CN104911259A - 抗艾滋病药物筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗艾滋病药物筛选方法，以PBS为模板、以PBS互补的DNA为引物，70℃，反应10min，依次加入缓冲液，水，DTT,dNTPS、药物、HIV RT，template/primer的浓度为1uM，50mM pH8.0 tris-HCl，60mM KCl，8mM MgCl₂，1mM DTT，500mM dNTPS，0.5U HIV RT，于37℃反应1h，通过丙烯酰胺电泳分离，Storm 840扫描，定量分析，计算药物的HIV RT抑制率。利用该方法能够方便、快速地筛选抗HIV-1药物，为抗HIV-1药物提供新途径。

Description

抗艾滋病药物筛选方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗艾滋病药物的筛选方法。

背景技术

获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS，音译为艾滋病)，是一种由人类免疫缺乏病毒(简称HIV)的反转录病毒感染后，因免疫系统受到破坏，逐渐成为许多伺机性疾病的攻击目标，促成多种临床症状，统称为综合症，而非单纯的一种疾病，是一种恶性传染病。2013年世界卫生组织公布称全球有200多万年龄在10岁和19岁之间的青少年携带艾滋病毒，另有数百万青少年面临着感染危险；另外，据国家卫生计生委公布，截至2013年9月30日，全国共报告现存活艾滋病病毒感染者和艾滋病病人约43.4万例。

目前，艾滋病疫苗尚未研制成功，药物治疗是用于抗AIDS和HIV感染的主要手段, 经美国FDA 批准上市的抗HIV药物已有30多种。临床上治疗AIDS和HIV 感染所采用的高效抗逆转录病毒疗法(highly active anti-retrovirus therapy, HAART)可以降低病毒对免疫系统的损害，一定程度上恢复其免疫功能，提高AIDS患者和HIV携带者的生存时间和生活质量。但是，由于HIV的高度变异性使HAART的治疗效果不稳定，目前已上市的药物不能将HIV病毒完全清除，而且毒副作用严重，影响患者对治疗方案的依从性。因此，急需寻找高效、低毒的新型抗艾滋病药物。

HIV-1逆转录酶(RT)是一个由P66和P51亚基组成的异二聚体酶,由HIV pol基因编码,分别有560和440个氨基酸残基。是一种具有RNA引物RNA依赖的DNA聚合酶活性(RDDP)和DNA依赖性DNA聚合酶活性(DDDP)和核糖核酸酶(RNase)H活性多功能酶，在HIV-1生命周期早期过程中发挥重要作用。

目前感染的艾滋病毒主要是HIV-1病毒，HIV-1病毒由两条单链RNA组成，以氢键相连接稳定存在于衣壳蛋白内。HIV-1的基因组很小，不到10 kb，在5’端有帽结构，3’端有poly(A)尾巴。在 HIV感染的过程中，逆转录酶 (reversetranscriptase, RT)、整合酶(integrase, IN)、蛋白酶(protease, PR)三种关键酶在整个HIV生命周期中起到决定性作用。

逆转录是病毒细胞核分解后，在RT的手掌区，以单链病毒基因RNA引物结合部位(viral primer binding site, PBS)为模板、以细胞的t RNA的3’端为引物，在RT的RNA 依赖的 DNA 聚合酶(RNA-dependent DNApolymerase，RDDP)活性作用下，合成 RNADNA杂交链，继而在RT的核糖核酸酶H(RNase H)活性下，剪切下RNA，保留DNA单链，再以DNA负链为模板，在RT的DNA依赖的DNA聚合酶(DNA- dependent DNA polymerase，DDDP)活性作用下，合成DNA双链，再经过DNA整合酶的作用整合到宿主细胞的DNA上，病毒基因就会进入到宿主细胞的DNA中。在此过程中可能产生病毒的突变体。在病毒的蛋白质整合酶与宿主的DNA修复酶共同作用下，病毒基因组与宿主DNA连接起来，形成宿主染色体DNA。

寻找高效、低毒的抗艾滋病药物，始终是本领域的研究热点，目前国内抗艾滋病药物的筛选方法层出不穷，仍鲜有简便、高效筛选抗艾滋病药物的方法报道。

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种抗艾滋病药物的筛选方法，可以有效、快速的完成抗艾滋病药物的筛选。

