MX2013007586A - Composiciones y metodos para identificar y diferenciar componentes virales de vacunas multivalentes de fiebre del embarque. - Google Patents

Abstract

Se describen métodos y composiciones para identificar secuencias de polinucleótido virales específicas en una muestra biológica, y particularmente en muestras de origen veterinario. También se describen pares de cebador de oligonucleótido, así como sondas de detección de oligonucleótido etiquetadas útiles para detectar la presencia de de una o más especies, cepas, tipos o subtipos de uno o más patógenos de mamífero de origen viral, así como sistemas, equipos de diagnóstico y artículos de fabricación que comprenden cebadores de virus específicos y sondas de detección marcadas, incluyendo aquellas útiles para identificar componentes virales de una vacuna multivalente, y cuantificar la potencia de virus vivos, atenuados particulares que comprenden una vacuna para ganado. En ciertas modalidades. Se han utilizado métodos de PCR cuantitativos, de tiempo real para identificar y distinguir entre tres subtipos genéticos conocidos de virus de diarrea viral de bovino (BVDV-Ia, BVDV-lb y BVDV-2) en una vacuna de fiebre de embarque multivalente de bóvidos.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA IDENTIFICAR Y DIFERENCIAR COMPONENTES VIRALES DE VACUNAS MULTIVALENTES DE FIEBRE DEL EMBARQUE Antecedentes de la invención Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas La presente solicitud está relacionada con la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense co-pendiente No. 61/427,361, titulada "Composiciones y Métodos de la Vacuna del Virus de Diarrea Viral Bovina Tipo 1b" (presentada conjuntamente con ésta el 27 de Diciembre de 2010, y específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a ésta).

Declaración con respecto a investigación o desarrollo patrocinado de manera federal No aplicable.

Nombres de las partes para un Acuerdo de investigación conjunta No aplicable.

Campo de la invención La presente invención se refiere en general al campo de biología molecular, y más específicamente a métodos de diagnóstico de laboratorio clínico veterinario. En particular, un sistema, método, composiciones, y kits de diagnóstico son proporcionados para identificación, amplificación, cuantificación y/o detección de segmentos de ácido nucleico derivados de especies virales específicas, tipos, y/o subtipos, que incluyen aquellas especies implicadas como agentes causales o que contribuyen en el complejo de la enfermedad respiratoria bovina (BRDC). En particular, se describen métodos y composiciones para identificar y diferenciar entre los tres subgenotipos conocidos de Virus de Diarrea Viral Bovina (BVDV).

Descripción de técnica relacionada "Fiebre del embarque" "Fiebre del embarque" es un término dado a un síndrome septicémico, altamente contagioso, agudo en vacas y ovejas que se caracteriza clínicamente por fiebre, inflamación aguda de las vías respiratorias, descarga nasal, anorexia, depresión, neumonía fibrinosa, y necrosis de los tejidos infectados. Muy frecuentemente encontrada en corrales de engorda después del embarque, la fiebre del embarque es la causa principal de muerte entre ganado joven, y es responsable de una pérdida anual estimada a la industria de más de la mitad a un billón de dólares. En 1991 solamente, la fiebre del embarque se estimó costar a la industria vacuna Estadounidense casi $624 millones de dólares, debido principalmente a los costos de tratamiento, pérdida de producción, y muerte.

La patogénesis de la fiebre del embarque es en general considerada por involucrar influencias externas adversas que predisponen al animal a una infección respiratoria viral inicial, la cual, a su vez, produce condiciones favorables para la proliferación de una o más infecciones bacterianas secundarias.

Complejo de enfermedad respiratoria bovina (BRD) (BRDC) El BRDC (a menudo comúnmente referido como "fiebre, del embarque.") es un complejo de enfermedad multifactorial que frecuentemente afecta a becerros de producción/engorda en canales en el mercado y en pastoreo o en corral. Caracterizado por infección secuencial o simultánea concomitante por tanto patógenos virales como bacterianos, el BRDC es una causa principal de pérdida económica en las industrias de ganado de carnes y productos lácteos.

La enfermedad, la cual infecta al ganado de todas las edades (incluyendo becerros lactantes), es caracterizada por respiración rápida, tos, depresión, pérdida del apetito, descarga nasal y ocular, y temperaturas elevadas. En un brote agudo, la muerte puede seguir dentro de 24 horas del comienzo de los síntomas. Los becerros que presentan depresión tendrán orejas caídas, una cabeza alargada, una espalda inclinada y/o a menudo se aislarán ellos mismos de otras vacas. Como la salud de los becerros progresivamente se deteriora, detienen su alimentación, presentando una frecuencia respiratoria incrementada, y desarrollan una fiebre pronunciada (típicamente en el intervalo de 40°-42°C (104°-108°F).

