaines structures spécifiques étrangères, les
2 antigènes, constituant le non-soi, en les distinguant des structures qui lui appartiennent, constïtuant le soi. Les acteurs de la réaction immunitaire impliquent * les lymphocytes qui sont les cellules effectrices de la réaction immunitaïre.
Ils comprennent les lymphocytes B et T subdivisés en deux sous-populations :
les lymphocytes T CD4+ auxïliaires (Th), coordinateurs des réponses immunes spécifiques, et les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTLs). Ces CTLs sont capables de reconnaître et tuer des cellules infectées par des virus, notamment, avant que le virus ne bourgeonne à la surface de la cellule et ne soit libéré dans le milieu extracellulaire.
* les cellules présentatrices d'antigènes qui capturent les antigènes, les conditionnent et les présentent sous forme immunogène aux lymphocytes T.
* les molécules du CMH (complexe majeur d'histocompatibilité) qui s'expriment à
la surface des cellules et participent à la présentation de l'antigène aux lymphocytes.
Chez l'homme, le CMH est appelé HLA (human leucocyte antigen). Il existe deux classes de molécules du CMH : les molécules de classe I qui sont présentes à
la surface de toutes les cellules nucléées de l'organisme et les molécules de classe II qui ne s'expriment qu'à la surface des cellules présentatrices d'antigènes. Des peptides antigéniques de 8 à 10 acides aminés se fixent dans une niche des molécules du CMH
de classe I, des peptides de 14-15 acides aminés se fixent au CMH de classe II. Leur fixation est déterminée par les forces d'interaction s'établissant entre les acides aminés (essentiellement dans les deux parties terminales) du peptide antigénique et ceux des parois de la niche des molécules HLA. Plus de 200 allèles HLA de classe I
ont à présent été définis au sein des trois familles de gènes HLA de classe I
A, B et C.
Chaque allèle HLA de classe I est sensiblement différent au niveau de la niche peptidique, aussi les peptides pouvant s'y fixer sont également différents. Il existe donc une stricte spécificité dans l'interaction entre peptide et molécule HLA
de classe I. Cette spécificité explique pourquoi même un changement mineur dans la séquence du peptide présenté comme cible peut être suffisant pour rendre ce peptide incapable de se fixer à la molécule HLA de classe I.
* les récepteurs pour l'antigène qui sont fixés dans la membrane des lymphocytes T.
Grâce à ce récepteur, chaque lymphocyte T reconnaît spécifiquement un antigène présenté sur le CMH. Le récepteur pour les lymphocytes T est appelé TCR (T
Cell Receptor). Ce récepteur doit reconnaître en même temps à la surface cellulaire le
Ils comprennent les lymphocytes B et T subdivisés en deux sous-populations :
les lymphocytes T CD4+ auxïliaires (Th), coordinateurs des réponses immunes spécifiques, et les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTLs). Ces CTLs sont capables de reconnaître et tuer des cellules infectées par des virus, notamment, avant que le virus ne bourgeonne à la surface de la cellule et ne soit libéré dans le milieu extracellulaire.
* les cellules présentatrices d'antigènes qui capturent les antigènes, les conditionnent et les présentent sous forme immunogène aux lymphocytes T.
* les molécules du CMH (complexe majeur d'histocompatibilité) qui s'expriment à
la surface des cellules et participent à la présentation de l'antigène aux lymphocytes.
Chez l'homme, le CMH est appelé HLA (human leucocyte antigen). Il existe deux classes de molécules du CMH : les molécules de classe I qui sont présentes à
la surface de toutes les cellules nucléées de l'organisme et les molécules de classe II qui ne s'expriment qu'à la surface des cellules présentatrices d'antigènes. Des peptides antigéniques de 8 à 10 acides aminés se fixent dans une niche des molécules du CMH
de classe I, des peptides de 14-15 acides aminés se fixent au CMH de classe II. Leur fixation est déterminée par les forces d'interaction s'établissant entre les acides aminés (essentiellement dans les deux parties terminales) du peptide antigénique et ceux des parois de la niche des molécules HLA. Plus de 200 allèles HLA de classe I
ont à présent été définis au sein des trois familles de gènes HLA de classe I
A, B et C.
Chaque allèle HLA de classe I est sensiblement différent au niveau de la niche peptidique, aussi les peptides pouvant s'y fixer sont également différents. Il existe donc une stricte spécificité dans l'interaction entre peptide et molécule HLA
de classe I. Cette spécificité explique pourquoi même un changement mineur dans la séquence du peptide présenté comme cible peut être suffisant pour rendre ce peptide incapable de se fixer à la molécule HLA de classe I.
* les récepteurs pour l'antigène qui sont fixés dans la membrane des lymphocytes T.
Grâce à ce récepteur, chaque lymphocyte T reconnaît spécifiquement un antigène présenté sur le CMH. Le récepteur pour les lymphocytes T est appelé TCR (T
Cell Receptor). Ce récepteur doit reconnaître en même temps à la surface cellulaire le
3 peptide antigénique et la molécule du CMH. On dit que la reconnaissance est restreinte par le CMH.
* les marqueurs CD (cluster de différentiation) qui sont des molécules dont la présence sur la membrane cellulaire identifie une cellule. Ainsi, les Th portent le marqueur CD4 et sont encore appelés CD4+ et les CTLs qui portent le marqueur CD8 sont appelés CD8+. Les lymphocytes CD8+ reconnaissent leur antigène sur le CMH de classe I ; les lymphocytes CD4+ sur le CMH de classe II.
* La présentation des séquences antigéniques par les cellules présentatrices d'antigènes est un des facteurs déterminants de l'efficacité d'un vaccin. Elle peut être amplifiée par certains composés naturels ou de synthèse, les adjuvants, tels que des lipides (acides gras, phospholipides, adjuvant de Freund), des copolymères anioniques, des motifs CpG... D'autres molécules telles que les cytokines (interleukines, interférons, TNF (tumor necrosis factors), TGF (transforming growth factors...) et chimiolcines sont impliquées dans la régulation de la maturation, l'activation, la prolifération et la différentiation des cellules du système immunitaire, et jouent un rôle majeur dans la moléculation de l'efficacité vaccinale.
L'infection par le VIH est une infection du système immunitaire en ce sens que ce virus infecte électivement les lymphocytes CD4+ et les cellules présentatrices d'antigènes et détruit progressivement le système immunitaire, généralement en ans. Certaines personnes infectées depuis plus de 20 ans et qui n'ont jamais été
traitées par des thérapies antirétrovirales ont pourtant une charge virale très basse (ou sous la limite de détection) et présentent des réponses CTLs spécifiques du virus très importantes, dirigées contre des épitoges restreints aux molécules HLA de classe I.
L'intensité et la diversité de ces réponses CTL au VIH ont pu être corrélées au contrôle de la réplication virale, suggérant le rôle capital joué par ces CTLs dans ces défenses immunes .
Les séquences peptidiques du VIH cibles des CTLs ont été définies pour la majorité des protéines du VIH. Ces cibles diffèrent selon les individus, en fonction des molécules HLA de classe I exprimées à la surface des cellules d'un individu donné.
L'échappement du virus au contrôle exercé par le système immunitaire est la cause principale de l'inefficacité de ces réponses. La variation virale dans les épitoges des CTLs pourrait jouer un rôle primordial dans l'échec du systeme immunitaire à
* les marqueurs CD (cluster de différentiation) qui sont des molécules dont la présence sur la membrane cellulaire identifie une cellule. Ainsi, les Th portent le marqueur CD4 et sont encore appelés CD4+ et les CTLs qui portent le marqueur CD8 sont appelés CD8+. Les lymphocytes CD8+ reconnaissent leur antigène sur le CMH de classe I ; les lymphocytes CD4+ sur le CMH de classe II.
* La présentation des séquences antigéniques par les cellules présentatrices d'antigènes est un des facteurs déterminants de l'efficacité d'un vaccin. Elle peut être amplifiée par certains composés naturels ou de synthèse, les adjuvants, tels que des lipides (acides gras, phospholipides, adjuvant de Freund), des copolymères anioniques, des motifs CpG... D'autres molécules telles que les cytokines (interleukines, interférons, TNF (tumor necrosis factors), TGF (transforming growth factors...) et chimiolcines sont impliquées dans la régulation de la maturation, l'activation, la prolifération et la différentiation des cellules du système immunitaire, et jouent un rôle majeur dans la moléculation de l'efficacité vaccinale.
L'infection par le VIH est une infection du système immunitaire en ce sens que ce virus infecte électivement les lymphocytes CD4+ et les cellules présentatrices d'antigènes et détruit progressivement le système immunitaire, généralement en ans. Certaines personnes infectées depuis plus de 20 ans et qui n'ont jamais été
traitées par des thérapies antirétrovirales ont pourtant une charge virale très basse (ou sous la limite de détection) et présentent des réponses CTLs spécifiques du virus très importantes, dirigées contre des épitoges restreints aux molécules HLA de classe I.
L'intensité et la diversité de ces réponses CTL au VIH ont pu être corrélées au contrôle de la réplication virale, suggérant le rôle capital joué par ces CTLs dans ces défenses immunes .
Les séquences peptidiques du VIH cibles des CTLs ont été définies pour la majorité des protéines du VIH. Ces cibles diffèrent selon les individus, en fonction des molécules HLA de classe I exprimées à la surface des cellules d'un individu donné.
L'échappement du virus au contrôle exercé par le système immunitaire est la cause principale de l'inefficacité de ces réponses. La variation virale dans les épitoges des CTLs pourrait jouer un rôle primordial dans l'échec du systeme immunitaire à
4 contenir le virus. Une mutation unique dans un épitope défini reconnu par un CTL
peut en effet suffire pour supprimer la reconnaissance CTL, ou pour bloquer la fixation du peptide sur la molécule de classe I, ou en altérant des résidus essentiels aux interactions avec le TCR. La séquence de l'enzyme Transcriptase Inverse du VIH
étant hautement conservée entre les différents sous-types de virus, celle-ci est une cible privilégiée des réponses immunitaires de type CTL : 80 % des patients testés présentent une réponse CTL dirigée contre la transcriptase inverse correspondant à
VIH-1.
Un grand nombre de vaccins contre le VIH ont été élaborés et testés. Ces vaccins incluent des protéines recombinantes du VIH, des peptides synthétiques, des vecteurs recombinants viraux ou bactériens, des vaccins de type ADN nu. Plus de 60 essais cliniques de phase I sur une trentaine de candidats vaccins spécifiques du type B du VIH qui est le sous-type le plus fréquent aux Etats-Unis et en Europe ont été
réalisés ou sont en cours. La plupart de ces essais se sont focalisés sur la protéine d'enveloppe du VIH. Cependant, les protéines recombinantes testées induisent rarement des CTLs CD8+ qui reconnaissent et tuent les cellules infectées par VIH.
De plus, les isolats du VIH de type I présentent un degré de diversité
génétique intense au niveau de l'enveloppe virale qui peut influer sur certains aspects du cycle biologique comme l'infectivité, la transmissibilité ou fimmunogénicité.
Les traitements du sida utilisent des molécules capables de bloquer une ou plusieurs étapes du cycle du virus sans altérer pour autant le bon fonctionnement des cellules de l'hôte. Les autres protéines structurales (la capside virale et la transcriptase inverse, notamment) ainsi que les protéines régulatrices, plus conservées que l'enveloppe virale, constituent aujourd'hui les cibles privilégiées des stratégies de vaccination préventive.
* La transcriptase inverse (RT pour reverse transcriptase), polymérase virale qui catalyse la synthèse d'ADN viral à partir du génome ARN est une cible de choix des traitements antirétroviraux. Des analogues non hydrolysables de nucléosides (NRTI) comme notamment l'AZT (zidovudine), DDI (didanosine), DDC
(zalcitabine), 3TC (lamivudine), ABC (abacavir), D4T (stavudine) ...
constituent la famille des inhibiteurs de la RT les plus utilisés à ce jour. Sous forme triphosphorylée, ils entrent en compétition avec les nucléosides naturels lors de la synthèse de l'ADN et entraînent la terminaison de son élongation. Une autre famille d'inhibiteurs de l'étape de transcription inverse, les inhibiteurs non nucléosidiques de l'enzyme (NNRTI), ne nécessite pas de phosphorylation pour être active et agit vraisemblablement par inhibition allostérique. Les plus connus sont la Névirapine, la Delavirdine ou l'Efavirenz.
* La protéase du VTH constitue l'autre cible principale des traitements anti-
peut en effet suffire pour supprimer la reconnaissance CTL, ou pour bloquer la fixation du peptide sur la molécule de classe I, ou en altérant des résidus essentiels aux interactions avec le TCR. La séquence de l'enzyme Transcriptase Inverse du VIH
étant hautement conservée entre les différents sous-types de virus, celle-ci est une cible privilégiée des réponses immunitaires de type CTL : 80 % des patients testés présentent une réponse CTL dirigée contre la transcriptase inverse correspondant à
VIH-1.
Un grand nombre de vaccins contre le VIH ont été élaborés et testés. Ces vaccins incluent des protéines recombinantes du VIH, des peptides synthétiques, des vecteurs recombinants viraux ou bactériens, des vaccins de type ADN nu. Plus de 60 essais cliniques de phase I sur une trentaine de candidats vaccins spécifiques du type B du VIH qui est le sous-type le plus fréquent aux Etats-Unis et en Europe ont été
réalisés ou sont en cours. La plupart de ces essais se sont focalisés sur la protéine d'enveloppe du VIH. Cependant, les protéines recombinantes testées induisent rarement des CTLs CD8+ qui reconnaissent et tuent les cellules infectées par VIH.
De plus, les isolats du VIH de type I présentent un degré de diversité
génétique intense au niveau de l'enveloppe virale qui peut influer sur certains aspects du cycle biologique comme l'infectivité, la transmissibilité ou fimmunogénicité.
Les traitements du sida utilisent des molécules capables de bloquer une ou plusieurs étapes du cycle du virus sans altérer pour autant le bon fonctionnement des cellules de l'hôte. Les autres protéines structurales (la capside virale et la transcriptase inverse, notamment) ainsi que les protéines régulatrices, plus conservées que l'enveloppe virale, constituent aujourd'hui les cibles privilégiées des stratégies de vaccination préventive.
* La transcriptase inverse (RT pour reverse transcriptase), polymérase virale qui catalyse la synthèse d'ADN viral à partir du génome ARN est une cible de choix des traitements antirétroviraux. Des analogues non hydrolysables de nucléosides (NRTI) comme notamment l'AZT (zidovudine), DDI (didanosine), DDC
(zalcitabine), 3TC (lamivudine), ABC (abacavir), D4T (stavudine) ...
constituent la famille des inhibiteurs de la RT les plus utilisés à ce jour. Sous forme triphosphorylée, ils entrent en compétition avec les nucléosides naturels lors de la synthèse de l'ADN et entraînent la terminaison de son élongation. Une autre famille d'inhibiteurs de l'étape de transcription inverse, les inhibiteurs non nucléosidiques de l'enzyme (NNRTI), ne nécessite pas de phosphorylation pour être active et agit vraisemblablement par inhibition allostérique. Les plus connus sont la Névirapine, la Delavirdine ou l'Efavirenz.
* La protéase du VTH constitue l'autre cible principale des traitements anti-
5 retroviraux qui utilisent des inhibiteurs de l'enzyme tels que le Ritonavir, le Saquinavir, l'Indinavir...
Les thérapies antirétrovirales actuelles combinent généralement plusieurs classes et incluent un ou plusieurs inhibiteurs de transcriptase inverse.