本发明提供一种抗艾滋病药物的筛选方法，包括以下步骤：

（1)制备模板和引物：在对HIV-1反转录起始被设计在RDDP活性和RT RNase H裂解活性的药物靶点，以PBS为模板、以PBS互补的DNA为引物；所述的PBS模板是2uL 1mM 21 nt HIV RNA template( 3’-ACAAGC CCGCG GUGAC GAUCU-5’)，所述的DNA引物为1uL 1mM 11 nt DNA primer (5’-γ-³²P-TGT TCG GGC GCC A-3’)；

（2)依次加入97μL H₂O，70℃，10 min, 缓慢冷却到室温；

（3)取template/primer溶液1uL，依次加入缓冲液，水，DTT, dNTPS、药物、HIV RT。

（4)制备10μL 反应体系，template/primer的浓度为1uM，50 mM pH 8.0 tris-HCl，60 mM KCl, 8mM MgCl₂，1mM DTT，500 mM dNTPS, 0.5 U HIV RT，于37℃反应1h。

（5)通过丙烯酰胺电泳分离，Storm 840扫描，定量分析，计算药物的HIV RT抑制率。

以上步骤（1）中以21 nt PBS的HIV RNA基因组PBS作为模板，11 nt DNA作为引物，即细胞tRNA₃ ^Lys互补序列的一部分。由DNA集成技术合成，其序列的选择如下：

11nt DNA引物：5’- TTCGGGCGCCA-3’

21 nt HIV RNA template: 3’-ACAAGCCCGCGGUGACGAUCU-5’

21nt HIV RNA模板：3’- ACAAGCCCGCGGUGACGAUCU-5’

11nt tRNA₃ ^Lys引物：11 nt tRNAlys3 primer: 5’-UUCGGGCGCCA-3’

5’- UUCGGGCGCCA-3’

14nt RNA-DNA引物：14 nt RNA-DNA primer: 5’-UUCGGGCGCCAdCdTdG-3’ (the last three bases are DNA)

5’- UUCGGGCGCCADCDTDG-3’（最后的三个碱基是DNA）。

上述中，以PBS互补的DNA为引物；还可以扩展以8-36　nt DNA作为引物，是指细胞tRNA₃ ^Lys互补序列的一部分作为引物。

以上所述的RNA的PBS模板、DNA引物的5’末端是用[γ-³²P] ATP(3000 Ci/mmol)标记，标记的过程包括以下步骤：加入6μL2 mM的RNA模板或引物，1μL T4多核苷酸激酶，2μL[γ-³²P] ATP (3000 Ci/mmol)和1μL T4多核苷酸激酶缓冲液，37°C培养1小时，然后置于65℃灭活25分钟。加入1.1μL 3M NaCl和33.3μL乙醇于-20°C下15分钟，高速离心机（13 K）离心20分钟分离得到放射性标记的RNA或DNA，处理废液。底部的白色小颗粒室温干燥15分钟后加入300μL水。

上述对HIV-1反转录起始被设计在RDDP活性和RT RNase H裂解活性的药物靶点，还可以15-40 nt PBS的HIV RNA基因组PBS作为模板，8-36　nt DNA（即细胞tRNA₃ ^Lys互补序列的一部分）作为引物，通过抑制DNA聚合酶，促进RNase　H酶靶向HIV逆转录酶药物筛选。

上述中，还要进行DNA聚合酶活性的测定、RNase H活性的测定、DNA聚合酶的筛选模型和优化RT浓度和RNase H活性的反应时间筛选系统，以下分别进行介绍：

1、DNA聚合酶活性的测定

为测量RT抑制DNA聚合酶活性，采用采用21 ntRNA模板和5’-放射性标记的11nt DNA引物进行筛选。

（1）制备10μL RNA混合液：400 nM的RNA模板，200 nM 5’-放射性标记的DNA引物，使终浓度缓冲液中含有50 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃），100 nM KCl，1 mM EDTA, 1 mM二硫苏糖醇，8 mM MgCl₂；

