JP2023518983A - コロナウイルス感染症２０１９（ｃｏｖｉｄ－１９）を検出するためのアッセイ - Google Patents

コロナウイルス感染症２０１９（ｃｏｖｉｄ－１９）を検出するためのアッセイ Download PDF

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Abstract

本開示は、試料中の２０１９－Ｃｏｖを増幅及び検出するための材料及び方法であって、増幅オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドプローブの種々の組合せを含む、材料及び方法に関する。本開示はまた、オリゴヌクレオチド配列、キット及びＣＯＶＩＤ－１９を検出するための方法に関する。

Description

本出願は、２０２０年３月２６日に出願された米国仮出願第６３／０００，３０４号、２０２０年３月２７日に出願された米国仮出願第６３／０００，９７１号、２０２０年４月３日に出願された米国仮出願第６３／００４，７７３号、２０２０年７月８日に出願された米国仮出願第６３／０４９、２３７号、及び２０２１年３月２日に出願された米国仮出願第６３／１５５，５９９号の利益を請求し、前記出願のそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願と同時に提出され、以下のように識別される、コンピューター可読ヌクレオチド／アミノ酸配列リストは、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる：２０２１年３月２４日に作成された、「２０２１－０３－２４＿３８３９１－６０１＿ＳＱＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の、１つの５，１３６バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。
本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの標的核酸配列を増幅して、ＣＯＶＩＤ－１９を検出するための方法に関する。
新規コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ））は、２０１９年後半に中国湖北省で、発熱、重症呼吸器疾患及び肺炎を引き起こすヒト病原体として出現した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と関連するこの疾患は、ＣＯＶＩＤ－１９と命名された。この新規コロナウイルスは、ベータコロナウイルス属のメンバーであり、いくつかのコウモリコロナウイルス及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）と密接に関連する。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとは異なり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はヒトの間で急速に伝播される。
２０２１年２月末の時点で、２００を超える国で１億例を超えるＣＯＶＩＤ－１９が確認され、ＣＯＶＩＤ－１９の合併症が２５０万人を超える個人において死亡原因として挙げられている。
（発明の要旨）
本開示は、試料中のコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を増幅及び検出するための、オリゴヌクレオチドを含む試薬を提供する。一部の実施態様において、オリゴヌクレオチドのセットは、少なくとも１種の第１の増幅オリゴヌクレオチド、少なくとも１種の第２の増幅オリゴヌクレオチド及び少なくとも１種のプローブオリゴヌクレオチドを含む。プローブオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）を含み得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドのセットは、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリコンビナーゼ－ポリメラーゼ増幅及び検出を目的とする。一部の実施形態において、試薬は、オリゴヌクレオチドの１つ以上のセットを含むオリゴヌクレオチドの群を含む。
一部の実施形態において、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリコンビナーゼ－ポリメラーゼ増幅及び検出のためのオリゴヌクレオチドのセットは、配列番号１７と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号１９と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号１８と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド；若しくは配列番号２０若しくは２１と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号２５若しくは２６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号２２～２４のいずれかと少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド；又はそれらの組合せを含み、各プローブオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む。一部の実施形態において、第１の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号２０と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、第２の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号２５と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドは配列番号２２又は２３と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、第１の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号２１と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、第２の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号２５又は２６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドは配列番号２４と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態において、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチドの群は、配列番号２と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号４と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドの第１のセットを含む。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドの群は、配列番号１１及び１５のいずれかと少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号３と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、並びに配列番号５と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドの第２のセットをさらに含む。
本開示はまた、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための方法を提供する。試料は、鼻腔スワブ若しくはブラシ、唾液、粘液、血液、血清、血漿又は糞便を含み得る。
一部の実施形態において、方法は、試料を、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドのセット又は群及び増幅用試薬と接触させるステップ；リコンビナーゼ－ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を使用して、試料中に存在する１種以上の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列を増幅するステップ；１種以上のオリゴヌクレオチドプローブを、１種以上の増幅された標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列にハイブリダイズするステップ；並びに検出可能な標識からのシグナルを測定することによって、１種以上の増幅されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸配列への１種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出するステップを含む。一部の実施形態において、方法は、オリゴヌクレオチドのセットからの第１及び第２の増幅オリゴヌクレオチドをリコンビナーゼ剤と接触させるステップをさらに含む。検出可能な標識からの１つ以上のシグナルの存在は、１種以上の増幅されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸配列への、１種以上のプローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを示し得る。
増幅用試薬は、ポリメラーゼ；リコンビナーゼ剤；リコンビナーゼローディングタンパク質；一本鎖結合タンパク質；ニッキング酵素；ヘリカーゼ；レゾルバーゼ；酵素補因子；バッファー；デオキシリボヌクレオチド；若しくはリボヌクレオチド三リン酸；クラウディング剤；ＡＴＰ、ＡＴＰ類似体若しくはＡＴＰ産生系；又はそれらの組合せを含み得る。
本開示はさらに、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキットであって、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのセット、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか、核酸配列を増幅及び検出するための試薬、並びに／又は使用説明書を含む、キットを提供する。
本開示の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び添付図を考慮すれば、明らかになる。
本特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を含む本特許又は特許出願公報の副本は、請求時及び必要な料金の納付時に、特許庁によって提供される。
増幅オリゴヌクレオチド及びプローブオリゴヌクレオチドの組合せ１を使用した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリコンビナーゼ－ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を示すグラフである。 増幅オリゴヌクレオチド及びプローブオリゴヌクレオチドの種々の組合せを使用した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリコンビナーゼ－ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を示すグラフである。
本開示は、少なくとも一部は、ＣＯＶＩＤ－１９の迅速な検出を容易にするオリゴヌクレオチド配列のコレクションの開発に基づく。
本明細書中で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ）」及びそれらの変形体は、追加の行為又は構造の可能性を排除しない、オープンエンドの移行句、用語、単語であることが意図される。単数形「１つ（種）の（ｏｎｅ）」、「及び（ａｎｄ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそうでないことを明白に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本開示はまた、明示的に示されているか否かに関わらず、本明細書中に提示された実施形態又は要素「を含む」、「からなる」及び「から本質的になる」他の実施形態を企図する。
本明細書中における数値範囲の列挙については、同じ精度を有する、その間の各介在数値も明示的に企図される。例えば、６～９の範囲では、６及び９に加えて、７及び８の数値も企図され、６．０～７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０が明示的に企図される。
「第１の」及び「第２の」という用語は、本開示中ではそれらの相対的意味でのみ使用される。特に断りのない限り、それらの用語は、１つ以上の実施形態の記載において単に便宜上使用されることが理解される。「第１の」及び「第２の」という用語は、１つの要素を別の要素から識別するためにのみ使用され、開示される技術の権利範囲は、これらの用語によって限定されるべきでない。例えば、第１の要素が第２の要素として指定されてもよいし、同様に、第２の要素が第１の要素として指定されてもよい。
