JP2014502846A - 多価輸送熱ワクチンのウイルス成分を同定し、識別するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

生物学的試料、特に家畜起源の試料中のウイルス特異的ポリヌクレオチド配列を同定するための方法および組成物が開示される。また、ウイルス起源の１種以上の哺乳動物病原体の１種以上の特定の種、株、型、または亜型の存在を検出するのに有用なオリゴヌクレオチドプライマー対、および標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブ、ならびに多価ワクチンのウイルス成分を同定し、家畜ワクチンを含む特定の弱毒化した生ウイルスの効力を定量するのに有用なものを含む、ウイルス特異的プライマーおよび標識された検出プローブを含む、システム、診断キットおよび製造品が開示される。特定の実施形態において、リアルタイム、定量的ＰＣＲ法が、多価ウシ輸送熱ワクチンにおけるウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂ、およびＢＶＤＶ−２）の３つの公知の遺伝的サブタイプを同定し、識別するのに利用される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、「Ｂｏｖｉｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １ｂ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」という発明の名称の同時係属の米国仮特許出願第６１／４２７，３６１号（２０１０年１２月２７日に本明細書と同時に出願され、本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）に関する。

連邦支援の研究または開発に関する声明
適用なし

研究契約に参加する団体の名称
適用なし

本発明の分野
本発明は概して、分子生物学、より具体的には獣医用臨床検査診断法の分野に関する。特に、ウシ呼吸器病症候群（ＢＲＤＣ）における病因または要因として関与している種を含む、特定のウイルス種、型、および／または亜型に由来する核酸セグメントの同定、増幅、定量および／または検出のためのシステム、方法、組成物、および診断キットが提供される。特に、ウシウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）の３つの既知の亜遺伝子型（ｓｕｂｇｅｎｏｔｙｐｅ）を同定および識別するための方法および組成物が開示される。

関連技術の詳細
輸送熱
「輸送熱」は、熱、気道の急性炎症、鼻汁、食欲不振、鬱病、線維素性肺炎、および感染組織の壊死により臨床的に特徴付けられるウシおよびヒツジにおける急性の感染力の強い敗血性症候群に与えられる用語である。輸送後に飼育場で最も頻繁に遭遇する輸送熱は若い畜牛の間の死の主な原因であり、５億ドル以上の産業に対する推定される年間損失の原因である。１９９１年単独で、輸送熱は、米国畜牛産業において処置、生産性損失、および死の費用の主な原因であるほぼ６億２４００万ドルの推定費用がかかった。

輸送熱の発症は一般的に、動物を初期のウイルス性呼吸器感染症にかかりやすくさせ、次に、１つ以上の二次的細菌感染の増殖に好適な状態を生じる、有害な外的要因に関与するとみなされている。

ウシ呼吸器病（ＢＲＤ）症候群（ＢＲＤＣ）
ＢＲＤＣ（多くの場合、一般に「輸送熱」と称される）は頻繁に、販売経路および目的地の牧場または飼育場において子ウシの保存者／飼育者を悩ます多因子疾患症候群である。ウイルスおよび細菌性病原体の両方に付随する連続または同時感染により特徴付けられる、ＢＲＤＣは肉牛および乳牛産業における経済的損失の主な原因である。

全ての年齢の畜牛（授乳している子ウシを含む）に感染する疾患は、速い呼吸、咳嗽、鬱病、食欲不振、眼漏および鼻汁、ならびに昇温により特徴付けられる。急性発生において、症状の発症の２４時間以内に死が起こり得る。鬱病を示す子ウシは、垂れ耳、伸長した頭、湾曲した背骨を有し、および／または多くの場合、それら自体他の子ウシから離れる。子ウシの健康は徐々に悪化し、それらは餌の摂取を止め、速い呼吸速度を示し、顕著な熱（典型的に１０４°〜１０８°Ｆの範囲）を発生する。

少なくとも４種のウイルス病原体がＢＲＤＣに関与している。それらは、ウシヘルペスウイルス１（ＢＨＶ−１）（ウシ伝染性鼻気管炎［ＩＢＲ］の病因）、ウシパラインフルエンザ３型ウイルス（ＰＩ_３）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）の１種以上の遺伝的変異体、およびウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）を含む。

ウイルス感染後、感染した動物は次いで、多くの場合、急性肺炎が現れる、１種以上のその後の細菌感染（例えば、マンヘモア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）［以前はパスツレア属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）］）ヘモリカ（ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレアムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ヒストフィルスソムニ（Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｉ）（以前はヘモフィルスソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ））、アクチノマイセスパイオジェン（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、および種々のマイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．））を発生する。

ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）
ＢＶＤＶは、現在、ＢＲＤＣにおける重要な病原体と認識されている。糞口様式で群れにわたって広がるウイルスが急性感染（下痢、熱、および出血症候群を含む）の原因となり、妊娠した畜牛の胎盤を交差でき、多くの場合、ウイルスに対して免疫寛容（ｉｍｍｕｎｏｔｏｌｅｒａｎｔ）である持続感染を受けた（ＰＩ）子ウシの誕生、およびそれらの生存の残りの間、持続的なウイルス血症を生じる。ＰＩウシ科は、現在、ウイルスの主要な保有宿主を表し、それらの動物は、肺炎または腸疾患の原因となる微生物に感染しやすくなっており、畜牛における致死的な粘膜疾患（ＭＤ）の発生に必要なウイルス保有宿主を与える（例えば、Ｌｉｅｓｓら，１９７４；Ｂａｒｂｅｒら，１９８５；Ｏｌａｆｓｏｎら，１９４６；Ｒａｍｓｅｙら，１９５３；Ｍａｌｍｑｕｉｓｔ，１９６８；およびＲｏｓｓら，１９８６（それらの各々は、本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）を参照のこと）。

ウシウイルス性下痢ウイルスは、表現型（例えば、Ｂａｋｅｒ，１９９５を参照のこと）（細胞変性または非細胞変性）および遺伝子型（例えば、Ｒｉｄｐａｔｈら，１９９４；Ｖｉｌｃｅｋら，２００１；およびＦｌｏｒｅｓら，２００２を参照のこと）の両方として分類され得るウイルスの異種の群である。家畜におけるＢＶＤＶに対する防御免疫を確立することは多くの理由のために問題がある。一部の他のウイルスに媒介される疾患におけるように、ＢＶＤＶに対する血清抗体のレベルは必ずしも疾患に対する防御と関連しない。ＢＶＤＶに対する母親由来抗体が、注入した免疫原を使い果たし、ワクチンを事実上無効にし得るので、授乳している子ウシにおいて防御免疫を確立することはさらなる障害を示す。

Ｆｕｌｔｏｎら（２００６）による研究は、米国の飼育場に入っている２１，７４３匹の子ウシを評価し、８８匹の子ウシがＢＶＤＶによる持続感染（ＰＩ）を受けたと決定した。８８匹のＰＩ子ウシのうち、７７．９％はＢＶＤＶ−１ｂに感染し、１１．６％のみがＢＶＤＶ−１ａに感染し、１０．５％のみがＢＶＤＶ−２ａに感染した。

本発明は、有益には、試料、特に生物学的または家畜起源の試料中の、またはそれらの試料から得たポリヌクレオチドの集団においてウイルス特異的ヌクレオチド配列を検出するためのシステムおよび方法を提供することによって従来技術に特有のこれらおよび他の欠点を克服する。本発明はまた、有益には、例えば、２種以上の遺伝的に関連するウイルス種、株、型、または亜型から得た核酸を含む、２種以上の遺伝的に関連するポリヌクレオチド集団から得た核酸を特異的に検出し、識別するための組成物および方法を提供することによって別の実施形態における当該技術分野の欠点を克服する。本発明は、初めて、ＢＶＤＶ（例えば、１ａ型、１ｂ型、および２型）の既知の遺伝的亜型に特異的なポリヌクレオチドを識別するため、およびウイルス粒子の多価集団に存在する各ウイルス成分を同定し、定量するための特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーおよび標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブ（およびそれらを含む診断アッセイキット）を提供できる。

本発明はまた、有益には、増幅プライマー対および標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブ、ならびに例えば、出願人の同時係属の米国仮特許出願第６１／４２７，３６１号（２０１０年１２月２７日に出願され、本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれている）に記載されている六価輸送熱ワクチンを含む、多価ワクチン製剤において個々の修飾された生ウイルス（ＭＬＶ）の効力をより正確に決定するために利用され得る、感受性の高い、ウイルス特異的検出システムを準備するための種々の実施形態においてこのような組成物を使用する方法を提供できる。

このようなウイルス特異的プライマーおよびプローブを含む診断キットを含む、製造品もまた開示される。（特に、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースの検出システムなどの蛍光および発色検出法を含む、１つ以上の検出可能な標識と併せて使用される場合）本発明の組成物を利用する定量的（および特に、リアルタイム定量的）ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）アッセイを使用して提供される迅速な分析および増加した感受性は、本発明が獣医学的臨床検査環境に与え得る多くの利点のうちのただ２つを例示する。

第１の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの第１のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマー、少なくとも１つの第２のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマー、およびポリヌクレオチドの集団のＰＣＲベースの増幅／検出アッセイを行うのに好適な少なくとも１つの第１の標識されたウイルス特異的検出プローブを含む組成物を提供する。

本明細書に記載されているように、このようなウイルス特異的検出プローブは好ましくは、限定されないが、１つ以上の発色、蛍光、スピン標識もしくは放射性部分、またはそれらの任意の組み合わせを含む、少なくとも１つの検出可能な標識を含む。

関連した実施形態において、本発明は、水性試料中の１つ以上のウイルス特異的核酸配列を検出するのに使用するための組成物を提供する。好ましくは、試料は、生物学的起源（限定されないが、細胞、組織、血液、血漿、血清、およびそれらの任意の組み合わせを含む）の試料、あるいは１つ以上のウイルス特異的核酸を含むことが知られているか、または含む疑いのある診断、検査もしくは医薬組成物もしくは製剤である。好ましくは、このような組成物は、哺乳動物家畜の１種以上の種で免疫反応を誘発できる哺乳動物ワクチン製剤、または免疫原性組成物である。

好ましくは、このような組成物は、１種以上のウシ病原性ウイルス種、株、型、および／または亜型に特異的である核酸配列に特異的にハイブリダイズし、その核酸配列のポリメラーゼ依存性増幅を容易にする１種以上のフォワード増幅プライマー、および１種以上のリバース増幅プライマーを含む。

本発明のさらなる態様は、限定されないが、本明細書に記載され、例示されるこれらのプローブ配列を含む、１種以上の好適な標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブ（複数も含む）を使用して検出可能および／または定量可能なＰＣＲにより複数の増幅された核酸セグメントを産生するために、好ましくは、適切な条件下で獣医学的に修飾された生ウイルスワクチンを含む試料由来のウイルス特異的核酸配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応を実施するのに好適な上述の組成物のうちの１種以上を含む、本明細書にさらに詳細に記載される診断および／または分子アッセイキットを含む。

本発明はまた、生物学的試料から得たポリヌクレオチドの集団における１種以上のウイルス特異的ポリヌクレオチドを増幅および／または検出するための物品の製造における１種以上のこのような組成物の使用を提供する。例示した実施形態において、そのような使用は、１種以上のＢＶＤＶ粒子、好ましくはＭＬＶと共に含まれる１種以上のこのようなウイルス粒子の増幅、検出、および／または定量を含む。例示的な実施形態において、多価ウシ輸送熱ワクチン内に含まれる複数の弱毒化した生ウイルス粒子由来のＢＶＤＶ１ｂ型、１ｂ型、および２型特異的ポリヌクレオチドの増幅、検出、および定量におけるこのような組成物についての使用が実証される。ウイルスの種々の種、株、型、または亜型に特異的なプローブ／プライマーの組み合わせを利用することによって、本発明の方法は、ワクチン効力、特にＢＲＤＣおよび既知のウイルス起源の病原体を有する関連する輸送熱などの疾患を予防するものなどの多価動物ワクチンの特徴付けにさらに利用され得る。

総合的および全体的な要旨において、本発明の方法は、ポリヌクレオチドの集団内由来、特にＢＲＤＣおよび関連する輸送熱などの多因子（および特に複数の病因起源の疾患）の１つ以上の症状の予防、処置、管理、および／または改善に効果的な多価ワクチン製剤由来のウイルス特異的ポリヌクレオチドの迅速、正確、かつ容易な検出を可能にする。このような方法は概して、少なくとも１つのサイクルステップを実施する工程であって、そのサイクルステップは、少なくとも１つの第１の増幅ステップおよび少なくとも１つの第１のハイブリダイズステップを含み、少なくとも１つの第１の増幅ステップは、ウイルス特異的核酸分子が試料に存在する場合、その試料を、本明細書に開示されるプローブ／プライマー組成物と接触させて、ウイルス特異的増幅産物を産生することを含み、少なくとも１つの第１のハイブリダイズステップは、その試料を組成物と接触させること、および得られたハイブリダイゼーション産物を特異的に検出するのに有効な条件下で、そのように産生された増幅産物を、少なくとも１つの第１の標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブと接触させることを含む。例示的な実施形態において、ウイルス特異的増幅プライマーの対は、配列番号１、配列番号１９、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、および配列番号１６の１つ以上から選択される核酸配列を含むか、それらから実質的になるか、または代替としてそれらからなる、約５０未満の長さのヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマー、ならびに配列番号２、配列番号２０、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、および配列番号１７の１つ以上から選択される核酸配列を含むか、またはそれらから実質的になるか、または代替としてそれらからなる約５０未満の長さのヌクレオチドの第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマーを含む。