（2）混合液70℃变性10分钟，缓慢冷却后加入1 μL 核苷三磷酸dNTPs（1 mM）；

（3） 加入不同浓度的抑制剂、药物和RT（0.2 U 到1U）（EMD Chemical, Inc.），于37℃下培养30分钟至180分钟；

（4）加入10μl缓冲液（10nM EDTA，pH 8，90%甲酰胺（V/V），和0.1%考马斯亮蓝和溴酚蓝）终止反转录。

（5）灭活的7 M尿素、15%（V/V）聚丙烯酰胺和1×TBE缓冲液在1000 V条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳1小时。结果采用 Storm 840进行分析。

 2、RNase H活性的测定

为了测量RNase H RT的活性，选择5-放射性标记的21 nt RNA模板和11nt DNA引物。

（1）10μL反应体系测定RNA / DNA杂交双链基板（200 nm）。终浓度缓冲液中含有50 mM Tris-HCl（p H 8.0,25℃），100nM KCl，1 mM EDTA, 1 mM二硫苏糖醇，8 mM MgCl₂；

（2）70℃变性10分钟，缓慢冷却后加入1μL 核苷三磷酸dNTPs（1μM）；

（3）加入不同浓度的抑制剂、参考药物和HIV-1逆转录酶（0.1U 到1U），37℃培养30分钟至120分钟；

（4）加入2×10μl缓冲液（10nM EDTA，pH 8，90%甲酰胺（V／V），和0.1%的二甲苯胺和溴酚蓝）终止反转录。

（5）灭活的7 M尿素、15%（V／V）聚丙烯酰胺和1×TBE缓冲液在1000 V条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳1小时。结果采用 Storm 840进行分析。

 3、DNA聚合酶的筛选模型

用不同浓度的模板/引物，RT和反应时间，最好的RRDD 活性筛选模型如下：

11ntDNA引物： 5’-[γ-^32P] ATP-TTCGGGCGCCA-3’

21nt HIV RNA模板：3’-ACAAGCCCGCGGUGACGAUCU-5’

（1）10μL RNA混合液：400 nM的RNA模板，200 nM 5’-放射性标记的DNA引物，终浓度缓冲液中含有50 mM Tris-HCl（p H 8，25℃），100nM KCl，1 mM EDTA，1 mM二硫苏糖醇和8 mM MgCl₂；

（2）70℃变性10分钟，缓慢冷却，加入1μ L 核苷三磷酸dNTPs（1mm）；

（3）加入HIV-1逆转录酶（1 U）37℃灭活60分钟。

 4、优化RT浓度和RNase H活性的反应时间筛选系统

在0.1U RT 10分钟，30分钟，60分钟中的百分产率分别为1.9，3.2，5.9；在0.2U RT HIV逆转录酶10分钟，30分钟，60分钟中的百分产率是4.1，6.8，8.2；在0.5U的HIV逆转录酶10分钟，30分钟，60分钟中的百分比率分别是20.5，73.6，85.8。最好的RNaseH活性筛选系统是0.5U RT和10min反应时间。

本发明的有益效果是：

本发明以反转录PCR筛选起始靶点筛选抑制HIV逆转录酶（RT）的DNA聚合酶活性，促进RNaseH酶活性的小分子，提供一种筛选抗艾滋病药物的方法，利用该方法能够方便、快速地筛选抗艾滋病药物，为艾滋病药物的筛选提供了新途径。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

本发明抗艾滋病药物筛选方法，包括以下步骤：

（1）制备模板和引物：以PBS为模板、以PBS互补的DNA为引物；所述的PBS模板是2uL 1mM 21 nt HIV RNA template( 3’-ACAAGC CCGCG GUGAC GAUCU-5’)，所述的DNA引物为1uL 1mM 11 nt DNA primer (5’-γ-³²P-TGT TCG GGC GCC A-3’)；

（2）依次加入97μL H₂O，70℃，10 min，缓慢冷却到室温；

（3）取template/primer溶液1μL，依次加入缓冲液，水，DTT, dNTPS、药物、HIV RT；

（4）制备10μL 反应体系，template/primer的浓度为1uM，50 mM pH 8.0 tris-HCl， 60 mM KCl，8mM MgCl₂, 1mM DTT，500 mM dNTPS，0.5 U HIV RT，于37℃反应1h；