本明細書中で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、約２～約１００個のヌクレオチド（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９若しくは１００個のヌクレオチド、又は前記値のいずれかによって規定される範囲）を含む短い核酸配列を指す。本明細書中で使用される「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリマー形態の任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のいずれかを指す。これらの用語は、分子の一次構造を指し、したがって、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡを含む。これらの用語は、均等物として、ヌクレオチド類似体から作製されたＲＮＡ若しくはＤＮＡのいずれかの類似体、並びに修飾されたポリヌクレオチド、例えば、メチル化及び／又はキャップされたポリヌクレオチドなどを含む。核酸は典型的には、リン酸結合を介して連結されて、核酸配列又はポリヌクレオチドを形成するが、他の多くの結合も当技術分野において公知である（例えば、ホスホロチオエート、ボラノホスフェートなど）。
オリゴヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖であることができ、又は二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡと相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の両方、ＲＮＡ、又はハイブリッドであることができ、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン（ｘａｎｔｈｉｎｅ ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、イソシトシン及びイソグアニンを含む塩基の組合せを含み得る。オリゴヌクレオチドは、化学的合成法によって又は組換え法によって得ることができる。
本明細書中で使用する「配列同一性パーセント」という用語は、核酸配列中のヌクレオチド若しくはヌクレオチド類似体又はアミノ酸配列中のアミノ酸の、２つの配列を整列させかつ必要ならば、最大同一性パーセントを達成するようにギャップを導入した後に参照配列中の対応するヌクレオチド又はアミノ酸と同一である、百分率を指す。したがって、本技術による核酸が参照配列よりも長い場合、参照配列と整列しない核酸中の余分のヌクレオチドは、配列同一性の決定のために考慮されない。アラインメントのための方法及びコンピュータープログラムは、ＢＬＡＳＴ、Ａｌｉｇｎ ２及びＦＡＳＴＡを含めて、当技術分野において周知である。
本明細書中で特に定義しない限り、本開示に関連して使用される科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。用語の意味及び範囲は明白であるはずであるが、潜在的な曖昧さがある場合、本明細書中に示された定義が、あらゆる辞書的定義又は外部定義に優先する。さらに、文脈によって特に要求がない限り、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
好ましい方法及び材料が以下に記載されるが、本明細書中に記載されるのと同様な又は同等な方法及び材料を、本開示の実施又は試験において使用してもよい。本明細書中で言及される全ての公表文献、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によってそれら全体が組み込まれる。本明細書中に開示される材料、方法及び例は例示に過ぎず、限定的であることを意図するものではない。本明細書中で使用されるセクションの表題は、構成のみを目的とするものであり、記載される主題を限定するものと決して解釈されるべきではない。
１．増幅オリゴヌクレオチド及びプローブオリゴヌクレオチド
一実施形態において、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、核酸増幅のために使用してもよいし（例えば、プライマー）、又は核酸ハイブリダイゼーション及び検出のためのプローブとして使用してもよい。本明細書中で使用される「プライマー」、「プライマー配列」、「プライマーオリゴヌクレオチド」及び「増幅オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド及び核酸重合剤（例えば、ＤＮＡ依存性又はＲＮＡ依存性ポリメラーゼ）の存在下で好適な増幅条件（例えば、バッファー、塩、温度及びｐＨ）に置かれた場合に、核酸（全ての種類のＤＮＡ又はＲＮＡ）の相補鎖である伸長産物の合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。本開示の増幅オリゴヌクレオチドは、任意の好適なサイズであることができ、望ましくは、約１５～５０個のヌクレオチド、好ましくは約２０～４０個のヌクレオチドを含む、それから本質的なる、又はそれからなることができる。本開示のオリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載されるものに加えて、追加のヌクレオチドを含むことができる。使用される増幅プロセスの種類に応じて、増幅オリゴヌクレオチドは、例えば、ニッキング酵素部位及び上流の安定化領域を含むことができる（例えば、米国特許第９，６８９，０３１号明細書、米国特許第９，６１７，５８６号明細書、米国特許第９，５６２，２６４号明細書及び米国特許第９，５６２，２６３号明細書を参照のこと；これらのそれぞれが参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。
「プローブ」、「プローブ配列」及び「プローブオリゴヌクレオチド」という用語は、適当なハイブリダイゼーション条件下で標的配列の少なくとも一部分（例えば、増幅された標的配列の一部分）に選択的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを指す。一般に、プローブ配列は、「相補的」（例えば、コード鎖又はセンス鎖に対して相補的（＋））又は「逆相補的」（例えば、アンチセンス鎖に対して相補的（－））のいずれかと特定できる。本開示のプローブは、任意の好適なサイズであることができ、望ましくは、約１０～５０個のヌクレオチド、好ましくは約１２～３５個のヌクレオチドを含む、それから本質的なる、又はそれからなることができる。
本明細書中で使用される「セット」、「プライマーセット」及び「プライマー及びプローブセット」という用語は、目的の標的配列若しくは標的核酸（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２内の標的配列）を一緒にプライミングできる２つ以上のオリゴヌクレオチド及び／又は標的配列若しくは標的核酸を検出できる少なくとも１種のプローブを指す。ある特定の実施形態において、「セット」という用語は、増幅される標的配列又は標的核酸の５’末端とハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチド、及び増幅される標的配列又は標的核酸の相補体とハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドを含む１対のオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドのセットは、試料中の１種以上の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）配列を増幅及び検出するのに使用できる。「標的配列」及び「標的核酸」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、開示される方法によって存在又は非存在を検出する予定の特定の核酸配列を指す。本開示の文脈において、標的配列は好ましくは、１種以上のオリゴヌクレオチドがそれにハイブリダイズしかつ増幅がそこから開始する核酸配列を含む。標的配列はまた、適当な増幅条件下でプローブが安定なハイブリッドを形成できるプローブハイブリダイズ領域を含むことができる。標的配列は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの任意の部分内、例えば、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質をコードする遺伝子又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）をコードする遺伝子内に存在することができる。
一部の実施形態において、セットは、第１の増幅オリゴヌクレオチド、第２の増幅オリゴヌクレオチド及びプローブオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、セットは、配列番号１及び１０～１６のいずれかと少なくとも７０％（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号３と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、並びに配列番号５と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む；若しくは配列番号２と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号４と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む；若しくは配列番号７と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号８と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号９と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む；若しくは配列番号１７と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号１９と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号１８と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む；若しくは配列番号２０若しくは２１と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号２５若しくは２６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号２２～２４のいずれかと少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む；又はそれらの組み合わせを含む。
一部の実施形態において、セットは、配列番号１及び１０～１６のいずれかと少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号３と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、並びに配列番号５と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド；並びに配列番号２と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号４と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、セットは、配列番号２０と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号２５と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号２２又は２３と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、セットは、配列番号２１と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号２５又は２６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号２４と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、セットは、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）のリコンビナーゼ－ポリメラーゼ増幅及び検出のためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１７と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号１９と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号１８と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド；若しくは配列番号２０若しくは２１と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号２５若しくは２６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号２２～２４のいずれかと少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド；又はそれらの組合せを含み、各プローブオリゴヌクレオチドは検出可能な標識を含む。一部の実施形態において、第１の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号２０と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、第２の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号２５と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドは配列番号２２又は２３と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、第１の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号２１と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、第２の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号２５又は２６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドは配列番号２４と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態において、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチドの群は、配列番号２と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号４と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含み、プローブオリゴヌクレオチドは検出可能な標識を含む。オリゴヌクレオチドの第１のセットを含む。