特定の実施形態において、組成物は、少なくとも１つの第１の標識されたウイルス特異的検出プローブをさらに含んでもよい。そのような検出プローブは好ましくは、約５０未満の長さのヌクレオチドであり、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５および配列番号１８の１つ以上から選択される核酸配列を含むか、それらから実質的になるか、または代替としてそれらからなる。

好ましい実施形態において、第１のサイクルステップは好ましくは、ウイルス特異的核酸分子がポリヌクレオチドの集団に存在する場合、ポリヌクレオチドの集団を、一対のウイルス特異的増幅プライマーと接触させて、増幅産物を産生することを含み、さらに、少なくとも１つの第１のハイブリダイズステップは、そのように産生された増幅産物を検出するのに有効な条件下でポリヌクレオチドの集団を、少なくとも１つの第１の標識されたウイルス特異的検出プローブと接触させることを含む。特定の実施形態において、検出ステップはリアルタイムで実施されてもよく、さらに必要に応じて、ウイルス特異的検出プローブとウイルス増幅産物との間の融解温度を検出するさらなるステップを含んでもよい。

ワクチン効力を決定するための方法および組成物
本発明は、ウイルス特異的ポリヌクレオチド配列、具体的には動物ワクチンに存在するものなどのＭＬＶの試料中のＢＶＤＶ特異的ポリヌクレオチド配列を同定する方法を提供する。本発明はまた、試料中、特に哺乳動物ワクチン中、またはウシおよびワクチン候補から得た獣医学的もしくは生物学的検体のウイルス特異的ポリヌクレオチド配列を特異的に検出するための方法および組成物を提供する。開示される方法は好ましくは、ＰＣＲ増幅産物を検出し、得られた増幅産物をハイブリダイズしたプライマーにより標識し、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、および特に後の融解曲線（例えばＣτ）分析と併せてＰＣＲ／ＦＲＥＴベースのアッセイの１つ以上を使用してそのような増幅産物を定量するための、オリゴヌクレオチドプライマー対および標識されたオリゴヌクレオチドプローブ組成物およびキット、特に本明細書に開示される配列の１つ以上を含むものを利用する。

一実施形態において、本発明は、１種以上のウイルス特異的ポリヌクレオチド、またはウイルス由来のタンパク質、ペプチドもしくはポリペプチドの全てもしくは一部をコードする核酸セグメントの存在または非存在を検出するための方法を提供する。特定の態様において、１つ以上の生物学的試料は、個体（例えば、ワクチン製剤、または家畜から得た生物学的試料）から採取されてもよく、このような配列の存在についてスクリーニングされてもよい。特定の実施形態において、ワクチン製剤または生物学的試料は、例えば、多因子動物ワクチンのＭＬＶウイルス成分の１つ以上に特異的な配列を含む、１つ以上の特定のウイルス配列の存在についてスクリーニングされてもよい。

ＰＣＲのプロセスは分子生物学的分野における当業者に周知である（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号（各々は本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）を参照のこと）。ＰＣＲにおいてプライマーの温度依存性伸長は、適切な塩、金属カチオン、およびｐＨ緩衝系からなる反応媒体中の適切な量の４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）の存在下で重合剤により触媒される。適切な重合剤は、鋳型依存性ＤＮＡ合成を触媒することが知られている酵素である。例えば、鋳型がＲＮＡである場合、ＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ＣＤＮＡ）配列に変換する適切な重合剤はニワトリ骨髄芽球症ウイルスＲＴなどの逆転写酵素（ＲＴ）である。米国特許第５，６１４，３８８号（本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されているように、増幅のための標的がＤＮＡである場合、適切なポリメラーゼとしては、限定されないが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたはそのクレノウ断片、Ｔ_４ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴａｑポリメラーゼ（微生物、サーマスアクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離される熱安定ＤＮＡポリメラーゼ）が挙げられる。「Ｔａｑポリメラーゼ」として知られている、後者の酵素は、核酸の増幅およびシークエンシングに広範に使用されており、このようなポリメラーゼを使用するための反応条件は当業者に周知である（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，２００１を参照のこと）。ＰＣＲプロセスの好ましい実施形態において、反応は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素により触媒され、高温で実施される。好ましい温度は、酵素が熱安定性であり、十分なプライマーが重合の適度な速度を可能にするように鋳型鎖にアニールするように核酸が一本鎖および二本鎖の平衡状態である温度である。鎖分離は、二本鎖の変性を引き起こすが、ポリメラーゼの不可逆的変性を引き起こさないように十分な時間、十分に高温に反応物を加熱することにより達成される。

特定の用途において、本発明の方法は、有益には、少なくとも１つの第１のＰＣＲベースの増幅ステップ、および好ましくは、少なくとも１つのサイクルステップ（これは、少なくとも１つの第１の「増幅する」ステップおよび少なくとも１つの第１の「ハイブリダイズする」ステップを含む）を実施することを全体的に含む、少なくとも１つの第１の定量的ＰＣＲベースの増幅ステップを利用する。この増幅ステップは、ウイルス標的ポリヌクレオチドが試料中に最初に存在している場合、その試料を、一対のウイルス特異的オリゴヌクレオチドプライマーと接触させて、増幅産物を産生することを含む（反対に、ウイルス標的ポリヌクレオチドが試料中に最初に存在していない場合、特定の産物の増幅はＰＣＲプロセスの間に生じない）。

ハイブリダイズステップは典型的に、増幅ステップから得た試料を、このように産生された増幅産物に特異的にハイブリダイズ（すなわち結合）する１つ以上の標識されたオリゴヌクレオチドプローブと接触させることを含む。ＦＲＥＴ分析の場合、検出プローブは、ウイルス特異的オリゴヌクレオチドプローブのＦＲＥＴ適合性検出対（例えば、約４または５個以下の互いのヌクレオチド内の増幅産物にハイブリダイズするこれらのＦＲＥＴ適合性対を含む）の第１および第２のメンバーを含んでもよい。ＦＲＥＴ分析の場合、検出プローブの対の第１のプローブは典型的にドナー蛍光部分で標識され、検出プローブの対の第２のプローブは典型的に対応するアクセプター蛍光部分で標識される。これらの検出プローブ、およびハイブリダイズステップに使用するためにそれらに作動可能に連結され得る部分の種類は本明細書上記により詳細に記載している。

この方法はまた、少なくとも、適切な標識（および典型的にプローブに作動可能に連結するもの）の使用により増幅産物：プローブハイブリッドの存在または非存在を検出するステップであって、標識されたプローブからの信号の存在が通常、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す、ステップをさらに含む。反対に、産生した増幅産物の非存在下で、プローブハイブリダイゼーションステップ後に検出可能な信号は実質的に得られず、したがって、分析した試料中に最初に存在する核酸配列の集団内の標的ポリヌクレオチドの非存在を示す。

特定の実施形態において、増幅および検出ステップはリアルタイムで実施されてもよく、必要に応じて、その方法は、追加の定量または分析ステップ（例えば、検出プローブ（複数も含む）と対応する増幅産物と間の融解温度を決定して、分析した試料中にウイルス由来の標的配列（存在する場合）を定量またはさらに特徴付けることを含む）をさらに含んでもよい。

プローブとその対応する標的との間の融解温度を決定するプロセスは概して以下を含む：ＰＣＲ増幅産物および対応する検出プローブ（複数も含む）は約４０℃に冷却されて、標的ＰＣＲ増幅産物（複数も含む）の相補的配列（複数も含む）に対するプローブ（複数も含む）のアニーリングを促進する。（存在する場合）標的ＰＣＲ産物に対してプローブ（複数も含む）をアニールするのに有効な条件下で標識されたプローブ（複数も含む）が反応混合物と接触すると、次いで検出可能な標識（例えば、フルオロフォアなど）が、分子生物学の分野における当業者に公知の従来の技術を使用して検出（およびその後に定量）される。

核酸の検出は当業者に周知であり、多くのアプローチの適用により達成され得る。これらの方法は概して、当該技術分野において公知の任意の放射性、蛍光性、生物学的または酵素的タグまたは標識などの標識またはマーカーの検出に基づく（例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号（それらの各々は本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）を参照のこと）。本発明の実施に利用され得る検出可能な標識のさらなる例としては、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）などの常磁性イオンが挙げられ、ガドリニウムが特に好ましい。限定されないが、ローダミン、フルオレセインおよびレノグラフィンを含む蛍光部分も使用されてもよく、発色基質と接触すると有色産物を生成する酵素が特に好ましい。分子生物学の分野における当業者に知られているような二次結合リガンド（限定されないが、二次抗体および／またはビオチン／アビジンリガンド結合構成を含む）も使用されてもよい。

上記のように、任意の標識が上述の要件を満たし、それが核酸特異的標識と相互作用する限り、オリゴヌクレオチドプローブの標識として任意の標識が使用されてもよい。例としては、限定されないが、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＲＥＤ６４０、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＲＥＤ７０５、ＴＡＭＲＡおよびＡｌｅｘａ６３３が挙げられる。標識は、取り付けがオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに影響を与えない限り任意の位置においてオリゴヌクレオチドに取り付けられてもよい。特定の用途において、標識は通常、オリゴヌクレオチドプローブ分子の５’または２１末端のいずれかにおいて作動可能に連結（すなわち結合、取り付け、連結など）される。

本明細書に具体的に記載されるオリゴヌクレオチドに加えて、本明細書に記載されるウイルス効力アッセイに使用するための増幅プライマーまたは検出プローブのいずれかとして、（例えば、ＯＬＩＧＯ［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ，ＵＳＡ］）などのコンピュータプログラムを使用して）さらなる核酸が設計され、合成されてもよい。典型的に、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、約７もしくは８から約６０もしくは８０程度の長さのヌクレオチド（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９などの長さのヌクレオチド）である。本明細書で使用する場合、「ウイルス特異的プライマー（複数も含む）」とは、特定の選択されたウイルスのゲノム内に存在する核酸配列に特異的にアニールし、適切な条件下でそこから増幅産物のポリメラーゼ合成の開始を促進するオリゴヌクレオチドプライマー（複数も含む）を指す。同様に、「ウイルス特異的プローブ（複数も含む）」とは、適切な条件下でハイブリダイズしたプライマー対を使用した適切なポリメラーゼにより増幅される核酸配列に特異的にアニールし、従来のオリゴヌクレオチド検出アッセイなどを使用して順次に、付随して、連続して、および／または後で検出可能（および好ましくは定量可能）であるオリゴヌクレオチドプローブ（複数も含む）を指す。

オリゴヌクレオチド組成物
一実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブおよびウイルス特異的ポリヌクレオチドに特異的なプライマー配列ならびにそれらから産生された増幅産物を提供し、その増幅産物は、対応する相同ウイルスポリヌクレオチド配列、特に動物ワクチンに存在する修飾された生ウイルス粒子の配列に対するハイブリダイゼーション、およびそれらの増幅に有用である。例示的な実施形態において、ＢＶＤＶ特異的核酸配列の特定の遺伝子株、型、および亜型を検出および増幅するのに有用である例示的なオリゴヌクレオチドプライマー配列が開示される。

本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、ウイルス特異的核酸セグメント、および特にＢＶＤＶ特異的ポリヌクレオチド（およびそれらから誘導される増幅産物）の選択的増幅および検出のために設計される。開示されるプライマー配列は、ハイブリダイゼーション法、およびＰＣＲ（商標）ベースの増幅法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ／ＦＲＥＴベースの遺伝分析におけるリアルタイム−ｐＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲを含む）などのＤＮＡ増幅法における使用に適切である。同様に、開示されるオリゴヌクレオチド検出プローブは、本明細書に開示されるウイルス特異的増幅プライマーの１つ以上の対を使用した核酸の増幅から得られる産物を検出および定量するのに適切な標識手段を用いて標識するのに好適である。

適切なマーカーで標識される場合、オリゴヌクレオチド検出プローブは特に、例えば、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＦＲＥＴベースの分析などを含む、蛍光ベースの検出に適している。例えば、ＦＲＥＴで標識された検出法が特に、マイクロボリューム（ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ）蛍光分析に基づいた蛍光検出に有用である。開示された増幅および検出オリゴヌクレオチド対の１つ以上の使用は特に、組み合わせたＲＴ−ＰＣＲ（商標）／マイクロボリューム蛍光分析ＦＲＥＴベース法（ＲＴ−ＰＣＲ（商標）／ＦＲＥＴ）、および特にＩｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．により開発され、現在、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓにより製造され、市販されている「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）」機器により容易にされる分析において意図される。

ほとんどの実施形態に関して、本発明者は、本発明の選択されるプローブおよびプライマー組成物の長さが好ましくは、約５０〜６０未満などの長さのヌクレオチドであり、より好ましくは約４０〜４５未満などの長さのヌクレオチドであるのに対して、本発明の他のプローブおよびプライマーは、約３０〜３５程度の長さのヌクレオチドであってもよいことを意図する。一部の実施形態において、選択されるオリゴヌクレオチドプライマー配列（例えば、「フォワード」および「リバース」プライマー）の長さおよび／または選択される検出プローブ配列（例えば「アンカー」および「センサー」プローブ）の長さは、可能な場合、約２０〜３０程度の長さのヌクレオチドであるが、一部の場合、特定のプローブおよびプライマー配列のサイズは、約６０〜７０程度以上の長さのヌクレオチドであってもよい。あるいは、一部の実施形態において、より短いプローブおよび／またはプライマー配列を利用することが所望され得、例えば、本発明を実施するために選択されるオリゴヌクレオチドは、約１５〜２０程度の長さのヌクレオチドまたは一部の実施形態においてさらに短くてもよい。