（5）通过丙烯酰胺电泳分离，Storm 840扫描，定量分析，计算药物的HIV RT抑制率。

对HIV-1反转录起始被设计在RDDP活性和RT RNase H裂解活性的药物靶点，以15-40 nt PBS的HIV RNA基因组PBS作为模板，8-36　nt DNA作为引物，通过抑制DNA聚合酶，促进RNase　H酶靶向HIV逆转录酶药物筛选。所述的8-36　nt DNA作为引物，是指细胞tRNA₃ ^Lys互补序列的一部分作为引物。

以上步骤（1）中以21 nt PBS的HIV RNA基因组PBS作为模板，11 nt DNA作为引物，即细胞tRNA₃ ^Lys互补序列的一部分。由DNA集成技术合成，其序列的选择如下：

11nt DNA引物：5’- TTCGGGCGCCA-3’

21 nt HIV RNA template: 3’-ACAAGCCCGCGGUGACGAUCU-5’

21nt HIV RNA模板：3’- ACAAGCCCGCGGUGACGAUCU-5’

11nt tRNA₃ ^Lys引物：11 nt tRNAlys3 primer: 5’-UUCGGGCGCCA-3’

5’- UUCGGGCGCCA-3’

14nt RNA-DNA引物：14 nt RNA-DNA primer: 5’-UUCGGGCGCCAdCdTdG-3’ (the last three bases are DNA)

5’- UUCGGGCGCCADCDTDG-3’（最后的三个碱基是DNA）。

实施例2

以PBS互补的DNA为引物；还可以扩展以8-36　nt DNA作为引物，是指细胞tRNA₃ ^Lys互补序列的一部分作为引物，所述的RNA的PBS模板、DNA引物的5’末端是用[γ-³²P] ATP(3000 Ci/mmol)标记，标记的过程包括以下步骤：加入6μL2 mM的RNA模板或引物，1μL T4多核苷酸激酶，2μL[γ-³²P] ATP (3000 Ci/mmol)和1μL T4多核苷酸激酶缓冲液，37°C培养1小时，然后置于65℃灭活25分钟。加入1.1μL 3M NaCl和33.3μL乙醇于-20°C下15分钟，高速离心机（13 K）离心20分钟分离得到放射性标记的RNA或DNA，处理废液。底部的白色小颗粒室温干燥15分钟后加入300μL水。

实施例3

对HIV-1反转录起始被设计在RDDP活性和RT RNase H裂解活性的药物靶点，还可以15-40 nt PBS的HIV RNA基因组PBS作为模板，8-36　nt DNA（即细胞tRNA₃ ^Lys互补序列的一部分）作为引物，通过抑制DNA聚合酶，促进RNase　H酶靶向HIV逆转录酶药物筛选。

上述中，还要进行DNA聚合酶活性的测定、RNase H活性的测定、DNA聚合酶的筛选模型和优化RT浓度和RNase H活性的反应时间筛选系统，以下分别进行介绍：

 1、DNA聚合酶活性的测定

为测量RT抑制DNA聚合酶活性，采用采用21 ntRNA模板和5’-放射性标记的11nt DNA引物进行筛选。

（1）制备10μL RNA混合液：400 nM的RNA模板，200 nM 5’-放射性标记的DNA引物，使终浓度缓冲液中含有50 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃），100 nM KCl，1 mM EDTA, 1 mM二硫苏糖醇，8 mM MgCl₂；

（2）混合液70℃变性10分钟，缓慢冷却后加入1 μL 核苷三磷酸dNTPs（1 mM）；

（3） 加入不同浓度的抑制剂、药物和RT（0.2 U 到1U）（EMD Chemical, Inc.），于37℃下培养30分钟至180分钟；

（4）加入10μl缓冲液（10nM EDTA，pH 8，90%甲酰胺（V/V），和0.1%考马斯亮蓝和溴酚蓝）终止反转录。

（5）灭活的7 M尿素、15%（V/V）聚丙烯酰胺和1×TBE缓冲液在1000 V条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳1小时。结果采用 Storm 840进行分析。