Cependant, ces traitements ne peuvent éradiquer le virus et la réplication résiduelle qui persiste au cours de ces traitements, même les plus actifs, permet la sélection au cours du temps de mutations dans le gène de la transcriptase inverse. Certaines de ces mutations confèrent au virus muté la capacité de résister à l'action inhibitrice de ces médicaments. Ainsi de nombreuses mutations affectent en particulier la séquence de la transcriptase inverse (incluant des changements dans le site actif de l'enzyme), favorisant ainsi l'émergence de virus variants résistants aux familles des NRTI ou des NNRTI dans un délai de un à douze mois de traitement. L'accumulation de ces mutations au cours du temps chez des patients traités par ces médicaments aboutit à
la sélection de virus multirésistants et conduit à des échecs thérapeutiques.
Il a été montré dans la demande de brevet W099/51750 qu'un traitement à la Lamivudine induit des mutations ponctuelles dans le site catalytique de la transcriptase inverse de VIH. Cette mutation ponctuelle est située dans le site de reconnaissance du peptide par le TCR. En conséquence, les CTLs du patient traité qui reconnaissaient un épitoge sauvage n'étaient plus capables de reconnaître un épitoge muté.
Les dernières estimations montrent que, sur les 85 % de patients atteints de VIH traités par au moins un inhibiteur de transcriptase inverse dans les pays occidentaux, 50 % d'entre eux conservent une virémie détectable et sont considérés comme étant en échec thérapeutique. Ceci est associé à l'existence d'au moins une mutation de résistance à ces inhibiteurs et se traduit par une augmentation de la charge virale et une diminution des lymphocytes T CD4+. De plus, 10 % des patients récemment contaminés, mais non encore traités, le sont par de nouvelles souches virales porteuses des mutations de résistance aux traitements antirétroviraux.
De nombreuses études ont montré que les thérapies antivirales ultérieures par des molécules de la même classe ont alors une efficacité moindre sur ces virus résistants.
Les thérapies antirétrovirales actuelles combinent généralement plusieurs classes et incluent un ou plusieurs inhibiteurs de transcriptase inverse.
Cependant, ces traitements ne peuvent éradiquer le virus et la réplication résiduelle qui persiste au cours de ces traitements, même les plus actifs, permet la sélection au cours du temps de mutations dans le gène de la transcriptase inverse. Certaines de ces mutations confèrent au virus muté la capacité de résister à l'action inhibitrice de ces médicaments. Ainsi de nombreuses mutations affectent en particulier la séquence de la transcriptase inverse (incluant des changements dans le site actif de l'enzyme), favorisant ainsi l'émergence de virus variants résistants aux familles des NRTI ou des NNRTI dans un délai de un à douze mois de traitement. L'accumulation de ces mutations au cours du temps chez des patients traités par ces médicaments aboutit à
la sélection de virus multirésistants et conduit à des échecs thérapeutiques.
Il a été montré dans la demande de brevet W099/51750 qu'un traitement à la Lamivudine induit des mutations ponctuelles dans le site catalytique de la transcriptase inverse de VIH. Cette mutation ponctuelle est située dans le site de reconnaissance du peptide par le TCR. En conséquence, les CTLs du patient traité qui reconnaissaient un épitoge sauvage n'étaient plus capables de reconnaître un épitoge muté.
Les dernières estimations montrent que, sur les 85 % de patients atteints de VIH traités par au moins un inhibiteur de transcriptase inverse dans les pays occidentaux, 50 % d'entre eux conservent une virémie détectable et sont considérés comme étant en échec thérapeutique. Ceci est associé à l'existence d'au moins une mutation de résistance à ces inhibiteurs et se traduit par une augmentation de la charge virale et une diminution des lymphocytes T CD4+. De plus, 10 % des patients récemment contaminés, mais non encore traités, le sont par de nouvelles souches virales porteuses des mutations de résistance aux traitements antirétroviraux.
De nombreuses études ont montré que les thérapies antivirales ultérieures par des molécules de la même classe ont alors une efficacité moindre sur ces virus résistants.
6 PCT/FRO1/02872 Une stratégie thérapeutique alternative est aujourd'hui proposée afin de limiter la toxicité et le coût de ces traitements au long cours. Il s'agit de stimuler les réponses immunitaires au VIH chez les patients traités en associant à ces traitements une immunisation anti-VIH par les candidats vaccins disponibles afin d'interrompre à
terme les traitements. Des essais cliniques de phase I et II, utilisant des composés vaccinaux dirigés contre les séquences consensus de référence des virus non mutés, sont en cours.
La demanderesse a découvert un traitement des pathologies infectieuses et tumorales comprenant une phase de traitement par chimiothérapie anti-infectieuse et/ou anti-tumorale inductrice de mutations de résistance et une phase de vaccination thérapeutique dirigée contre ces mutations de résistance.
La demanderesse a découvert plus particulièrement que certaines séquences de la transcriptase inverse sites de mutations ponctuelles et standardisées survenant au cours de divers traitements par des NRTI et/ou NNRTI, sont en fait capables de provoquer l'ïnduction de CTLs spécifiques capables de reconnaître ces mutations. On a démontré ex vivo, par des méthodes de type ELISPOT, l'existence de cellules CD8+
(de l'ordre de 50 à 500 cellules spécifiques par million de cellules mononucléées sanguines) dirigées contre plusieurs mutations de la transcriptase inverse induites par les NRTI, telles que la mutation 41, 74, 184.... au sein des cellules mononucléées sanguines du sang périphérique de patients infectés, traités et porteurs de ces mutations. Cette réponse immune peut donc se mettre en place au cours de ces traitements mais semble incapable d'assurer à elle seule l'élimination des variants spécifiques. L'amplification de l'immunité dirigée contre ces mutations permettra de contrôler l'émergence de ces variants de VIH et de maintenir une suppression virale durable sous ces traitements. L'administration de vaccins contenant ces séquences virales mutées de la transcriptase inverse, avant ou au cours de l'administration de traitements par NRTI ou NNRTI devrait permettre de prévenir, retarder ou diminuer l'apparition de virus mutés capables de résister à ces traitements. Ce nouveau type d'immunisation thérapeutique vise ainsi à renforcer ou à prolonger l'efficacité des traitements antirétroviraux par les NRTI etlou NNRTI. Ceci peut être secondairement appliqué à d'autres mutations induites par les autres classes d'antirétroviraux et peut également être utilisé en vaccination préventive.
terme les traitements. Des essais cliniques de phase I et II, utilisant des composés vaccinaux dirigés contre les séquences consensus de référence des virus non mutés, sont en cours.
La demanderesse a découvert un traitement des pathologies infectieuses et tumorales comprenant une phase de traitement par chimiothérapie anti-infectieuse et/ou anti-tumorale inductrice de mutations de résistance et une phase de vaccination thérapeutique dirigée contre ces mutations de résistance.
La demanderesse a découvert plus particulièrement que certaines séquences de la transcriptase inverse sites de mutations ponctuelles et standardisées survenant au cours de divers traitements par des NRTI et/ou NNRTI, sont en fait capables de provoquer l'ïnduction de CTLs spécifiques capables de reconnaître ces mutations. On a démontré ex vivo, par des méthodes de type ELISPOT, l'existence de cellules CD8+
(de l'ordre de 50 à 500 cellules spécifiques par million de cellules mononucléées sanguines) dirigées contre plusieurs mutations de la transcriptase inverse induites par les NRTI, telles que la mutation 41, 74, 184.... au sein des cellules mononucléées sanguines du sang périphérique de patients infectés, traités et porteurs de ces mutations. Cette réponse immune peut donc se mettre en place au cours de ces traitements mais semble incapable d'assurer à elle seule l'élimination des variants spécifiques. L'amplification de l'immunité dirigée contre ces mutations permettra de contrôler l'émergence de ces variants de VIH et de maintenir une suppression virale durable sous ces traitements. L'administration de vaccins contenant ces séquences virales mutées de la transcriptase inverse, avant ou au cours de l'administration de traitements par NRTI ou NNRTI devrait permettre de prévenir, retarder ou diminuer l'apparition de virus mutés capables de résister à ces traitements. Ce nouveau type d'immunisation thérapeutique vise ainsi à renforcer ou à prolonger l'efficacité des traitements antirétroviraux par les NRTI etlou NNRTI. Ceci peut être secondairement appliqué à d'autres mutations induites par les autres classes d'antirétroviraux et peut également être utilisé en vaccination préventive.
7 L'invention consiste donc en un traitement des pathologies infectieuses et/ou tumorales.
L'invention consiste également en les agents de traitement utilisés dans le cadre de ce traitement.
L'invention a également pour objet la préparation d'immunogènes contenant les mutations de résistance aux NRTI et/ou NNRTI.
Plus particulièrement, l'invention consiste en la préparation d'immunogènes contenant les mutations de résistance à un ou des NNRTI utilisés seuls ou conjointement avec un ou des NRTI.
L'invention a également pour objet les peptides éléments des immunogènes.
Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle comprend au moins un peptide tel que défini, dispersé
dans des excipients pharmaceutiquement acceptables, cette composition étant utilisée à titre de vaccin.
Un autre objet de l'invention est la détermination d'épitopes reconnus par les CTLs spécifiques des séquences peptidiques vaccinales introduites à la vaccination, utilisables à visée diagnostique.
Le procédé de traitement des pathologies infectieuses et/ou tumorales comporte une phase de traitement par chimiothérapie anti-infectieuse et/ou anti-tumorale inductrice de mutations de résistance et une phase de vaccination thérapeutique dirigée contre ces mutations de résistance. De préférence la phase de vaccination suit la phase de traitement par chimiothérapie.
La présente invention concerne également un agent de traitement des pathologies infectieuses et/ou tumorales qui comprend au moins deux composants - le premier composant comprenant un médicament destiné au traitement des pathologies infectieuses edou anti-tumorales inducteur de mutations de résistance, - le second composant comportant un vaccin dirigé contre ces mutations de résistance, les deux composants étant destinés à une utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans le temps.
La présente invention a également pour objet des peptides de 8 à 80 acides aminés de la séquence de la transcriptase inverse de VIH comportant au moins une mutation par substitution et/ou par insertion simple ou multiple par rapport aux ô
séquences établies de la transcriptase inverse, en l'absence de tout traitement, mutation observée à la suite d'un traitement aux NRTI et/ou NNRTI, les peptides étant caractérisés par le fait qu'ils sont capables d'induire une réponse médiée par les lymphocytes T spécifiques de cette séquence mutée de la transcriptase inverse de VIH, à l'exception des peptides de séquence Zl-Y-V-D-D-Zz, Zl-Y-I-D-D-Z~ et Zl-Y-L-D-D-Z2 avec Zl et ZZ étant au moins un acide aminé quelconque, ces peptides ayant été observés à la suite d'un traitement à la lamivudine seule (NRTI).
En particulier, l'invention a pour objet de préférence des peptides de 8 à 80 acides aminés de la séquence de la transcriptase inverse de VIH comportant au moins une mutation par substitution et/ou par insertion simple ou multiple par rapport aux séquences établies de la transcriptase inverse, en l'absence de tout traitement, mutation observée à la suite d'un traitement aux NNRTI seuls ou à la suite d'un traitement combinant NNRTI et NRTI, les peptides étant caractérisés par le fait qu'ils sont capables d'induire une réponse médiée par les lymphocytes T spécifiques de cette séquence mutée de la transcriptase inverse de VIH.
De préférence, les peptides selon l'invention comportent de 15 à 50 acides aminés.
Les séquences des peptides selon l'invention peuvent être précédées ou suivies d'acides aminés neutres pouvant solubiliser ou stabïliser les peptides.
Les peptides selon l'invention sont caractérisés par les séquences ou parties de séquence comportant au moins une des mutation Mp suivantes avec Xn étant un acide aminé correspondant à celui décrit dans la banque de données de Los Alamos à
la même position de la séquence peptidique de la transcriptase inverse de VIH-1, et n étant la position d'un acide aminé décrit dans la banque de données de Los Alamos dans la séquence de la transcriptase inverse de VIH-1, et avec Mp étant un acide aminé muté et p étant le numéro de la mutation observée.
* Séquence A
aa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 X X X X X Ml X X X X X X X X X
dans laquelle M1 (aa 6) peut être muté en K, G ou S ;
* Séquence B
aa 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 X X X X X X
dans laquelle M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S;
M3 (aa 41) peut être X41 ou être muté en L;
l'un au moins de M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M2 (aa 39) peut être muté en A, K, N, P, M
ou S;
M3 (aa 41) peut être X41 ou être muté en L;
* Séquence C
aa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 X X X X X X X X X X X X X X X
X X X X X X
dans laquelle M1 (aa 6) peut être X6 ou être muté en K, G ou S ;
M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S ;
M3 (aa 41) peut être X4lou être muté en L ;
l'un au moins de M1, M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, Ml (aa 6) peut être X6 ou être muté en K, G
ouS;
M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S ;
M3 (aa 41) peut être X4lou être muté en L ;
avec M1 ou M2 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence D
aa X X X X
dans laquelle M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
5 M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
10 M11 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
l'un au moins de M4 à M12 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
M11 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
l'un au moins de M4, M7 ou M12 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence E
aa X X X
dans laquelle M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
Ml l (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
M13 (aa 88) peut être X88 ou être muté en C;
M14 (aa 89) peut être X89 ou être muté en G ;
M15 (aa 90) peut être X90 ou être muté en I;
M16 (aa 98) peut être X98 ou être muté en G ou S;
M17 (aa 100) peut être X100 ou être muté en I;
M18 (aa 101) peut être X101 ou être muté en E, Q, R, I ou P;
M19 (aa 103) peut être X103 ou être muté en N, Q, R, T ou S;
M20 (aa 106) peut être X106 ou être muté en A, I ou L;
M21 (aa 108) peut être X108 ou être muté en I;
M22 (aa 115) peut être X115 ou être muté en F;
M23 (aa 116) peut être X116 ou être muté en Y;
M24 (aa 119) peut être X119 ou être muté en S;
l'un au moins de M4 à M24 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M4 (aa 62) peut étre X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
M11 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
M13 (aa 88) peut être X88 ou être muté en C;
M14 (aa 89) peut être X89 ou être muté en G ;
M15 (aa 90) peut être X90 ou être muté en I;
M16 (aa 98) peut être X98 ou être muté en G ou S;
M17 (aa 100) peut être X100 ou être muté en I;
M18 (aa 101) peut étre X101 ou être muté en E, Q, R, I ou P;
M19 (aa 103) peut être X103 ou être muté en N, Q, R, T ou S;
M20 (aa 106) peut être X106 ou être muté en A, I ou L;
M21 (aa 108) peut être X108 ou être muté en I;
M22 (aa 115) peut être X115 ou être muté en F;
M23 (aa 116) peut être X116 ou être muté en Y;
M24 (aa 119) peut être X119 ou être muté en S;
l'un au moins de M4, M7, M12 à M21, M23 ou M24 représentant un acide aminé
portant une mutation.