Al menos cuatro patógenos virales han sido implicados en el BRDC. Incluyen el virus del herpes bovino 1 (BHV-1) (el agente causal de rinotraqueítis bovina infecciosa [IBR]), virus de parainfluenza bovina tipo 3 (PI3), una o más variantes genéticas del virus de diarrea viral bovina (BVDV), y virus sincitial respiratorio Bovino (BRSV).

Después de la infección viral, los animales afectados entonces desarrollan una o más infecciones bacterianas subsecuentes (por ejemplo, Mannheimia [anteriormente Pasteurella] haemolytica, Pasteurella multocida, Histophilus somni (anteriormente Haemophilus somnus), Actinomyces pyogenes, y varios Mycoplasma spp.) los cuales a menudo se manifiestan en neumonía aguda.

Virus de diarrea viral bovina (BVDV) El BVDV es ahora reconocido como un agente etiológico importante en BRDC. Dispersado a través de un rebaño en una manera fecal-oral, el virus causa infecciones agudas (que incluyen diarrea, fiebre, y síndrome hemorrágico), y es capaz de cruzar la placenta de ganado preñado, lo cual a menudo resulta en el nacimiento de becerros persistentemente infectados (Pl) que son ¡nmunotolerantes al virus y persistentemente virémicos por el resto de sus vidas. Los bóvidos Pl actualmente presentan el principal reservorio de los virus; estos animales están altamente predispuestos a la infección con microorganismos que causan neumonía o enfermedad entérica, y proporcionan los reservónos virales necesarios para brotes de enfermedad fatal de la mucosa (MD) en ganado (véase por ejemplo, Liess et al., 1974; Barber et al., 1985; Olafson et al., 1946; Ramsey et al., 1953; Malmquist, 1968; and Ross et al., 1986, cada una de las cuales está específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta).

Los Virus de Diarrea Viral Bovina son un grupo disparado de virus que pueden ser clasificados tanto fenotípicamente {véase, por ejemplo, Baker, 1995) (citopático o no citopático) y genotípicamente (véase, por ejemplo, Ridpath et al., 1994; Vilcek et al., 2001; y Flores et al., 2002). Establecer la inmunidad protectora contra el BVDV en ganado ha sido problemático por un número de razones. Como en algunas otras enfermedades viralmente mediadas, los niveles de anticuerpos del suero contra BVDV no se correlacionan necesariamente con la protección contra la enfermedad. Establecer la protección inmune en becerros lactantes presenta obstáculos adicionales, puesto que los anticuerpos maternales al BVDV pueden agotar el inmunógeno inyectado y neutralizar efectivamente la vacuna.

Un estudio por Fulton et al. (2006) evaluó 21,743 becerros que ingresan a los corrales de engorda Estadounidenses y determinó que 88 becerros fueron persistentemente infectados (Pl) con BVDV. De los 88 becerros Pl, 77.9% se infectaron con BVDV-1b; solamente 11.6% se infectaron con BVDV-1a, y solamente 10.5% se infectaron con BVDV-2a.

Breve descripción de la invención La presente invención supera estas y otras limitaciones inherentes en la técnica anterior proporcionando ventajosamente un sistema y método para detectar secuencias de nucleótidos virales específicas en una población de polinucleótidos en, u obtenidos de, una muestra, y particularmente muestras de origen biológico o veterinario. La presente invención también supera deficiencias en la técnica en otra modalidad proporcionando ventajosamente composiciones y- métodos para detectar y distinguir específicamente entre ácidos nucleicos obtenidos de dos o más poblaciones de polinucleótidos genéticamente relacionados, que incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos obtenidos de dos o más especies, cepas, tipos, o subtipos virales genéticamente relacionados. La invención puede proporcionar, por primera vez, cebadores de amplificación de oligonucleótido específicos y sondas de detección de oligonucleótido etiquetadas (así como también kits de ensayos de diagnóstico que los comprenden), para discriminar entre polinucleótidos específicos a los subtipos genéticos conocidos de BVDV (por ejemplo, Tipo 1a, Tipo 1b, y Tipo 2), y para identificar y cuantificar cada componente viral presente en una población polivalente de partículas virales.

La invención también puede proporcionar ventajosamente pares cebadores de amplificación y sondas de detección de oligonucleótido etiquetadas, así como también métodos para usar tales composiciones variando las modalidades para la preparación de sistemas de detección altamente sensibles, específicos vírales que pueden ser explotados para determinar más exactamente la potencia de virus vivo, modificado (MLV) individual en formulaciones de vacuna multivalente, que incluye por ejemplo, la vacuna hexavalente de fiebre del embarque expuesta en la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense co-pendiente del Solicitante 61/427,361 (presentada el 27 de Diciembre y específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta).