一部の実施形態において、群は、配列番号１１及び１５のいずれかと少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号３と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、並びに配列番号５と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含み、プローブオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、オリゴヌクレオチドの第２のセットをさらに含む。
Figure 2023518983000002
Figure 2023518983000003
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドはいずれも、オリゴヌクレオチドのその標的に対する結合親和性を安定化させる又は増強するために、任意の好適な方法で修飾することができる。例えば、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチド配列は、１種以上の修飾オリゴヌクレオチドを含むことができる。さらに、内部スペーサー又は修飾を含む、リストに記載した配列はいずれも、修飾又はスペーサーなして使用することができる。
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドはいずれも、例えば、スペーサー、ブロック基及び修飾ヌクレオチドを含むことができる。修飾ヌクレオチドは、天然ヌクレオチド及びヌクレオチド三リン酸と組成及び／又は構造が異なるヌクレオチド又はヌクレオチド三リン酸である。修飾は、ヌクレオチドを修飾する酵素、例えば、メチルトランスフェラーゼによる修飾によって生じる、天然起源のものを含む。修飾ヌクレオチドはまた、合成ヌクレオチド又は非天然起源のヌクレオチドを含む。例えば、修飾ヌクレオチドは、２’修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル及び２’－フルオロを有するものを含む。他の２’－修飾ヌクレオチドも当技術分野において公知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる米国特許第９，０９６，８９７号明細書に記載されている。本明細書中で使用される修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド三リン酸は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位が存在する二本鎖核酸の１つの鎖上に修飾が存在する場合には修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド三リン酸が修飾鎖を制限酵素による切断から保護するように、変更することができる。
ブロック基又はポリメラーゼ停止分子は、ポリメラーゼによる標的配列非依存的核酸重合を抑制する化学的部分である。ブロック基は、オリゴヌクレオチドが、標的核酸分子を結合できるが、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを標的として利用する鋳型の伸長を支持できないようにすることができる。例えば、ポリメラーゼの進行をさせない１つ以上の部分の存在は、オリゴヌクレオチドへの非核酸主鎖付加における又は複製ポリメラーゼの失速による、ポリメラーゼの停止を引き起こす可能性がある。これらの部分を有するオリゴヌクレオチドは、増幅反応の過程においてプローブの非正統的増幅を妨げる又は低減することができる。ブロック基の例としては、例えば、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート、アルカンジオール残基、ペプチド核酸、及び例えばコルジセピン、スペーサー部分、損傷したＤＮＡ塩基などを含む、３’－ＯＨを欠いているヌクレオチド誘導体が挙げられる。スペーサーの例としては、例えば、Ｃ３スペーサーが挙げられる。スペーサーは、例えば、オリゴヌクレオチド内で、及びまた、例えば、他の基、例えば標識などを結合させるために末端で、使用され得る。
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチド配列はいずれも、本明細書中に開示される配列のいずれかの相補体を含む、それから本質的になる、又はそれからなることができる。本明細書中で使用される「相補体」又は「相補的配列」という用語は、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドを有する安定な二本鎖をワトソン－クリック塩基対規則によって形成する核酸配列を指し、典型的には、開示されるオリゴヌクレオチドと約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％以上の同一性を共有する。核酸配列の同一性は、当技術分野において公知の任意の好適な数学アルゴリズム又はコンピューターソフトウェア、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ－Ｗ、Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅ及びＡＬＩＧＮ（核酸及びアミノ酸配列のアラインメントのため）、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ２．１、ＢＬ２ＳＥＱ及びそれのそれ以降のバージョン）並びにＦＡＳＴＡプログラム（例えば、ＦＡＳＴＡ３×、ＦＡＳＴＭ及びＳＳＥＡＲＣＨ）（配列アラインメント及び配列類似性の探索のため）などを使用して決定することができる。配列アラインメントアルゴリズムはまた、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．、２１５（３）：４０３～４１０頁（１９９０）；Ｂｅｉｇｅｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０６（１０）：３７７０～３７７５頁（２００９）；Ｄｕｒｂｉｎら編、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｐｒｏｂａｌｉｓｔｉｃ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ（２００９）；Ｓｏｄｉｎｇ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２１（７）：９５１～９６０頁（２００５）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５（１７）：３３８９～３４０２頁（１９９７）；及びＧｕｓｆｉｅｌｄ、Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｏｎ Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｔｒｅｅｓ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ（１９９７）に開示されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、任意の好適な方法を使用して調製でき、種々のこのような方法は当技術分野において公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８９年、２．Ｓｕｐｐ．Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ－Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（パートＩ及びＩＩ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）；Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編）、ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９５）；及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：Ｓｅｃａｕｃｕｓ、Ｎ．Ｊ．（２００２）；Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：９０～９８頁（１９７９）；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：１０９～１５１頁（１９７９）；及びＢｅｌｏｕｓｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３４４０～３４４４頁（１９９７）を参照のこと；これらのそれぞれが参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）。オリゴヌクレオチド対はまた、種々のツール、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）により提供されるＰｒｉｍｅｒ－ＢＬＡＳＴツールを使用して設計することができる。オリゴヌクレオチド合成は、オリゴ合成機、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）又はＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）から商業的に入手可能なもので行うことができる。あるいは、オリゴヌクレオチドは、オーダーメードであることができ、例えば、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ）、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）、ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）などを含む、当技術分野において周知の種々の商業的供給元から入手できる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野において公知の任意の好適な方法、例えば、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動、陰イオン交換ＨＰＬＣ（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．、２５５：１３７～１４９頁（１９８３）を参照のこと；これは参照により本明細書中に組み込まれる）、逆相ＨＰＬＣ（例えば、ＭｃＦａｒｌａｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、７：１０６７～１０８０頁（１９７９）を参照のこと；これは参照により本明細書中に組み込まれる）を使用して精製することができる。
オリゴヌクレオチドの配列は、化学分解（例えば、Ｍａｘａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５：４９９～５６０頁（１９８０）を参照のこと；これは参照により本明細書中に組み込まれる）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析（例えば、Ｐｉｅｌｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：３１９１～３１９６頁（１９９３）を参照のこと；これは参照により本明細書中に組み込まれる）、アルカリホスファターゼとエキソヌクレアーゼ消化の組合せ後の質量分析（Ｗｕら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９０：３４７～３５２頁（２００１）；これは参照により本明細書中に組み込まれる）などを含むがこれらに限定されるものではない、当技術分野において公知の任意の好適な配列決定方法を使用して検証することができる。
２．検出可能な標識