* Séquence F
aa 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 X X X X X X X X
dans laquelle M25 (aa 138) peut être X138 ou être muté en A, G, K ou Q;
M26 (aa 139) peut être X139 ou être muté en I, M ou K;
M27 (aa 141) peut être X141 ou être muté en E ;
M28 (aa 151) peut être X151 ou être muté en M;
M29 (aa 157) peut être X157 ou être muté en S ;
l'un au moins de M25 à M29 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M25 (aa 138) peut être X138 ou être muté en A, G, K ou Q;
M26 (aa 139) peut être X139 ou être muté en I, M ou K;
M27 (aa 141) peut être X141 ou être muté en E ;
M28 (aa 151) peut être X151 ou être muté en M;
M29 (aa 157) peut être X157 ou être muté en S ;
l'un au moins de M25 à M28 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence G
aa X X X X X X X
dans laquelle M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M , L, ou F
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M30 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M , L, ou F
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M30, M33, M35 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence H
aa dans laquelle M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M, L, ou F;
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
l'un au moins de M30 à M34 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M, L, ou F;
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
l'un au moins de M30; M32 ou M33 représentant un acide aminé portant une mutation.
* SéquenceI
aa 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 dans laquelle M34 (aa184) peut être X184 dans laquelle M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
5 M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M34 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, 10 M34 (aa184) peut être X184 dans laquelle M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M35 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence J
aa 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 X X X X X X
dans laquelle M38 (aa 208) peut être X208 ou être muté en Y;
M39 (aa 210) peut être X210 ou être muté en W;
M40 (aa 211) peut être X211 ou être muté en K, A, E, N, D, G ou Q;
M41 (aa 214) peut être X214 ou être muté en L ou F;
M42 (aa 215) peut être X215 ou être muté en Y, F ou C;
M43 (aa 219) peut être X219 ou être muté en Q, E N, R, T ou W;
M44 (aa 223) peut être X223 ou être muté en Q;
M45 (aa 225) peut être X225 ou être muté en H;
M46 (aa 227) peut être X227 ou être muté en L;
M47 (aa 228) peut être X228 ou être muté en R, H ou F;
M48 (aa 233) peut être X233 ou être muté en V ou N;
M49 (aa 234) peut être X234 ou être muté en I, H ou P;
M50 (aa 236) peut être X236 ou être muté en M, S ou L;
M51 (aa 238) peut être X238 ou être muté en T ou S;
M52 (aa 240) peut être X240 ou être muté en A, D ou I;
l'un au moins de M38 à M52 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M38 (aa 208) peut être X208 ou être muté en Y;
M39 (aa 210) peut être X210 ou être muté en W;
M40 (aa 211) peut être X211 ou être muté en K, A, E, N, D, G ou Q;
M41 (aa 214) peut être X214 ou être muté en L ou F;
M42 (aa 215) peut être X215 ou être muté en Y, F ou C;
M43 (aa 219) peut être X219 ou être muté en Q, E N, R, T ou W;
M44 (aa 223) peut être X223 ou être muté en Q;
M45 (aa 225) peut être X225 ou être muté en H;
M46 (aa 227) peut être X227 ou être muté en L;
M47 (aa 228) peut être X228 ou être muté en R, H ou F;
M48 (aa 233) peut être X233 ou être muté en V ou N;
M49 (aa 234) peut être X234 ou être muté en I, H ou P;
M50 (aa 236) peut être X236 ou être muté en M, S ou L;
M51 (aa 238) peut être X238 ou être muté en T ou S;
M52 (aa 240) peut être X240 ou être muté en A, D ou I;
l'un au moins de M38, M40, M44 à M52 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence K
aa 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 X X X X
dans laquelle M53 (aa 333) peut être muté en E ou D;
De préférence les peptides selon l'invention sont caractérisés par les séquences ou parties de séquence suivantes comportant au moins une des mutations Mp suivantes:
* Séquence A bis:
dans laquelle Ml (aa 6 - wt=E) peut être muté majoritairement en K, ou en G ou S ;
* Séquence B bis G K I S K I
dans laquelle M2 (aa 39- wt=T) peut être X39 ou être muté majoritairement en A, ou en K, ou N, ou P, ou M ou S;
M3 (aa 41- wt=M) peut être X41 ou être muté majoritairement en L;
l'un au moins de M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M2 (aa 39) peut être muté en A, K, N, P, M
ou S;
M3 (aa 41) peut être X41 ou être muté en L;
* Séquence C bis M D G P K V K Q W P L T E E K
K I S K I G
dans laquelle M1 (aa 6- wt=E) peut être muté majoritairement en K,ou en G ou S
;
M2 (aa 39- wt=T) peut être X39 ou être muté majoritairement en A, ou en K, ou N, ou P,ouMouS;
M3 (aa 41- wt=M) peut être X4lou être muté majoritairement en L ;
l'un au moins de Ml, M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M1 (aa 6) peut être X6 ou être muté en K, G
ouS;
M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S ;
M3 (aa 41 ) peut être X41 ou être muté en L ;
avec M1 ou M2 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence D bis R T Q D
dans laquelle M4 (aa 62- wt=A) peut être X62 ou être muté majoritairement en V;
M5 (aa 65- wt=K) peut être X65 ou être muté majoritairement en R;
M6 (aa 67- wt=D) peut être X67 ou être muté majoritairement en N ou G;
M7 (aa 68- wt=S) peut être X68 ou être muté majoritairement en G ou N ;
M8 (aa 69- wt=T) peut être X69 ou être muté majoritairement en D, ou en N, ou S, ou A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70- wt=K) peut être X70 ou être muté majoritairement en R, ou en N, ou E
ou S;
M10 (aa 74- wt=L) peut être X74 ou être muté majoritairement en V ou en I;
M11 (aa 75- wt=V) peut être X75 ou être muté majoritairement en M, ou en I, ou L
ou T;
M12 (aa 77- wt=F) peut être X77 ou être muté majoritairement en L;
l'un au moins de M4 à M12 représentant un acide aminé portant une mutation Dans un mode préféré de l'invention, M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
M11 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
l'un au moins de M4, M7 ou M12 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence E bis K Y T
dans laquelle M4 (aa 62- wt=A) peut être X62 ou être muté majoritairement en V;
M5 (aa 65- wt=K) peut être X65 ou être muté majoritairement en R;
M6 (aa 67- wt=D) peut être X67 ou être muté majoritairement en N ou en G;
M7 (aa 68- wt=S) peut être X68 ou être muté majoritairement en G ou en N ;
M8 (aa 69- wt=T) peut être X69 ou être muté majoritairement en D, ou en N, ou S, ou A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70- wt=K) peut être X70 ou être muté majoritairement en R, ou en N, ou E
ou S;
M10 (aa 74- wt=L) peut être X74 ou être muté majoritairement en V ou en I;
M11 (aa 75- wt=V) peut être X75 ou être muté majoritairement en M, ou en I, ou L
5 ou T;
M12 (aa 77- wt=F) peut être X77 ou être muté majoritaïrement en L;
M13 (aa 88- wt=W) peut être X88 ou être muté majoritairement en C;
M14 (aa 89- wt=E) peut être X89 ou être muté majoritairement en G ;
M15 (aa 90- wt=V) peut être X90 ou être muté majoritairement en I;
10 M16 (aa 98- wt=A) peut être X98 ou être muté majoritairement en S ou en G;
M17 (aa 100- wt=L) peut être X100 ou être muté majoritairement en I;
M18 (aa 101- wt=K) peut être X101 ou être muté majoritairement en E, ou en Q, ou R, ou I ou P;
M19 (aa 103- wt=K) peut être X103 ou être muté en N, majoritairement Q, ou en R, 15 ouTouS;
M20 (aa 106- wt=V) peut être X106 ou être muté majoritairement en A, ou en I
ou L;
M21 (aa 108- wt=V) peut être X108 ou être muté majoritairement en I;
M22 (aa 115- wt=Y) peut être X115 ou être muté majoritairement en F;
20 M23 (aa 116- wt=F) peut être X116 ou être muté majoritairement en Y;
M24 (aa 119- wt=P) peut être X119 ou être muté majoritairement en S;
l'un au moins de M4 à M24 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
M11 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
M13 (aa 88) peut être X88 ou être muté en C;
M14 (aa 89) peut être X89 ou être muté en G ;
M15 (aa 90) peut être X90 ou être muté en I;
M16 (aa 98) peut être X98 ou être muté en G~ ou S;
M17 (aa 100) peut être X100 ou être muté en I;
M18 (aa 101) peut être X101 ou être muté en E, Q, R, I ou P;
M19 (aa 103) peut être X103 ou être muté en N, Q, R, T ou S;
M20 (aa 106) peut être X106 ou être muté en A, I ou L;
M21 (aa 108) peut être X108 ou être muté en I;
M22 (aa 115) peut être X115 ou être muté en F;
M23 (aa 116) peut être X116 ou être muté en Y;
M24 (aa 119) peut être X119 ou être muté en S;
l'un au moins de M4, M7, M12 à M21, M23 ou M24 représentant un acide aminé
portant une mutation.
* Séquence F bis I F Q S S M T K
dans laquelle M25 (aa 138- wt=E) peut être X138 ou être muté majoritairement en A, ou en G, ou K ou Q;
M26 (aa 139- wt=T) peut être X139 ou être muté majoritairement en I, ou en M
ou K;
M27 (aa 141- wt=G) peut être X141 ou être muté majoritairement en E ;
M28 (aa 151- wt=Q) peut être X151 ou être muté majoritairement en M;
M29 (aa 157- wt=P) peut être X157 ou être muté majoritairement en S ;
l'un au moins de M25 à M29 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M25 (aa 138) peut être X138 ou être muté en A, G, K ou Q;
M26 (aa 139) peut être X139 ou être muté en I, M ou K;
M27 (aa 141) peut être X141 ou être muté en E ;
M28 (aa 151) peut être X151 ou être muté en M;
M29 (aa 157) peut être X157 ou être muté en S ;
l'un au moins de M25 à M28 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence G bis Q N P D
L E I G Q H R
dans laquelle M30 (aa 172- wt=R) peut être X172 ou être muté majoritairement en K;
M31 (aa 178- wt=I) peut être X178 ou être muté majoritairement en M, L ou en F;
M32 (aa 179- wt=V) peut être X179 ou être muté majoritairement en I, ou en L, ou D ou E;
M33 (aa 181- wt=Y) peut être X181 ou être muté majoritairement en C ou en I;
M34 (aa 184- wt=M) peut être X184 ou être muté majoritairement en V, ou en I
ou T;
M35 (aa 188- wt=Y) peut être X188 ou être muté majoritairement en L, ou en C
ou H;
M36 (aa 189- wt=V) peut être X189 ou être muté majoritairement en I;
M37 (aa 190- wt=G) peut être X190 ou être muté majoritairement en A, ou en S, ou E, ou Q ou T;
l'un au moins de M30 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M , L, ou F
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M30, M33, M35 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence H bis S
dans laquelle M30 (aa 172- wt=R) peut être X172 ou être muté majoritairement en K;
M31 (aa 178- wt=I) peut être X178 ou être muté majoritairement en M, ou en L ;
M32 (aa 179- wt=V) peut être X179 ou être muté majoritairement en I, ou en L, ou D ou E;
M33 (aa 181- wt=Y) peut être X181 ou être muté majoritairement en C ou en I;
M34 (aa 184- wt=M) peut être X184 ou être muté majoritairement en V, ou en I
ou T;
l'un au moins de M30 à M34 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M, L, ou F;
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
l'un au moins de M30; M32 ou M33 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence I bis R
dans laquelle M34 (aa 184- wt=M) peut être X184 ou être muté majoritairement en V, ou en I ou T;
dans laquelle M35 (aa 188- wt=Y) peut être X188 ou être muté majoritairement en L, ouenCouH;
M36 (aa 189- wt=V) peut être X189 ou être muté majoritairement en I
M37 (aa 190- wt=G) peut être X190 ou être muté majoritairement en A, ou en S, ou E, ou Q ou T;
l'un au moins de M34 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M34 (aa184) peut être X184 dans laquelle M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M35 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence J bis I V L P E IC
dans laquelle M38 (aa 208- wt=H) peut être X208 ou être muté majoritairement en Y;
M39 (aa 210- wt=L) peut être X210 ou être muté majoritairement en W;
M40 (aa 211- wt=R) peut être X211 ou être muté majoritairement en K, ou en A, ou E, ou N, ou D, ou G ou Q;
M41 (aa 214- wt=F ou L) peut être X214 ou être muté majoritairement en L ou en F;
M42 (aa 215- wt=T) peut être X215 ou être muté majoritairement en Y, ou en F
ou C;
M43 (aa 219- wt=K) peut être X219 ou être muté majoritairement en Q, ou en E, ou N, ou R, ouT ou W;
M44 (aa 223- wt=K) peut être X223 ou être muté majoritairement en Q;
M45 (aa 225- wt=P) peut être X225 ou être muté majoritairement en H;
M46 (aa 227- wt=F) peut être X227 ou être muté majoritairement en L;
M47 (aa 228- wt=L) peut être X228 ou être muté majorïtairement en R, ou en H
ou 5 F;
M48 (aa 233- wt=E) peut être X233 ou être muté majoritairement en V, ou en N
M49 (aa 234- wt=L) peut être X234 ou être muté majoritairement en I, ou en H
ou P;
M50 (aa 236- wt=P) peut être X236 ou être muté majoritairement en M, ou en S
ou 10 L;
M51 (aa 238- wt=K) peut être X238 ou être muté majoritairement en T ou en S;
M52 (aa 240- wt=T) peut être X240 ou être muté majoritairement en A, ou en D
ou I;
l'un au moins de M38 à M52 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M38 (aa 208) peut être X208 ou être muté en Y;
M39 (aa 210) peut être X210 ou être muté en W;
M40 (aa 211) peut être X211 ou être muté en K, A, E, N, D, G ou Q;
M41 (aa 214) peut être X214 ou être muté en L ou F;
M42 (aa 215) peut être X215 ou être muté en Y, F ou C;
M43 (aa 219) peut être X219 ou être muté en Q, E N, R, T ou W;
M44 (aa 223) peut être X223 ou être muté en Q;
M45 (aa 225) peut être X225 ou être muté en H;
M46 (aa 227) peut être X227 ou être muté en L;
M47 (aa 228) peut être X228 ou être muté en R, H ou F;
M48 (aa 233) peut être X233 ou être muté en V ou N;
M49 (aa 234) peut être X234 ou être muté en I, H ou P;
M50 (aa 236) peut être X236 ou être muté en M, S ou L;
M51 (aa 238) peut être X238 ou être muté en T ou S;
M52 (aa 240) peut être X240 ou être muté en A, D ou I;
l'un au moins de M38, M40, M44 à M52 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence K bis Y Q I Y
dans laquelle M53 (aa 333- wt=G) peut être muté majoritairement en E ou en D.
L'invention porte également sur une composition pharmaceutique à base d'au moins un peptide, dispersé dans des excipients pharmaceutiquement acceptables, pour leur utilisation à titre de vaccin.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut également comporter en plus, des immunomodulateurs tels que des cytolcines ou des chimiokines.
On peut ajouter dans la composition pharmaceutique selon l'invention, des adjuvants tels que des lipides (acides gras, phospholipides, adjuvant incomplet de Freund notamment), des copolymères anioniques, des motifs CpG......
Dans un mode de réalisation de l'invention, au moins un peptide selon l'invention entre dans la composition d'un lipopeptide ou d'une lipoprotéine.
En effet, l'association d'un peptide à une séquence d'acides gras ou de phospholipides permet d'observer une potentialisation de la réponse immunogène par rapport à celle entraînée par l'administration de l'antigène seul.
Le ou les peptides selon l'invention peuvent être couplés à des micro ou nano particules constituées d'un noyau polysaccharidique et/ou recouverts notamment d'une bicouche lipidique. Ils peuvent également être couplés à un ou des liposomes ou un ou des niosomes.