También se describen artículos de manufactura, que incluyen kits de diagnóstico que contienen tales cebadores y sondas específicos virales. Los análisis rápidos y sensibilidad incrementada proporcionados usando ensayos cuantitativos (y en particular, cuantitativos en tiempo real) de reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) que emplean las composiciones de la presente invención (particularmente cuando se usan en conjunto con una o más etiquetas detectables, que incluyen, por ejemplo, metodologías de detección fluorogénicas y cromogénicas, tales como sistemas de detección a base de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), ilustran solo dos de las muchas ventajas que la invención puede ofrecer al ambiente de laboratorio clínico veterinario.

En una primera modalidad, la invención proporciona una composición que incluye al menos un primer cebador de amplificación de oligonucleótido específico viral; al menos un segundo cebador de amplificación de oligonucleótido específico viral; y al menos una primera sonda de detección específica viral, etiquetada, adecuada para conducir un ensayo de detección/amplificación a base de PCR de una población de polinucleótidos.

Como se observa en la presente, tales sondas de detección virales específicas preferiblemente incluyen al menos una etiqueta detectable, que incluye, sin limitación, una o más porciones de etiquetas cromogénicas, fluorogénicas, de etiqueta giratoria o radioactivas, o cualquier combinación de las mismas.

En una modalidad relacionada, la invención proporciona una composición para uso en la detección de una o más secuencias de ácido nucleico virales específicas en una muestra acuosa. Preferiblemente la muestra es una muestra de origen biológico (que incluye, sin limitación, células, tejidos, sangre, plasma, suero, y cualesquiera combinaciones de los mismos), o una composición o formulación de diagnóstico, laboratorio o farmacéutica que se conoce por contener, o es sospechosa de contener, uno o más ácidos nucleicos virales específicos. Preferiblemente, tal composición es una formulación de vacuna de mamífero, o una composición inmunogénica capaz de provocar una respuesta inmune en una o más especies de ganado mamífero.

Preferiblemente, tales composiciones incluyen uno o más cebadores de amplificación delanteros, y uno o más cebadores de amplificación inversos que hibridan específicamente a, y facilitan la amplificación dependiente de la polimerasa de, una secuencia de ácido nucleico que es específica para una o más especies, cepas, tipos y/o subtipos virales patogénicos bovinos.

Aspectos adicionales de la invención incluyen kits de ensayos moleculares y/o diagnóstico como se describe en detalle adicional en la presente que contienen una o más de las composiciones mencionadas antes, preferiblemente adecuadas para realizar una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar una secuencia de ácido nucleico viral específica a partir de una muestra que comprende una vacuna veterinaria del virus vivo, modificado, bajo condiciones apropiadas para producir una pluralidad de segmentos de ácido nucleico amplificados vía PCR que son detectables y/o cuantificables usando una o más sonda(s) de detección de oligonucleótido etiquetadas adecuadas, que incluyen, sin limitación, aquellas secuencias de sonda descritas y ejemplificadas en la presente.

La invención también proporciona el uso de una o más de tales composiciones en la manufactura de un artículo para amplificar y/o detectar uno o más polinucleótidos virales específicos en una población de polinucleótidos obtenidos a partir de una muestra biológica. En modalidades ilustrativas, tal uso incluye la amplificación, detección, y/o cuantificación de una o más partículas del BVDV, y preferiblemente una o más de tales partículas virales que son comprendidas con un MLV. En modalidades ejemplares, se demuestra el uso para tales composiciones en la amplificación, detección y cuantificación de polinucleótidos específicos del BVDV Tipo 1b, Tipo 1b, y Tipo 2 a partir de una pluralidad de partículas del virus vivo, atenuado, comprendidas dentro de una vacuna de fiebre del embarque bovino, multivalente. Utilizando combinaciones de sonda/cebador que son específicas para varias especies, cepas, tipos, o subtipos de virus, los métodos de la invención pueden ser además empleados en la caracterización de potencias de vacunas, y particularmente en vacunas animales, polivalentes, tales como aquellas que son representativas para enfermedades tales como BRDC y fiebres del embarque relacionadas que tienen agentes etiológicos de origen viral conocido.