本出願に関して、本明細書に記される種々の範囲内の全ての中間のオリゴヌクレオチドの長さは、本発明の範囲内に明確に含まれることを意図することが理解される。そのため、「約ＸＸ未満のヌクレオチドの長さ」であるオリゴヌクレオチドはその範囲内の全ての整数を含む。例えば、「約６０未満のオリゴヌクレオチドの長さ」であるオリゴヌクレオチドは、５９、５８、５７などから４、３、２、または１のヌクレオチドの長さであるオリゴヌクレオチドを含み、各々は明確に本開示の範囲内である。

本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホラミダイト化学（例えば、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ，１９９２および米国特許第４，９８０，４６０号、同第４，７２５，６７７号、同第４，４１５，７３２号、同第４，４５８，０６６号、および同第４，９７３，６７９号などを参照のこと）を含む、標準的な方法を使用した当業者に公知である多くの従来のアプローチ（例えば、Ｏｚａｋｉら，１９９２；Ａｇｒａｗａｌら，１９９０などを参照のこと）により合成されてもよい。ホスホロチオエート、ホスホラミデートなどの非天然の骨格基が得られる、代替の化学もまた、得られるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率に有害な影響を与えないならば、利用されてもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約１０〜約１２０の長さのヌクレオチドの範囲、より好ましくは約１５〜約１００の長さのヌクレオチドの範囲、さらにより好ましくは約２０〜約８０の長さのヌクレオチドの範囲であるが、結合位置および長さが、特定の実施形態について適切なアニーリングおよび融解特性を達成するために変化し得るので、オリゴヌクレオチドの正確な配列および長さは、とりわけ、それがハイブリダイズする標的核酸配列の性質に依存する。このような設計選択を得るための指針は、以下の実施例で利用され、またＨｏｌｌａｎｄら（１９９１）に詳細に記載されている「Ｔａｑｍａｎ（登録商標）型」アッセイを記載している多くの上記に引用した参照文献に見出され得る。上述の参照文献の各々は本明細書に対する参照を示すことによってその全体は本明細書に具体的に組み込まれる。

ウイルス特異的増幅プライマー
本発明の実施において、ウイルス特異的ポリヌクレオチド配列、および特にＢＶＤＶをコードするポリヌクレオチド配列の増幅に使用するためのフォワードおよびリバース増幅プライマーは好ましくは、配列番号１、配列番号１９、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、もしくは配列番号１６に開示される少なくとも約６〜少なくとも約２５（それらの間の各整数を含む）またはそれ以上の「フォワード」オリゴヌクレオチドプライマー配列または配列番号２、配列番号２０、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、もしくは配列番号１７に開示される「リバース」オリゴヌクレオチドプライマー配列のいずれかから、あるいは配列番号１、配列番号１９、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、もしくは配列番号１６に開示される「フォワード」オリゴヌクレオチドプライマー配列または配列番号２、配列番号２０、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、もしくは配列番号１７に開示される「リバース」オリゴヌクレオチドプライマー配列のいずれかに対して少なくとも約９０％同一であるオリゴヌクレオチド配列から、あるいはさらに配列番号１、配列番号１９、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、もしくは配列番号１６に開示される「フォワード」オリゴヌクレオチドプライマー配列または配列番号２、配列番号２０、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、もしくは配列番号１７に開示される「リバース」オリゴヌクレオチドプライマー配列のいずれか１つに対して少なくとも約９５％同一であるオリゴヌクレオチド配列から隣接する核酸を含むか、それらから実質的になるか、または代替としてそれらからからなる。

他の実施形態において、本発明の好ましいオリゴヌクレオチドフォワードおよびリバース増幅プライマー配列は、配列番号１、配列番号１９、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、もしくは配列番号１６に開示される「フォワード」オリゴヌクレオチドプライマー配列または配列番号２、配列番号２０、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、もしくは配列番号１７に開示される「リバース」オリゴヌクレオチドプライマー配列のいずれか１つを含んでもよく、それらから実質的になってもよく、または代替としてそれらからなってもよいのに対して、他の実施形態において、配列番号１、配列番号１９、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、もしくは配列番号１６に開示される「フォワード」オリゴヌクレオチドプライマー配列、または配列番号２、配列番号２０、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、もしくは配列番号１７に開示される「リバース」オリゴヌクレオチドプライマー配列のいずれか１つから実質的になるプライマー配列を利用することが望まれ得るのに対して、さらに他の実施形態において、配列番号１、配列番号１９、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、もしくは配列番号１６に開示される「フォワード」オリゴヌクレオチドプライマー配列、または配列番号２、配列番号２０、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、もしくは配列番号１７に開示される「リバース」オリゴヌクレオチドプライマー配列のいずれか１つからなるプライマー配列を利用することが望まれ得る。

なおさらなる実施形態において、本発明の方法を実施するのに好適なフォワードおよびリバース増幅プライマー組成物は、配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つに開示される約６〜約２５（その間の各整数を含む）もしくはそれ以上のヌクレオチドの隣接核酸配列を表す核酸配列を含んでもよく、それらから実質的になってもよく、または代替としてそれらからなってもよい。

同様に、本発明の増幅方法を実施するのに好ましいプライマー組成物は、約６〜約２５（それらの間の各整数を含む）の隣接核酸配列、または配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つに開示される多くのヌクレオチドに対して約９０％同一である核酸配列を含んでもよく、それらから実質的になってもよく、または代替としてそれらから実質的になってもよい。

さらに、本発明の増幅方法を実施するのに好適な増幅プライマー組成物は、配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６もしくは配列番号１７のいずれか１つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか１つに対して少なくとも約９５％同一である核酸配列を含んでもよく、それらから実質的になってもよく、または代替としてそれらからなってもよい。

他の実施形態において、本発明を実施するのに好適なプライマー組成物は、配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか１つから選択される少なくとも約６〜少なくとも約２５（再び、それらの間の互いの整数を含む）もしくはそれ以上の隣接核酸である核酸配列を含んでもよく、それらから実質的になってもよく、または代替としてそれらからなってもよく、あるいは配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか１つに対して少なくとも約９０％同一であるオリゴヌクレオチド配列から実質的になってもよいか、あるいはさらに、配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか１つに対して少なくとも約９５％同一であるオリゴヌクレオチド配列から実質的になってもよい。

特定の実施形態において、本発明の例示的な増幅プライマーは、少なくとも約５０の長さのヌクレオチドであり、配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つに開示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、もしくはそれらからなる。

他の実施形態において、本発明の例示的な増幅プライマーは、少なくとも約４０の長さのヌクレオチドであり、配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つに開示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなる。

さらなる実施形態において、本発明の例示的な増幅プライマーは、少なくとも約３０の長さのヌクレオチドであり、配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つに開示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなる。

本発明のなおさらなる態様において、本発明の例示的な増幅プライマーは、少なくとも約２５の長さのヌクレオチドであり、配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つに開示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなるのに対して、他の実施形態において、本発明の例示的な増幅プライマーは、少なくとも約２０などの長さのヌクレオチドであり、配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つに開示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなる。

特定の例示的な実施例において、本発明のオリゴヌクレオチドプライマー組成物は、約５０未満の長さのヌクレオチドであり、配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むのに対して、他の例示的な実施例において、本発明のオリゴヌクレオチドプライマー組成物は、約４０未満の長さのヌクレオチドであり、配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、さらに他の実施例において、本発明のオリゴヌクレオチドプライマー組成物は、約３０未満の長さのヌクレオチドであり、配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。

本発明の一部の態様において、約４５未満などの長さのヌクレオチドであり、配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つのヌクレオチド配列から実質的になる、本明細書に開示される方法を実施する際のオリゴヌクレオチドプライマー組成物、または約３５未満などの長さのヌクレオチドであり、配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つのヌクレオチド配列から実質的になる組成物を利用することが望まれ得るのに対して、さらに他の実施例において、約２５未満などの長さのヌクレオチドであり、配列番号１、配列番号１９、配列番号２、配列番号２０、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１７のいずれか１つのヌクレオチド配列から実質的になるオリゴヌクレオチドプライマー組成物を利用することが望まれ得る。

ウイルス特異的検出プローブ
本発明の実施において、本明細書に記載されるＲＴ−ｑＰＣＲ（商標）分析を使用するウイルス特異的ポリヌクレオチド配列（および特にＢＶＤＶ特異的ポリヌクレオチド配列）の検出に使用するためのオリゴヌクレオチドプローブは好ましくは、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８に開示されるオリゴヌクレオチドプローブ配列のいずれか１つに由来するか、または配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８に開示されるオリゴヌクレオチド検出プローブ配列のいずれか１つに対して少なくとも約９０％同一であるオリゴヌクレオチド配列に由来するか、またはさらに配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８に開示されるオリゴヌクレオチドプローブ配列のいずれか１つに対して少なくとも約９５％同一であるオリゴヌクレオチド配列に由来する少なくとも約６〜少なくとも約２５（それらの間の各々の整数を含む）またはそれ以上の隣接核酸を含む。

他の実施形態において、本発明の好ましいオリゴヌクレオチド検出プローブは、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８に開示されるオリゴヌクレオチドプローブ配列のいずれか１つを含んでもよいか、それらから実質的になってもよいか、または代替としてそれらからなってもよく、一方、他の実施形態において、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか１つから実質的になる検出プローブ核酸セグメントを利用することが望ましくなり得、一方、さらに他の実施形態において、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８に開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか１つからなるプローブ配列を利用することが望ましくなり得る。

なおさらなる実施形態において、特に、ＦＲＥＴ分析がそのように産生された増幅産物を検出するために利用され、本発明の検出プローブは好ましくは一対のプローブを含み、その第１は「アンカー」プローブであり、その第２は「センサー」プローブである。

本発明の方法を実施するのに好ましいプローブ組成物は、一対の検出プローブを含んでもよく、それらから実質的になってもよく、または代替としてそれらからなってもよく、その第１および第２のメンバーは、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８のいずれか１つに開示される約６〜約２５（それらの間の各々の整数を含む）もしくはそれ以上のヌクレオチドの隣接核酸配列を表す核酸配列からなってもよい。

同様に、ＦＲＥＴベースの検出法を実施するのに好ましいプローブ組成物は、一対の検出プローブを含んでもよいか、それらから実質的になってもよいか、またはそれらからなってもよく、その第１のメンバーは、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８のいずれか１つに開示される約６〜約２５（それらの間の各整数を含む）もしくはそれ以上のヌクレオチドの隣接核酸配列に対して約８０％、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％もしくは少なくとも約８５％同一である核酸配列からなってもよく、一方、その一対の検出プローブの第２のメンバーは好ましくは、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８のいずれか１つに開示される約６〜約２５（それらの間の各整数を含む）もしくはそれ以上のヌクレオチドの隣接核酸配列に対して約９０％、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％もしくは少なくとも約９５％同一である核酸配列を含んでもよいか、それらから実質的になってもよいか、または代替としてそれらからなってもよい。

さらに、増幅産物のＦＲＥＴベースの分析が望まれる場合、本発明の方法を実施するのに好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、一対のＦＲＥＴ検出プローブ含んでもよいか、それらから実質的になってもよいか、または代替としてそれらからなってもよく、その第１および第２のメンバーは、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８のいずれか１つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか１つに対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、または少なくとも約９８％もしくは９９％同一である核酸配列を含んでもよい。他の実施形態において、本発明を実施するのに好ましいプローブ組成物は、一対のＦＲＥＴアンカー／センサープローブを含んでもよいか、それらから実質的になってもよいか、または代替としてそれらからなってもよく、その第１および第２のメンバーは、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８のいずれか１つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか１つから選択される少なくとも約６〜少なくとも約２５（それらの間の各整数を含む）もしくはそれ以上の隣接核酸である核酸配列から実質的になってもよいか、あるいは配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８のいずれか１つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか１つに対して少なくとも約９０％同一であるオリゴヌクレオチド配列から実質的になってもよいか、あるいはさらに、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８のいずれか１つに開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか１つに対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、または少なくとも約９８％もしくは９９％同一であるオリゴヌクレオチド配列から実質的になってもよい。

特定の実施形態において、本発明の例示的なウイルス増幅産物特異的オリゴヌクレオチド検出プローブ組成物は好ましくは、少なくとも約５０などの長さのヌクレオチドであり、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなる。

他の実施形態において、本発明の例示的な検出プローブ組成物は好ましくは、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなる少なくとも約４０など長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。

他の実施形態において、検出プローブ組成物は、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらかなる少なくとも約３０などの長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってもよく、一方、さらに他の実施形態において、適切な検出オリゴヌクレオチドは、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなる少なくとも約２０などの長さのヌクレオチドであってもよい。

特定の例示的な例において、本発明のオリゴヌクレオチド検出プローブ組成物は、約５０未満などの長さのヌクレオチドであり、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、一方、他の例示的な例において、オリゴヌクレオチド検出プローブ組成物は、約４０未満の長さのヌクレオチドであり、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、または配列番号１８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。

他の適用において、適切なオリゴヌクレオチド検出プローブは、約３０未満の長さのヌクレオチドであってもよく、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでもよい。

本発明の一部の態様において、約４５未満などの長さのヌクレオチドであり、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８のいずれか１つのヌクレオチド配列から実質的になる、本明細書に開示される方法を実施する際のオリゴヌクレオチドプローブ組成物、あるいは代替として、約３５未満などの長さのヌクレオチドであり、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８のいずれか１つのヌクレオチド配列から実質的になるオリゴヌクレオチドプローブを利用することが望まれ得、一方、さらに他の例において、約２５未満などの長さのヌクレオチドであり、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、もしくは配列番号１８のいずれか１つのヌクレオチド配列から実質的になるオリゴヌクレオチド検出プローブ組成物を利用することが望まれ得る。