 2、RNase H活性的测定

为了测量RNase H RT的活性，选择5-放射性标记的21 nt RNA模板和11nt DNA引物。

（1）10μL反应体系测定RNA / DNA杂交双链基板（200 nm）。终浓度缓冲液中含有50 mM Tris-HCl（p H 8.0,25℃），100nM KCl，1 mM EDTA, 1 mM二硫苏糖醇，8 mM MgCl₂；

（2）70℃变性10分钟，缓慢冷却后加入1μL 核苷三磷酸dNTPs（1μM）；

（3）加入不同浓度的抑制剂、参考药物和HIV-1逆转录酶（0.1U 到1U），37℃培养30分钟至120分钟；

（4）加入2×10μl缓冲液（10nM EDTA，pH 8，90%甲酰胺（V／V），和0.1%的二甲苯胺和溴酚蓝）终止反转录。

（5）灭活的7 M尿素、15%（V／V）聚丙烯酰胺和1×TBE缓冲液在1000 V条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳1小时。结果采用 Storm 840进行分析。

 3、DNA聚合酶的筛选模型

用不同浓度的模板/引物，RT和反应时间，最好的RRDD 活性筛选模型如下：

11ntDNA引物： 5’-[γ-^32P] ATP-TTCGGGCGCCA-3’

21nt HIV RNA模板：3’-ACAAGCCCGCGGUGACGAUCU-5’

（1）10μL RNA混合液：400 nM的RNA模板，200 nM 5’-放射性标记的DNA引物，终浓度缓冲液中含有50 mM Tris-HCl（p H 8，25℃），100nM KCl，1 mM EDTA，1 mM二硫苏糖醇和8 mM MgCl₂；

（2）70℃变性10分钟，缓慢冷却，加入1μ L 核苷三磷酸dNTPs（1mm）；

（3）加入HIV-1逆转录酶（1 U）37℃灭活60分钟。

 4、优化RT浓度和RNase H活性的反应时间筛选系统

在0.1U RT 10分钟，30分钟，60分钟中的百分产率分别为1.9，3.2，5.9；在0.2U RT HIV逆转录酶10分钟，30分钟，60分钟中的百分产率是4.1，6.8，8.2；在0.5U的HIV逆转录酶10分钟，30分钟，60分钟中的百分比率分别是20.5，73.6，85.8。最好的RNaseH活性筛选系统是0.5U RT和10min反应时间。

以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。本发明不限于以上实施例，可以有许多变形。本领域的技术人员从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

采用本发明方法筛选抗艾滋病药物的应用实施例：

应用实施例1

采用本发明方法对壮药山风提取物及分离得到的化合物进行了筛选，发现α-L-正丁基山梨糖苷、菠甾醇3-O-β-D-葡萄糖苷-6'-O-棕榈酸酯浓度为1mg/mL时，抑制率约为20%，对HIV RT有一定的抑制作用。上述壮药山风Blumea aromatica分离的α-L-正丁基山梨糖苷、菠甾醇3-O-β-D-葡萄糖苷-6'-O-棕榈酸酯是采用柱色谱分离技术进行分离纯化,运用MS和NMR分析鉴定化合物结构。抗艾滋病作用的步骤为：

以PBS为模板、以PBS互补的DNA为引物；所述的PBS模板是2uL 1mM 21 nt HIV RNA template( 3’-ACAAGC CCGCG GUGAC GAUCU-5’)，所述的DNA引物为1uL 1mM 11 nt DNA primer (5’-γ-³²P-TGT TCG GGC GCC A-3’)；

（2）依次加入97uL H₂O，70℃，10 min，缓慢冷却到室温；

（3）取template/primer溶液1uL，依次加入缓冲液，水，DTT, dNTPS、药物、HIV RT；

（4）制备10uL 反应体系，template/primer的浓度为1uM，50 mM pH 8.0 tris-HCl， 60 mM KCl，8mM MgCl₂, 1mM DTT，500 mM dNTPS，0.5 U HIV RT，于37℃反应1h；