Le ou les peptides selon l'invention peuvent être exprimés dans un virus recombinant, ou un vecteur viral recombinant, ou dans un virus atténué ou inactivé.
Le ou les peptides selon l'invention peuvent être exprimés dans une bactérie recombinante ou dans un vecteur bactérien recombinant.
Le ou les peptides selon l'invention peuvent être exprimés dans une cellule présentatrice d'antigène.
Un autre objet de l'invention est un vaccin comportant au moins un ADN nu ou un ARN nu codant au moins un peptide selon l'invention.
Un autre objet de l'invention est que l'agent de traitement des malades infectés par le VIH, comporte au moins deux compositions, la première composition comprenant au moins un médicament de la famille des NRTI et/ou NNRTI, et la seconde composition comportant au moins un peptide selon l'invention. Ces compositions sont destinées à une application séquentielle, séparée ou non dans le temps ou simultanée.
Préférentiellement, l'agent de traitement des malades infectés par le VIH, comporte au moins deux compositions, la première composition comprenant au moins un médicament de la famille des NNRTI, et la seconde composition comportant au moins un peptide selon l'invention.
Un autre objet de l'invention est un procédé de prévention ou traitement d'une infection par le virus VIH. Ce procédé consiste en l'induction d'une réponse immunitaire de type T spécifique en réponse à l'administration d'un vaccin selon l'invention. De préférence, la ou les mutations du virus VIH se situent dans l'enzyme transcriptase inverse.
Un autre objet de l'invention est des séquences peptidiques de 8 à 20 acides aminés, reconnues en tant que séquences épitopiques par les cellules T
spécifiques des séquences peptidiques correspondant préalablement à la vaccination introduites à
la vaccination.
Les séquences épitopiques selon l'invention sont des séquences peptidiques de 8 à 20 acides aminés contigus choisies dans les séquences peptidiques de A
à K
possédant au moins une mutation Mp. Préférentiellement, ces séquences peptidiques sont constituées de 8 à 10 acides aminés contigus choisis dans les séquences peptidiques de A à K possédant au moins une mutation Mp. Plus préférentiellement, les séquences épitopiques selon l'invention sont constituées de 9 acides aminés contigus choisis dans les séquences peptidiques de A à K possédant au moins une mutation Mp.
Les séquences épitopiques possédant les caractéristiques énoncées, sont utilisables pour la détermination et la quantification des cellules T
spécifiques de ces séquences épitopiques.
L'invention a également pour objet une composition diagnostique de détermination des cellules T spécifiques de ces séquences épitopiques caractérisée par le fait qu'elle comprend, entre autres, au moins une séquence épitopique selon l'invention.
Les vaccins obtenus selon les procédés de l'invention peuvent être formulés en tant que compositions pharmaceutiques pour une administration sous-cutanée, intramusculaire intra-dermale ou intra-veineuse. Les techniques d'administration de ce type de vaccins sont abondamment décrites dans la littérature et sont bien connues de l'homme du métier.
Des excipïents acceptables au niveau pharmaceutique peuvent être ajoutés en fonction de la technique d'administration utilisée. On pourra en particulier ajouter des excipients aqueux telle qu'une solution saline tampon. Ces solutions sont stériles et dépourvues de substances toxiques ou pyrogènes.
Les compositions selon l'invention peuvent être stérilisées par des méthodes de stérilisation conventionnelles et connues.
Selon le mode d'administration, les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous toutes les formes habituellement utilisées en diagnostic.
Les compositions selon l'invention peuvent en particulier contenir des substances acceptables au niveau pharmaceutique telles que des stabilisateurs de pH, des agents tampon ou par exemple de l'acétate de sodium, du chlorure de sodium, de potassium, de calcium, du lactate de sodium ou d'autres afin d'être dans des conditions physiologiques.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter aucunement.
Exemple 1 : Génération des lignées CTLs Les conséquences de mutations induites sous NRTI sur les réponses CTL
spécifiques de la RT ont été étudiées. Un total de 66 échantillons sanguins provenant de patients traités ou non en mono- ou bi-thérapie avec des NRTI, sans inhibiteur de protéase, a été collecté pendant 1 à 6 ans chaque année entre 1991 et 1996.
Pour analyser la reconnaissance des produits des gènes pol et rt du virus VIH-30 1, des lignées VIH-spécifiques ont été générées par co-culture des PBMC
(peripheral blond mononuclear cens) de patients et de PHA-blastes autologues. Des PBMC
stimulés avec de la PHA (phytohémagglutinine) à 2 ~,g/ml pendant 18h à
37°C en atmosphère humide à 5 % de C02 et irradiés à 5000 rads sont ajoutés à des PBMC
autologues fraîchement décongelés à un ratio de 1 :5 et déposés dans des plaques de 24 puits à la concentration de 1x106 /ml. Les lignées CTLs sont cultivées pendant au moins 3 semaines en présence d'Interleukine 2 à 20 U/ml, ajoutée au troisième jour de la culture et ensuite tous les 3 jours. Ces lignées sont testées pour leur activité
cytotoxique après au moins 3 semaines de culture contre des lignées autologues B-EBV
(Lymphocytes B transformés par fEBV) servant de cibles.
On a mis en oeuvre le même procédé en ce qui concerne les mutations induites sous traitement aux NNRTI ou sous traitement conjoint aux NNRTI et NRTI.
Exemple 2 : Test CTL
L'activité CTL a été mesurée en utilisant un test de relargage de 5lChrome.
Les cellules cibles sont des lignées B-EBV autologues infectées par les différents virus recombinants de la vaccine exprimant le gène pol ou des fragments du gène pol du VIH-1, à une multiplicité d'infection de 5 PFU (Plaque Forming Unit) /
cellule, 18h avant le test CTL. Le virus de la vaccine sauvage non recombiné (Vac-WT) sert de contrôle. Les cellules cibles sont incubées en culot en présence de Na251Cr04 (activité
spécifique 2mci/ml), à la concentration de 70 ,uci/x106 cellules, pendant 2 h à 37°C. La radioactivité mesurée est calculée selon la formule suivante : (relargage expérimental -relargage spontané / (relargage total - relargage spontané) X 100 = % de lyse spécifique. Les réponses CTL sont considérées comme positives lorsque l' on obtient plus de 10% de lyse spécifique, ceci à au moins 2 rapports effecteurs/ cibles successifs.
L'analyse de la reconnaissance des régions RT-1 : 1-143 et RT-2 : 143-293 s'est faite sur des lignées CTL spécifiques de Pol. Les réponses T
cytotoxiques ont été
évaluées en utilisant un test de relargage de chrome 51. Les cellules cibles étaient des lignées-B-EBV autologues infectées par des virus de la vaccine exprimant différents fragments de gènes de la Yt (RT-1 : 1-143 et RT-2 : 143-293).
Exemple 3 : Détection des mutations de résistance Les mutations de résistance ont été détectées dans l'ADN proviral en utilisant un test LiPA VIH-1 RT (Murex. Diagnostics SA, Châtillon, France). Ce test permet la détection simultanée des séquences de type "sauvage" et des mutations de résistance (41, 69, 70, 74, 184, 214 et 215) induites par les inhibiteurs nucléosidiques de la RT
(NRTI). Ä partir de l'ADN isolé des PBMC, une amplification du gène de la rt est réalisée en utilisant des amorces biotinylées, l'ADN biotinylé est ensuite hybridé avec des sondes oligo-nucléotidiques spécifiques immobilisées en lignes parallèles sur une bandelette. L' addition de streptavidine marquée à la phosphatase alcaline entraîne une 5 liaison de celle-ci avec les hybrides biotinylés formés qui conduit à la formation d'un précipité violet /brun. Les séquences sauvages et mutées de la rt localisées au niveau des différents codons peuvent être localisées au niveau de la même bandelette.
Exemple 4 : Test ELISpot Pour la reconnaissance de peptïdes épitopiques, un test ELISpot-IFNy où les PBMC étaient incubés, sans stimulation préalable, avec le peptide d'intérêt a été utilisé.
Les 96 puits d'une plaque de type Immobilon p (Millipore, Molsheim, France) sont recouverts pendant 18h à 4°C avec un anticorps de capture anti-IFN~y (interféron 'y) monoclonal (IgGl B-B 1 à l,ug/ml Diaclone, Besançon, France). Après 3 lavages, les PBMC sont ajoutés en triplicata à la concentration de 1x105 et 5x104 cellules par puits en présence de 5 ,ug/ml de peptide ou de 0,5 ~,g/ml de PHA, utilisé comme témoin positif ou de milieu seul utilisé comme témoin négatif. Les plaques sont ensuite incubées pendant 40h à 37°C en atmosphère humide à 5 % de C02, puis lavées, l'anticorps de détection anti-IFN~y monoclonal biotinylé (B-G1 à 0,2 ~.g/ml Diaclone, Besançon, France) est ensuite ajouté et les plaques sont de nouveau incubées pendant 4h à 37°C. Après les lavages, la streptavidine marquée à la phosphatase alcaline (Amersham, Les Ulis, France) est ajoutée et la plaque est incubée pendant 1h à
37°C.
La plaque est ensuite lavée puis incubée avec du BCIP/NTP (Sigma, Aldrich, Saint Quentin, France), des spots violets apparaissent après 10 à 15 min. La plaque est lavée avec de l'eau pour arrêter la réaction. Les spots sont comptés à l'aide d'un lecteur ELISpot automatique. Le nombre de cellules T spécifiques répondeuses est calculé
après soustraction des valeurs du contrôle négatif. La fréquence de cellules sécrétant de l'IFNy est rendue en SFC (Spot Forming Cells).
Exemple N°5 : Découpage de la séauence B (aa 30-50) en différents peptides de longueur variant entre 8 et 21 acides aminés.
Les séquences peptidiques sont découpées en peptides de 8 à 80 acides aminés (aa) impliquant n'importe quelle partie de la séquence recouvrant au moins une mutation , ceci pour des applications thérapeutiques ou diagnostiques.
Pour la séquence peptidique 30-50 où M2 correspond à l'aa 39 muté (A) et M3 correspond à l'aa 41 muté (L):
aa 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 K I K A L V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 8 aa:
aa 32-39 3233 34 3536 37 3839 K A L V E I C A
aa 33-40 3334 35 3637 38 3940 A L V E I C A E
aa 34-41 3435 36 3738 39 4041 L V E I C A E L
aa 35-42 3536 37 3839 40 4142 V E I C A E L E
aa 36-43 3637 38 3940 41 4243 E I C A E L E K
aa 37-44 3738 39 4041 42 4344 I C A E L E K E
aa 38-45 3839 40 4142 43 4445 C A E L E K E G
aa 39-46 3940 41 4243 44 4546 A E L E K E G K
aa 40-47 4041 42 4344 45 4647 E L E K E G K I
aa 41-48 4142 43 4445 46 4748 L E K E G K I S
* Séquences de 9 aa:
aa 31-39 31 32 33 34 35 36 37 38 39 I K A L V E I C A
aa 32-40 32 33 34 35 36 37 38 39 40 K A L V E I C A E
aa 33-41 33 34 35 36 37 38 39 40 41 A L V E I C A E L
aa 34-42 34 35 36 37 38 39 40 41 42 L V E I C A E L E
aa 35-43 35 36 37 38 39 40 41 42 43 V E I C A E L E K
aa 36-44 36 37 38 39 40 41 42 43 44 E I C A E L E K E
aa 37-45 37 38 39 40 41 42 43 44 45 I C A E L E K E G
aa 38-46 38 39 40 41 42 43 44 45 46 C A E L E K E G K
aa 39-47 39 40 41 42 43 44 45 46 47 A E L E K E G K I
aa 40-48 40 41 42 43 44 45 46 47 48 E L E K E G K I S
aa 41-49 41 42 43 44 45 46 47 48 49 L E K E G K I S K
* Séquences de 10 aa:
aa 30-39 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 K I K A L V E I C A
aa 31-40 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 I K A L V E I C A E
aa 32-41 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 K A L V E I C A E L
aa 33-42 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 A L V E I C A E L E
aa 34-43 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 L V E I C A E L E K
aa 35-44 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 V E I C A E L E K E
aa 36-45 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 E I C A E L E K E G
aa 37-46 3738 39 4041 42 4344 4546 I C A E L E K E G K
aa 38-47 3839 40 4142 43 4445 4647 C A E L E K E G K I
A E L E K E G K I S
aa 40-49 4041 42 4344 45 4647 4849 E L E K E G K I S K
aa 41-50 4142 43 4445 46 4748 4950 L E K E G K I S K I
* Séquences de 11 aa:
aa 30-40 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 K I K A L V E I C A E
aa 31-41 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 I K A L V E I C A E L
aa 32-42 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 K A L V E I C A E L E
aa 33-43 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 A L V E I C A E L E K
aa 34-44 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 L V E I C A E L E K E
aa 35-45 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 V E I C A E L E K E G
aa 36-46 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 E I C A E L E K E G K
aa 37-47 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 I C A E L E K E G K I
aa 38-48 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 C A E L E K E G K I S
aa 39-49 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 A E L E K E G K I S K
aa 40-50 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 E L E K E G K I S K I
* Séquences de 12 aa:
aa 30-41 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 K I K A L V E I C A E L
aa 31-42 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 I K A L V E I C A E L E
aa 32,-43 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 K A L V E I C A E L E K
aa 33-44 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 A L V E I C A E L E K E
aa 34-45 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 L V E I C A E L E K E G
aa 35-46 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 V E I C A E L E K E G K
aa 36-47 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 E I C A E L E K E G K I
aa 37-48 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 I C A E L E K E G K I S
aa 38-49 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 C A E L E K E G K I S K
aa 39-50 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 13 aa:
aa 30-42 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 K I K A L V E I C A E L E
aa 31-43 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 I K A L V E I C A E L E K
aa 32-44 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 K A L V E I C A E L E K E
aa 33-45 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 A L V E I C A E L E K E G
aa 34-46 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 L V E I C A E L E K E G K
aa 35-47 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 V E I C A E L E K E G K I
aa 36-48 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 E I C A E L E K E G K I S
aa 37-49 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 I C A E L E K E G K I S K
aa 38-50 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 14 aa:
aa 30-43 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 K I K A L V E I C A E L E K
aa 31-44 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 I K A L V E I C A E L E K E
aa 32-45 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 K A L V E I C A E L E K E G
aa 33-46 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 A L V E I C A E L E K E G K
aa 34-47 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 L V E I C A E L E K E G K I
aa 35-48 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 V E I C A E L E K E G K I S
aa 36-49 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 E I C A E L E K E G K I S K
aa 37-50 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 15 aa:
aa 30-44 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 K I K A L V E I C A E L E K E
aa 31-45 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 I K A L V E I C A E L E K E G
aa 32-46 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 K A L V E I C A E L E K E G K
aa 33-47 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 A L V E I C A E L E K E G K I
aa 34-48 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 L V E I C A E L E K E G K I S
aa 35-49 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 V E I C A E L E K E G K I S K
aa 36-50 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 16 aa:
aa 30-453031 32 3334 35 3637 3839 40 4142 43 4445 K I K A L V E I C A E L E K E G
aa31-463132 33 3435 36 3738 3940 41 4243 44 4546 I K A L V E I C A E L E K E G K
aa 32-473233 34 3536 37 3839 4041 42 4344 45 4647 K A L V E I C A E L E K E G K I
aa 33-483334 35 3637 38 3940 4142 43 4445 46 4748 A L V E I C A E L E K E G K I S
aa 34-493435 36 3738 39 4041 4243 44 4546 47 4849 L V E I C A E L E K E G K I S K
aa 35-503536 37 3839 40 41.42 4344 45 4647 48 4950 V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 17 aa:
aa 30-46 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 K I K A L V E I C A E L E K E G K
aa 31-47 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 I K A L V E I C A E L E K E G K I
aa 32-48 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 K A L V E I C A E L E K E G K I S
aa33-49 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 A L V E I C A E L E K E G K I S K
aa 34-50 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 L V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 18 aa:
aa 30-47 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 K I K A L V E I C A E L E K E G K I
aa 31-48 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 I K A L V E I C A E L E K E G K I S
aa 32-49 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 K A L V E I C A E L E K E G K I S K
aa 33-50 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 A L V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 19 aa:
aa 30-48 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 K I K A L V E I C A E L E K E G K I S
aa 31-49 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 I K A L V E I C A E L E K E G K I S K
aa 32-50 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 K A L V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 20 aa:
aa 30-49 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 K I K A L V E I C A E L E K E G K I S K
aa 31-50 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 I K A L V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 21 aa:
aa 30-50 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 K I K A L V E I C A E L E K E G K I S K I
Exemple N°6 : Détection de mutations de résistance sur l'ADN
proviral isolé
des cellules mononucléées san uines (CMNS) du patient 201#5 Chez le patient 201#5 traité par NRTI, la détection des mutations de résistance s'est faite dans l'ADN proviral en utilisant un test LiPA VIH-1-RT (voir exemple 3).