例示的な実施形態において、本発明は好ましくは、配列番号１から配列番号１８に開示されるオリゴヌクレオチド配列のいずれか１つもしくは複数に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％またはそれ以上同一である核酸配列を含むか、それらから実質的になるか、またはそれらからなるウイルス特異的増幅プライマーおよび検出プローブを提供する。

特定の実施形態において、本発明は、ウイルス増幅産物の１つ以上の部分に対するそれらの特異的結合に基づいて設計されるプライマーおよびプローブのセットを提供する。それらのプローブおよびプライマーは特に、生物学的試料中のウイルス特異的ポリヌクレオチド配列を迅速に検出し、同定するための方法に有用である。特定の実施形態において、これらの方法は、限定されないが、定量的ＰＣＴ（ｑＰＣＲ）、逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、および／またはＲＴ−ＰＣＲ／蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（ＲＴ−ＰＣＲ／ＦＲＥＴ）ベースの増幅、検出、ならびに／あるいは定量方法を含む、リアルタイム定量を含む。

本発明の例示的な実施形態を以下に記載する。明確さの目的のために、実際の実施の全ての特徴を本明細書に記載しているわけではない。もちろん、任意のこのような実際の実施形態の開発、多数の実施に特有の決定が、ある実施から別の実施へと変更する、システムに関連し、ビジネスに関連する制約の順守などの開発者の特定の目標を達成するためになされなければならないことは理解されるだろう。さらに、そのような開発の試みは、複雑であり、時間を消費する場合もあるが、本開示の利益を受ける当業者には慣用であることは理解されるだろう。

ペスチウイルス（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）
ペスチウイルスは世界中で動物に経済的に重要な疾患を引き起こす。フラビウイルス科内のペスチウイルス属は、３種の一本鎖プラスセンスＲＮＡウイルス：ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、古典的ブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）を含む。最近、ペスチウイルスの４番目の異なる群が、遺伝学的にＢＶＤＶに関連し、ウシウイルス性下痢ウイルス２型（ＢＶＤＶ−２）として文献に参照されていると確認された（例えば、Ｔｈｉｅｌら，１９９６；およびＢｅｃｈｅｒら，１９９５（それらの各々は本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）を参照のこと）。したがって、ここで、同じ文書で、２種を識別するために元の種のＢＶＤＶを「ＢＶＤＶ−１」と表す。

ペストウイルス種の型はＢＶＤＶ１型（ＢＤＶＤ−１）であり、そのゲノムは、長さが約１２．５ｋｂであり、１つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する（Ｃｏｌｌｅｔｔら，１９９８（本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれる））。約４５０ｋＤａの大きなポリタンパク質のためのＯＲＦコードは、宿主またはウイルスプロテアーゼにより同時翻訳で、および翻訳後に処理される。標準的なＢＶＤＶポリプロテインのＮ末端は、非構造タンパク質ｐ２０（Ｎｐｒｏ）、カプシドタンパク質ｐ１４（Ｃ）；エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４８（Ｅ０）、ｇｐ２５（Ｅ１）、ｇｐ５３（Ｅ２）；非構造タンパク質ｐ１２５（ＮＳ２３）、ｐ１０（ＮＳ４Ａ）、ｐ３２（ＮＳ４Ｂ）、ｐ５８（ＮＳ５Ａ）およびｐ７５（ＮＳ５Ｂ）を生じる（例えば、Ｔａｕｔｚら，１９９７；Ｘｕら，１９９７；Ｅｌｂｅｒｓら，１９９６；およびＷｉｓｋｅｒｃｈｅｎら，１９９１（それらの各々は本明細書に対する参照を示すことによりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）を参照のこと）。ＢＶＤＶ−１は２つのバイオタイプ、細胞変性（「ｃｐ」と指定）または非細胞変性（「ｎｃｐ」）に存在し、それらは典型的に、細胞変性変異において単一の８０ｋＤａポリペプチド（非構造タンパク質ｐ８０、ＮＳ３）の産生が異なる（例えば、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら，１９６０（本明細書に対する参照を示すことによってその全体が具体的に組み込まれる）を参照のこと）。

複数のＢＶＤＶ単離株の系統発生解析に基づいて、ＢＶＤＶ−１は少なくとも１３の異なる亜遺伝子型（ＢＶＤＶ−１ａからＢＶＤＶ−１１と指定）を含むことが示されており、一方で、２つの亜遺伝子型（ＢＶＤＶ−２ａおよびＢＶＤＶ−２ｂ）がＢＶＤＶ−２について同定されている（例えば、Ｐｅｌｌｅｒｉｎら，１９９４；Ｒｉｄｐａｔｈら，１９９４、およびＸｕｅら，２０１０（それらの各々は本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）を参照のこと）。

過去３０年において、畜牛産業で市販されている、ＢＶＤＶについてのほぼ１００および５０のワクチン、修飾された生ウイルス（ＭＬＶ）および不活性化された弱毒化したウイルスまたはウイルス粒子の両方は成功度が異なり、市販ワクチン製剤の広範な利用および使用にも関わらず、年間ベースでＢＶＤＶの発生が依然として報告されている。疾患管理に対する現在のアプローチは、畜牛に対してワクチンの反復される毎年の接種を含み、追加のステップが一般に、ＰＩキャリアとして子ウシが生まれないことを保証するために試みられる。いくつかの異なる試験法がＢＶＤＶを検出するために開発されており、および／またはＢＶＤＶに感染した動物の検出は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、標準的なウイルス単離技術、および種々の免疫組織化学的分析を含む。

ウイルス効力アッセイ
所与のワクチンに対する認可の主な障害となるのは多くの場合、適した効力試験の開発である。歴史的に、ＢＶＤＶ効力試験が、ワクチン中のウシウイルス性下痢ウイルスを滴定するための補足アッセイ法（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ Ａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ）（ＳＡＭ１０１）に従って行われている。ＳＡＭ１０１のような方法は、感染性細胞株を接種する前にＢＨＶ、ＰＩ_３およびＢＲＳＶ画分を中和するために単一特異的な中和抗血清を利用する。細胞変性効果（ＣＰＥ）のために培養物を観測し、次いで特定のウェル（希釈）が、ＢＶＤＶ１型または２型について陽性または陰性であるかを決定するために直接蛍光抗体（ＦＡ）および／または間接ＦＡ（ＩＦＡ）染色を使用する。次いでＣＰＥ／ＦＡについて陽性であると決定したウェルに基づいて力価を算出する。

しかしながら、主にＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂおよびＢＶＤＶ−２についての既存の抗体は、これらの遺伝子型と亜遺伝子型との個々の力価を正確に識別するのに必要とされる特異性を欠くため、上記のような従来の方法はＢＶＤＶの亜遺伝子型を識別するのに十分に適していない。

この問題はペスチウイルスゲノムの非翻訳領域に存在する相違を識別することによって克服できる。これらの相違は、ペスチウイルスを遺伝子型と亜遺伝子型に分離するために使用されている（Ｐａｔｏｎ，１９９５；およびＨｏｆｍａｎｎら，１９９４）。ＲｉｄｐａｔｈおよびＢｏｌｉｎ（１９９８）は、ＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂおよびＢＶＤＶ−２を識別するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を報告している。逆転写−定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）アッセイはヒト生物学に増加しつつあり、麻疹ウイルス（Ｓｃｈａｌｋら，２００４）；アデノウイルスベースのワクチン（Ｗａｎｇら，２００５）、ロタウイルスワクチン（Ｒａｎｈｅｉｍら，２００６）、および三価はしか・おたふく風邪・風疹（ＭＭＲ）ワクチン（Ｓｃｈａｌｋら，２００５）の効力を決定するために使用される。上述の参照文献の各々は本明細書に対する参照を示すことによりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。

「Ｂｏｖｉｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １ｂ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」（本明細書と同時に出願され、本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）という発明の名称の同時係属の米国仮特許出願第６１／４２７，３６１号において、本発明者は、多価ワクチンにおける個々のウイルス成分の直接ウイルス定量（すなわち「効力」）を得るのに有用な修飾された遺伝的に基づいたアッセイプロトコルの開発を報告している。本発明は、個々のアッセイウェル（すなわち希釈物）における特定のウイルス種、型、または亜型の存在または非存在を決定するために従来のＦＡ／ＩＦＡアッセイ（現在のＳＡＭ１０１アッセイに記載されたもの）をＲＴ−ｑＰＣＲアッセイと置き換える。

本明細書に記載される六価ＭＬＶワクチンなどの多価ワクチンの個々の成分についての効力試験はまた、ＣＰＥの目視観測を個々のウェルのＲＴ−ｑＰＣＲ／ｑＰＣＲ分析に置き換えることによって、より客観的にすることができる。例えば、ウイルス力価アッセイにおけるＣＰＥの観測はむしろ主観的であり得、多くの場合、試験設備間でのＭＬＶワクチン力価の相違の源であるとみなされる。しかしながら、アッセイの客観性を増加させることによって、実験室間の再現性も増加するはずである。

ＰＩ_３についての効力試験は、パラインフルエンザ３ウイルスワクチン（ＭＶＳＡＭ１０２．０１）を滴定するための修飾された補足アッセイ法を使用して実施できる。ＢＲＳＶについての効力試験は、ワクチンにおけるウシ呼吸器合胞体ウイルスを滴定するための修飾された補足アッセイ法（ＭＶＳＡＭ０１２９．０１）を使用して実施できる。これらのアッセイは、ＣＰＥの視覚観測を、個々のウェルのリアルタイムｑＰＣＲ分析に置換することによって修飾される。ＢＨＶ画分の力価は、ワクチンにおけるウシ伝染性鼻気管炎ウイルスを滴定するための修飾された補足アッセイ法（ＭＶＳＡＭ１０５．０１）を使用して実施する。このアッセイにおいて、多価ワクチン分析についてのアッセイを標準化するために標準的な６ウェルフォーマットの代わりに９６ウェルフォーマットが使用されてもよい。重要なことには、このプロトコルは、目視観測を個々のウェルのｑＰＣＲ分析に置き換え、ＢＨＶプラークを計数して、より正確かつ確実なアッセイを提供することを含む。

核酸増幅
増幅のための鋳型として使用される核酸は標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９８）に従ってウイルスまたは細胞から単離され得る。核酸はゲノムＤＮＡまたは断片化もしくは全細胞ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡが使用される場合、ＲＮＡを相補的ＤＮＡに変換することが望まれ得る。一実施形態において、ＲＮＡは全細胞ＲＮＡであり、増幅のための鋳型として直接使用される。

ウイルス特異的ポリヌクレオチド（または保存された隣接領域）に対応する核酸と選択的にハイブリダイズするプライマー対は、選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、単離核酸と接触する。本明細書に定義されるように、「プライマー」という用語は、鋳型依存性のプロセスにおいて発生核酸の合成をプライミングできる任意の核酸を包含することを意味する。典型的に、プライマーは、８または１０個から４０個程度の長さの塩基対（ｂｐ）のオリゴヌクレオチドであるが、より長い、または短い配列が特定の実施形態において利用されてもよい。プライマーは二本鎖または一本鎖形態で提供されてもよいが、一本鎖形態が好ましい。

一旦ハイブリダイズすると、核酸：プライマー複合体は鋳型依存性核酸合成を促進する１種以上の酵素と接触する。十分な量の増幅産物が産生されるまで、「サイクル」とも称される、複数の増幅ラウンドが実施される。

次に増幅産物が検出される。特定の用途において、検出は視覚手段によって実施されてもよい。あるいは、検出は、化学発光、組み込まれた放射性標識もしくは蛍光標識の放射性シンチグラフィーによる、またはさらに、電気もしくは熱衝撃信号を使用するシステムによる生産物の間接同定を含んでもよい。

所与の鋳型試料中に存在するマーカー配列を増幅させるために複数の鋳型依存性プロセスが利用可能である。最もよく知られている増幅法の１つはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、それは米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２号、および米国特許第４，８００，１５９号（それらの各々はその全体が本明細書に参照として組み込まれる）に詳細に記載されている。

手短に述べると、ＰＣＲ（商標）において、反対のマーカー配列の相補鎖における領域に相補的である２つのプライマー配列を調製する。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼと共に反応混合物に加える。マーカー配列が試料中に存在する場合、プライマーはマーカーに結合し、ポリメラーゼにより、プライマーはヌクレオチドに加えることによりマーカー配列に沿って伸長する。反応混合物の温度を上昇させ、低下させることによって、伸長したプライマーはマーカーから解離して反応産物を形成し、過剰なプライマーはマーカーおよび反応産物に結合し、プロセスが反復される。

増幅したｍＲＮＡの量を定量するために逆転写ＰＣＲ（商標）増幅手順が実施されてもよい。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されている。逆転写のための代替の方法は熱安定性のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。

得られた「ジ−オリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下での２つ（またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドのライゲーションに基づいた方法、それによるジ−オリゴヌクレオチドの増幅もまた、本発明の増幅ステップに使用されてもよい。

任意の増幅後、特異的増幅が発生したかどうかを決定する目的のために鋳型および過剰なプライマーから増幅産物を分離することが望まれ得る。一実施形態において、増幅産物は、標準的な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）（これは本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）を参照のこと）を使用してアガロース、アガロース−アクリルアミドまたはポリアクリルアミゲル電気泳動により分離される。