（5）通过丙烯酰胺电泳分离，Storm 840扫描，定量分析，计算药物的HIV RT抑制率。

应用实施例2

采用本发明方法对从滕茶分离的双氢杨梅素进行筛选，结果表明浓度为1mg/mL时，抑制率约为20%，对HIV RT有一定的抑制作用。方法与应用实施例1相同。

应用实施例3

采用本发明方法对合成小分子化合物进行筛选，发现2,2’-双(5, 6-二苯基-1, 2, 4-三嗪基-3)-4,4’-联吡啶(btpbp))对HIV RT有一定的抑制作用(在1mg/mL浓度时，抑制率约为20%）。方法与应用实施例1相同。

Claims (7)

1.抗艾滋病药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备模板和引物：在对HIV-1反转录起始被设计在RDDP活性和RT RNase H裂解活性的药物靶点，以RNA的PBS为模板、以PBS互补的DNA为引物；所述的PBS模板是2uL 1mM 21 nt HIV RNA template( 3’-ACAAGC CCGCG GUGAC GAUCU-5’)，所述的DNA引物为1uL 1mM 11 nt DNA primer (5’-γ-³²P-TGT TCG GGC GCC A-3’)；

（2）依次加入97 μL H₂O，70℃10 min，缓慢冷却到室温；

（3）取template/primer溶液1μL，依次加入缓冲液，水，DTT, dNTPS、药物、HIV RT；

（4）制备10μL 反应体系，template/primer的浓度为1uM，50 mM pH 8.0 tris-HCl， 60 mM KCl，8mM MgCl₂, 1mM DTT，500 mM dNTPS，0.5 U HIV RT，于37℃反应1h；

（5）通过丙烯酰胺电泳分离，Storm 840扫描，定量分析，计算药物的HIV RT抑制率。

2.根据权利要求1所述的抗艾滋病药物筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）中以21 nt PBS的HIV RNA基因组PBS作为模板，11 nt DNA作为引物，即细胞tRNA₃ ^Lys互补序列的一部分；

由DNA集成技术合成，其序列的选择如下：

11nt DNA引物：5’- TTCGGGCGCCA-3’

21 nt HIV RNA template: 3’-ACAAGCCCGCGGUGACGAUCU-5’

21nt HIV RNA模板：3’- ACAAGCCCGCGGUGACGAUCU-5’

11nt tRNA₃ ^Lys引物：11 nt tRNAlys3 primer: 5’-UUCGGGCGCCA-3’

5’- UUCGGGCGCCA-3’

14nt RNA-DNA引物：14 nt RNA-DNA primer: 5’-UUCGGGCGCCAdCdTdG-3’ (the last three bases are DNA)

5’- UUCGGGCGCCADCDTDG-3’（最后的三个碱基是DNA）。

3.根据权利要求1所述的抗艾滋病药物筛选方法，其特征在于，所述的RNA的PBS模板、DNA引物的5’末端是用[γ-³²P] ATP(3000 Ci/mmol)标记。

4.根据权利要求3所述的抗艾滋病药物筛选方法，其特征在于，所述的RNA的PBS模板、DNA引物的5’末端是用[γ-³²P] ATP(3000 Ci/mmol)标记，包括以下步骤：加入6μL2 mM的RNA模板或引物，1μL T4多核苷酸激酶，2μL[γ-³²P] ATP (3000 Ci/mmol)和1μL T4多核苷酸激酶缓冲液，37°C培养1小时，然后置于65℃灭活25分钟；加入1.1μL 3M NaCl和33.3μL乙醇于-20°C下15分钟，高速离心机（13 K）离心20分钟分离得到放射性标记的RNA或DNA，处理废液；

底部的白色小颗粒室温干燥15分钟后加入300μL水。

5.根据权利要求1所述的抗艾滋病药物筛选方法，其特征在于，以PBS互补的DNA为引物；还可以扩展以8-36　nt DNA作为引物，是指细胞tRNA₃ ^Lys互补序列的一部分作为引物。