Le test LiPA permet la définition d'acides aminés mutés de façon ponctuelle au sein d'une séquence donnée et non celle de séquences d'acides nucléiques. La méthode de détection des mutations de résistance sur l'ADN est résumée dans la figure 1.
En utilisant ce test, nous avons détecté chez ce patient les mutations 41, 184 et 215.
La séquence RT du prélèvement du patient 201#5 est ainsi Xx41(L)Xx184(V)Xx215(Y ou F)Xx Dans laquelle Xx représente une séquence de référence en acides aminés.
Exemple N°7 ' Evaluation ex-vivo de l'immunogénicité de la mutation 41 ~M>L~ sur les CMNS du Patient 201#5 La reconnaissance de la mutation 41 (M>L) de la RT par les cellules CD8 productrices d'IFN-gamma est étudiée chez le patient 201#5 traité par NRTI. La mutation 41 avait été détectée sur l'ADN proviral isolé de ces mêmes CMNS( voir exemple 6). La reconnaissance des peptides 33-41 sauvage et muté a été évaluée par ELISpot.
peptide 33-41 sauvage mut ALVEICTEM ALVEICTEL
SFC/ 10~ CMNS 3 95 La fréquence de reconnaissance du peptide 33-41 muté est de 95 SFC / 10~
CMNS et de 3 SFC / 10G CMNS pour le peptide 33-41 sauvage.
Exemple N°8 ' Structure d'un lipopeptide La structure générale d'un lipopeptide est décrite dans la figure 2 Un lipopeptide se compose d'un acide palmitique de formule C,6H32~2 ou décrit dans le texte comme C15H31-COOH, d'un résidu lysine (acide aminé
basique ajouté à l'extrémité N-terminale du peptide) et d'un peptide dont la structure est choisie au sein des séquences décrites.
Pour le peptide 30-50 (séquence B) aa 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 K I K A L V E I C M~ E M3 E K E
G K I S K I
dans lequel M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S; M3 (aa 41) peut être X41 ou être muté en L; l'un au moins de M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Exemple de Lipopeptide construit avec la séquence 30-50 incluant les mutations de résistance 39 et 41 induites par les NRTI
aa 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 K I K A L V E I C A E L E K E
G K I S K I
Ce peptide est noté sous la forme aa30-aa50 (aa50=I) Dans cet exemple, l'ajout de la lysine se fait sur l'acide aminé 50 qui est une isoleucine (I). La fonction amine de la chaîne latérale de la lysine est modifiée par un acide palmitique et l'acide aminé C terminal est amidaté selon les réactions suivantes aa30-aa50-NH2 + lysine ~ aa30-aa50-NH-CO-Lysine aa30-aa50 -NH-CO-Lysine + COOH-C15H31 CONH2-aàa30-aa50 -NH-CO-Lysine-NH-CO-C15H3~
Cette structure varie selon les procédés industriels . Ainsi la lysine peut être ajoutée à l'extrémité C-terminale du peptide.
Cette structure est ensuite purifiée et conditionnée selon des procédés industriels répondant aux conditions nécessaires à l'obtention de lots cliniques avant utilisation pour immunisation chez l'homme.
L'invention consiste également en les agents de traitement utilisés dans le cadre de ce traitement.
L'invention a également pour objet la préparation d'immunogènes contenant les mutations de résistance aux NRTI et/ou NNRTI.
Plus particulièrement, l'invention consiste en la préparation d'immunogènes contenant les mutations de résistance à un ou des NNRTI utilisés seuls ou conjointement avec un ou des NRTI.
L'invention a également pour objet les peptides éléments des immunogènes.
Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle comprend au moins un peptide tel que défini, dispersé
dans des excipients pharmaceutiquement acceptables, cette composition étant utilisée à titre de vaccin.
Un autre objet de l'invention est la détermination d'épitopes reconnus par les CTLs spécifiques des séquences peptidiques vaccinales introduites à la vaccination, utilisables à visée diagnostique.
Le procédé de traitement des pathologies infectieuses et/ou tumorales comporte une phase de traitement par chimiothérapie anti-infectieuse et/ou anti-tumorale inductrice de mutations de résistance et une phase de vaccination thérapeutique dirigée contre ces mutations de résistance. De préférence la phase de vaccination suit la phase de traitement par chimiothérapie.
La présente invention concerne également un agent de traitement des pathologies infectieuses et/ou tumorales qui comprend au moins deux composants - le premier composant comprenant un médicament destiné au traitement des pathologies infectieuses edou anti-tumorales inducteur de mutations de résistance, - le second composant comportant un vaccin dirigé contre ces mutations de résistance, les deux composants étant destinés à une utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans le temps.
La présente invention a également pour objet des peptides de 8 à 80 acides aminés de la séquence de la transcriptase inverse de VIH comportant au moins une mutation par substitution et/ou par insertion simple ou multiple par rapport aux ô
séquences établies de la transcriptase inverse, en l'absence de tout traitement, mutation observée à la suite d'un traitement aux NRTI et/ou NNRTI, les peptides étant caractérisés par le fait qu'ils sont capables d'induire une réponse médiée par les lymphocytes T spécifiques de cette séquence mutée de la transcriptase inverse de VIH, à l'exception des peptides de séquence Zl-Y-V-D-D-Zz, Zl-Y-I-D-D-Z~ et Zl-Y-L-D-D-Z2 avec Zl et ZZ étant au moins un acide aminé quelconque, ces peptides ayant été observés à la suite d'un traitement à la lamivudine seule (NRTI).
En particulier, l'invention a pour objet de préférence des peptides de 8 à 80 acides aminés de la séquence de la transcriptase inverse de VIH comportant au moins une mutation par substitution et/ou par insertion simple ou multiple par rapport aux séquences établies de la transcriptase inverse, en l'absence de tout traitement, mutation observée à la suite d'un traitement aux NNRTI seuls ou à la suite d'un traitement combinant NNRTI et NRTI, les peptides étant caractérisés par le fait qu'ils sont capables d'induire une réponse médiée par les lymphocytes T spécifiques de cette séquence mutée de la transcriptase inverse de VIH.
De préférence, les peptides selon l'invention comportent de 15 à 50 acides aminés.
Les séquences des peptides selon l'invention peuvent être précédées ou suivies d'acides aminés neutres pouvant solubiliser ou stabïliser les peptides.
Les peptides selon l'invention sont caractérisés par les séquences ou parties de séquence comportant au moins une des mutation Mp suivantes avec Xn étant un acide aminé correspondant à celui décrit dans la banque de données de Los Alamos à
la même position de la séquence peptidique de la transcriptase inverse de VIH-1, et n étant la position d'un acide aminé décrit dans la banque de données de Los Alamos dans la séquence de la transcriptase inverse de VIH-1, et avec Mp étant un acide aminé muté et p étant le numéro de la mutation observée.
* Séquence A
aa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 X X X X X Ml X X X X X X X X X
dans laquelle M1 (aa 6) peut être muté en K, G ou S ;
* Séquence B
aa 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 X X X X X X
dans laquelle M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S;
M3 (aa 41) peut être X41 ou être muté en L;
l'un au moins de M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M2 (aa 39) peut être muté en A, K, N, P, M
ou S;
M3 (aa 41) peut être X41 ou être muté en L;
* Séquence C
aa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 X X X X X X X X X X X X X X X
X X X X X X
dans laquelle M1 (aa 6) peut être X6 ou être muté en K, G ou S ;
M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S ;
M3 (aa 41) peut être X4lou être muté en L ;
l'un au moins de M1, M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, Ml (aa 6) peut être X6 ou être muté en K, G
ouS;
M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S ;
M3 (aa 41) peut être X4lou être muté en L ;
avec M1 ou M2 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence D
aa X X X X
dans laquelle M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
5 M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
10 M11 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
l'un au moins de M4 à M12 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
M11 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
l'un au moins de M4, M7 ou M12 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence E
aa X X X
dans laquelle M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
Ml l (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
M13 (aa 88) peut être X88 ou être muté en C;
M14 (aa 89) peut être X89 ou être muté en G ;
M15 (aa 90) peut être X90 ou être muté en I;
M16 (aa 98) peut être X98 ou être muté en G ou S;
M17 (aa 100) peut être X100 ou être muté en I;
M18 (aa 101) peut être X101 ou être muté en E, Q, R, I ou P;
M19 (aa 103) peut être X103 ou être muté en N, Q, R, T ou S;
M20 (aa 106) peut être X106 ou être muté en A, I ou L;
M21 (aa 108) peut être X108 ou être muté en I;
M22 (aa 115) peut être X115 ou être muté en F;
M23 (aa 116) peut être X116 ou être muté en Y;
M24 (aa 119) peut être X119 ou être muté en S;
l'un au moins de M4 à M24 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M4 (aa 62) peut étre X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
M11 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
M13 (aa 88) peut être X88 ou être muté en C;
M14 (aa 89) peut être X89 ou être muté en G ;
M15 (aa 90) peut être X90 ou être muté en I;
M16 (aa 98) peut être X98 ou être muté en G ou S;
M17 (aa 100) peut être X100 ou être muté en I;
M18 (aa 101) peut étre X101 ou être muté en E, Q, R, I ou P;
M19 (aa 103) peut être X103 ou être muté en N, Q, R, T ou S;
M20 (aa 106) peut être X106 ou être muté en A, I ou L;
M21 (aa 108) peut être X108 ou être muté en I;
M22 (aa 115) peut être X115 ou être muté en F;
M23 (aa 116) peut être X116 ou être muté en Y;
M24 (aa 119) peut être X119 ou être muté en S;
l'un au moins de M4, M7, M12 à M21, M23 ou M24 représentant un acide aminé
portant une mutation.
* Séquence F
aa 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 X X X X X X X X
dans laquelle M25 (aa 138) peut être X138 ou être muté en A, G, K ou Q;
M26 (aa 139) peut être X139 ou être muté en I, M ou K;
M27 (aa 141) peut être X141 ou être muté en E ;
M28 (aa 151) peut être X151 ou être muté en M;
M29 (aa 157) peut être X157 ou être muté en S ;
l'un au moins de M25 à M29 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M25 (aa 138) peut être X138 ou être muté en A, G, K ou Q;
M26 (aa 139) peut être X139 ou être muté en I, M ou K;
M27 (aa 141) peut être X141 ou être muté en E ;
M28 (aa 151) peut être X151 ou être muté en M;
M29 (aa 157) peut être X157 ou être muté en S ;
l'un au moins de M25 à M28 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence G
aa X X X X X X X
dans laquelle M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M , L, ou F
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M30 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M , L, ou F
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M30, M33, M35 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence H
aa dans laquelle M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M, L, ou F;
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
l'un au moins de M30 à M34 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M, L, ou F;
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
l'un au moins de M30; M32 ou M33 représentant un acide aminé portant une mutation.