あるいは、増幅産物および／またはハイブリダイズした増幅産物：標識されたプローブ二本鎖の分離を行うためにクロマトグラフ法が利用されてもよい。限定されないが、吸着、分離、イオン交換クロマトグラフ、分子篩、ならびにカラム、紙、薄層およびガスクロマトグラフィーを含むこれらを使用するための多くの特殊な技術を含む、本発明の増幅産物の分析に関連して使用され得る多くの種類のクロマトグラフィーが存在する。

マーカー配列の増幅を確認するために増幅産物は可視化されなければならない。１つの典型的な可視化法は、エチジウムブロマイドを用いるゲルの染色およびＵＶ光下での可視化を含む。代替として、増幅産物が放射性または蛍光定量的に標識されたヌクレオチドで完全に標識される場合、増幅産物はｘ線フィルムに曝露されるか、または分離後、適切な刺激スペクトル下で可視化される。

特定の実施形態において、可視化は間接的に達成され得る。増幅産物の分離後、標識された核酸プローブは増幅されたマーカー配列と接触される。プローブは好ましくは発色団とコンジュゲートされるが、放射性標識されてもよい。別の実施形態において、プローブは抗体またはビオチンなどの結合パートナーにコンジュゲートされ、結合対の他のメンバーは検出可能な部分を保有する。

一実施形態において、検出は、適切に標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブを用いたサザンハイブリダイゼーション（ブロッティング）による。サザンブロッティングに関する技術は当業者に周知であり、分子プロトコルに関する多くの標準的な書籍に見出され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと。手短に述べると、増幅産物はゲル電気泳動により分離される。次いでゲルはニトロセルロースなどの膜と接触し、核酸の移動および非共有結合を可能にする。続いて、膜は、標的増幅産物とハイブリダイズできる発色団がコンジュゲートしたプローブと共に培養される。検出は、ｘ線フィルムまたはイオン放出検出装置に対する膜の曝露による。

上述の一例は、自動化電気泳動および核酸の移動のための装置および方法を開示している、米国特許第５，２７９，７２１号（本明細書に対する参照を示すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されている。その装置は、ゲルの外部操作を用いずに電気泳動およびブロッティングを可能にし、本発明に係る方法を実施するのに理想的に適している。

ポリヌクレオチド増幅キット
本発明はまた、ウイルス由来核酸、特に、限定されないが、ＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂ、およびＢＶＤＶ−２を含む、ＢＶＤＶについての１つ以上の特定の株、型、または亜型に特異的な核酸を増幅するためのキットを提供する。このようなキットは典型的に、ポリヌクレオチドの集団から１種以上のウイルス核酸を増幅するのに必要な２つ以上の成分を含む。例えば、キット内の１つの容器が第１のプライマーを含んでもよく、一方、キット内の第２の容器が第２のプライマーを含んでもよい。キット内の第３の容器は、１種以上のハイブリダイゼーションおよび／または検出プローブ、ならびに／あるいは１種以上のそのような検出プローブを標識するための１種以上の試薬を含んでもよい。さらに、本発明のキットはまた、本明細書に記載される増幅および／または検出反応においてプライマーを使用するための指示書、ならびに１種以上の蛍光分子（複数も含む）、または必要に応じて、限定されないが、例えば、緩衝酵素、ポリメラーゼ、ＲＮＡｓｅｓなどを含む、他の試薬を含んでもよい。

ウイルス特異的ヌクレオチドを検出し、定量するためのキット
診断キットは本発明の別の態様を表す。このようなキットはまた、プローブ、プライマー、蛍光標識、または反応緩衝液、ポリメラーゼなどのためのキット内に１つ以上の別の容器手段を含んでもよい。キットはまた、限定されないが、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ／ＦＲＥＴなどを含む、１つ以上のポリメラーゼ連鎖反応に基づいた方法においてキット内に含まれる組成物を使用するための指示書をさらに含んでもよい。１種以上の株、型、もしくは亜型またはＢＶＤＶ（限定されないが、ＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂ、およびＢＶＤＶ−２を含む）などのウイルス、あるいは限定されないが、このような１種以上のウイルス特異的ポリヌクレオチドを含む疑いのある試料中のＢＨＶ−１、ＰＩ_３、ＢＲＳＶなどの１種以上のさらなる哺乳動物ウイルス病原体を検出するためのキット内に含まれる試薬を使用するための指示書がまた、提供されてもよい。特定の実施形態において、本発明の診断アッセイキットはまた、好ましくは、例えばリアルタイムｑＰＣＲを含む、本明細書に記載されるＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ／ＦＲＥＴアッセイにおいてこのようなキット内に含まれる物品を使用するための指示書を含んでもよい。

上述のキットのいずれかは、さらに必要に応じて、検出アッセイについての標準曲線を調製するのに使用するための、１種以上の「陽性」または「陰性」対照因子（複数も含む）（標識されているかまたは標識されていないかに関わらず）を含んでもよい。キットの成分は、例えば、水性媒体中で、または乾燥、凍結乾燥、もしくは凍結乾燥成分としてなどの従来の方法でパッケージ化されてもよい。キットの容器手段は概して、少なくとも１つのウイルス、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器を含み、それらの中にアッセイの成分が配置されてもよく、好ましくは、１つ以上のアリコート（複数も含む）に適切に分配される。さらなる成分が提供される場合、キットはまた、全体的に、第２、第３または他の追加の容器を含み、それらの中にこの成分が配置されてもよい。キットはまた、多価ワクチン製剤などの試料内に含まれるＭＬＶを識別し、定量し、または特徴付けるのに使用するための他の診断試薬を含んでもよい。本発明のキットはまた典型的に、市販のための厳重な管理下でプローブ（複数も含む）、プライマー（複数も含む）、および／またはアッセイ試薬（複数も含む）を含むための手段を含む。このような容器は例えば、１つ以上の注射またはブロー成形プラスチック容器（複数も含む）を含んでもよく、それらの中に所望の試薬容器（例えばバイアル、試験管、注射器など）が保持される。

例示的な定義
本発明によれば、ポリヌクレオチド、核酸セグメント、核酸配列などは、限定されないが、ＤＮＡ（例えば限定されないが、ゲノムまたはゲノム外ＤＮＡを含む）、遺伝子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＲＮＡ（例えば限定されないが、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡを含む）、ヌクレオシド、および天然源から得、化学的に合成され、修飾され、またはそうでなければヒトの手により完全にもしくは部分的に調製され、もしくは合成された適切な核酸セグメントを含む。

他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または等しい任意の方法および組成物が本発明を実施または試験するのに使用され得るが、好ましい方法および組成物が本明細書に記載される。本発明の目的のために以下の用語が以下のように定義される。

本明細書で使用する場合、「約」および「およそ」という用語は、交換可能であり、全体的に、所与の数に近い数の範囲、および列挙した範囲の数の全ての数（例えば、「約５〜１５」は他に記載しない限り「約５〜約１５」）を指すと理解されるべきである。さらに、本明細書における全ての数値範囲は、その範囲内の各整数全部を含むと理解されるべきである。

本明細書で使用する場合、「ＰＣＲ試薬」という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを実施するのに必要とされる標的核酸配列以外の化学物質を指す。これらの化学物質は概して５つのカテゴリーの成分：（ａ）水性緩衝液；（ｂ）水溶性マグネシウム塩；（ｃ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）；（ｄ）フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマー対；ならびに（ｅ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、その酵素活性のほぼ半分より多くを損失させずに少なくとも約１０分間、約８０から約１００℃の温度を許容できるＤＮＡポリメラーゼ）を含む。４つの従来のｄＮＴＰは、チミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）およびデオキシグアノシン（ｄＧＴＰ）であるが、それらは、従来の塩基（例えば、デオキシウリジン三リン酸［ｄＵＴＰ］など）の１つと同様のようにワトソン−クリック形態の塩基対の塩基類似体を含有する１つ以上のｄＮＴＰによりＰＣＲ反応において補足または置換されてもよい。

本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、モノマー間相互作用の規則正しいパターンにより（例えば、ワトソン−クリック塩基対などにより）標的核酸に特異的に結合できるデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドなどを含む、天然または修飾されたモノマーまたは連結の線形オリゴマーを含む。モノマーは典型的に、ホスホジエステル（または等価物）結合により連結されて、少数の単量体単位から数十の単量体単位までのサイズの範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。本開示の全体にわたって、オリゴヌクレオチドが一連の文字（例えば、「ＴＴＡＣＧＣＡＧ」）により表わされるときはいつでも、ヌクレオチドが左から右に読んで５’→３’の順で示されることは理解される。このような表現において、「Ａ」はアデノシン（またはＤＮＡの場合、デオキシアデノシン）を意味すると理解されるのに対して、「Ｃ」、「Ｇ」、「Ｔ」、および「Ｕ」はそれぞれ、シチジン／デオキシシチジン、グアノシン／デオキシグアノシン、デオキシチミジン、およびウリジンを示す。ホスホジエステル結合の類似体としては、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデートなどが挙げられる。

本明細書で使用する場合、「に実質的に対応する」、「実質的に相同」、または「実質的に同一」という用語は核酸またはアミノ酸配列の特性を示し、選択された核酸またはアミノ酸配列は、選択された参照核酸またはアミノ酸配列と比較して少なくとも約７０または約７５パーセントの同一性を有する。より典型的に、選択された配列および参照配列は、少なくとも約７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４またはさらに８５パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５パーセントの配列同一性を有する。さらにより好ましくは、高い相同配列は多くの場合、選択された配列と、比較される参照配列との間で少なくとも約９６、９７、９８、または９９パーセントの配列同一性を共有する。

配列同一性のパーセンテージは、比較される配列の全長にわたって算出され得るか、または選択される参照配列の合計約２５パーセント未満程度である少しの欠失もしくは付加を除外することによって算出され得る。参照配列は、遺伝子もしくは隣接配列、または染色体の反復部分の一部などのより大きな配列のサブセットであってもよい。しかしながら、２つ以上のオリゴ−またはポリヌクレオチド配列の配列相同性の場合、参照配列は典型的に、少なくとも約１０〜１５ヌクレオチド、より典型的に少なくとも約１６〜２５ヌクレオチド、さらにより典型的に少なくとも約２６〜３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、または少なくとも約６０、７０、８０、９０、もしくはさらに少なくとも約１００程度のヌクレオチドを含む。

好ましくは、高い相同断片が望まれる場合、２つの配列（多くの場合、「標的」と「プローブ」配列と称される）の間の同一性パーセントは、少なくとも約８０％同一、好ましくは少なくとも約８５％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、またはさらに少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％もしくはそれ以上である。２以上のオリゴ−またはポリヌクレオチド配列間の相同性のパーセンテージまたは同一性のパーセンテージは、例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）により記載されているＦＡＳＴＡプログラム分析などの標準的な配列比較アルゴリズムの１つ以上を使用して、当業者により容易に決定され得る。

本明細書で使用する場合、「天然に発生する」という用語は、対象物が天然に見出され得るという事実を指す対象物に適用される。例えば、天然源から単離され得、ヒトの手によって意図的に修飾されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は「天然に発生する」配列である。

アミノ酸または核酸配列のいずれかを規定するために使用される場合、「実質的に相補的」という用語は、特定の対象配列、例えばオリゴヌクレオチド配列が、選択される配列の全てまたは一部と実質的に相補的であり、それにより、選択される配列をコードするｍＲＮＡの一部と特異的に結合することを意味する。したがって、典型的に配列はｍＲＮＡ「標的」配列に体して高い相補性であり、配列の相補性部分にわたって約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以下の塩基ミスマッチを有さない。

実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応する標的核酸配列に対して約８０％超の相補性、約８５％超の相補性、約９０％超の相補性、またはさらに約９５％超の相補性（または「完全一致の％」）であり、より好ましくはオリゴヌクレオチドが特異的に結合する対応する核酸配列に対して約９６％超またはそれより高い相補性である。

特定の態様において、上記のように、本発明の実施に使用するためにさらにより実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有することが望ましく、そのような場合、オリゴヌクレオチド配列は、設計したオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーが特異的に結合する標的核酸配列の全てまたは一部に対して約９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、またはさらに１００％相補的である。

開示される配列のいずれかの類似性パーセントまたは相補的パーセントは、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能であるＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン６．０を使用して配列情報を比較することにより決定されてもよい。ＧＡＰプログラムはＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアラインメント法を利用する。手短に述べると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列の短い方の記号の全数で割った、類似している並べられた記号（すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として類似性を定義する。ＧＡＰプログラムについての好ましいデフォルトパラメータには以下が挙げられる：（１）ヌクレオチドについての単項比較マトリクス（同一性について１および非同一性について０の値を含む）、およびＧｒｉｂｓｋｏｖらの加重比較マトリクス、（２）各ギャップについて３．０のペナルティおよび各ギャップにおける各記号について追加の０．１０のペナルティ、ならびに（３）エンドギャップについてペナルティなし。

多くの場合、配列が正確に一致する、すなわちオリゴヌクレオチドが特異的に結合する配列に完全に相補的であり、したがって、相補的ストレッチに沿ってミスマッチがないことが望まれ得る。したがって、高い相補的プライマーまたはプローブ配列は典型的に、複数のポリヌクレオチドの標的配列領域とかなり特異的に結合するので、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、またはＲＴ−ｑＰＣＲ／ＦＲＥＴなどによる標的配列の増幅を誘導するのに非常に効果的である。

「増幅反応混合物」とは、１つ以上の選択された標的核酸配列（複数も含む）を増幅するのに必要な１種以上の種々の試薬を含む水溶液を指す。そのような混合物としては、限定されないが、１種以上の酵素、１種以上の水性緩衝液、１種以上の塩、１つ以上の標的核酸（複数も含む）、および複数の慣用のヌクレオチド三リン酸が挙げられる。文脈に応じて、混合物は完全または不完全のいずれかの増幅反応混合物であってもよい。