En un sentido total y general, los métodos de la presente invención permiten la detección rápida, exacta y fácil de polinucleótidos virales específicos dentro de poblaciones de polinucleótidos, y en particular, de formulaciones de vacuna multivalentes efectivas en la prevención, tratamiento, manejo y/o alivio de uno o más síntomas multifactoriales (y, particularmente, enfermedades de orígenes multi-etiológicos), tales como BRDC y fiebre del embarque relacionadas. Tal método en general involucra realizar al menos una etapa cíclica, en donde la etapa cíclica comprende al menos una primera etapa de amplificación y al menos una primera etapa de hibridación, y en donde al menos una primera etapa de amplificación comprende poner en contacto la muestra con una composición de sonda/cebador como se describe en la presente, para producir un producto de amplificación viral específico si una molécula de ácido nucleico viral específica está presente en la muestra, en donde al menos una primera etapa de hibridación comprende poner en contacto la muestra con la composición; y poner en contacto el producto de amplificación así producido con al menos una primera sonda de detección de oligonucleótido etiquetado bajo condiciones efectivas para detectar específicamente el producto de hibridación resultante. En modalidades ilustrativas, el par de cebadores de amplificación virales específicos comprende: una primera sonda de amplificación de oligonucleótido de menos de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, que comprende, consiste esencialmente de, o alternativamente, consiste de, una secuencia de ácido nucleico seleccionada de una o más de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:4, SEC ID NO:7, SEC ID NO:10, SEC ID NO:13, y SEC ID NO:16; y un segundo cebador de amplificación de oligonucleótido de menos de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, que comprende, consiste esencialmente de, o alternativamente, consiste de, una secuencia de ácido nucleico seleccionada de una o más de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:5, SEC ID NO:8, SEC ID NO:11, SEC ID NO:14, y SEC ID NO:17.

En ciertas modalidades, la composición puede comprender además al menos una primera sonda de detección viral específica etiquetada. Tales sondas de detección preferiblemente son de menos de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, y comprenden, consisten esencialmente de, o alternativamente, consisten de, una secuencia de ácido nucleico seleccionada de una o más de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, y SEC ID NO:18.

En modalidades preferidas, la primera etapa cíclica preferiblemente incluye poner en contacto la población de polinucleótidos con un par de cebadores de amplificación virales específicos para producir un producto de amplificación cuando una molécula de ácido nucleico viral específica está presente en la población de polinucleótidos, y además en donde al menos una primera etapa de hibridación comprende poner en contacto la población de polinucleótidos con al menos una primera sonda de detección viral específica etiquetada bajo condiciones efectivas para detectar el producto de amplificación así producido. En ciertas modalidades, la etapa de detección puede ser realizada en tiempo real, y puede además incluir opcionalmente la etapa adicional de determinar la temperatura de fusión entre la sonda de detección viral específica y el producto de amplificación viral.

Métodos y composiciones para la determinación de la potencia de la vacuna La presente invención proporciona métodos para identificar secuencias de polinucleótido virales específicas, y en particular, secuencias de polinucleótido del BVDV específicas en una muestra de MLV, tal como aquellas presentes en una vacuna animal. La invención también proporciona métodos y composiciones para detectar específicamente secuencias de polinucleótido virales específicas en una muestra, y particularmente en una vacuna de mamífero, o un espécimen veterinario o biológico obtenido de un bóvido, así como también de un candidato de vacuna. Los métodos descritos preferiblemente utilizan pares cebadores de oligonucleótido y composiciones y kits de sondas de oligonucleótido etiquetadas, y particularmente aquellas que comprenden una o más de las secuencias descritas en la presente, para detectar productos de amplificación por PCR, etiquetando los productos de amplificación resultantes vía un cebador hibridado, y cuantificar tales productos de amplificación usando uno o más de los ensayos a base de PCR, qPCR, RT-qPCR, y PCR/FRET, particularmente en combinación con el análisis de curva de fusión subsecuente (por ejemplo, CT).

En una modalidad, la invención proporciona un método para detectar la presencia o ausencia de uno o más polinucleótidos virales específicos, o un segmento de ácido nucleico que codifica toda o una porción de una proteína, péptido o polipéptido viral derivado. En ciertos aspectos, una o más muestras biológicas pueden ser tomadas de un individuo (por ejemplo, una formulación de vacuna, o una muestra biológica obtenida de un ganado doméstico), y seleccionado para determinar la presencia de tal secuencia. En modalidades particulares, la formulación de vacuna o muestra biológica puede ser seleccionada por la presencia de una o más secuencias virales específicas, que incluyen, por ejemplo, una secuencia específica a uno o más de los componentes virales LV de una vacuna animal multifactorial.