本明細書中に記載される任意の１種以上のオリゴヌクレオチド配列は、１種以上の増幅オリゴヌクレオチド及び／又はプローブオリゴヌクレオチドが測定されることができるように、検出可能な標識を含み得る。一実施形態において、本明細書中に記載されるプローブオリゴヌクレオチド配列のそれぞれは、検出可能な標識を含む。本明細書中で使用される「検出可能な標識」という用語は、測定されることができるシグナルであって、その強度がそれに結合された実在物の量と関連する（例えば、それに比例する）シグナルを生成させる部分又は化合物を指す。標的配列へのオリゴヌクレオチドの結合を検出するようにオリゴヌクレオチドにコンジュゲート又は連結されることができる、任意の好適な検出可能な標識を使用でき、その多くは当技術分野において公知である。一実施形態において、検出可能な標識は、間接的に検出され得る。間接的に検出可能な標識は典型的には、直接検出可能な標識に結合又はカップリングされる「コンジュゲート」と共に使用される特異的結合メンバーである。このようなコンジュゲートを合成するためのカップリング化学は、当技術分野において周知であり、特異的結合メンバーの特異的結合特性及び標識の検出可能な特性が損なわれないままであるように設計される。本明細書中で使用される「特異的結合メンバー」及び「コンジュゲート」という用語は、結合対の２つのメンバー、例えば、２つの異なる分子を指し、特異的結合メンバーは、本開示のポリヌクレオチドに特異的に結合し、「コンジュゲート」は特異的結合メンバーに特異的に結合する。対の２つのメンバー間の結合は典型的には、本質的に化学的又は物理的である。このような結合対の例としては、抗原と抗体、アビジン／ストレプトアビジンとビオチン、ハプテンとハプテンに特異的な抗体、相補的ヌクレオチド配列、酵素補因子／基材と酵素などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
望ましくは、プローブオリゴヌクレオチド配列のそれぞれが、検出可能な標識を含む。プローブのそれぞれが、同じ検出可能な標識又は異なる検出可能な標識で標識されることができる。
一部の実施形態において、検出可能な標識は、直接検出されることができる。このような直接検出可能な標識としては、例えば、放射性同位元素、フルオロフォア、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微小粒子、挿入染料（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ又は臭化エチジウム）などが挙げられる。えり抜きの実施形態において、検出可能な標識は、フルオロフォア、例えば、フルオレセイン系染料、ポリハロフルオレセイン系染料、ヘキサクロロフルオレセイン系染料、クマリン系染料、ローダミン系染料、シアニン系染料、オキサジン系染料、チアジン系染料、スクアライン系染料、キレート化ランタニド系染料、アゾ系染料、トリフェニルメタン系染料又はＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系染料であることができる。フルオロフォアの例としては、ＦＡＭ（商標）、ＣＡＬ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）、ＱＵＡＳＡＲ（登録商標）、ＨＥＸ（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＮＥＤ（商標）、ＰＥＴ（登録商標）、ＲＯＸ（商標）、ＴＡＭＲＡ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ（登録商標）及びＶＩＣ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。当業者ならば、直接検出可能な標識が、標識の検出を可能にするために追加の成分、例えば、基質、トリガー試薬、光などを必要とする場合があることがわかるであろう。オリゴヌクレオチド、例えば、プローブを標識するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３９：１１４～１２９頁（２００２）；ｖａｎ Ｇｉｊｌｓｗｉｊｋら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．、１：８１～９１頁（２００１）；Ｊｏｏｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３５：１３５～１５３頁（１９９４）；Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３：２３９９～２４１２頁（１９８５）；Ｃｏｎｎｏｌｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３：４４８５～４５０２頁（１９８５）；Ｂｒｏｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、５：３６３～３８４頁（１９７８）；Ｂａｙｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌｙｓｉｓ、２６：１～４５頁（１９８０）；Ｌａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：６６３３～６６３７頁（１９８１）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１１：６１６７～６１８４頁（１９８３）；Ｂｒｉｇａｔｉら、Ｖｉｒｏｌ．、１２６：３２～５０頁（１９８３）；Ｔｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３４６６～３４７０頁（１９８４）；Ｌａｎｄｅｇｅｎｔら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、１５：６１～７２頁（１９８４）；Ａ．Ｈ．Ｈｏｐｍａｎら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、１６９：３５７～３６８頁（１９８７）；及びＴｅｍｓａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５：２２３～２３２頁（１９９６）に記載されており、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドの任意の１種以上はまた、クエンチャー部分を含むことができる。検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）及びクエンチャー部分がプローブの近傍に、例えば、プローブの末端に保持されている場合には、クエンチャー部分は検出可能な標識からのシグナル（例えば、蛍光）の検出を妨げる。２つの部分が物理的に分離されている場合には、シグナルは検出可能になる。クエンチャーは、当業界において公知の任意の好適なクエンチャー、例えば、ＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ（登録商標）１（ＢＨＱ－１（登録商標））、ＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ（登録商標）２（ＢＨＱ－２（登録商標））、ＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ（登録商標）３（ＢＨＱ－３（登録商標））、ＩＯＷＡ ＢＬＡＣＫ（登録商標）ＦＱ、及びＩＯＷＡ ＢＬＡＣＫ（登録商標）ＲＱなどから選択され得る。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、ＦＡＭフルオロフォア、ＣＡＬ－ＦＬＵＯＲ（登録商標）又はＱＵＡＳＡＲフルオロフォア及びＢＨＱ－１又はＢＨＱ－２クエンチャーを含み得る。
特定の標識及び標識技術の選択は、いくつかの要因、例えば、標識方法の容易さ及びコスト、使用される異なる検出可能な標識間のスペクトル間隔、所望の試料標識量、ハイブリダイゼーション反応に対する（例えば、ハイブリダイゼーションプロセスの速度及び／又は効率に対する）検出可能な部分の効果、使用される増幅方法の性質、検出システムの性質、検出可能な標識によって生成されるシグナルの性質及び強度などに依存する。
３．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）を増幅及び検出するための方法
本開示は、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）を検出するための方法を提供する。この方法は、試料を、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドのセット及び増幅用試薬と接触させるステップ；試料中に存在する１種以上の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列を増幅するステップ；１種以上のオリゴヌクレオチドプローブを、１種以上の増幅された標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列にハイブリダイズするステップ；並びに検出可能な標識からのシグナルを測定することによって、１種以上の増幅されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸配列への１種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出するステップを含む。前述のオリゴヌクレオチドのセットに関して本明細書中に示されたオリゴヌクレオチドセットについての説明はまた、この開示される方法にも当てはまる。
試料は、任意の好適な対象、典型的には哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ（ｃｏｗ）、ブタ、ウマ、非ヒト霊長類又はヒト）から得られる任意の好適な試料であることができる。好ましくは、対象はヒトである。試料は、任意の好適な生物学的供給源、例えば、鼻腔スワブ若しくはブラシ、又は全血、血清、血漿、間質液、唾液、眼球レンズ液（ｏｃｕｌａｒ ｌｅｎｓ ｆｌｕｉｄ）、脳脊髄液、汗、尿、乳汁、腹水液（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ）、粘液（ｍｕｃｏｕｓ）、関節液、腹水（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｆｌｕｉｄ）、膣液、月経分泌物、羊水、精液、糞便などを含むがこれらに限定されるものではない、好適な生理学的流体から得ることができる。
試料は、当業者に公知のルーチン技術を使用して対象から得ることができ、試料は、生物学的供給源から入手したまま直接使用してもよいし、又は試料の特性を変更するために前処理後に使用してもよい。このような前処理としては、例えば、血液からの血漿の調製、粘稠な流体の希釈、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、妨害成分の不活性化、試薬の添加、溶解などを挙げることができる。
対象から試料を得た後、試料は、本明細書中に記載される増幅オリゴヌクレオチド及びプローブを含むオリゴヌクレオチドのセットと接触させ、反応混合物を形成することができる。次いで、反応混合物を増幅条件下に置く。本明細書中で使用される「増幅条件」という用語は、増幅オリゴヌクレオチドのアニーリング及び／又は伸長を促進する条件を指す。このような条件は、当技術分野において周知であり、選択される増幅方法に依存する。増幅条件は、温度及び／又は温度サイクル、バッファー、塩、イオン強度、ｐＨなどを含むがこれらに限定されるものではない、全ての反応条件を包含する。
試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列の増幅は、当技術分野において公知の任意の好適な核酸配列増幅方法を使用して行い得る。一部の実施形態において、増幅としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、ローリングサークル増幅、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、リコンビナーゼ－ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）核酸配列の増幅は、等温増幅（例えば、ＲＰＡ又はＮＥＡＲ）を使用して行われる。一部の実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列の増幅及び検出は、ポイントオブケアデバイス（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ｄｅｖｉｃｅ）（例えば、ＩＤ ＮＯＷシステム（Ａｂｂｏｔｔ））を使用して行われる。
一部の実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列の増幅は、リアルタイムＰＣＲを使用して行われる。本明細書中で使用される「リアルタイムＰＣＲ」は、増幅ＤＮＡ産物をエンドポイント分析で検出する従来のＰＣＲとは異なり、反応が進行するにつれて増幅産物の蓄積をリアルタイムで測定し、各サイクル後に産物の定量化を行うＰＣＲ法を指す。リアルタイムＰＣＲはまた、当技術分野において「定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）」として知られる。ＰＣＲ産物のリアルタイム検出は、任意の二本鎖ＤＮＡにインターカレートする非特異的蛍光染料及び配列特異的蛍光標識ＤＮＡプローブの使用を含む。リアルタイムＰＣＲ技術及びシステムは当技術分野において公知であり（例えば、Ｄｏｒａｋ、Ｍ．Ｔｅｖｆｉｋ編 Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ． Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ（２００７）；及びＦｒａｇａら、「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：１０－３（２００８）を参照のこと；これらのそれぞれが参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）、種々の供給元から商業的に入手可能であり（例えば、ｍ２０００ｒｔ ＲＥＡＬＴＩＭＥ（商標）ＰＣＲシステム（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．、Ｄｅｓ Ｐｌａｉｎｅｓ、ＩＬ）；ＣＦＸリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）；及びＴＡＱＭＡＮ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ））、それらはいずれも、本明細書中に記載される方法において使用できる。