「増幅反応」は、標的核酸配列の集団を生成するためにそのような配列を増幅させる任意のインビトロ法を指す。慣用の増幅方法としては、限定されないが、ＰＣＲ、ＤＮＡリガーゼ、Ｑβレプリカーゼ、ＲＮＡ転写ベースの増幅システムなどが挙げられる。

本明細書で使用する場合、「増幅試薬」という用語は、選択された増幅反応を実施するために使用される種々の緩衝液、酵素、プライマー、ヌクレオシド三リン酸（慣用および非慣用の両方）、プローブを指す。

本明細書で使用する場合、「増幅する」または「増幅」とは典型的に、標的核酸の指数関数的増加を指し、本明細書で使用される場合、核酸の選択標的配列の数の直線的および指数関数的の両方の増加を表す。

「実質的に結合する」とは、オリゴヌクレオチド間の相補的ハイブリダイゼーションを指し、ＰＣＲポリメラーゼの所望のプライミングを達成するためにハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを減少させることによって調整され得るわずかなミスマッチを包含する。

本明細書で使用する場合、「ビオチン化」とは、検出アッセイにおけるストレプトアビジンとの反応のためにオリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合したビオチン部分を指す。

核酸に関して、「結合する」、「結合している」、「結合」および「結合した」という用語は、相補的なワトソン−クリック塩基対による２つ以上の核酸配列のハイブリダイゼーションを指す。

本明細書で使用する場合、「核酸」とは、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、他に限定しない限り、天然に発生するヌクレオチドと同様の方法で機能し得る天然ヌクレオチドの既知の類似体を包含する。

「ヌクレオチドポリメラーゼ」は、ヌクレオシド三リン酸前駆体の集団由来のＤＮＡまたはＲＮＡの合成を触媒できる酵素である。本発明の増幅反応において、ポリメラーゼは、鋳型依存性であり、典型的に形成されるポリマーの２１端部から伸長する。好ましい適用において、利用されるポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼである。

本明細書で使用する場合、「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー（複数も含む）」とは、天然または合成に関わらず、適切な緩衝液中および適切な温度で、核酸鎖と相補的なプライマー伸長産物の合成が開始される条件下（すなわち、４つの異なるヌクレオチド三リン酸、およびＤＮＡポリメラーゼもしくは逆転写酵素などの重合のための因子の存在下）でＤＮＡ合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドを指す。本発明に関して、プライマーは好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオチド、好ましくは増幅の最大効率のための一本鎖である。当業者に公知のように、このようなプライマーは標的鋳型の正確な配列を反映することを必要としないが、配列に対して十分に相補的であるが、適切な反応条件下で鋳型に対するハイブリダイゼーション（すなわち結合）を可能にするべきである。

本明細書で使用する場合、「修飾された生ワクチン」は、典型的に、疾患を生じるその能力を弱めるが、後で哺乳動物に投与される場合、疾患または感染に対して防御するその能力を保持するために組織培養細胞中で継代することによって変更されるウイルスを含むワクチンである。

「病原体」という用語は、例えば、ウイルス、プリオン、原生動物、寄生生物、および細菌、酵母、カビ、真菌などの微生物を含む、任意の種類の感染因子として本明細書に定義される。

本明細書で使用する場合、「個体」（また交換可能に「宿主」、「被験体」、「レシピエント」、「患者」などとも称される）という用語は、１種以上の医薬組成物または本明細書に開示されるワクチン製剤を受容できる任意の動物を指す。好ましくは、被験体は、任意の動物種（および好ましくは哺乳動物種）を示すことを意図する脊椎動物である。特定の実施形態において、個体は好ましくは、限定されないが、家畜、動物標本、外来動物、およびコンパニオンアニマル、ペット、および獣医師の介護の下での任意の動物を含む、非ヒト霊長類、ウシ、イヌ、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅｓ）、ケビン（ｃａｖｉｎｅｓ）、カラス、エピネ（ｅｐｉｎｅｓ）、ウマ、ネコ科、ヤギ（ｈｉｒｃｉｎｅｓ）、ウサギ（ｌａｐｉｎｅｓ）、ウサギ（ｌｅｐｏｒｉｎｅｓ）、オオカミ、ヒツジ、ブタ、ラシーヌ（ｒａｃｉｎｅｓ）、キツネを含む、任意の哺乳動物宿主である。

本明細書で使用する場合、「ワクチン」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物などの動物に投与できる形態の本発明の免疫原性組成物を含有する組成物または製剤を指す。典型的に、本発明のワクチンは、本明細書に開示され、それを必要とする動物に投与するために製剤化される免疫原性組成物（１種以上の修飾された生ウイルス粒子またはその複数）のうちの１つ以上を含む。そのような組成物は、限定されないが、水性ビヒクル中で調製されたもの、および後で、投与前に慣用の薬学的に許容可能なビヒクル（例えば無菌食塩水または同様の緩衝化水溶液）中で再水和または懸濁される凍結、フリーズドライ、凍結乾燥、または脱水形態を含む、任意の適切な製剤であってもよい。このような形態において、本発明のワクチン組成物は、感受性動物におけるウイルスおよび／または微生物感染の１つ以上の病態または１つ以上の症状を予防、管理または処置するための本明細書に開示される方法またはワクチン接種レジメンの１つ以上において容易に利用され得る簡便な単回または複数回アリコートで製造され得る。

本明細書で使用される場合、「例えば」という用語は、例示のためだけに使用され、限定することを決して意図せず、したがって、本明細書中で明確に列挙されたそれらの項目のみに言及していると解釈されるべきではない。

本明細書で使用する場合、「標的配列」または「標的ヌクレオチド配列」は、ポリメラーゼ活性を有する酵素がプライマー配列を伸長でき、それにより、相補鎖を複製できる条件下で前記プライマー配列の１つがハイブリダイズする任意のヌクレオチド配列を含む。

核酸分子（典型的にＤＮＡからなる）は宿主細胞内で複製でき、および／または結合したセグメントの複製をもたらすように別の核酸セグメントに作動可能に連結され得る。プラスミド、コスミド、またはウイルスが例示的なベクターである。

「プライマー」または「プライマー配列」は、相補的鋳型核酸鎖（「標的配列」）と選択的にハイブリダイズし、鋳型鎖を複製するためのヌクレオチドの付加のための開始点として機能する任意の核酸配列またはセグメントを含んでもよい。本発明のプライマー配列は、標識されてもよいか、または増幅産物の検出および／もしくは分析を可能にする他の修飾を含有してもよい。標的ＤＮＡ配列のポリメラーゼにより媒介される複製のための開始因子として機能することに加えて、プライマー配列はまた、鋳型ＲＮＡの対応するＤＮＡへの逆転写のために使用されてもよい。

本明細書で使用される場合、「蛍光共鳴エネルギー転移対」または「ＦＲＥＴ対」とは、ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアを含むフルオロフォアの対を指し、そのドナーフルオロフォアは共鳴エネルギーをアクセプターフルオロフォアに転移できる。好ましい蛍光共鳴エネルギー転移対において、ドナーフルオロフォアの吸収スペクトルは実質的にアクセプターフルオロフォアの吸収スペクトルと重複しない。本明細書で使用される場合、「ドナーオリゴヌクレオチドプローブ」とは、ＦＲＥＴ対のドナーフルオロフォアで標識されるオリゴヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、「アクセプターオリゴヌクレオチドプローブ」とは、ＦＲＥＴ対のアクセプターフルオロフォアで標識されるオリゴヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、「ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド対」は典型的に、「アンカー」または「ドナー」オリゴヌクレオチドプローブおよび「アクセプター」または「センサー」オリゴヌクレオチドプローブを含み、そのような対は、ドナーオリゴヌクレオチドプローブおよびアクセプターオリゴヌクレオチドプローブの両方がそれらの相補的標的核酸配列とハイブリダイズする場合、ＦＲＥＴ関係を形成する。ＦＲＥＴ対として使用するための許容可能なフルオロフォア対は当業者に周知であり、限定されないが、フルオレセイン／ローダミン、フィコエリトリン／Ｃｙ７、フルオレセイン／Ｃｙ５、フルオレセイン／Ｃｙ５．５、フルオレセイン／ＬＣ Ｒｅｄ６４０、およびフルオレセイン／ＬＣ Ｒｅｄ７０５を含む。

長年の特許法の慣例によれば、「一つの（ａ）」および「一つの（ａｎ）」という単語は、特許請求の範囲を含む本明細書に使用される場合、「一つ以上」も示す。

以下の実施例は、本発明の例示的な実施形態を示すために含まれる。実施例中に開示された技術は本発明の実施において十分に機能するように発見された代表的な技術に従うので、本発明の実施のための好ましい様式を構成するとみなすことができることが、当業者により理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲を逸脱せずに、多くの変更を開示された特定の実施形態において行うことができ、同じ結果または類似する結果が依然として得られることを、理解するべきである。

多価ワクチンの成分についての効力アッセイプロトコル
本実施例は、多価改変された生ウイルス（ＭＬＶ）ワクチンの個々のウイルス成分の効力を首尾よく決定するための定量的（リアルタイム）ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）アッセイの使用を実証する。

本発明者の同時係属の米国仮特許出願第６１／４２７，３６１号において、本発明者は、ＢＲＤＣおよび輸送熱に対して有効な６通り（ｓｉｘ−ｗａｙ）（すなわち、六価）改変された、生ウイルス（ＭＬＶ）ワクチンを開発した。本実施例は、このようなワクチンの個々のウイルス成分を定量するのに有用なアッセイを説明する。本発明者は、このアッセイが、多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）（すなわち、多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）または多成分）ワクチンにおいて遺伝的に関連のある株の個々の効力を決定する既存の方法に対して、特に有利であることを示す。六価ＭＬＶ ＢＲＤＣワクチンをモデルとして使用して、本発明者は、ワクチンが単一型のウイルスの３つの亜遺伝子型を含有した場合でさえも、このアッセイが個々のワクチン成分の効力を識別し、定量するのに効果的であることを実証した。このようなアッセイは、多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）ワクチン製剤中のＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂ、およびＢＶＤＶ−２の存在を正確に定量するための新規かつより信頼できる方法を提供する。

材料および方法
細胞培養
全ての培養物は、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）に記載されている従来の技術および供給物を用いて調製する。培養物中で典型的な上皮様形態を示すＴＶＬ−ウシ腎細胞株を、全ての培養アッセイに用いる。

ＢＶＤＶ−１ｂ Ｍａｓｔｅｒ Ｓｅｅｄ培養物（出願人の同時係属の米国仮特許出願第６１／４２７，３６１号において指定された「ＴＶＬ ＢＶＤＶ１ｂ ＭＳ ０４／２７／２００７ ＤＷ３−０９５」）を、米国特許規則第１．１４条および米国特許法第１２２条下で権限が与えられた米国特許商標庁の長官により決定された者に対して、この特許出願の係属中にその培養物を利用する機会を得られることを保証するという条件で寄託した。この寄託物は、対象の出願の対応出願またはその派生出願が提出される国における外国特許法による要求に応じて入手可能である。ただし、寄託物の入手可能性は、政府の措置により付与された特許権を逸脱して対象の発明を実施するライセンスを構成するものではないことが、理解されるべきである。対象の培養寄託物は保管され、微生物の寄託に関するブタペスト条約の規定に従って公衆が入手可能のようにされる。すなわち、対象の培養寄託物は、寄託物の試料を片付ける最新の要求の後の少なくとも５年の期間、およびいずれの場合でも、寄託日の後または寄託された培養物を開示することが発令され得るあらゆる特許の実施可能期間の後の少なくとも３０（三十）年の期間、それが生存可能でかつ汚染されずに維持するのに必要な細心の注意をはらって保管される。寄託者は、寄託物の状態が原因で、寄託物が要求された際に試料を播種できない状態にある場合、寄託物を交換する義務を認める。対象の培養寄託物の公衆への入手可能性に関する全ての制限は、特許付与により培養寄託物を開示する際に、決定的に解除される。ＴＶＬ ＢＶＤＶ１ｂ ＭＳ ０４／２７／２００７ ＤＷ３−０９５ウイルスの寄託物は、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ， ２０１１０−２２０９， ＵＳＡにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・ラボラトリー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の特許寄託物の永久コレクションへと、ブタペスト条約の条件下で２０１０年１２月２１日に、登録された。ここで、ＴＶＬ ＢＶＤＶ１ｂ ＭＳ ０４／２７／２００７ ＤＷ３−０９５ウイルスの寄託物は、貯蔵所によりアクセッション番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１１５５３が割り当てられた。

プライマー／プローブセットの特異性
ＲＮＡを、以下の米農務省（ＵＳＤＡ）認定ウイルス種の各々からのウイルス性液体より抽出する：ＢＶＤＶ−１ａ（シンガー株）、ＢＶＤＶ−１ｂ（ＴＧＡＣ株）、ＢＶＤＶ−２（１２５）、ＰＩ_３（ライジンガーＳＦ−４）、およびＢＲＳＶ（Ｎ３７５）（それがＤＮＡウイルスであるため、抽出プロセスはＢＨＶ−１［クーパー株］については行われない）。ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）−４ＰＣＲ（Ａｍｂｉｏｎ；Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を用いて抽出を行う。

ＲＮＡウイルス試料の各々を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ワンステップＲＴ−ＰＣＲ化学を用いて、６つのプライマー／プローブセットの各々について別個のＲＴ−ｑＰＣＲ反応において鋳型（試料）として用いる。ＤＮＡウイルス（ＢＨＶ−１）をまた、上述の６つのプライマー／プローブセットの各々との別個のｑＰＣＲ反応において鋳型（試料）として用いる。六価ワクチンの６つのウイルス画分全てに対するＢＲＳＶプライマー／プローブセットの分析は、他のウイルス画分のいずれかとのプライマー／プローブセットの各々の交差反応がないことを示す。