El proceso de PCR es bien conocido por aquellos de habilidad ordinaria en las artes de biología molecular (véase, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 4,683,195 y 4,683,202, cada una específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta). La extensión dependiente de la plantilla de cebadores en PCR es catalizada por un agente polimerízante en la presencia de cantidades adecuadas de cuatro desoxirribonucleótidos trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP, y dTTP) en un medio de reacción comprendido de las sales apropiadas, cationes de metal, y el sistema amortiguador de pH. Los agentes polimerizantes adecuados son enzimas conocidas por catalizar la síntesis de DNA dependiente de la plantilla. Por ejemplo, si la plantilla es RNA, un agente polimerízante adecuado para convertir el RNA en una secuencia de DNA complementario (cDNA) es transcriptasa inversa (RT), tal como RT del virus de mieloblastosis aviar. Como se observa en la patente Estadounidense No. 5,614,388 (específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta), si el objetivo para la amplificación es DNA, las polimerasas adecuadas incluyen, sin limitación polimerasa I de DNA de E. coli o su fragmento Klenow, polimerasa de DNA T4, y polimerasa Taq (una polimerasa de DNA estable al calor aislada a partir del microorganismo, Thermus aquaticus). La última enzima, conocida como "polimerasa Taq", es ampliamente usada en la amplificación y secuenciamiento de ácidos nucleicos, y las condiciones de reacción para usar tales polimerasas son bien conocidas por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook and Russell, 2001). En una modalidad preferida del proceso de PCR, la reacción es catalizada por una enzima de polimerasa de DNA termoestable, tal como polimerasa de DNA Taq, y llevada a cabo a una temperatura elevada. La temperatura preferida es una en la cual la enzima es termoestable, y en la cual los ácidos nucleicos están en equilibrio de filamentos simples y dobles, de manera que el suficiente cebador templará a los filamentos de la plantilla para permitir un índice razonable de polimerización. La separación del filamento se logra por calentando la reacción a una temperatura suficientemente alta por un tiempo suficiente para causar la desnaturalización del duplo, pero no para causar una desnaturalización irreversible de la polimerasa.

En una solicitud particular, los métodos de la invención emplean ventajosamente al menos una primera etapa de amplificación a base de PCR, y preferiblemente al menos una primera etapa de amplificación a base de PCR cuantitativa, la cual en general involucra realizar al menos una etapa cíclica (la cual incluye al menos una primera etapa de "amplificación" y al menos una primera etapa de "hibridación"). Esta etapa de amplificación incluye poner en contacto la muestra con un par de cebadores de oligonucleótido virales específicos para producir un producto de amplificación si un polinucleótido objetivo viral estuvo originalmente presente en la muestra. (Contrariamente, si ningún polinucleótido objetivo viral estuvo originalmente presente en la muestra, entonces ningún producto de amplificación específico podría ser producido durante el proceso de PCR).

La etapa de hibridación típicamente incluye poner en contacto la muestra que resulta de la etapa de amplificación con una o más sondas de oligonucleótido etiquetadas que específicamente hibridan (es decir, se unen a) al producto de amplificación así producido. En casos de análisis FRET, la sonda de detección puede comprender un primer y un segundo miembro de un par de detección compatible con FRET de sondas de oligonucleótido virales específicas (que incluyen, por ejemplo, aquellos pares compatibles con FRET que hibridan al producto de amplificación dentro de no más de aproximadamente cuatro o cinco nucleótidos de entre sí. En el caso de análisis FRET, la primera sonda del par de sondas de detección es típicamente etiquetada con una porción fluorescente donadora y una segunda sonda del par de sondas de detección es típicamente etiquetada con una porción fluorescente aceptora correspondiente. Estas sondas de detección, y el tipo de porciones que pueden ser operablemente ligadas a ellas para uso en la etapa de hibridación, han sido descritas en más detalle aquí posteriormente.

El método también comprende además al menos la etapa de detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación:sonda híbrida a través del uso de una etiqueta adecuada (y típicamente una operablemente ligada a la sonda), en donde la presencia de una señal a partir de la sonda etiquetada es usualmente indicativo de la presencia del polinucleótido objetivo en la muestra. Contrariamente, en la ausencia de un producto de amplificación producido, no se obtiene señal sustancialmente detectable después de la etapa de hibridación, de este modo indicativo de la ausencia del polinucleótido objetivo en la población de secuencias de ácido nucleico originalmente presentes en la muestra analizada.

En ciertas modalidades, las etapas de amplificación y detección pueden ser realizadas en tiempo real, y opcionalmente el método puede incluir además una etapa analítica o de cuantificación adicional (que incluye, por ejemplo, determinar la temperatura de fusión entre la(s) sonda(s) de detección y el producto de amplificación correspondiente para cuantificar o además caracterizar la secuencia objetivo viral derivada (si está presente) en la muestra analizada.

El proceso para determinar la temperatura de fusión entre una sonda y su objetivo correspondiente en general involucra lo siguiente: Un producto de amplificación por PCR y la(s) sonda(s) de detección correspondiente son enfriadas a alrededor de 40°C para facilitar el templado de la(s) sonda(s) a la secuencia(s) complemeñtaria(s) del(los) producto(s) de amplificación por PCR objetivo. Una vez que la(s) sonda(s) etiquetada(s) han sido puestas en contacto con la mezcla de reacción bajo condiciones efectivas para templar la(s) sonda(s) al producto de PCR de objetivo (si está presente), la etiqueta detectable (por ejemplo, fluoróforos, etc.) es entonces detectada (y subsecuentemente cuantificada) usando técnicas convencionales conocidas por aquellos de habilidad ordinaria en las artes de biología molecular.