6.根据权利要求1所述的抗艾滋病药物筛选方法，其特征在于，在对HIV-1反转录起始被设计在RDDP活性和RT RNase H裂解活性的药物靶点基础上，还可以15-40 nt PBS的HIV RNA基因组PBS作为模板，8-36　nt DNA作为引物，通过抑制DNA聚合酶，促进RNase　H酶靶向HIV逆转录酶药物筛选。

7.根据权利要求6所述的抗艾滋病药物筛选方法，其特征在于，对抗艾滋病药物的筛选过程中，还包括进行DNA聚合酶活性的测定、RNase H活性的测定、DNA聚合酶的筛选模型和优化RT浓度和RNase H活性的反应时间筛选系统：

（1）DNA聚合酶活性的测定

为测量RT抑制DNA聚合酶活性，采用采用21 ntRNA模板和5’-放射性标记的11nt DNA引物进行筛选；

（a）制备10μL RNA混合液：400 nM的RNA模板，200 nM 5’-放射性标记的DNA引物，使终浓度缓冲液中含有50 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃），100 nM KCl，1 mM EDTA, 1 mM二硫苏糖醇，8 mM MgCl₂；

（b）混合液70℃变性10分钟，缓慢冷却后加入1 μL 核苷三磷酸dNTPs（1 mM）；

（c） 加入不同浓度的抑制剂、药物和RT（0.2 U 到1U）（EMD Chemical, Inc.），于37℃下培养30分钟至180分钟；

（d）加入10μl缓冲液（10nM EDTA，pH 8，90%甲酰胺（V/V），和0.1%考马斯亮蓝和溴酚蓝）终止反转录；

（e）灭活的7 M尿素、15%（V/V）聚丙烯酰胺和1×TBE缓冲液在1000 V条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳1小时；

结果采用 Storm 840进行分析；

（2）RNase H活性的测定

为了测量RNase H RT的活性，选择5-放射性标记的21 nt RNA模板和11nt DNA引物；

（a）10μL反应体系测定RNA / DNA杂交双链基板（200 nm）；

终浓度缓冲液中含有50 mM Tris-HCl（p H 8.0,25℃），100nM KCl，1 mM EDTA, 1 mM二硫苏糖醇，8 mM MgCl₂；

（b）70℃变性10分钟，缓慢冷却后加入1μL 核苷三磷酸dNTPs（1μM）；

（c）加入不同浓度的抑制剂、参考药物和HIV-1逆转录酶（0.1U 到1U），37℃培养30分钟至120分钟；

（d）加入2×10μl缓冲液（10nM EDTA，pH 8，90%甲酰胺（V／V），和0.1%的二甲苯胺和溴酚蓝）终止反转录；

（e）灭活的7 M尿素、15%（V／V）聚丙烯酰胺和1×TBE缓冲液在1000 V条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳1小时；

结果采用 Storm 840进行分析；

（3）DNA聚合酶的筛选模型

用不同浓度的模板/引物，RT和反应时间，最好的RRDD 活性筛选模型如下：

11ntDNA引物： 5’-[γ-^32P] ATP-TTCGGGCGCCA-3’

21nt HIV RNA模板：3’-ACAAGCCCGCGGUGACGAUCU-5’

（a）10μL RNA混合液：400 nM的RNA模板，200 nM 5’-放射性标记的DNA引物，终浓度缓冲液中含有50 mM Tris-HCl（p H 8，25℃），100nM KCl，1 mM EDTA，1 mM二硫苏糖醇和8 mM MgCl₂；

（b）70℃变性10分钟，缓慢冷却，加入1μ L 核苷三磷酸dNTPs（1mm）；

（c）加入HIV-1逆转录酶（1 U）37℃灭活60分钟；

（4）优化RT浓度和RNase H活性的反应时间筛选系统

在0.1U RT 10分钟，30分钟，60分钟中的百分产率分别为1.9，3.2，5.9；在0.2U RT HIV逆转录酶10分钟，30分钟，60分钟中的百分产率是4.1，6.8，8.2；在0.5U的HIV逆转录酶10分钟，30分钟，60分钟中的百分比率分别是20.5，73.6，85.8；

最好的RNaseH活性筛选系统是0.5U RT和10min反应时间。