ｑＰＣＲアッセイ
ｑＰＣＲアッセイをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００リアルタイムＰＣＲシステムを用いて実施する。

オリゴヌクレオチドプライマーおよび標識された分子プローブ
以下のカスタムＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびウイルス特異的なフォワードおよびリバースプライマー対を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）により製造した。

ＢＶＤＶ−１ｂ（第１）：
フォワードプライマー：５’−ＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＡＴＡＧＣ−３’（配列番号１）；
リバースプライマー：５’−ＴＧＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＡＴＣＴＴＡＡＣＣ−３’（配列番号２）；および
ＢＶＤＶ−１ｂ検出プローブ：５’−ＴＣＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＣＣ−３’（配列番号３）。

ＢＶＤＶ−１ｂ（第２）：
第２のフォワードプライマー：５’−ＧＴＣＧＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＴ−３’（配列番号１９）；
第２のリバースプライマー：５’−ＧＴＣＧＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＴ−３’（配列番号２０）；および
第２のＢＶＤＶ−１ｂ検出プローブ：５’−ＧＴＣＧＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＴ−３’（配列番号２１）。

ＢＶＤＶ−１ｂ（第１）が受容可能な結果を提供している一方、ＢＶＤＶ−１ｂ（第２）はより良好な結果を示した。

ＢＲＳＶ：
フォワードプライマー：５’−ＧＣＡＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＡＧＧＴＡＴＡＡＴ−３’（配列番号４）；
リバースプライマー：５’−ＡＣＡＣＴＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＣＡＴＴＣＴ−３’（配列番号５）；および
ＢＲＳＶ検出プローブ：５’−ＡＡＧＡＣＴＴＧＴＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡ−３’（配列番号６）。

ＢＶＤＶ−１ａ：
フォワードプライマー：５’−ＧＧＴＣＧＣＣＣＡＧＧＴＡＡＡＡＧＣＡ−３’（配列番号７）；
リバースプライマー：５’−ＧＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡ−３’（配列番号８）；および
ＢＶＤＶ−１ａ検出プローブ：５’−ＡＡＣＣＧＡＣＴＧＴＴＡＣＧＡＡＴＡＣ−３’（配列番号９）。

ＢＶＤＶ−２：
フォワードプライマー：５’−ＧＣＴＡＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＡＧＴＡＧＧＡＣ−３’（配列番号１０）；
リバースプライマー：５’−ＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＣＴＧＴＡＣＴＣＡＧＧ−３’（配列番号１１）；および
ＢＶＤＶ−２検出プローブ：５’−ＣＡＧＴＧＡＧＴＣＣＡＴＴＧＧＡＴＧＧ−３’（配列番号１２）。

ＰＩ_３：
フォワードプライマー：５’−ＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１３）；
リバースプライマー：５’−ＣＧＴＣＴＧＣＣＣＡＴＧＣＡＴＡＡＧＧ−３’（配列番号１４）；および
ＰＩ_３検出プローブ：５’−ＡＣＣＴＣＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧ−３’（配列番号１５）。

ＢＨＶ−１：
フォワードプライマー：５’−ＣＣＡＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣ−３’（配列番号１６）；
リバースプライマー：５’−ＣＧＴＣＴＴＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＣＴＣＣ−３’（配列番号１７）；および
ＢＨＶ−１検出プローブ：５’−ＡＣＧＧＡＣＧＴＧＣＧＣＧＡＡ−３’（配列番号１８）。

一価ワクチンについての効力アッセイ
以下のアッセイの各々についてのプロトコルは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００比較閾値サイクル（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）（Ｃ_Ｔ）法を利用して、滴定プレートの個々のウェルが同等の参照ウェルよりも多くの量のウイルスを含むかどうかを決定する。ほとんどのウイルス試料は、ＰＣＲアッセイにより検出できるいくつかの生きられないウイルス分子を含むので、潜在的な偽陽性結果を示す。この問題は、細胞を含まない参照プレートを用いることで解決する。試料を、ウイルス複製の可能性を除外するために細胞を含まないアッセイプレート中でのように正確に参照プレート中に希釈する。参照プレートを使用して、各アッセイにおける各々のウェルについてのベースラインまたはバッググラウンドＣ_Ｔ値を生成する。アッセイプレート上のウェルが対応するバッググラウンドウェルよりも高いＣ_Ｔ値を有する場合、ウイルス複製は起こり、ウェルは陽性とみなされる。Ｃ_Ｔ値がウェルについて決定されない場合またはＣ_Ｔ値がバックグラウンドＣ_Ｔ値と同等である場合、ウェルは陰性とみなされる。

多価ワクチンについての効力アッセイ
ＩＢＲ／ＢＶＤＶ−１ａ、−１ｂ、−２／ＰＩ_３／ＲＳＶ六価ワクチン（改変された生ウイルス）の試験的連続物を上述のように調製した。手短に述べると、ＢＨＶ−１（クーパー株）、ＢＶＤＶ−１ａ（シンガー株）、ＢＶＤＶ−１ｂ（ＴＧＡＣ株）、ＢＶＤＶ−２（１２５）、ＰＩ_３（ライジンガーＳＦ−４）、およびＢＲＳＶ（Ｎ３７５）を、ＴＶＬ−ＢＫ細胞株（２０代継代）中で増殖させた。個々の画分を１０代継代で採取し、６通りの生成物中に一緒に混ぜた。６通りのワクチンの各画分についての効力試験は、適切な中和抗血清の添加により本明細書に記載されるように実施してもよい。各ウイルス画分のＴＣＩＤ_５０を、ＣＰＥ／ＦＡ／ＩＦＡ結果に基づいて決定し、ＲＴ−ｑＰＣＲ／ｑＰＣＲに基づいた結果と比較する。

ＢＶＤＶ−１Ａ、ＢＶＤＶ−１Ｂ、およびＢＶＤＶ−２効力試験
一価ＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂおよびＢＶＤＶ−２試料は、ワクチン（ＳＡＭ １０１）中のウシウイルス性下痢ウイルスを滴定するための補足アッセイ法に従って別々に滴定できる。手短に述べると、アッセイを、上述したＣＰＥおよび／またはＦＡ／ＩＦＡに基づいた力価計算に使用されているプレートの１つを用いて２連で実施する。他のプレートを、ＲＴ−ｑＰＣＲに基づいた力価を決定するために使用する。各々のウイルスについて上述のように細胞を含まない参照プレートが含まれる。

ＰＩ_３効力試験
ＰＩ_３についての効力試験を、ＣＰＥに基づいた力価計算のために使用されているプレートの１つを用いて２連で実施する。他のプレートを、ＲＴ−ｑＰＣＲにより決定した場合のＰＩ_３の比較Ｃ_Ｔ値に基づいて力価を決定するために使用する。上述のように細胞を含まない参照プレートが含まれる。

ＢＲＳＶ効力試験
ＢＲＳＶについての効力試験を２連で実施し、そのプレートの１つは上記のＣＰＥに基づいた力価計算のために使用し、残りのプレートはＲＴ−ｑＰＣＲにより決定した場合のＢＲＳＶの比較Ｃ_Ｔ値に基づいた力価を決定するために使用する。上記で説明したように、細胞を含まない参照プレートもまた、このアッセイに含まれる。

ＢＨＶ効力試験
従来の目視観測およびプラーク計数を個々のウェルのｑＰＣＲ分析に置き換えることにより、ＢＨＶについての効力試験を９６ウェルフォーマットで実施する。このアッセイは２連で実施し、そのプレートの１つは個々のウェル（希釈物）中のＣＰＥの有無に基づいた力価計算のために使用し、一方、残りのプレートはＱＰＣＲにより決定した場合のＢＨＶの比較Ｃ_Ｔ値に基づいた力価を計算するために使用する。上記のように細胞を含まない参照プレートが含まれる。

試験結果
上述の試験からの結果を以下に与える。

表１：調査中の６種のウイルスそれぞれからの既知のウイルス試料を、ＲＴ−ＰＣＲ ＢＶＤ １ａプローブ−プライマーセット（１Ａ ｐｐ）に対して実行した。ＢＶＤ １ａプローブ−プライマーセットは、調査中の他のウイルスのいずれかとの交差反応を有さなかった。（ｎｄ＝希釈なし、ｐｐ＝プローブ−プライマーセット）

表２：ＲＴ−ＰＣＲ ＢＶＤ １ａプローブ−プライマーセットとの反応からのＢＶＤ １ａ（１Ａ）の対応するＣ_Ｔスコアでの既知のＴＣＩＤ_５０でのＢＶＤ １ａ（１Ａ）対数希釈、および各希釈についての推定ＴＣＩＤ_５０値。（ｎｄ＝希釈なし、ｐｐ＝プローブ−プライマーセット）

表３：調査中の６種のウイルスそれぞれからの既知のウイルス試料を、ＲＴ−ＰＣＲ ＢＲＳＶプローブ−プライマーセット（ｐｐ）に対して実行した。ＢＲＳＶ プローブ−プライマーセットは、調査中の他のウイルスのいずれかとの交差反応を有さなかった。（ｎｄ＝希釈なし、ｐｐ＝プローブ−プライマーセット）

表４：ＲＴ−ＰＣＲ ＢＲＳＶ プローブ−プライマーセットとの反応からのＢＲＳＶの対応するＣ_Ｔスコアでの既知のＴＣＩＤ_５０でのＢＲＳＶの対数希釈、および各希釈についての推定ＴＣＩＤ_５０値。（ｎｄ＝希釈なし、ｐｐ＝プローブ−プライマーセット）

表５：調査中の６種のウイルスそれぞれからの既知のウイルス試料を、ＲＴ−ＰＣＲ ＢＶＤ １ｂプローブ−プライマーセット（１Ｂ ｐｐ）に対して実行した。ＢＶＤ １ｂプローブ−プライマーセットは、調査中の他のウイルスのいずれかとの交差反応を有さなかった。（ｎｄ＝希釈なし、ｐｐ＝プローブ−プライマーセット、＋＝ポジティブコントロール）

表６：ＲＴ−ＰＣＲ ＢＶＤ １ｂプローブ−プライマーセットとの反応からのＢＶＤ １ｂ（１Ｂ）の対応するＣ_Ｔスコアでの既知のＴＣＩＤ_５０でのＢＶＤ １ｂ（１Ｂ）の対数希釈、および各希釈についての推定ＴＣＩＤ_５０値。（ｎｄ＝希釈なし、ｐｐ＝プローブ−プライマーセット）

表７：調査中の６種のウイルスそれぞれからの既知のウイルス試料を、ＲＴ−ＰＣＲ ＰＩ３プローブ−プライマーセットに対して実行した。ＰＩ３プローブ−プライマーセットは、調査中の他のウイルスのいずれかとの交差反応を有さなかった。（ｎｄ＝希釈なし、ｐｐ＝プローブ−プライマーセット）

表８：ＲＴ−ＰＣＲ ＰＩ３プローブ−プライマーセットとの反応からのＰＩ３の対応するＣ_Ｔスコアでの既知のＴＣＩＤ_５０でのＰＩ３の対数希釈、および各希釈についての推定ＴＣＩＤ_５０値。（ｎｄ＝希釈なし、ｐｐ＝プローブ−プライマーセット）

表９：調査中の６種のウイルスそれぞれからの既知のウイルス試料を、ＲＴ−ＰＣＲ ＢＨＶプローブ−プライマーセットに対して実行した。ＢＨＶプローブ−プライマーセットは、調査中の他のウイルスのいずれかとの交差反応を有さなかった。（ｎｄ＝希釈なし、ｐｐ＝プローブ−プライマーセット）

表１０：ＲＴ−ＰＣＲ ＢＨＶプローブ−プライマーセットとの反応からのＢＨＶの対応するＣ_Ｔスコアでの既知のＴＣＩＤ_５０でのＢＨＶの対数希釈、および各希釈についての推定ＴＣＩＤ_５０値。（ｎｄ＝希釈なし、ｐｐ＝プローブ−プライマーセット）