増幅に有用なオリゴヌクレオチドのセットは、配列番号１及び１０～１６のいずれかと少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号３と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、並びに配列番号５と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド；並びに／又は配列番号２と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号４と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含み得る。
えり抜きの実施形態において、等温増幅法は、伝統的な増幅反応よりも速い時間枠でより短い配列を増幅するために、ニッキング及び伸長反応、「ニッキング及び伸長増幅」に依拠し得る。これらの方法は、例えば、等温条件下で２種の増幅オリゴヌクレオチド、１種又は２種のニッキング酵素及びポリメラーゼのみを使用する反応を含み得る。ニッキング及び伸長増幅に有用なオリゴヌクレオチドのセットは、配列番号７と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号８と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号９と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。
ニッキング及び伸長増幅において、センス及びアンチセンス鎖を有する標的核酸配列を１対の増幅オリゴヌクレオチドと接触させる。第１の増幅オリゴヌクレオチドは、標的配列アンチセンス鎖の３’末端と相補的な認識領域を３’末端に含む核酸配列、前記認識領域の上流のニッキング酵素部位、及び前記ニッキング酵素部位の上流の安定化領域を含む。第２の増幅オリゴヌクレオチドは、標的配列センス鎖の３’末端と相補的な認識領域を３’末端に含むヌクレオチド配列、前記認識領域の上流のニッキング酵素部位、及び前記ニッキング酵素部位の上流の安定化領域を含む。２種のニッキング酵素を用意する。一方のニッキング酵素は、第１の増幅オリゴヌクレオチドのニッキング酵素部位においてニッキング可能であるが、前記標的配列内ではニッキング可能でない。他方のニッキング酵素は、第２の増幅オリゴヌクレオチドのニッキング酵素部位においてニッキング可能であるが、前記標的配列内ではニッキング可能でない。ＤＮＡポリメラーゼは、増幅オリゴヌクレオチドの複数のサイクルの伸長を含む増幅条件下で使用し、それによって、ニッキング酵素によってニッキングされる二本鎖ニッキング酵素部位を生成して、増幅産物を産生する。例えば、米国特許第９，６８９，０３１号明細書；米国特許第９，６１７，５８６号明細書；米国特許第９，５６２，２６４号明細書；及び米国特許第９，５６２，２６３号明細書、並びに米国特許出願第１５／４６７，８９３号明細書；米国特許出願第１５／６００，９５１号明細書；及び米国特許出願第１６／２４３／８２９号明細書を参照のこと。これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
一部の実施形態において、ＩＤ ＮＯＷ ＣＯＶＩＤ－１９アッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ中のＲｄＲｐ遺伝子の高度に保存された領域を標的とするために、等温核酸増幅技術であるニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）を使用する。一部の実施形態において、アッセイシステムは、溶出／溶解バッファーを収容する試料受け器；それぞれ凍結乾燥ペレットを収容する２つの密封型反応チューブを含む試験ベース；溶出された試料を試験ベースに移動させるための移動カートリッジ；及びＩＤ ＮＯＷインスツルメントを含む。ＩＤ ＮＯＷ ＣＯＶＩＤ－１９アッセイは、陽性の結果をわずか５分で及び陰性の結果を１３分で送り出し、広範囲の医療現場において迅速なＣＯＶＩＤ－１９の結果を提供する。
一部の実施形態において、ＩＤ ＮＯＷ ＣＯＶＩＤ－１９ ＰＯＣアッセイの検出下限（ＬＯＤ）は、１２５コピー／ｍＬ以下である。インシリコ分析により、全ての鋳型及びプローブが、４５カ国及び２１都市並びに中国の省から報告された９５７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列と１００％の相同性を有することが判明し、他のコロナウイルス、インフルエンザ、ＲＳＶ及びライノウイルスを含む一般的な呼吸器疾患を引き起こす微生物に対して有意な交差反応性はないことが予測された。
臨床成績は、既知濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを含む３０個の人工的な試料及び３０個の人工的な陰性試料において判定された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡは、全ての陽性試料で検出され（陽性一致パーセント１００％［ＣＩ、８８．６～１００％］）、陰性試料では検出されなかった（陰性一致パーセント１００％［ＣＩ、８８．６～１００％］）。
えり抜きの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列の増幅は、リコンビナーゼ及び関連タンパク質の特性に依拠するリコンビナーゼ－ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を使用して行って、ＤＮＡポリメラーゼ反応の配列特異的なプライミングを可能にする一本鎖相同ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに侵入させる。
ＲＰＡに有用なオリゴヌクレオチドのセットは、配列番号１７と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号１９と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号１８と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド；又は配列番号２０若しくは２１と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号２５若しくは２６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号２２～２４のいずれかと少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、第１の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号２０と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、第２の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号２５と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドは配列番号２２又は２３と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、第１の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号２１と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、第２の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号２５又は２６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドは配列番号２４と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む。
ＲＰＡにおいて、リコンビナーゼ剤を、第１及び第２の増幅オリゴヌクレオチドで接触させて、核タンパク質を形成する。これらの核タンパク質は、標的配列に接触して、第１の二本鎖構造を前記第１の鎖の第１の部分で形成し、二本鎖構造を前記第２の鎖の第２の部分で形成し、したがって、前記第１の増幅オリゴヌクレオチド及び第２の増幅オリゴヌクレオチドの３’末端は、標的配列を含むＤＮＡ上で互いに向かって配向される。核タンパク質中のこれらの増幅オリゴヌクレオチドの３’末端を、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長させて、第１及び第２の二本鎖核酸並びに核酸の第１及び第２の置換鎖を生成させる。所望の増幅レベルが達成されるまで、これらのステップを繰り返す。
標的核酸配列のＲＰＡに有用な方法及び材料は、当技術分野において公知である、米国特許第第７，２７０，９８１号明細書；米国特許第８，４６０，８７５号明細書；米国特許第７，３９９，５９０号明細書；米国特許第７，６６６，５９８号明細書；米国特許第８，０３０，０００号明細書；米国特許第８，４２６，１３４号明細書；米国特許第８，９４５，８４５号明細書；米国特許第９，６６３，８２０号明細書；米国特許第１０，３２９，６０３号明細書；米国特許第１０，３２９，６０２号明細書；米国特許第８，０１７，３３９号明細書；米国特許第８，５７４，８４６号明細書；米国特許第８，９６２，２５５号明細書；米国特許第１０，０３６，０５７号明細書；米国特許第８，０７１，３０８号明細書；米国特許第１０，０９３，９０８号明細書；及び米国特許第８，６３７，２５３号明細書、並びに米国特許出願第１５／０９９，７５４号明細書；米国特許出願第１６／４４２，００７号明細書；米国特許出願第１４／７０５，１５０号明細書；及び米国特許出願第１６／１５５，１３３号明細書を参照のこと；これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。例えば、好適なリコンビナーゼ剤としては、エシェリキア・コリ（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４ ｕｖｓＸタンパク質、又は任意の門に由来する任意の相同タンパク質若しくはタンパク質複合体が挙げられる。他の非相同リコンビナーゼ剤を、ＲｅｃＡの代わりに、例えばＲｅｃＴ又はＲｅｃＯとして利用してもよい。好適なリコンビナーゼローディングタンパク質としては、例えば、Ｔ４ｕｖｓＹ、Ｅ．コリｒｅｃＯ、Ｅ．コリｒｅｃＲ並びにこれらのタンパク質の誘導体及び組合せを挙げることができる。好適な一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｅ．コリＳＳＢ若しくはＴ４ｇｐ３２又はこれらのタンパク質の誘導体若しくは組合せであることができる。ＤＮＡポリメラーゼは、真核生物又は原核生物ポリメラーゼであってもよい。真核生物ポリメラーゼの例としては、ｐｏｌ－α、ｐｏｌ－β、ｐｏｌ－δ、ｐｏｌ－ε並びにそれらの誘導体及び組合せが挙げられる。原核生物ポリメラーゼの例としては、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、バクテリオファージＴ４ ｇｐ４３ ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＩラージフラグメント、ファイ－２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｐｏｌ Ｉ、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩＩ、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩＶ、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＶ並びにそれらの誘導体及び組合せが挙げられる。ＲＰＡの他の成分としては、ＡＴＰ、ＡＴＰ類似体又はＡＴＰ再生（ＡＤＰのＡＴＰへの変換）のためのシステムが挙げられる。このようなシステムは、例えば、フォスフォクレアチン及びクレアチンキナーゼを利用することができる。ＡＴＰ又はＡＴＰ類似体は、ＡＴＰ、ＡＴＰ－γ－Ｓ、ＡＴＰ－β－Ｓ、ｄｄＡＴＰ又はそれらの組合せのいずれかであり得る。ＲＰＡ反応はまた、ＡＭＰからＡＤＰを再生する及びピロホスフェートをホスフェート（ピロホスフェート）に変換するシステムを含み得る。ＲＰＡにおいて使用される好適なクラウディング剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン及びフィコールが挙げられる。
試料中に存在する１種以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス核酸配列の増幅に続いて、開示される方法は、１種以上の、本明細書中に開示されるプローブオリゴヌクレオチド配列を１種以上の増幅された標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）核酸配列にハイブリダイズするステップをさらに含み得る。