La detección de ácidos nucleicos es bien conocida por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, y se puede lograr a través de la aplicación de numerosos procedimientos. Estos métodos en general se basan en la detección de una etiqueta o marcador, tal como cualquier etiqueta radioactiva, fluorescente, biológica o enzimática o marcas conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149' y 4,366,241, cada una de las cuales es específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta. Ejemplos adicionales de etiquetas detectables que pueden ser utilizados en la práctica de la invención incluyen iones paramagnéticos tales como cromo (III), manganeso (II), fierro (III), fierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) y erbio (III), con gadolinio siendo particularmente preferidos. Las porciones fluorescentes que incluyen, sin limitación, rodamina, fluoresceína y renografina también pueden ser usadas, con enzimas que generan un producto coloreado después del contacto con un sustrato cromogénico siendo particularmente preferido.

Los ligandos de unión secundarios (que incluyen, sin limitación, un segundo anticuerpo y/o un arreglo de unión de ligando de avidina/biotina), también pueden ser usados, como se conoce por aquellos de habilidad ordinaria en las artes de biología molecular.

Como se describe anteriormente, cualquier etiqueta puede ser usada como una etiqueta de una sonda de oligonucleótido en la medida que cubra completamente los requerimientos mencionados anteriormente e interactúe con una etiqueta de ácido nucleico específica. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, LightCycler® RED 640, LightCycler® RED 705, TAMRA y Alexa 633. La etiqueta puede ser unida a un oligonucleótido en cualquier posición en la medida que la unión no tenga influencia en la hibridación del oligonucleótido. En solicitudes particulares, la etiqueta es usualmente operablemente ligada a (es decir, unida, anexada, ligada, etc.) a ya sea el 5' o el extremo 21 de la molécula de sonda de oligonucleótido.

Además de los oligonucleótidos específicamente expuestos en la presente, pueden ser diseñados y sintetizados ácidos nucleicos adicionales (por ejemplo, usando un programa de computadora tal como OLIGO [Molecular Biology Insights Inc., Cascade, CO, USA]) ya sea como cebadores de amplificación o sondas de detección para uso en los ensayos de potencia viral descritos en la presente. Típicamente, los cebadores y sondas de oligonucleótido son desde aproximadamente 7 u 8 hasta aproximadamente 60 u 80 o así de nucleótidos de longitud (por ejemplo, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, efe. nucleótidos de longitud). "Cebador(es) virales específicos" como se usa en la presente se refiere a cebador(es) de oligonucleótido que específicamente templan a secuencias de ácido nucleico presentes dentro del genoma de un virus particular seleccionado, y facilitan el inicio de la síntesis de polimerasa de productos de amplificación a partir de estos bajo condiciones apropiadas. Del mismo modo "sonda(s) virales específicas" se refiere a sonda(s) de oligonucleótido que específicamente templan a secuencias de ácido nucleico que son amplificadas por una polimerasa adecuada usando los pares cebadores hibridados bajo condiciones apropiadas, y son serialmente, concomitantemente, secuencialmente y/o subsecuentemente detectables (y, preferiblemente, cuantificables) usando ensayos de detección de oligonucleótidos convencionales y similares.

Composiciones de oligonucleótidos En una modalidad, la presente invención proporciona sondas de oligonucleótidos y secuencias cebadoras específicas para polinucleótidos virales específicas y productos de amplificación producidos a partir de estas, que son útiles en la hibridación a, y amplificación de, secuencias de polinucleótído virales homologas correspondientes, y en particular a secuencias de partículas virales vivas, modificadas, presentes en -una vacuna animal. En modalidades ilustrativas, las secuencias cebadoras de oligonucleótido ejemplares son descritas de manera que son útiles en la detección y amplificación de cepas genéticas particulares, tipos, y subtipos de secuencias de ácido nucleico específicas del BVDV.

Los cebadores y sondas de oligonucleótido de la presente invención son diseñados para la amplificación y detección selectiva de segmentos de ácido nucleico virales específicos y polinucleótidos específicos del BVDV (y productos de amplificación derivados de estos) en particular. Las secuencias cebadoras descritas son adecuadas para uso en métodos de hibridación, y en métodos de amplificación de DNA tales como métodos de amplificación a base de PCR™ (que incluyen, por ejemplo, pPCR en tiempo real, RT-PCR, en análisis genéticos a base de RT-PCR/FRET). Del mismo modo, las sondas de detección de oligonucleótido descritas son adecuadas para etiquetado con un medio de etiqueta apropiado para detección y cuantificación de los productos que resultan de la amplificación de ácidos nucleicos usando uno o más pares de los cebadores de amplificación virales específicos descritos en la presente.