* SéquenceI
aa 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 dans laquelle M34 (aa184) peut être X184 dans laquelle M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
5 M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M34 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, 10 M34 (aa184) peut être X184 dans laquelle M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M35 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence J
aa 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 X X X X X X
dans laquelle M38 (aa 208) peut être X208 ou être muté en Y;
M39 (aa 210) peut être X210 ou être muté en W;
M40 (aa 211) peut être X211 ou être muté en K, A, E, N, D, G ou Q;
M41 (aa 214) peut être X214 ou être muté en L ou F;
M42 (aa 215) peut être X215 ou être muté en Y, F ou C;
M43 (aa 219) peut être X219 ou être muté en Q, E N, R, T ou W;
M44 (aa 223) peut être X223 ou être muté en Q;
M45 (aa 225) peut être X225 ou être muté en H;
M46 (aa 227) peut être X227 ou être muté en L;
M47 (aa 228) peut être X228 ou être muté en R, H ou F;
M48 (aa 233) peut être X233 ou être muté en V ou N;
M49 (aa 234) peut être X234 ou être muté en I, H ou P;
M50 (aa 236) peut être X236 ou être muté en M, S ou L;
M51 (aa 238) peut être X238 ou être muté en T ou S;
M52 (aa 240) peut être X240 ou être muté en A, D ou I;
l'un au moins de M38 à M52 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M38 (aa 208) peut être X208 ou être muté en Y;
M39 (aa 210) peut être X210 ou être muté en W;
M40 (aa 211) peut être X211 ou être muté en K, A, E, N, D, G ou Q;
M41 (aa 214) peut être X214 ou être muté en L ou F;
M42 (aa 215) peut être X215 ou être muté en Y, F ou C;
M43 (aa 219) peut être X219 ou être muté en Q, E N, R, T ou W;
M44 (aa 223) peut être X223 ou être muté en Q;
M45 (aa 225) peut être X225 ou être muté en H;
M46 (aa 227) peut être X227 ou être muté en L;
M47 (aa 228) peut être X228 ou être muté en R, H ou F;
M48 (aa 233) peut être X233 ou être muté en V ou N;
M49 (aa 234) peut être X234 ou être muté en I, H ou P;
M50 (aa 236) peut être X236 ou être muté en M, S ou L;
M51 (aa 238) peut être X238 ou être muté en T ou S;
M52 (aa 240) peut être X240 ou être muté en A, D ou I;
l'un au moins de M38, M40, M44 à M52 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence K
aa 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 X X X X
dans laquelle M53 (aa 333) peut être muté en E ou D;
De préférence les peptides selon l'invention sont caractérisés par les séquences ou parties de séquence suivantes comportant au moins une des mutations Mp suivantes:
* Séquence A bis:
dans laquelle Ml (aa 6 - wt=E) peut être muté majoritairement en K, ou en G ou S ;
* Séquence B bis G K I S K I
dans laquelle M2 (aa 39- wt=T) peut être X39 ou être muté majoritairement en A, ou en K, ou N, ou P, ou M ou S;
M3 (aa 41- wt=M) peut être X41 ou être muté majoritairement en L;
l'un au moins de M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M2 (aa 39) peut être muté en A, K, N, P, M
ou S;
M3 (aa 41) peut être X41 ou être muté en L;
* Séquence C bis M D G P K V K Q W P L T E E K
K I S K I G
dans laquelle M1 (aa 6- wt=E) peut être muté majoritairement en K,ou en G ou S
;
M2 (aa 39- wt=T) peut être X39 ou être muté majoritairement en A, ou en K, ou N, ou P,ouMouS;
M3 (aa 41- wt=M) peut être X4lou être muté majoritairement en L ;
l'un au moins de Ml, M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M1 (aa 6) peut être X6 ou être muté en K, G
ouS;
M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S ;
M3 (aa 41 ) peut être X41 ou être muté en L ;
avec M1 ou M2 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence D bis R T Q D
dans laquelle M4 (aa 62- wt=A) peut être X62 ou être muté majoritairement en V;
M5 (aa 65- wt=K) peut être X65 ou être muté majoritairement en R;
M6 (aa 67- wt=D) peut être X67 ou être muté majoritairement en N ou G;
M7 (aa 68- wt=S) peut être X68 ou être muté majoritairement en G ou N ;
M8 (aa 69- wt=T) peut être X69 ou être muté majoritairement en D, ou en N, ou S, ou A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70- wt=K) peut être X70 ou être muté majoritairement en R, ou en N, ou E
ou S;
M10 (aa 74- wt=L) peut être X74 ou être muté majoritairement en V ou en I;
M11 (aa 75- wt=V) peut être X75 ou être muté majoritairement en M, ou en I, ou L
ou T;
M12 (aa 77- wt=F) peut être X77 ou être muté majoritairement en L;
l'un au moins de M4 à M12 représentant un acide aminé portant une mutation Dans un mode préféré de l'invention, M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
M11 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
l'un au moins de M4, M7 ou M12 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence E bis K Y T
dans laquelle M4 (aa 62- wt=A) peut être X62 ou être muté majoritairement en V;
M5 (aa 65- wt=K) peut être X65 ou être muté majoritairement en R;
M6 (aa 67- wt=D) peut être X67 ou être muté majoritairement en N ou en G;
M7 (aa 68- wt=S) peut être X68 ou être muté majoritairement en G ou en N ;
M8 (aa 69- wt=T) peut être X69 ou être muté majoritairement en D, ou en N, ou S, ou A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70- wt=K) peut être X70 ou être muté majoritairement en R, ou en N, ou E
ou S;
M10 (aa 74- wt=L) peut être X74 ou être muté majoritairement en V ou en I;
M11 (aa 75- wt=V) peut être X75 ou être muté majoritairement en M, ou en I, ou L
5 ou T;
M12 (aa 77- wt=F) peut être X77 ou être muté majoritaïrement en L;
M13 (aa 88- wt=W) peut être X88 ou être muté majoritairement en C;
M14 (aa 89- wt=E) peut être X89 ou être muté majoritairement en G ;
M15 (aa 90- wt=V) peut être X90 ou être muté majoritairement en I;
10 M16 (aa 98- wt=A) peut être X98 ou être muté majoritairement en S ou en G;
M17 (aa 100- wt=L) peut être X100 ou être muté majoritairement en I;
M18 (aa 101- wt=K) peut être X101 ou être muté majoritairement en E, ou en Q, ou R, ou I ou P;
M19 (aa 103- wt=K) peut être X103 ou être muté en N, majoritairement Q, ou en R, 15 ouTouS;
M20 (aa 106- wt=V) peut être X106 ou être muté majoritairement en A, ou en I
ou L;
M21 (aa 108- wt=V) peut être X108 ou être muté majoritairement en I;
M22 (aa 115- wt=Y) peut être X115 ou être muté majoritairement en F;
20 M23 (aa 116- wt=F) peut être X116 ou être muté majoritairement en Y;
M24 (aa 119- wt=P) peut être X119 ou être muté majoritairement en S;
l'un au moins de M4 à M24 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
M11 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
M13 (aa 88) peut être X88 ou être muté en C;
M14 (aa 89) peut être X89 ou être muté en G ;
M15 (aa 90) peut être X90 ou être muté en I;
M16 (aa 98) peut être X98 ou être muté en G~ ou S;
M17 (aa 100) peut être X100 ou être muté en I;
M18 (aa 101) peut être X101 ou être muté en E, Q, R, I ou P;
M19 (aa 103) peut être X103 ou être muté en N, Q, R, T ou S;
M20 (aa 106) peut être X106 ou être muté en A, I ou L;
M21 (aa 108) peut être X108 ou être muté en I;
M22 (aa 115) peut être X115 ou être muté en F;
M23 (aa 116) peut être X116 ou être muté en Y;
M24 (aa 119) peut être X119 ou être muté en S;
l'un au moins de M4, M7, M12 à M21, M23 ou M24 représentant un acide aminé
portant une mutation.
* Séquence F bis I F Q S S M T K
dans laquelle M25 (aa 138- wt=E) peut être X138 ou être muté majoritairement en A, ou en G, ou K ou Q;
M26 (aa 139- wt=T) peut être X139 ou être muté majoritairement en I, ou en M
ou K;
M27 (aa 141- wt=G) peut être X141 ou être muté majoritairement en E ;
M28 (aa 151- wt=Q) peut être X151 ou être muté majoritairement en M;
M29 (aa 157- wt=P) peut être X157 ou être muté majoritairement en S ;
l'un au moins de M25 à M29 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M25 (aa 138) peut être X138 ou être muté en A, G, K ou Q;
M26 (aa 139) peut être X139 ou être muté en I, M ou K;
M27 (aa 141) peut être X141 ou être muté en E ;
M28 (aa 151) peut être X151 ou être muté en M;
M29 (aa 157) peut être X157 ou être muté en S ;
l'un au moins de M25 à M28 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence G bis Q N P D
L E I G Q H R
dans laquelle M30 (aa 172- wt=R) peut être X172 ou être muté majoritairement en K;
M31 (aa 178- wt=I) peut être X178 ou être muté majoritairement en M, L ou en F;
M32 (aa 179- wt=V) peut être X179 ou être muté majoritairement en I, ou en L, ou D ou E;
M33 (aa 181- wt=Y) peut être X181 ou être muté majoritairement en C ou en I;
M34 (aa 184- wt=M) peut être X184 ou être muté majoritairement en V, ou en I
ou T;
M35 (aa 188- wt=Y) peut être X188 ou être muté majoritairement en L, ou en C
ou H;
M36 (aa 189- wt=V) peut être X189 ou être muté majoritairement en I;
M37 (aa 190- wt=G) peut être X190 ou être muté majoritairement en A, ou en S, ou E, ou Q ou T;
l'un au moins de M30 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M , L, ou F
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M30, M33, M35 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence H bis S
dans laquelle M30 (aa 172- wt=R) peut être X172 ou être muté majoritairement en K;
M31 (aa 178- wt=I) peut être X178 ou être muté majoritairement en M, ou en L ;
M32 (aa 179- wt=V) peut être X179 ou être muté majoritairement en I, ou en L, ou D ou E;
M33 (aa 181- wt=Y) peut être X181 ou être muté majoritairement en C ou en I;
M34 (aa 184- wt=M) peut être X184 ou être muté majoritairement en V, ou en I
ou T;
l'un au moins de M30 à M34 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M, L, ou F;
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
l'un au moins de M30; M32 ou M33 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence I bis R
dans laquelle M34 (aa 184- wt=M) peut être X184 ou être muté majoritairement en V, ou en I ou T;
dans laquelle M35 (aa 188- wt=Y) peut être X188 ou être muté majoritairement en L, ouenCouH;
M36 (aa 189- wt=V) peut être X189 ou être muté majoritairement en I
M37 (aa 190- wt=G) peut être X190 ou être muté majoritairement en A, ou en S, ou E, ou Q ou T;
l'un au moins de M34 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M34 (aa184) peut être X184 dans laquelle M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M35 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence J bis I V L P E IC
dans laquelle M38 (aa 208- wt=H) peut être X208 ou être muté majoritairement en Y;
M39 (aa 210- wt=L) peut être X210 ou être muté majoritairement en W;
M40 (aa 211- wt=R) peut être X211 ou être muté majoritairement en K, ou en A, ou E, ou N, ou D, ou G ou Q;
M41 (aa 214- wt=F ou L) peut être X214 ou être muté majoritairement en L ou en F;
M42 (aa 215- wt=T) peut être X215 ou être muté majoritairement en Y, ou en F
ou C;
M43 (aa 219- wt=K) peut être X219 ou être muté majoritairement en Q, ou en E, ou N, ou R, ouT ou W;
M44 (aa 223- wt=K) peut être X223 ou être muté majoritairement en Q;
M45 (aa 225- wt=P) peut être X225 ou être muté majoritairement en H;
M46 (aa 227- wt=F) peut être X227 ou être muté majoritairement en L;
M47 (aa 228- wt=L) peut être X228 ou être muté majorïtairement en R, ou en H
ou 5 F;
M48 (aa 233- wt=E) peut être X233 ou être muté majoritairement en V, ou en N
M49 (aa 234- wt=L) peut être X234 ou être muté majoritairement en I, ou en H
ou P;
M50 (aa 236- wt=P) peut être X236 ou être muté majoritairement en M, ou en S
ou 10 L;
M51 (aa 238- wt=K) peut être X238 ou être muté majoritairement en T ou en S;
M52 (aa 240- wt=T) peut être X240 ou être muté majoritairement en A, ou en D
ou I;
l'un au moins de M38 à M52 représentant un acide aminé portant une mutation.
Dans un mode préféré de l'invention, M38 (aa 208) peut être X208 ou être muté en Y;
M39 (aa 210) peut être X210 ou être muté en W;
M40 (aa 211) peut être X211 ou être muté en K, A, E, N, D, G ou Q;
M41 (aa 214) peut être X214 ou être muté en L ou F;
M42 (aa 215) peut être X215 ou être muté en Y, F ou C;
M43 (aa 219) peut être X219 ou être muté en Q, E N, R, T ou W;
M44 (aa 223) peut être X223 ou être muté en Q;
M45 (aa 225) peut être X225 ou être muté en H;
M46 (aa 227) peut être X227 ou être muté en L;
M47 (aa 228) peut être X228 ou être muté en R, H ou F;
M48 (aa 233) peut être X233 ou être muté en V ou N;
M49 (aa 234) peut être X234 ou être muté en I, H ou P;
M50 (aa 236) peut être X236 ou être muté en M, S ou L;
M51 (aa 238) peut être X238 ou être muté en T ou S;
M52 (aa 240) peut être X240 ou être muté en A, D ou I;
l'un au moins de M38, M40, M44 à M52 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence K bis Y Q I Y
dans laquelle M53 (aa 333- wt=G) peut être muté majoritairement en E ou en D.
L'invention porte également sur une composition pharmaceutique à base d'au moins un peptide, dispersé dans des excipients pharmaceutiquement acceptables, pour leur utilisation à titre de vaccin.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut également comporter en plus, des immunomodulateurs tels que des cytolcines ou des chimiokines.
On peut ajouter dans la composition pharmaceutique selon l'invention, des adjuvants tels que des lipides (acides gras, phospholipides, adjuvant incomplet de Freund notamment), des copolymères anioniques, des motifs CpG......
Dans un mode de réalisation de l'invention, au moins un peptide selon l'invention entre dans la composition d'un lipopeptide ou d'une lipoprotéine.
En effet, l'association d'un peptide à une séquence d'acides gras ou de phospholipides permet d'observer une potentialisation de la réponse immunogène par rapport à celle entraînée par l'administration de l'antigène seul.
Le ou les peptides selon l'invention peuvent être couplés à des micro ou nano particules constituées d'un noyau polysaccharidique et/ou recouverts notamment d'une bicouche lipidique. Ils peuvent également être couplés à un ou des liposomes ou un ou des niosomes.
Le ou les peptides selon l'invention peuvent être exprimés dans un virus recombinant, ou un vecteur viral recombinant, ou dans un virus atténué ou inactivé.
Le ou les peptides selon l'invention peuvent être exprimés dans une bactérie recombinante ou dans un vecteur bactérien recombinant.
Le ou les peptides selon l'invention peuvent être exprimés dans une cellule présentatrice d'antigène.
Un autre objet de l'invention est un vaccin comportant au moins un ADN nu ou un ARN nu codant au moins un peptide selon l'invention.
Un autre objet de l'invention est que l'agent de traitement des malades infectés par le VIH, comporte au moins deux compositions, la première composition comprenant au moins un médicament de la famille des NRTI et/ou NNRTI, et la seconde composition comportant au moins un peptide selon l'invention. Ces compositions sont destinées à une application séquentielle, séparée ou non dans le temps ou simultanée.
Préférentiellement, l'agent de traitement des malades infectés par le VIH, comporte au moins deux compositions, la première composition comprenant au moins un médicament de la famille des NNRTI, et la seconde composition comportant au moins un peptide selon l'invention.
Un autre objet de l'invention est un procédé de prévention ou traitement d'une infection par le virus VIH. Ce procédé consiste en l'induction d'une réponse immunitaire de type T spécifique en réponse à l'administration d'un vaccin selon l'invention. De préférence, la ou les mutations du virus VIH se situent dans l'enzyme transcriptase inverse.
Un autre objet de l'invention est des séquences peptidiques de 8 à 20 acides aminés, reconnues en tant que séquences épitopiques par les cellules T
spécifiques des séquences peptidiques correspondant préalablement à la vaccination introduites à
la vaccination.
Les séquences épitopiques selon l'invention sont des séquences peptidiques de 8 à 20 acides aminés contigus choisies dans les séquences peptidiques de A
à K
possédant au moins une mutation Mp. Préférentiellement, ces séquences peptidiques sont constituées de 8 à 10 acides aminés contigus choisis dans les séquences peptidiques de A à K possédant au moins une mutation Mp. Plus préférentiellement, les séquences épitopiques selon l'invention sont constituées de 9 acides aminés contigus choisis dans les séquences peptidiques de A à K possédant au moins une mutation Mp.
Les séquences épitopiques possédant les caractéristiques énoncées, sont utilisables pour la détermination et la quantification des cellules T
spécifiques de ces séquences épitopiques.
L'invention a également pour objet une composition diagnostique de détermination des cellules T spécifiques de ces séquences épitopiques caractérisée par le fait qu'elle comprend, entre autres, au moins une séquence épitopique selon l'invention.
Les vaccins obtenus selon les procédés de l'invention peuvent être formulés en tant que compositions pharmaceutiques pour une administration sous-cutanée, intramusculaire intra-dermale ou intra-veineuse. Les techniques d'administration de ce type de vaccins sont abondamment décrites dans la littérature et sont bien connues de l'homme du métier.
Des excipïents acceptables au niveau pharmaceutique peuvent être ajoutés en fonction de la technique d'administration utilisée. On pourra en particulier ajouter des excipients aqueux telle qu'une solution saline tampon. Ces solutions sont stériles et dépourvues de substances toxiques ou pyrogènes.
Les compositions selon l'invention peuvent être stérilisées par des méthodes de stérilisation conventionnelles et connues.
Selon le mode d'administration, les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous toutes les formes habituellement utilisées en diagnostic.
Les compositions selon l'invention peuvent en particulier contenir des substances acceptables au niveau pharmaceutique telles que des stabilisateurs de pH, des agents tampon ou par exemple de l'acétate de sodium, du chlorure de sodium, de potassium, de calcium, du lactate de sodium ou d'autres afin d'être dans des conditions physiologiques.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter aucunement.
Exemple 1 : Génération des lignées CTLs Les conséquences de mutations induites sous NRTI sur les réponses CTL
spécifiques de la RT ont été étudiées. Un total de 66 échantillons sanguins provenant de patients traités ou non en mono- ou bi-thérapie avec des NRTI, sans inhibiteur de protéase, a été collecté pendant 1 à 6 ans chaque année entre 1991 et 1996.