１種以上の増幅された標的核酸配列への１種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに続いて、この方法は、検出可能な標識のそれぞれからのシグナルを測定することによって、１種以上の増幅された標的核酸配列への１種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出するステップであって、（ｉ）１種以上のシグナルの存在が、１種以上の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列への１種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション、及び試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を示し、かつ（ｉｉ）シグナルの非存在が試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非存在を示す、ステップを含む。１種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列からのシグナルの検出は、検出可能な標識の種類に応じて、種々の周知の方法体系を使用して行うことができる。例えば、検出は、溶液リアルタイム蛍光を使用して又は固体表面法を使用して行うことができる。
４．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有すると特定された対象の治療及び監視
本明細書中に記載される方法に従ってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有すると特定された対象は、治療し、監視し（対象からの試料において判定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の存在について）、治療及び監視し、並びに／又は当技術分野において公知のルーチン技術を使用して監視及び治療することができる。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるこの方法は、本方法を使用して対象から得られた１つ以上の試料においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の存在が判定された場合に対象を治療するステップをさらに含む。
治療は、対象が無症状であるか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の軽度、中等度若しくは重度の症状を経験しているかに応じて、種々の形態を取り得る。例えば、軽度の症状を経験している対象は、発熱、咳（痰産生を伴う又は伴わない）、食欲不振、倦怠感、筋痛、咽頭痛、呼吸困難、鼻閉、頭痛、下痢、嘔気、嘔吐又はそれらの任意の組合せを経験する。中等度の症状を経験している対象は、数日間続く１００．４°Ｆ超の発熱、悪寒、息切れ、嗜眠又はそれらの任意の組合せを経験する。このような対象はまた、肺炎にかかることがある。重度の感染を経験している対象は、呼吸困難、胸部の持続痛若しくは圧迫感、錯乱、覚醒不能、青みを帯びた唇若しくは顔又はそれらの任意の組合せを経験する。このような対象は、重症肺炎にかかることがある。
対象が無症状であるか又は軽度の症状を有する場合、対象は、安静、睡眠、保温、液体摂取（例えば、水分補給の持続）、他の対象との社会的交流の最小化（例えば、隔離又は強制隔離の持続、例えば、自宅隔離）又はそれらの任意の組合せによって治療することができる。さらに、対象は、症状が起こる及び／又は悪化するかどうか見るために監視することができる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の中程度又は重度の症状を有する対象は、１種以上の薬物（例えば、レムデシビル）、ワクチン、回復期血漿療法（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染を克服した対象から採取した血液に由来する血漿を受ける）、呼吸支援若しくは補助（例えば、鼻カニューレ、フェイスマスク又は侵襲的若しくは非侵襲的（例えば、挿管）補助換気を通じて酸素補給を受ける）又はそれらの組合せによって治療することができる。前記治療のいずれかを受ける対象はまた、当技術分野において公知のルーチン技術を使用して監視することができる。
５．ワクチン接種
別の実施形態において、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）に対する対象の少なくとも１回のワクチン接種及び／又はワクチン再接種（例えば、さらなるワクチン接種）と関連する、本明細書中に記載される方法の使用に関する。一部の実施形態において、本方法は、対象から得られた少なくとも１つの試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の存在を検出して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する少なくとも１つのワクチン（例えば、１回目の又は初回のワクチン、１回以上のさらなる又は追加のワクチンなど）を対象に投与すべきか否か又は投与できるか否かを判定するのに使用される。一部の実施形態において、試験される対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して免疫がない又は免疫学的免疫（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を欠いているような、無感作の対象であり得る。一部の実施形態において、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して以前にワクチン接種されたことがあるが無感作である対象であり得る。一部の実施形態において、対象は、現在ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているが、症状がなく又は軽度であり、かつ以前にワクチン接種を受けたことがない対象であり得る。一部の実施形態において、対象は、現在ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しており、症状がなく又は軽度であり、かつ以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン接種を受けたことがある対象であり得る。一部の実施形態において、対象は、以前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から回復しており、かつ以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２日するワクチン接種を受けたことがない対象であり得る。一部の実施形態において、対象は、以前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から回復しており、かつ以前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２日するワクチン接種を受けたことがある対象であり得る。
前記方法は、以前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の時期及び／又は重症度の差異にかかわらず、行うことができる。投与されるワクチンが初回投与のワクチン、２回目（ブースターなど）投与のワクチン、３回目又はあらゆるさらなる追加投与（ブースターなど）投与のワクチンであるかにかかわらず、本明細書中に記載される方法を使用して試料中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の存在が検出される場合には、対象は一定期間（例えば、３０日間、６０日間、９０日間など）待って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する少なくとも１つのワクチンを投与される必要がある。あるいは、試料中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の存在が検出されない場合には、少なくとも１つのワクチンを対象に投与することができる。
「少なくとも１つのさらなるワクチン又は少なくとも１回のワクチン接種」又は「少なくとも１つの追加ワクチン又は少なくとも１回の追加ワクチン接種」という表現は、１回目又は現在のワクチンが対象に投与され、続いてある後の時点で、追加の又はさらなるワクチン又はワクチン接種（例えば、Ｎ＋１（Ｎは１回目又は現在のワクチン＋追加の又はさらなるワクチンである）、Ｎ＋２（Ｎは１回目＋２つの追加のワクチンである）Ｎ＋３、Ｎ＋４、Ｎ＋５、Ｎ＋６、Ｎ＋７、Ｎ＋８、Ｎ＋９、Ｎ＋１０～Ｎ＋Ｎ’（Ｎ’は１～１０００、１～５００、１～１００である））が投与される計画を包含する。
別の実施形態において、本明細書中に記載される方法は、対象にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する少なくとも１つのさらなるワクチンを投与する（例えば、１つ以上のブースターを受ける）べきか否かを判定するために；及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する少なくとも１つのワクチンの投与後に対象を監視するために、対象にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する少なくとも１つのワクチンが投与された後の一定の時間枠内に対象から得られた少なくとも１つの試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の存在を検出するのに使用される。一部の実施形態において、この方法は、対象にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する少なくとも１つのワクチンが投与された後の一定の時間枠内に試料を得るステップを含む。対象に少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンが投与された後の時間枠は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日、少なくとも１９日、少なくとも２０日、少なくとも２１日、少なくとも２２日、少なくとも２３日、少なくとも２４日、少なくとも２５日、少なくとも２６日、少なくとも２７日、少なくとも２８日、少なくとも２９日、少なくとも３０日、少なくとも３１日、少なくとも３２日、少なくとも３３日、少なくとも３４日、少なくとも３５日、少なくとも３６日、少なくとも３７日、少なくとも３８日、少なくとも３９日、少なくとも４０日、少なくとも４１日、少なくとも４２日、少なくとも４３日、少なくとも４４日、少なくとも４５日、少なくとも４６日、少なくとも４７日、少なくとも４８日、少なくとも４９日、少なくとも５０日などであることができる。一部の実施形態において、試料は、対象に少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンが投与された後約７～約２１日以内に得る。さらに、なおさらなる実施形態において、対象の監視は、対象が１つ以上のワクチンを受けた後（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンの初回投与後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンの２回目投与後など）の、ワクチン後総体症状又は副作用（例えば、疲労若しくは倦怠感、頭痛、めまい、又はもうろう状態、発熱若しくは悪寒、筋肉、骨、関節若しくは神経の症状、嘔気、嘔吐、下痢若しくは他の消化器症状、睡眠変化、リンパ節の膨大、皮膚／爪若しくは顔面の変化、眼、耳、口若しくはのど変化、咳、胸部若しくは呼吸症状、及び／又は記憶若しくは気分変化のうちの１つ以上）の監視を含む。
本明細書中に記載される方法を使用して、試料中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸が検出されない場合には、少なくとも１つのさらなるワクチン（例えば、１つ以上のブースター）を対象に投与することができる。あるいは、試料中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸が検出される場合には、少なくとも１つのさらなるワクチンを対象に投与してもしなくてもよい。
６．キット
本開示はまた、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）を増幅及び検出するためのキットを提供する。キットは、本明細書中に記載される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、キットは、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドのセット又は群を含む。キットは、核酸配列を増幅及び検出するための試薬並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を増幅及び検出するための使用説明書をさらに含み得る。前記方法に関して本明細書中に示されたオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドのセットについての記載はまた、本明細書中に記載されるキットのそれらの同じ態様に当てはまる。多くのこのような試薬は、本明細書中に記載されており、又はそうでなければ当技術分野において公知であり、商業的に入手可能である。キットに含める（本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドに加えて）のに好適な試薬の例としては、例えば、ポリメラーゼ活性を有する１種以上の酵素、酵素補因子（例えば、マグネシウム又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ））、塩、バッファー、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ／ｒＮＴＰ；例えば、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸及びデオキシチミジン三リン酸）遮断剤、標識剤などのような、核酸増幅反応に使用される従来の試薬が挙げられる。増幅反応に使用される他の試薬としては、ニッキング酵素、一本鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、レゾルバーゼなどが挙げられる。