Cuando se etiquetan con marcadores apropiados, las sondas de detección de oligonucleótido son particularmente adecuadas para detección a base de fluorescencia, que incluyen, por ejemplo, PCR, PCR en tiempo real, PCR cuantitativa (qPCR), análisis a base de FRET y similares. Por ejemplo, las metodologías de detección etiquetadas con FRET son particularmente útiles en detección fluorimétrica a base de fluorimetría de microvolumen. El uso de uno o más de los pares de oligonucleótidos de amplificación y detección descritos está particularmente contemplado en las metodologías a base de FRET de fluorimetría de microvolumen/RT-PCR™ combinadas (RT-PCR /FRET), y particularmente en análisis facilitados por la instrumentación de "LightCycler®" ya desarrollada por Idaho Technology, Inc., y ahora manufacturado y comercializado por Roche Molecular Systems.

Para la mayoría de las modalidades, el inventor contempla que la longitud de las composiciones de sonda y cebador seleccionadas de la invención preferiblemente serán de menos de aproximadamente 50 a 60 o menos nucleótidos de longitud, y más preferiblemente, será menos de aproximadamente 40 a 45 o menos nucleótidos de longitud, mientras otras sondas y cebadores de la invención pueden ser del orden de aproximadamente 30 a 35 o menos nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, la longitud de las secuencias cebadoras de oligonucleótido seleccionado (por ejemplo, cebadores "delantero" e "inverso") y/o la longitud de las secuencias de sonda de detección seleccionadas (por ejemplo, sondas de "anclaje" y "sensoras"), probablemente estarán en el orden de aproximadamente 20 a 30 o menos nucleótidos de longitud, aunque en algunos casos, los tamaños de secuencias cebadoras y sondas particulares pueden ser mayores que aquellas, y en el orden de aproximadamente 60 a 70 nucleótidos de longitud. Alternativamente, en algunas modalidades, puede ser deseable emplear secuencias de sonda y/o cebador más cortas, y como tal, los oligonucleótidos seleccionados para la práctica de la invención pueden estar en el orden de aproximadamente 15 a 20 o menos nucleótidos de longitud o aún ligeramente más cortos en algunas modalidades.

En el contexto de la presente solicitud, se entiende que todas ios longitudes de oligonucleótidos intermediarios dentro de los varios intervalos declarados en la presente están contemplados por caer expresamente dentro del alcance de la presente invención. Con tal fin, oligonucleótidos que son "menos de aproximadamente XX nucleótidos de longitud" incluyen todos los números enteros incluidos dentro del tal intervalo. Por ejemplo, oligonucleótidos que son "menos de aproximadamente 60 nucleótidos de longitud" incluyen oligonucleótidos que son 59, 58, 57, efe. a 4, 3, 2, o 1 nucleótidos de longitud y cada uno está expresamente dentro del alcance de la presente descripción.

Los oligonucleótidos de la invención pueden ser sintetizados por un número de procedimientos convencionales que son conocidos por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica (véase, por ejemplo, Ozaki et al., 1992; Agrawal et al., 1990 o similares) usando metodologías estándares, que incluyen química de fosforamidita {véase, por ejemplo, Beaucage and lyer, 1992; y Patentes Estadounidenses Nos. 4,980,460; 4,725,677; 4,415,732; 4,458,066; y 4,973,679; y similares). Químicas alternativas, por ejemplo, que resultan en grupos de estructura no natural, tales como fosforotioato, fosforamidita, y similares, también pueden ser empleados siempre que las eficiencias de hibridación de los oligonucleótidos resultantes no sean adversamente afectadas. Preferiblemente, los oligonucleótidos están en el intervalo de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 120 nucleótidos de longitud; más preferiblemente, en el intervalo de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente todavía, en el intervalo de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 80 nucleótidos de longitud, aunque la secuencia y longitud precisa de un oligonucleótido puede depender entre otros de la naturaleza de la secuencia de ácido nucleico objetivo a la cual híbrida, puesto que la ubicación y longitud de unión puede ser variada para lograr las propiedades de fusión y templado apropiadas para una modalidad particular. La guía para elaborar tales elecciones de diseño se puede encontrar en muchas de las referencias citadas anteriormente que describen los ensayos de "tipo Taqman®" empleados en el ejemplo siguiente y también descritas en detalle en Holland et al. (1991). Cada una de las referencias anteriores está específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta.