Pour analyser la reconnaissance des produits des gènes pol et rt du virus VIH-30 1, des lignées VIH-spécifiques ont été générées par co-culture des PBMC
(peripheral blond mononuclear cens) de patients et de PHA-blastes autologues. Des PBMC
stimulés avec de la PHA (phytohémagglutinine) à 2 ~,g/ml pendant 18h à
37°C en atmosphère humide à 5 % de C02 et irradiés à 5000 rads sont ajoutés à des PBMC
autologues fraîchement décongelés à un ratio de 1 :5 et déposés dans des plaques de 24 puits à la concentration de 1x106 /ml. Les lignées CTLs sont cultivées pendant au moins 3 semaines en présence d'Interleukine 2 à 20 U/ml, ajoutée au troisième jour de la culture et ensuite tous les 3 jours. Ces lignées sont testées pour leur activité
cytotoxique après au moins 3 semaines de culture contre des lignées autologues B-EBV
(Lymphocytes B transformés par fEBV) servant de cibles.
On a mis en oeuvre le même procédé en ce qui concerne les mutations induites sous traitement aux NNRTI ou sous traitement conjoint aux NNRTI et NRTI.
Exemple 2 : Test CTL
L'activité CTL a été mesurée en utilisant un test de relargage de 5lChrome.
Les cellules cibles sont des lignées B-EBV autologues infectées par les différents virus recombinants de la vaccine exprimant le gène pol ou des fragments du gène pol du VIH-1, à une multiplicité d'infection de 5 PFU (Plaque Forming Unit) /
cellule, 18h avant le test CTL. Le virus de la vaccine sauvage non recombiné (Vac-WT) sert de contrôle. Les cellules cibles sont incubées en culot en présence de Na251Cr04 (activité
spécifique 2mci/ml), à la concentration de 70 ,uci/x106 cellules, pendant 2 h à 37°C. La radioactivité mesurée est calculée selon la formule suivante : (relargage expérimental -relargage spontané / (relargage total - relargage spontané) X 100 = % de lyse spécifique. Les réponses CTL sont considérées comme positives lorsque l' on obtient plus de 10% de lyse spécifique, ceci à au moins 2 rapports effecteurs/ cibles successifs.
L'analyse de la reconnaissance des régions RT-1 : 1-143 et RT-2 : 143-293 s'est faite sur des lignées CTL spécifiques de Pol. Les réponses T
cytotoxiques ont été
évaluées en utilisant un test de relargage de chrome 51. Les cellules cibles étaient des lignées-B-EBV autologues infectées par des virus de la vaccine exprimant différents fragments de gènes de la Yt (RT-1 : 1-143 et RT-2 : 143-293).
Exemple 3 : Détection des mutations de résistance Les mutations de résistance ont été détectées dans l'ADN proviral en utilisant un test LiPA VIH-1 RT (Murex. Diagnostics SA, Châtillon, France). Ce test permet la détection simultanée des séquences de type "sauvage" et des mutations de résistance (41, 69, 70, 74, 184, 214 et 215) induites par les inhibiteurs nucléosidiques de la RT
(NRTI). Ä partir de l'ADN isolé des PBMC, une amplification du gène de la rt est réalisée en utilisant des amorces biotinylées, l'ADN biotinylé est ensuite hybridé avec des sondes oligo-nucléotidiques spécifiques immobilisées en lignes parallèles sur une bandelette. L' addition de streptavidine marquée à la phosphatase alcaline entraîne une 5 liaison de celle-ci avec les hybrides biotinylés formés qui conduit à la formation d'un précipité violet /brun. Les séquences sauvages et mutées de la rt localisées au niveau des différents codons peuvent être localisées au niveau de la même bandelette.
Exemple 4 : Test ELISpot Pour la reconnaissance de peptïdes épitopiques, un test ELISpot-IFNy où les PBMC étaient incubés, sans stimulation préalable, avec le peptide d'intérêt a été utilisé.
Les 96 puits d'une plaque de type Immobilon p (Millipore, Molsheim, France) sont recouverts pendant 18h à 4°C avec un anticorps de capture anti-IFN~y (interféron 'y) monoclonal (IgGl B-B 1 à l,ug/ml Diaclone, Besançon, France). Après 3 lavages, les PBMC sont ajoutés en triplicata à la concentration de 1x105 et 5x104 cellules par puits en présence de 5 ,ug/ml de peptide ou de 0,5 ~,g/ml de PHA, utilisé comme témoin positif ou de milieu seul utilisé comme témoin négatif. Les plaques sont ensuite incubées pendant 40h à 37°C en atmosphère humide à 5 % de C02, puis lavées, l'anticorps de détection anti-IFN~y monoclonal biotinylé (B-G1 à 0,2 ~.g/ml Diaclone, Besançon, France) est ensuite ajouté et les plaques sont de nouveau incubées pendant 4h à 37°C. Après les lavages, la streptavidine marquée à la phosphatase alcaline (Amersham, Les Ulis, France) est ajoutée et la plaque est incubée pendant 1h à
37°C.
La plaque est ensuite lavée puis incubée avec du BCIP/NTP (Sigma, Aldrich, Saint Quentin, France), des spots violets apparaissent après 10 à 15 min. La plaque est lavée avec de l'eau pour arrêter la réaction. Les spots sont comptés à l'aide d'un lecteur ELISpot automatique. Le nombre de cellules T spécifiques répondeuses est calculé
après soustraction des valeurs du contrôle négatif. La fréquence de cellules sécrétant de l'IFNy est rendue en SFC (Spot Forming Cells).
Exemple N°5 : Découpage de la séauence B (aa 30-50) en différents peptides de longueur variant entre 8 et 21 acides aminés.
Les séquences peptidiques sont découpées en peptides de 8 à 80 acides aminés (aa) impliquant n'importe quelle partie de la séquence recouvrant au moins une mutation , ceci pour des applications thérapeutiques ou diagnostiques.
Pour la séquence peptidique 30-50 où M2 correspond à l'aa 39 muté (A) et M3 correspond à l'aa 41 muté (L):
aa 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 K I K A L V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 8 aa:
aa 32-39 3233 34 3536 37 3839 K A L V E I C A
aa 33-40 3334 35 3637 38 3940 A L V E I C A E
aa 34-41 3435 36 3738 39 4041 L V E I C A E L
aa 35-42 3536 37 3839 40 4142 V E I C A E L E
aa 36-43 3637 38 3940 41 4243 E I C A E L E K
aa 37-44 3738 39 4041 42 4344 I C A E L E K E
aa 38-45 3839 40 4142 43 4445 C A E L E K E G
aa 39-46 3940 41 4243 44 4546 A E L E K E G K
aa 40-47 4041 42 4344 45 4647 E L E K E G K I
aa 41-48 4142 43 4445 46 4748 L E K E G K I S
* Séquences de 9 aa:
aa 31-39 31 32 33 34 35 36 37 38 39 I K A L V E I C A
aa 32-40 32 33 34 35 36 37 38 39 40 K A L V E I C A E
aa 33-41 33 34 35 36 37 38 39 40 41 A L V E I C A E L
aa 34-42 34 35 36 37 38 39 40 41 42 L V E I C A E L E
aa 35-43 35 36 37 38 39 40 41 42 43 V E I C A E L E K
aa 36-44 36 37 38 39 40 41 42 43 44 E I C A E L E K E
aa 37-45 37 38 39 40 41 42 43 44 45 I C A E L E K E G
aa 38-46 38 39 40 41 42 43 44 45 46 C A E L E K E G K
aa 39-47 39 40 41 42 43 44 45 46 47 A E L E K E G K I
aa 40-48 40 41 42 43 44 45 46 47 48 E L E K E G K I S
aa 41-49 41 42 43 44 45 46 47 48 49 L E K E G K I S K
* Séquences de 10 aa:
aa 30-39 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 K I K A L V E I C A
aa 31-40 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 I K A L V E I C A E
aa 32-41 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 K A L V E I C A E L
aa 33-42 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 A L V E I C A E L E
aa 34-43 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 L V E I C A E L E K
aa 35-44 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 V E I C A E L E K E
aa 36-45 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 E I C A E L E K E G
aa 37-46 3738 39 4041 42 4344 4546 I C A E L E K E G K
aa 38-47 3839 40 4142 43 4445 4647 C A E L E K E G K I
A E L E K E G K I S
aa 40-49 4041 42 4344 45 4647 4849 E L E K E G K I S K
aa 41-50 4142 43 4445 46 4748 4950 L E K E G K I S K I
* Séquences de 11 aa:
aa 30-40 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 K I K A L V E I C A E
aa 31-41 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 I K A L V E I C A E L
aa 32-42 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 K A L V E I C A E L E
aa 33-43 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 A L V E I C A E L E K
aa 34-44 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 L V E I C A E L E K E
aa 35-45 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 V E I C A E L E K E G
aa 36-46 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 E I C A E L E K E G K
aa 37-47 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 I C A E L E K E G K I
aa 38-48 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 C A E L E K E G K I S
aa 39-49 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 A E L E K E G K I S K
aa 40-50 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 E L E K E G K I S K I
* Séquences de 12 aa:
aa 30-41 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 K I K A L V E I C A E L
aa 31-42 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 I K A L V E I C A E L E
aa 32,-43 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 K A L V E I C A E L E K
aa 33-44 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 A L V E I C A E L E K E
aa 34-45 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 L V E I C A E L E K E G
aa 35-46 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 V E I C A E L E K E G K
aa 36-47 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 E I C A E L E K E G K I
aa 37-48 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 I C A E L E K E G K I S
aa 38-49 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 C A E L E K E G K I S K
aa 39-50 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 13 aa:
aa 30-42 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 K I K A L V E I C A E L E
aa 31-43 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 I K A L V E I C A E L E K
aa 32-44 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 K A L V E I C A E L E K E
aa 33-45 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 A L V E I C A E L E K E G
aa 34-46 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 L V E I C A E L E K E G K
aa 35-47 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 V E I C A E L E K E G K I
aa 36-48 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 E I C A E L E K E G K I S
aa 37-49 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 I C A E L E K E G K I S K
aa 38-50 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 14 aa:
aa 30-43 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 K I K A L V E I C A E L E K
aa 31-44 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 I K A L V E I C A E L E K E
aa 32-45 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 K A L V E I C A E L E K E G
aa 33-46 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 A L V E I C A E L E K E G K
aa 34-47 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 L V E I C A E L E K E G K I
aa 35-48 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 V E I C A E L E K E G K I S
aa 36-49 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 E I C A E L E K E G K I S K
aa 37-50 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 15 aa:
aa 30-44 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 K I K A L V E I C A E L E K E
aa 31-45 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 I K A L V E I C A E L E K E G
aa 32-46 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 K A L V E I C A E L E K E G K
aa 33-47 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 A L V E I C A E L E K E G K I
aa 34-48 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 L V E I C A E L E K E G K I S
aa 35-49 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 V E I C A E L E K E G K I S K
aa 36-50 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 16 aa:
aa 30-453031 32 3334 35 3637 3839 40 4142 43 4445 K I K A L V E I C A E L E K E G
aa31-463132 33 3435 36 3738 3940 41 4243 44 4546 I K A L V E I C A E L E K E G K
aa 32-473233 34 3536 37 3839 4041 42 4344 45 4647 K A L V E I C A E L E K E G K I
aa 33-483334 35 3637 38 3940 4142 43 4445 46 4748 A L V E I C A E L E K E G K I S
aa 34-493435 36 3738 39 4041 4243 44 4546 47 4849 L V E I C A E L E K E G K I S K
aa 35-503536 37 3839 40 41.42 4344 45 4647 48 4950 V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 17 aa:
aa 30-46 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 K I K A L V E I C A E L E K E G K
aa 31-47 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 I K A L V E I C A E L E K E G K I
aa 32-48 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 K A L V E I C A E L E K E G K I S
aa33-49 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 A L V E I C A E L E K E G K I S K
aa 34-50 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 L V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 18 aa:
aa 30-47 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 K I K A L V E I C A E L E K E G K I
aa 31-48 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 I K A L V E I C A E L E K E G K I S
aa 32-49 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 K A L V E I C A E L E K E G K I S K
aa 33-50 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 A L V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 19 aa:
aa 30-48 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 K I K A L V E I C A E L E K E G K I S
aa 31-49 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 I K A L V E I C A E L E K E G K I S K
aa 32-50 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 K A L V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 20 aa:
aa 30-49 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 K I K A L V E I C A E L E K E G K I S K
aa 31-50 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 I K A L V E I C A E L E K E G K I S K I
* Séquences de 21 aa:
aa 30-50 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 K I K A L V E I C A E L E K E G K I S K I
Exemple N°6 : Détection de mutations de résistance sur l'ADN
proviral isolé
des cellules mononucléées san uines (CMNS) du patient 201#5 Chez le patient 201#5 traité par NRTI, la détection des mutations de résistance s'est faite dans l'ADN proviral en utilisant un test LiPA VIH-1-RT (voir exemple 3).
Le test LiPA permet la définition d'acides aminés mutés de façon ponctuelle au sein d'une séquence donnée et non celle de séquences d'acides nucléiques. La méthode de détection des mutations de résistance sur l'ADN est résumée dans la figure 1.
En utilisant ce test, nous avons détecté chez ce patient les mutations 41, 184 et 215.
La séquence RT du prélèvement du patient 201#5 est ainsi Xx41(L)Xx184(V)Xx215(Y ou F)Xx Dans laquelle Xx représente une séquence de référence en acides aminés.
Exemple N°7 ' Evaluation ex-vivo de l'immunogénicité de la mutation 41 ~M>L~ sur les CMNS du Patient 201#5 La reconnaissance de la mutation 41 (M>L) de la RT par les cellules CD8 productrices d'IFN-gamma est étudiée chez le patient 201#5 traité par NRTI. La mutation 41 avait été détectée sur l'ADN proviral isolé de ces mêmes CMNS( voir exemple 6). La reconnaissance des peptides 33-41 sauvage et muté a été évaluée par ELISpot.
peptide 33-41 sauvage mut ALVEICTEM ALVEICTEL
SFC/ 10~ CMNS 3 95 La fréquence de reconnaissance du peptide 33-41 muté est de 95 SFC / 10~
CMNS et de 3 SFC / 10G CMNS pour le peptide 33-41 sauvage.
Exemple N°8 ' Structure d'un lipopeptide La structure générale d'un lipopeptide est décrite dans la figure 2 Un lipopeptide se compose d'un acide palmitique de formule C,6H32~2 ou décrit dans le texte comme C15H31-COOH, d'un résidu lysine (acide aminé
basique ajouté à l'extrémité N-terminale du peptide) et d'un peptide dont la structure est choisie au sein des séquences décrites.
Pour le peptide 30-50 (séquence B) aa 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 K I K A L V E I C M~ E M3 E K E
G K I S K I
dans lequel M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S; M3 (aa 41) peut être X41 ou être muté en L; l'un au moins de M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Exemple de Lipopeptide construit avec la séquence 30-50 incluant les mutations de résistance 39 et 41 induites par les NRTI
aa 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 K I K A L V E I C A E L E K E
G K I S K I
Ce peptide est noté sous la forme aa30-aa50 (aa50=I) Dans cet exemple, l'ajout de la lysine se fait sur l'acide aminé 50 qui est une isoleucine (I). La fonction amine de la chaîne latérale de la lysine est modifiée par un acide palmitique et l'acide aminé C terminal est amidaté selon les réactions suivantes aa30-aa50-NH2 + lysine ~ aa30-aa50-NH-CO-Lysine aa30-aa50 -NH-CO-Lysine + COOH-C15H31 CONH2-aàa30-aa50 -NH-CO-Lysine-NH-CO-C15H3~
Cette structure varie selon les procédés industriels . Ainsi la lysine peut être ajoutée à l'extrémité C-terminale du peptide.