キットは、本明細書中に記載される増幅試薬及びオリゴヌクレオチドを使用するための、例えば、試験試料を処理するための、核酸分子を抽出するための及び／又は試験を行うための、並びに得られた結果を解釈するための、使用説明書を含み得る。使用説明書は、印刷されていても電子的に提供されていてもよい（例えば、ＤＶＤ、ＣＤ又はインターネットリソースを介して視聴若しくは取得するために入手可能）。
キットは固体（例えば、凍結乾燥された）形態又は液体形態で供給できる。本開示のキットの種々の成分は任意選択的に、個々の成分（例えば、増幅オリゴヌクレオチド、プローブオリゴヌクレオチド又はバッファー）のそれぞれのための異なる容器（例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコ又はボトル）を含んでいてもよい。各成分は一般に、そのそれぞれの容器中に分注されるのに又は濃縮された形態で提供されるのに好適である。増幅／検出アッセイのある特定のステップを実施するのに好適な他の容器も、提供されてもよい。個々の容器は好ましくは、商業的販売のために厳密に閉じ込めた状態に保持される。
キットは、生体試料を得るためのスワブをさらに含み得る。一部の実施形態において、キットは、生体試料にアクセスするための及び／又は生体試料から核酸を抽出／単離するための試薬を含む。
７．実施例
［実施例１］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）核酸配列の増幅を、種々の第１の増幅オリゴヌクレオチドを、配列番号３を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド及び配列番号５を含むプローブオリゴヌクレオチドと共に使用して、ＰＣＲによって行った。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試料は、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス２の分離株ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）に由来するゲノムＲＮＡであった。ゲノムＲＮＡを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の分離株ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０に感染させたセルコピテクス・アエチオプス（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）の腎臓上皮（Ｖｅｒｏ Ｅ６、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５８６（商標））細胞からの細胞溶解物及び上清の調製物から抽出した。ウイルスゲノムＲＮＡは、細胞の核酸及びキャリアＲＮＡのバックグラウンドにある。
ＰＣＲサイクリングパラメーター：
Figure 2023518983000004
ＰＣＲ反応混合物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、配列番号３及び配列番号１、１０、１２～１４又は１６のうちの１つを含むＣＯＶＩＤ－１９プライマーセット（プライマーセット１）、並びに配列番号５のプローブオリゴヌクレオチドを含んでいた。記載されている場合には、内部対照核酸及び内部対照に対するプライマーセットも、陽性対照として含めた。反応混合物はまた、反応バッファー、ｄＮＴＰ、参照染料、ＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴｔｈ）を、当技術分野において一般に使用される濃度で、含んだ。
表３は、プライマーセットのそれぞれについての結果を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的及び内部標準ＲＮＡはいずれも、サイクリング条件下で増幅した。
Figure 2023518983000005
第２のＣＯＶＩＤ－１９プライマーセット（プライマーセット２）を、選択された第１のＣＯＶＩＤ－１９プライマーセットと共に含む追加のＰＣＲ反応を、行った。第２のＣＯＶＩＤ－１９プライマーセットは、配列番号２及び配列番号４を含んでいた。反応はまた、配列番号６をプローブオリゴヌクレオチドとして含んでいた。表４に示されるように、プライマーセット２は、いずれのプライマーセット１と比較してもより強いシグナル（ｄＲｎ）を示したが、プラマーセット２にプライマーセット１を加えると最も強い全シグナルを示した。
Figure 2023518983000006
［実施例２］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）核酸配列の増幅を、増幅オリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドの種々の組合せを用いて、リコンビナーゼ－ポリメラーゼ増幅（ＴＲＡ）を使用して行った。試験した組合せは、表５に示される。組合せ１は、標的領域を対象とし、組合せ２～５は第２の標的領域を対象とした。
Figure 2023518983000007
図１Ａ及び図１Ｂは、５つの組合せのそれぞれについての経時的なｄＲｎ値のグラフを示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的は、全ての組合せについて反応条件下で増幅され、検出可能なレベルの増幅が反応開始から１０分以内に起こった。組合せ１、４及び５では、標的増幅は４～６分で検出された（図１Ａ～図１Ｂ）。
［実施例３］
２０２０年４月２８日の時点でＧｅｎＢａｎｋにおいて入手可能なすべての完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列との相同性について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー及びプローブのそれぞれの配列を分析することによって、包括性（ｉｎｃｌｕｓｉｖｉｔｙ）を実証した。２６の国／地域（オーストラリア、ブラジル、中国、コロンビア、チェコ共和国、フランス、ギリシャ、香港、インド、イラン、イスラエル、イタリア、マレーシア、ネパール、オランダ、パキスタン、ペルー、南アフリカ、韓国、スペイン、スリランカ、スウェーデン、台湾、トルコ、ＵＳＡ及びベトナム）からの合計１３８３の完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列を分析した。９９．５％（１３７６／１３８３）が、全てのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー及びプローブ配列に対して１００％の同一性を示し、０．５％（７／１３８３）が、プライマー又はプローブの１つに対して単一のミスマッチを含んでいた。
２０２０年５月５日の時点でＧＩＳＡＩＤデータベースにおいて入手可能なすべての完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列との相同性について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー及びプローブのそれぞれの配列を分析することによって、包括性を実証した。８１の国／地域からの合計１４，９６４の完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列を分析し；１．１％（１７０／１４，９６４）が単一ミスマッチを含み、０．０４％（６／１４，９６４）が２つのミスマッチを含み、０．００７％（１／１４９６４）が４つのミスマッチを含んでいた。
［実施例４］
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを使用して、開示されるプライマーセットを既知のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２陽性試料、陰性試料及び非ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２呼吸器試料を使用してＡｂｂｏｔｔ Ａｌｉｎｉｔｙ ｍシステムで評価した。表６に示されるように、既知の陽性試料の希釈系列により、１００コピー／ｍＬの検出限界が決定された。検出限界（ＬＯＤ）は、試験の結果、全（真陽性）複製物の９５％以上が陽性であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の最低検出可能濃度と定義した。
Figure 2023518983000008
予め試験された１０９個の凍結鼻咽喉スワブを、陽性（ＰＰＡ）及び陰性（ＮＰＡ）一致パーセントについて上記で使用されたリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、再試験した（表７）。ＰＰＡは８９．８％（５３／５９）であることが判明し、ＮＰＡは９８％（４９／５０）であることが判明した。
Figure 2023518983000009
臨床相関、交差反応性及び検出限界（表８）も、Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００リアルタイムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイを使用して評価した。
Figure 2023518983000010
合計１０４個の検体を、Ａｂｂｏｔｔ ｍ２０００リアルタイムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイとＡｌｉｎｉｔｙ ｍ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リアルタイムＲＴ－ＰＣＲアッセイの両方によって分析した。２つのアッセイ間の陽性一致パーセント（ＰＰＡ）は１００％（４７／４７）であり、陰性一致パーセント（ＮＰＡ）は９６．５％（５５／５７）であった。結果を表９及び１０に要約する。
Figure 2023518983000011
Figure 2023518983000012
［実施例５］
英国において初めて同定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１．７株は、伝播性の増加とスパイク遺伝子変異と関連が観察されたため、評価が最も懸念されている。スパイク遺伝子変異が主にＢ．１．１．７系統を特徴付けるが、ゲノム全体に追加の変異が存在すると、種々の診断アッセイの性能に影響を及ぼす可能性がある。
ＧＩＳＡＩＤにおける（Ｎ＝１７８７、２０２０年１２月２１日にアクセス）Ｂ．１．１．７系統の初期のインシリコ調査により、本明細書中に記載されるプライマー、プローブ及び方法の性能に懸念のある、系統を特徴付ける変異（ｌｉｎｅａｇｅ－ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎ）は明らかにされなかった。ウイルス培養物（ＢＥＩ ＮＲ－５４０１１、ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿７５１８０１）を６５℃において３０分間、熱不活性化し、希釈系列で試験した。他の株で以前に観察された予想範囲において、複数の希釈溶液が検出された（表１１）。これらの結果は、本プライマー、プローブ及び方法がＢ．１．１．７株を確実に検出できるというインシリコ予測を裏付けた。これらは、英国公衆衛生庁（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ）によって実施された最近の評価と一致している。
残りの患者鼻咽喉スワブ検体を用いて、さらなる評価を行った。全ての検体のゲノム配列を完成させ、Ｂ．１．１．７系統に属することが確認された。残量に限りがあるため、残りのＶＴＭ（ウイルス輸送用培地；ｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｍｅｄｉａ）を試験前に５～６２．５倍に希釈した。充分な量の検体が全て検出された（表１１）。
Figure 2023518983000013
Ｂ．１．３５１系統は南アフリカで初めて同定された。それ以来、これは、十数カ国を超えて蔓延している。初期の報告は、このバリアントが中和抗体を逃れる可能性があることを示している。Ｂ．１．３５１系統の独特の変異プロフィールは、主にスパイク遺伝子変異Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙによって特徴付けられるが、ゲノム全体に追加の変異が存在すると、種々の診断アッセイの性能に影響を及ぼす可能性がある。
ＧＩＳＡＩＤにおける（Ｎ＝１９５、２０２０年１２月２７日にアクセス）Ｂ．１．３５１系統の初期のインシリコ調査）により、本明細書中に記載されるプライマー、プローブ及び方法の性能に懸念のある、系統を特徴付ける変異は明らかにされなかった。２つのウイルス培養物（ＢＥＩ ＮＲ－５４００８、ＮＲ－５４００９）を熱不活性化し、希釈系列で試験し、他の株で以前に観察された範囲において検出した（表１２）。これらの結果は、本プライマー、プローブ及び方法がＢ．１．３５１系統を確実に検出できるというインシリコ予測を裏付けた。