参考文献
以下の参考文献は、それらが例示的な手順または本明細書に記載されているものに対する他の詳細な補足を提供する範囲で、本明細書に対する参照を表すことによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれる
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓらによる米国特許第４，４１５，７３２号
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓらによる米国特許第４，４５８，０６６号
Ｍｕｌｌｉｓらによる米国特許第４，６８３，１９５号
Ｍｕｌｌｉｓらによる米国特許第４，６８３，２０２号
Ｋｏｓｔｅｒらによる米国特許第４，７２５，６７７号
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓらによる米国特許第４，９７３，６７９号
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Ｓｃｈａｌｋ， Ｊ．Ａ．Ｃ．， ｄｅ Ｖｒｉｅｓ， Ｃ．Ｇ．Ｊ．Ｃ．Ａ．， ａｎｄ Ｊｏｎｇｅｎ， Ｐ．Ｍ．Ｊ．Ｍ．， “Ｐｏｔｅｎｃｙ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ， ｍｕｍｐｓ ａｎｄ ｒｕｂｅｌｌａ ｔｒｉｖａｌｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ，” Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， ３３（２）：７１−７９， ２００５．
Ｓｃｈａｌｋ， Ｊ．Ａ．Ｃ．， Ｅｌｚｅｎ ，Ｃ．Ｖ．Ｄ．， Ｏｖｅｌｇｏｎｎｅ， Ｈ， ｅｔ ａｌ．， “Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｌｉｖｅ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ，” Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈ．， １１７：１７９−１８７， ２００４．
Ｓｃｈｅｆｅｒｓ， Ｊ．， Ｍｕｎｏｚ−Ｚａｎｚｉ， Ｃ．， Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｊ．Ｅ．， Ｇｏｙａｌ， Ｓ．Ｍ．， ａｎｄ Ａｍｅｓ， Ｔ．Ｒ．， “Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅｃｏｌｏｓｔｒａｌ ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌａｒｇｅ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｄａｉｒｙ ｈｅｒｄｓ，” Ｊ． Ｖｅｔ． Ｄｉａｇｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ２０：６２５−６２８， ２００８．
Ｔａｎｎｅｒ， Ｊ．Ｅ．， ａｎｄ Ａ． Ｐ． Ｍｏｒｇａｎ， “Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｒｉａｌｓ，” Ｖｅｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３７（３−４）：２２１−２３０， １９９３．
Ｔａｕｔｚ， Ｎ．， Ｅｌｂｅｒｓ， Ｋ．， Ｓｔｏｌｌ， Ｄ．， Ｍｅｙｅｒｓ， Ｇ．， ａｎｄ Ｔｈｉｅｌ， Ｈ．Ｊ．， “Ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｏｆ ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ： ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ，” Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７１（７）：５４１５−５４２２， １９９７．
Ｔｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｅ ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ，” Ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， （ｅｄｓ．） （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ， ＵＳＡ）， ｐｐ．１０５９−１０７３， １９９６．
Ｖｉｌｃｅｋ， Ｓ， Ｐａｔｏｎ， Ｄ．Ｊ．， Ｄｕｒｋｏｖｉｃ， Ｂ， ｅｔ ａｌ． “Ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ ｃａｎ ｂｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ａｔ ｌｅａｓｔ ｅｌｅｖｅｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｇｒｏｕｐｓ．” Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．， １４６：９９−１１５， ２００１．
Ｗａｎｇ， Ｆ， Ｐｕｄｄｙ， Ａ．Ｃ．， Ｍａｔｈｉｓ， Ｂ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， “Ｕｓｉｎｇ ＱＰＣＲ ｔｏ ａｓｓｉｇｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐｏｔｅｎｃｉｅｓ ｔｏ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ： ｔｏｗａｒｄ ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆａｃｉｌｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒ ｐｏｔｅｎｃｙ，” Ｖａｃｃｉｎｅ， ２３：４５００−４５０８， ２００５．
Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｍ．Ｓ． Ｃｏｌｌｅｔｔ， “Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： ｐｒｏｔｅｉｎ ｐ８０ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｉｓ ａ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，” Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １８４（１）：３４１−３５０， １９９１．
Ｗｒｅｎ， Ｇ．， “Ｎｅｗ Ｔｈｉｎｋｉｎｇ ｏｎ ＢＲＳＶ： Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｔｏ ＢＲＳＶ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｎｅｗ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｂｏｕｔ ｈｏｗ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｂｅｈａｖｅｓ ａｎｄ ｈｏｗ ｉｔ ｍａｙ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｋｉｌｌｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ，” Ｂｏｖｉｎｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎ， （Ｆｅｂｒｕａｒｙ） ｐｐ． １６−１９， ２００１．
Ｘｕ， Ｊ．， Ｅ． Ｍｅｎｄｅｚ， Ｐ．Ｒ． Ｃａｒｏｎ， Ｃ． Ｌｉｎ， Ｍ．Ａ． Ｍｕｒｃｋｏ， Ｍ．Ｓ． Ｃｏｌｌｅｔｔ， ａｎｄ Ｃ．Ｍ． Ｒｉｃｅ， “Ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ： ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ， ｃｏｆａｃｔｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ， ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，” Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７１（７）：５３１２−５３２２， １９９７．
Ｘｕｅ， Ｗ．， Ｄ． Ｍａｔｔｉｃｋ， Ｌ． Ｓｍｉｔｈ， Ｊ． Ｕｍｂａｕｇｈ， ａｎｄ Ｅ． Ｔｒｉｇｏ， “Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｌｉｖｅ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ （ＢＶＤＶ） ｔｙｐｅ １ａ ｖａｃｃｉｎｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｃａｌｖｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ＢＶＤＶ ｔｙｐｅ １ ｂ ｓｔｒａｉｎｓ，” ， Ｖａｃｃｉｎｅ， ２９（１）：７０−７６， Ｄｅｃ． １０， ２０１０， ［ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ Ｏｃｔ． ２７， ２０１０］．

本明細書に開示され、特許請求される組成物および方法の全ては、本開示を鑑みて過度の実験を必要とせずになされ、実施され得る。本発明の組成物および方法は例示的な実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱せずに、変更が本明細書に記載される組成物、方法および方法の工程の順序に適用されてもよいことは当業者に自明である。より具体的には、化学的および生理的の両方に関連する特定の因子が、同じまたは類似の結果が達成されている間、本明細書に記載される因子と置換されてもよいことは自明である。全てのこのような類似物質および修飾は、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされることは当業者に自明である。したがって、特許化されることを目的とする独占権が添付の特許請求の範囲に記載される。

Claims (40)

1. 存在する場合、複数の弱毒化した生ウイルス粒子内でウイルス特異的核酸を検出するように適合された組成物であって、
   （ａ）配列番号１、配列番号１９、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、および配列番号１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む約５０未満の長さのヌクレオチドの第１のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマー、
   （ｂ）配列番号２、配列番号２０、配列番号２０、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、および配列番号１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む約５０未満の長さのヌクレオチドの第２のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマー、ならびに
   （ｃ）配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、および配列番号１８からなる群から選択される標識されたヌクレオチド配列を含む約５０未満の長さのヌクレオチドのウイルス特異的検出プローブの少なくとも１つの第１の標識されたウイルス特異的検出プローブ
   を含む、組成物。
2. ウイルス粒子が家畜ワクチン内に含まれる、請求項１に記載の組成物。
3. 第１および第２のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーならびに第１の標識されたウイルス特異的検出プローブの１つ以上が約４０未満の長さのヌクレオチドである、請求項１または請求項２に記載の組成物。
4. 第１および第２のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーならびに第１の標識されたウイルス特異的検出プローブの１つ以上が約３０未満の長さのヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 第１および第２のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーならびに第１の標識されたウイルス特異的検出プローブの１つ以上が約２０未満の長さのヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 第１のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーが、配列番号１、配列番号１９、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、および配列番号１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列から実質的になる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 第２のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーが、配列番号２、配列番号２０、配列番号２０、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、および配列番号１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列から実質的になる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 少なくとも１つの第１の標識されたウイルス特異的検出プローブが、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、および配列番号１８からなる群から選択される標識されたヌクレオチド配列から実質的になる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 少なくとも１つの第１の標識されたウイルス特異的検出プローブが、少なくとも１つの発色、蛍光、スピン標識または放射性部分をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 複数の弱毒化した生ウイルス粒子が、ＢＲＳＶ、ＢＨＶ−１、ＰＩ_３、およびＢＶＤＶから選択される１種以上のウイルスを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 複数の弱毒化した生ウイルス粒子が、ＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂ、およびＢＶＤＶ−２から選択される１種以上のウイルスを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 複数の弱毒化した生ウイルス粒子が、ＢＶＤＶ−１ｂを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 第１のウイルス特異的オリゴヌクレオチド増幅プライマーが、配列番号１または配列番号１９のヌクレオチド配列から実質的になり、第２の増幅プライマーが、配列番号２または配列番号２０のヌクレオチド配列から実質的になり、少なくとも１つの第１の標識されたウイルス特異的検出プローブが、配列番号３または配列番号２１のヌクレオチド配列から実質的になる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 家畜起源の生物学的試料から、または多価ウシ輸送熱ワクチン内に含まれる複数の弱毒化した生ウイルス粒子から得たポリヌクレオチドの集団においてウイルス特異的ポリヌクレオチドの存在を検出するのに使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. ウイルス特異的核酸を含有していると疑われる生物学的試料中のウイルス特異的核酸配列を検出するための組成物であって、
    （ａ）配列番号１、配列番号１９、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、および配列番号１６からなる群から選択される第１のウイルス特異的フォワード増幅プライマー、ならびに
    （ｂ）配列番号２、配列番号２０、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、および配列番号１７からなる群から選択される第１のウイルス特異的リバース増幅プライマー
    を含む、組成物。
16. ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により核酸配列を増幅するのに十分な１種以上の緩衝液、１種以上のポリメラーゼ、および１種以上のｄＮＴＰをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
17. ポリメラーゼ連鎖反応がリアルタイムで実施される、請求項１６に記載の組成物。
18. ＰＣＲによりこのように産生された増幅産物に特異的に結合する配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、および配列番号１８からなる群から選択される少なくとも１つの第１の標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブをさらに含む、請求項１６または請求項１７に記載の組成物。
19. 第１の標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブが、蛍光、発色、放射性、化学発光、発光、またはスピン共鳴標識を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
20. 標識された検出プローブが、ＢＶＤＶ−１ａ−、ＢＶＤＶ−１ｂ−、ＢＶＤＶ−２−、ＢＨＶ−１−、ＰＩ_３−またはＢＲＳＶ−特異的核酸に特異的に結合する、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
21. リアルタイムにおけるＰＣＲの間に産生された増幅産物の量を定量するための１種以上のさらなる成分をさらに含む、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
22. 獣医学的に修飾された生ウイルスワクチンを含む試料からウイルス特異的核酸配列を増幅させるためにポリメラーゼ連鎖反応を実施するための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
23. ポリヌクレオチドの集団におけるウイルス特異的ポリヌクレオチドの存在を検出するための方法であって、
    少なくとも１つのサイクルステップを実施する工程であって、前記サイクルステップは、少なくとも１つの第１の増幅ステップおよび少なくとも１つの第１のハイブリダイズステップを含み、前記少なくとも１つの第１の増幅ステップは、ウイルス特異的核酸分子が試料中に存在する場合、前記試料を、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物と接触させて、ウイルス特異的増幅産物を産生することを含み、前記少なくとも１つの第１のハイブリダイズステップは前記試料を前記組成物と接触させることを含む、工程と、
    得られたハイブリダイゼーション産物を特異的に検出するのに有効な条件下で、このように産生された前記増幅産物を少なくとも１つの第１の標識されたオリゴヌクレオチド検出プローブと接触させる工程と、
    を含む、方法。
24. 一対のウイルス特異的増幅プライマーが、
    （ａ）配列番号１、配列番号１９、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、および配列番号１６からなる群から選択される核酸配列を含む、約５０未満の長さのヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチド増幅プライマー、ならびに
    （ｂ）配列番号２、配列番号２０、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、および配列番号１７からなる群から選択される核酸配列を含む、約５０未満の長さのヌクレオチドの第２のオリゴヌクレオチド増幅プライマー
    を含む、請求項２３に記載の方法。
25. 少なくとも１つの第１の標識されたウイルス特異的検出プローブが、配列番号３、配列番号２１、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、および配列番号１８のいずれか１つの核酸配列を含む、約５０未満の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
26. ウイルス特異的核酸分子がポリヌクレオチドの集団に存在する場合、第１のサイクルステップが、ポリヌクレオチドの集団を一対のウイルス特異的増幅プライマーと接触させて、増幅産物を産生することを含み、さらに、少なくとも１つの第１のハイブリダイズステップが、このように産生された前記増幅産物を検出するのに有効な条件下で、ポリヌクレオチドの集団を少なくとも１つの第１の標識されたウイルス特異的検出プローブと接触させることを含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 検出するステップがリアルタイムで実施される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. ウイルス特異的検出プローブとウイルス増幅産物との間の融解温度を測定するさらなるステップをさらに含む、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
29. ポリヌクレオチドの集団が複数の弱毒化した生ウイルス粒子から得られる、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. ポリヌクレオチドの集団が家畜起源の生物学的試料内に含まれる複数の弱毒化した生ウイルス粒子から得られる、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. ポリヌクレオチドの集団が、血液、血漿、細胞、組織、血清、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される生物学的試料から得られる、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
32. ポリヌクレオチドの集団が、哺乳動物ワクチン内に含まれる複数の弱毒化した生ウイルス粒子から得られる、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 複数の弱毒化した生ウイルス粒子が、ＢＨＶ−１、ＰＩ_３、ＢＲＳＶ、およびＢＶＤＶからなる群から選択される１種以上のウイルスを含む、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 複数の弱毒化した生ウイルス粒子が、ＢＶＤＶ１ａ型、ＢＶＤＶ１ｂ型、およびＢＶＤＶ２型の１つ以上を含む、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 哺乳動物ワクチンがウシＢＲＤＣまたは輸送熱ワクチンである、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 標識された検出プローブが、非蛍光クエンチャーまたはマイナーグルーブバインダーをさらに含む、請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 検出プローブが、６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）で蛍光標識されている、請求項２３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 標識された検出プローブが、ＢＶＤＶ−１ａ、ＢＶＤＶ−１ｂ、ＢＶＤＶ−２、ＢＨＶ−１、ＰＩ_３、またはＢＲＳＶウイルス核酸に特異的に結合する、請求項２３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 生物学的試料から得たポリヌクレオチドの集団内のウイルス特異的ポリヌクレオチドの増幅および検出における、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
40. 多価ウシ輸送熱ワクチン内に含まれる複数の弱毒化した生ウイルス粒子由来のＢＶＤＶ１ａ型、１ｂ型、または２型−特異的ポリヌクレオチドの増幅および検出における、請求項３９に記載の使用。