Cette structure est ensuite purifiée et conditionnée selon des procédés industriels répondant aux conditions nécessaires à l'obtention de lots cliniques avant utilisation pour immunisation chez l'homme.
Claims (32)
1. Procédé de traitement de pathologies infectieuses et/ou tumorales comprenant une phase de traitement par chimiothérapie anti-infectieuse et/ou anti-tumorale inducteur de mutations de résistance et une phase de vaccination thérapeutique dirigée contre ces mutations de résistance.
2. Agent de traitement des pathologies infectieuses ou tumorales comprenant au moins deux composants:
- le premier composant comprenant un médicament destiné au traitement des pathologies infectieuses et/ou anti-tumorale inducteur de mutations de résistance, - le second composant comportant un vaccin dirigé contre ces mutations de résistance, les deux composants étant destinés à une utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans le temps.
- le premier composant comprenant un médicament destiné au traitement des pathologies infectieuses et/ou anti-tumorale inducteur de mutations de résistance, - le second composant comportant un vaccin dirigé contre ces mutations de résistance, les deux composants étant destinés à une utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans le temps.
3. Peptides de 8 à 80 acides aminés de la séquence de la transcriptase inverse de VIH comportant au moins une mutation par substitution et/ou par insertion simple ou multiple par rapport à des séquences de référence de la transcriptase inverse établies en l'absence de tout traitement, mutation observée à la suite d'un traitement aux NRTI et/ou NNRTI dans des patients infectés par le VIH, les peptides étant capables d'induire une réponse médiée par les lymphocytes T spécifique de cette séquence mutée de la transcriptase inverse de VIH, à l'exception des peptides de séquence Z1-Y-V-D-D-Z2, Z1-Y-I-D-D-Z2 et Z1-Y-L-D-D-Z2 avec Z1 et Z2 étant au moins un acide aminé
quelconque.
quelconque.
4. Peptides selon la revendication 3, caractérisés par le fait qu'ils comportent de préférence de 15 à 50 acides aminés.
5. Peptides selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisés par le fait que leur séquence peptidique peut être précédée ou suivie par un ou des acides aminés neutres pour solubiliser ou stabiliser les peptides.
6. Peptides selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, de séquence ou partie de séquence suivante comportant au moins une mutation Mp:
n - avec X (qui sera écrit pour la commodité de ce qui suit : Xn) étant un acide aminé
correspondant à celui décrit dans la banque de données de Los Alamos à la même position de la séquence peptidique de la transcriptase inverse de VIH-1 et n étant la position d'un acide aminé (aa) décrit dans la banque de données de Los Alamos dans la séquence de la transcriptase inverse de VIH-1.
- avec Mp étant un acide aminé muté et p étant le numéro de la mutation observée.
* Séquence A:
aa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 dans laquelle M1 (aa 6) peut être muté en K, G ou S;
* Séquence B:
aa 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 X X X X X X
dans laquelle M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S;
M3 (aa 41) peut être X41 ou être muté en L;
l'un au moins de M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence C
aa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 X X X X X X X X X X X X X X X
X X X X X X
dans laquelle M1 (aa 6) peut être X6 ou être muté en K, G ou S;
M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S;
M3 (aa 41) peut être X41ou être muté en L;
l'un au moins de M1, M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence D
aa X X X X
dans laquelle M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
M11 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
l'un au moins de M4 à M12 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence E
aa X X X
dans laquelle M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
Ml1 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
M13 (aa 88) peut être X88 ou être muté en C;
M14 (aa 89) peut être X89 ou être muté en G ;
M15 (aa 90) peut être X90 ou être muté en I;
M16 (aa 98) peut être X98 ou être muté en G ou S;
M17 (aa 100) peut être X100 ou être muté en I;
M18 (aa 101) peut être X101 ou être muté en E, Q, R, I ou P;
M19 (aa 103) peut être X103 ou être muté en N, Q, R, T ou S;
M20 (aa 106) peut être X106 ou être muté en A, I ou L;
M21 (aa 108) peut être X108 ou être muté en I;
M22 (aa 115) peut être X115 ou être muté en F;
M23 (aa 116) peut être X116 ou être muté en Y;
M24 (aa 119) peut être X119 ou être muté en S;
l'un au moins de M4 à M24 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence F
aa 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 X X X X X X X X
dans laquelle M25 (aa 138) peut être X138 ou être muté en A, G, K ou Q;
M26 (aa 139) peut être X139 ou être muté en I, M ou K;
M27 (aa 141) peut être X141 ou être muté en E ;
M28 (aa 151) peut être X151 ou être muté en M;
M29 (aa 157) peut être X157 ou être muté en S;
l'un au moins de M25 à M29 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence G
aa X X X X X X X
dans laquelle M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M, L ou F;
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M30 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence H
aa dans laquelle M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M, L ou F;
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
l'un au moins de M30 à M34 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence I
aa 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 dans laquelle M34 (aa184) peut être X184 M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M34 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence J
aa 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 X X X X X X
dans laquelle M38 (aa 208) peut être X208 ou être muté en Y;
M39 (aa 210) peut être X210 ou être muté en W;
M40 (aa 211) peut être X211 ou être muté en K, A, E, N, D, G ou Q;
M41 (aa 214) peut être X214 ou être muté en L ou F;
M42 (aa 215) peut être X215 ou être muté en Y, F ou C;
M43 (aa 219) peut être X219 ou être muté en Q, E N, R, T ou W;
M44 (aa 223) peut être X223 ou être muté en Q;
M45 (aa 225) peut être X225 ou être muté en H;
M46 (aa 227) peut être X227 ou être muté en L;
M47 (aa 228) peut être X228 ou être muté en R, H ou F;
M48 (aa 233) peut être X233 ou être muté en V ou N;
M49 (aa 234) peut être X234 ou être muté en I, H ou P;
M50 (aa 236) peut être X236 ou être muté en M, S ou L;
M51 (aa 238) peut être X238 ou être muté en T ou S;
M52 (aa 240) peut être X240 ou être muté en A, D ou I;
l'un au moins de M38 à M52 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence K
aa 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 X X X X
dans laquelle M53 (aa 333) peut être muté en E ou D;
n - avec X (qui sera écrit pour la commodité de ce qui suit : Xn) étant un acide aminé
correspondant à celui décrit dans la banque de données de Los Alamos à la même position de la séquence peptidique de la transcriptase inverse de VIH-1 et n étant la position d'un acide aminé (aa) décrit dans la banque de données de Los Alamos dans la séquence de la transcriptase inverse de VIH-1.
- avec Mp étant un acide aminé muté et p étant le numéro de la mutation observée.
* Séquence A:
aa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 dans laquelle M1 (aa 6) peut être muté en K, G ou S;
* Séquence B:
aa 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 X X X X X X
dans laquelle M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S;
M3 (aa 41) peut être X41 ou être muté en L;
l'un au moins de M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence C
aa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 X X X X X X X X X X X X X X X
X X X X X X
dans laquelle M1 (aa 6) peut être X6 ou être muté en K, G ou S;
M2 (aa 39) peut être X39 ou être muté en A, K, N, P, M ou S;
M3 (aa 41) peut être X41ou être muté en L;
l'un au moins de M1, M2 et M3 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence D
aa X X X X
dans laquelle M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
M11 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
l'un au moins de M4 à M12 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence E
aa X X X
dans laquelle M4 (aa 62) peut être X62 ou être muté en V;
M5 (aa 65) peut être X65 ou être muté en R;
M6 (aa 67) peut être X67 ou être muté en N ou G;
M7 (aa 68) peut être X68 ou être muté en G ou N ;
M8 (aa 69) peut être X69 ou être muté en D, N, S, A, ou combiné avec de multiples insertions comme SG, SX, SSA, SSG, SSS, SEA, STS, ASG, SXX, ou XXX ;
M9 (aa 70) peut être X70 ou être muté en R, N, E ou S;
M10 (aa 74) peut être X74 ou être muté en V ou I;
Ml1 (aa 75) peut être X75 ou être muté en M, I, L ou T;
M12 (aa 77) peut être X77 ou être muté en L;
M13 (aa 88) peut être X88 ou être muté en C;
M14 (aa 89) peut être X89 ou être muté en G ;
M15 (aa 90) peut être X90 ou être muté en I;
M16 (aa 98) peut être X98 ou être muté en G ou S;
M17 (aa 100) peut être X100 ou être muté en I;
M18 (aa 101) peut être X101 ou être muté en E, Q, R, I ou P;
M19 (aa 103) peut être X103 ou être muté en N, Q, R, T ou S;
M20 (aa 106) peut être X106 ou être muté en A, I ou L;
M21 (aa 108) peut être X108 ou être muté en I;
M22 (aa 115) peut être X115 ou être muté en F;
M23 (aa 116) peut être X116 ou être muté en Y;
M24 (aa 119) peut être X119 ou être muté en S;
l'un au moins de M4 à M24 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence F
aa 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 X X X X X X X X
dans laquelle M25 (aa 138) peut être X138 ou être muté en A, G, K ou Q;
M26 (aa 139) peut être X139 ou être muté en I, M ou K;
M27 (aa 141) peut être X141 ou être muté en E ;
M28 (aa 151) peut être X151 ou être muté en M;
M29 (aa 157) peut être X157 ou être muté en S;
l'un au moins de M25 à M29 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence G
aa X X X X X X X
dans laquelle M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M, L ou F;
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M30 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence H
aa dans laquelle M30 (aa 172) peut être X172 ou être muté en K;
M31 (aa 178) peut être X178 ou être muté en M, L ou F;
M32 (aa 179) peut être X179 ou être muté en I, L, D ou E;
M33 (aa 181) peut être X181 ou être muté en C ou I;
M34 (aa 184) peut être X184 ou être muté en V, I ou T;
l'un au moins de M30 à M34 représentant un acide aminé portant une mutation.
Séquence I
aa 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 dans laquelle M34 (aa184) peut être X184 M35 (aa 188) peut être X188 ou être muté en L, C ou H ;
M36 (aa 189) peut être X189 ou être muté en I;
M37 (aa 190) peut être X190 ou être muté en A, S, E, Q ou T;
l'un au moins de M34 à M37 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence J
aa 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 X X X X X X
dans laquelle M38 (aa 208) peut être X208 ou être muté en Y;
M39 (aa 210) peut être X210 ou être muté en W;
M40 (aa 211) peut être X211 ou être muté en K, A, E, N, D, G ou Q;
M41 (aa 214) peut être X214 ou être muté en L ou F;
M42 (aa 215) peut être X215 ou être muté en Y, F ou C;
M43 (aa 219) peut être X219 ou être muté en Q, E N, R, T ou W;
M44 (aa 223) peut être X223 ou être muté en Q;
M45 (aa 225) peut être X225 ou être muté en H;
M46 (aa 227) peut être X227 ou être muté en L;
M47 (aa 228) peut être X228 ou être muté en R, H ou F;
M48 (aa 233) peut être X233 ou être muté en V ou N;
M49 (aa 234) peut être X234 ou être muté en I, H ou P;
M50 (aa 236) peut être X236 ou être muté en M, S ou L;
M51 (aa 238) peut être X238 ou être muté en T ou S;
M52 (aa 240) peut être X240 ou être muté en A, D ou I;
l'un au moins de M38 à M52 représentant un acide aminé portant une mutation.
* Séquence K
aa 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 X X X X
dans laquelle M53 (aa 333) peut être muté en E ou D;
7. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide selon les revendications 3 à 6, dispersé dans des excipients pharmaceutiquement acceptables.
8. Peptides selon l'une des revendications 3 à 6 ou composition selon la revendication 5, pour leur utilisation à titre de vaccin.
9. Vaccin caractérisé par le fait qu'il contient au moins un peptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 6.
10. Vaccin caractérisé par le fait qu'il contient au moins un peptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 6 auquel sont ajoutés des immunomodulateurs tels que des cytokines ou chimiokines.
11. Vaccin caractérisé par le fait qu'il contient au moins un peptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 6 auquel sont ajoutés des adjuvants tels que des lipides (acides gras, phospholipides, adjuvant incomplet de Freund), des copolymères anioniques, des motifs CpG......
12. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est couplé à un lipopeptide.
13. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est couplé à une lipoprotéine.
14. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est couplé à des micro ou nano particules (a definir).
15. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est couplé à un ou des liposomes.
16. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est couplé à un ou des niosomes.
17. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est exprimé dans un virus recombinant.
18. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est exprimé dans un virus atténué ou inactivé.
19. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est exprimé dans un vecteur viral recombinant.
20. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est exprimé dans une bactérie recombinante.
21. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est exprimé dans un vecteur bactérien recombinant.
22. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'au moins un peptide selon les revendications 3 à 6 est exprimé dans une cellule présentatrice d'antigène.
23. Vaccin selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins un ADN nu codant au moins un peptide tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 3 à 6.
24. Agent de traitement des malades infectés par le VIH, comportant au moins deux compositions, la première composition comprenant au moins un médicament de la famille des NRTI et/ou NNRTI, et la seconde composition comportant au moins un peptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 6, ces compositions étant destinées à une application séquentielle, séparée ou non dans le temps ou simultanée.
25. Procédé de prévention ou traitement d'une infection par le virus VIH
consistant en l'induction d'une réponse immunitaire de type T spécifique en réponse à
l'administration d'un vaccin tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 9 à 23.
consistant en l'induction d'une réponse immunitaire de type T spécifique en réponse à
l'administration d'un vaccin tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 9 à 23.
26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé par le fait que la ou les mutations du virus VIH se situent dans l'enzyme transcriptase inverse.
27. Séquences peptidiques de 8 à 20 acides aminés, caractérisées par le fait qu'elles sont reconnues en tant que séquences épitopiques par les cellules T
spécifiques des séquences peptidiques vaccinales introduites à la vaccination.
spécifiques des séquences peptidiques vaccinales introduites à la vaccination.
28. Séquences épitopiques selon la revendication 27, caractérisées par le fait qu'elles sont des séquences peptidiques de 8 à 20 acides aminés contigus choisies dans les séquences peptidiques de A à K possédant au moins une mutation Mp.
29. Séquences épitopiques selon la revendication 27, caractérisées par le fait qu'elles sont des séquences peptidiques de 8 à 10 acides aminés contigus choisies dans les séquences peptidiques de A à K possédant au moins une mutation Mp.
30. Séquences épitopiques selon la revendication 27, caractérisées par le fait qu'elles sont des séquences peptidiques de 9 acides aminés contigus choisies dans les séquences peptidiques de A à K possédant au moins une mutation Mp
31. Utilisation des séquences épitopiques selon l'une quelconque des revendications 27 à 30, pour la détermination et la quantification des cellules T spécifiques de ces séquences épitopiques.
32. Composition diagnostique de détermination des cellules T spécifiques de ces séquences épitopiques caractérisée par le fait qu'elle comprend au moins une séquence épitopique telle que définie dans l'une quelconque des revendications 27 à 30.
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| US6491907B1 (en) * | 1998-11-10 | 2002-12-10 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Recombinant parvovirus vectors and method of making |
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2001
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