Figure 2023518983000014
前述の詳細な説明及び付随する実施例は、単に例示的なものであり、開示の範囲に対する制限と解釈されるべきではなく、開示の範囲は添付した特許請求の範囲及びその均等物によってのみ定義されることが理解される。
開示される実施形態に対する種々の変更及び修正は、当業者には明らかであり、その精神及び範囲から逸脱することなく行うことができる。

Claims (21)

  1. 試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリコンビナーゼ－ポリメラーゼ増幅及び検出のためのオリゴヌクレオチドのセットであって、
    配列番号１７と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号１９と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号１８と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド、若しくは
    配列番号２０若しくは２１と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号２５若しくは２６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号２２～２４のいずれかと少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド、又は
    それらの組合せ
    を含み、
    各プローブオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、
    セット。
  2. 第１の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号２０と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、第２の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号２５と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドが配列番号２２又は２３と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載のセット。
  3. 第１の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号２１と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、第２の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号２５又は２６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドが配列番号２４と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載のセット。
  4. 検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項１～３のいずれかに記載のセット。
  5. 試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための方法であって、
    試料を、請求項１～４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドのセット及び増幅用試薬と接触させるステップ、
    リコンビナーゼ－ポリメラーゼ増幅を使用して、試料中に存在する１種以上の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列を増幅するステップ、
    １種以上のオリゴヌクレオチドプローブを、１種以上の増幅された標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列にハイブリダイズするステップ、並びに
    検出可能な標識からのシグナルを測定することによって、１種以上の増幅されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸配列への１種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出するステップ
    を含む、方法。
  6. 検出可能な標識からの１つ以上のシグナルの存在が、１種以上の増幅されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸配列への、１種以上のプローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを示す、請求項５に記載の方法。
  7. オリゴヌクレオチドのセットからの第１及び第２の増幅オリゴヌクレオチドをリコンビナーゼ剤と接触させるステップをさらに含む、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 増幅用試薬が、ポリメラーゼ；リコンビナーゼ；リコンビナーゼローディングタンパク質；一本鎖結合タンパク質；バッファー；デオキシリボヌクレオチド；若しくはリボヌクレオチド三リン酸；クラウディング剤；ＡＴＰ、ＡＴＰ類似体若しくはＡＴＰ産生系；又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５～７のいずれかに記載の方法。
  9. 試料が、鼻腔スワブ若しくはブラシ、唾液、粘液、血液、血清、血漿又は糞便を含む、請求項５～８のいずれかに記載の方法。
  10. 試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキットであって、
    少なくとも１つの、請求項１～４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドのセット、又は
    配列番号１７～２６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むオリゴヌクレオチドのいずれか
    を含む、キット。
  11. 核酸配列を増幅及び検出するための試薬並びに／又は使用説明書をさらに含む、請求項１０に記載のキット。
  12. 試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチドの群であって、
    配列番号２と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号４と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号６と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドの第１のセット
    を含み、
    プローブオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、
    群。
  13. 配列番号１１及び１５のいずれかと少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第１の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号３と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含む第２の増幅オリゴヌクレオチド、並びに配列番号５と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドの第２のセット
    をさらに含み、
    プローブオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、
    請求項１２に記載の群。
  14. 検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項１２又は１３に記載の群。
  15. 試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための方法であって、
    試料を、請求項１２～１４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの群及び増幅用試薬と接触させるステップ、
    試料中に存在する１種以上の標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列を増幅するステップ、
    １種以上のオリゴヌクレオチドプローブを、１種以上の増幅された標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列にハイブリダイズするステップ、並びに
    検出可能な標識からのシグナルを測定することによって、１種以上の増幅されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸配列への１種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出するステップ
    を含む、方法。
  16. 検出可能な標識からの１つ以上のシグナルの存在が、１種以上の増幅されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸配列への、１種以上のプローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを示す、請求項１５に記載の方法。
  17. オリゴヌクレオチドのセットからの第１及び第２の増幅オリゴヌクレオチドをリコンビナーゼ剤と接触させるステップをさらに含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 増幅用試薬が、ニッキング酵素、ポリメラーゼ、一本鎖結合タンパク質、リコンビナーゼ剤、ヘリカーゼ、レゾルバーゼ、酵素補因子、バッファー、デオキシリボヌクレオチド、若しくはリボヌクレオチド三リン酸、又はそれらの組合せを含む、請求項１５～１７のいずれかに記載の方法。
  19. 試料が、鼻腔スワブ若しくはブラシ、唾液、粘液、血液、血清、血漿又は糞便を含む、請求項１５～１８のいずれかに記載の方法。
  20. 試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキットであって、
    少なくとも１つの、請求項１２～１４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの群、又は
    配列番号２～６、１１及び１５と少なくとも７０％の類似性を有する核酸配列を含むオリゴヌクレオチドのいずれか
    を含む、キット。
  21. 核酸配列を増幅及び検出するための試薬並びに／又は使用説明書をさらに含む、請求項２０に記載のキット。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1590471A4 (en) * 2002-12-31 2009-12-09 Metamorphix Inc COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS OF INFERENCE RELATING TO CATTLE CHARACTERISTICS
WO2004092383A2 (en) * 2003-04-15 2004-10-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME (SARS) VIRUS GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7339051B2 (en) * 2003-04-28 2008-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of severe acute respiratory syndrome (SARS)
WO2005081776A2 (en) * 2004-01-30 2005-09-09 Eragen Biosciences, Inc. Materials and methods for the detection of sars
US20100279273A1 (en) * 2007-07-17 2010-11-04 Universite Laval Nucleic acid sequences for the amplification and detection of respiratory viruses
US11332783B2 (en) * 2015-08-28 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Sample analysis, presence determination of a target sequence
WO2018154418A1 (en) * 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of early onset parkinson's disease (park1) and other synuclein, alpha (snca) gene related conditions or disorders

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