Cebadores de amplificación virales específicos En la práctica de la invención, cebadores de amplificación delantero e inverso para uso en la amplificación de secuencias de polinucleótido virales específicas, y secuencias de polinucleótido que codifican al BVDV en específico, preferiblemente comprenderán, consisten esencialmente de, o alternativamente, consisten de, al menos aproximadamente 6 hasta al menos aproximadamente 25 (que incluye cada número entero entre estos) o más ácidos nucleicos contiguos de cualquiera de las secuencias cebadoras de oligonucleótido "delantero" descritas en la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:4, SEC ID NO:7, SEC ID NO:10, SEC ID NO:13, o SEC ID NO:16 o las secuencias cebadoras de oligonucleótido "inverso" descritas en la SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:5, SEC ID NO:8, SEC ID NO:11, SEC ID N0:14, o SEC ID NO:17; o a partir de secuencias de oligonucleótido que son al menos aproximadamente 90% idénticas a cualquiera de las secuencias cebadoras de oligonucleótido "delantero" descritas en la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:4, SEC ID NO:7, SEC ID NO:10, SEC ID NO:13, o SEC ID NO:16 o las secuencias cebadoras de oligonucleótido "inverso" descritas en la SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:5, SEC ID NO:8, SEC ID NO:11, SEC ID NO:14, o SEC ID NO:17; o aún a partir de secuencias de oligonucleótido que son al menos aproximadamente 95% idénticas a cualquiera de las secuencias cebadoras de oligonucleótido "delantero" descritas en la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:4, SEC ID NO:7, SEC ID NO:10, SEC ID NO:13, o SEC ID NO:16, o las secuencias cebadoras de oligonucleótido "inverso" descritas en la SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:5, SEC ID NO:8, SEC ID NO:11, SEC ID NO:14, o SEC ID NO:17.

En otras modalidades, las secuencias cebadoras de amplificación delantero e inverso de oligonucleótido preferidas de la invención pueden comprender, consisten esencialmente de, o alternativamente, consisten de, cualquiera de las secuencias cebadoras de oligonucleótido "delantero" descritas en la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:4, SEC ID NO:7, SEC ID NO:10, SEC ID NO:13, o SEC ID NO:16 o las secuencias cebadoras de oligonucleótido "inverso" descritas en la SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:5, SEC ID NO:8, SEC ID NO:11, SEC ID NO:14, o SEC ID NO:17, mientras en otras modalidades, puede ser deseable emplear secuencias cebadoras que consisten esencialmente de cualquiera de las secuencias cebadoras de oligonucleótido "delantero" descritas en la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:4, SEC ID NO:7, SEC ID NO:10, SEC ID NO:13, o SEC ID NO:16, o las secuencias cebadoras de oligonucleótido "inverso" descritas en la SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:5, SEC ID NO:8, SEC ID NO:11, SEC ID NO:14, o SEC ID NO:17, y mientras en todavía otras modalidades, puede ser deseable emplear secuencias cebadoras que consisten de cualquiera de las secuencias cebadoras de oligonucleótido "delantero" descritas en la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:4, SEC ID NO:7, SEC ID NO:10, SEC ID NO:13, o SEC ID NO:16, o las secuencias cebadoras de oligonucleótido "inverso" descritas en la SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:5, SEC ID NO:8, SEC ID NO:11, SEC ID NO:14, o SEC ID NO:17.

En aún modalidades adicionales, las composiciones cebadoras de amplificación delanteras e inversas preferidas para la práctica de los métodos de la presente invención pueden comprender, consisten esencialmente de, o alternativamente, consisten de, una secuencia de ácido nucleico que representa una secuencia de ácido nucleico contiguo de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 25 (que incluye cada número entero entre estos) o más nucleótidos como se describe en cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17.

Del mismo modo, las composiciones cebadoras preferidas para la práctica de los métodos de amplificación de la presente invención pueden comprender, consisten esencialmente de, o alternativamente, consisten de, una secuencia de ácido nucleico que es aproximadamente 90% idéntica a una secuencia de ácido nucleico contiguo de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 25 (que incluye cada número entero entre estos), o más nucleótidos como se describe en cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17.

Adicionalmente, las composiciones cebadoras de amplificación preferidas para la práctica de los métodos de amplificación de la presente invención pueden comprender, consisten esencialmente de, o alternativamente, consisten de, una secuencia de ácido nucleico que es al menos aproximadamente 95% idéntica a cualquiera de las secuencias de oligonucleótido descritas en cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17.

En otras modalidades, las composiciones cebadoras preferidas para la práctica de la invención pueden comprender, consisten esencialmente de, o alternativamente, consisten de, una secuencia de ácido nucleico que es al menos aproximadamente 6 hasta al menos aproximadamente 25 (nuevamente, que incluye cada número entero entre estos) o más ácidos nucleicos contiguos seleccionados de cualquiera de las secuencias de oligonucleótido descritas en cualquiera de la SEC ID N0:1, SEC ID N0:19, SEC ID N0:2, SEC ID NO:20, SEC ID N0:4, SEC ID N0:5, SEC ID N0:7, SEC ID N0:8, SEC ID NO:10, SEC ID N0:11, SEC ID N0:13, SEC ID N0:14, SEC ID N0:16, o SEC ID NO:17; o pueden consistir esencialmente de una secuencia de oligonucleótido que es al menos aproximadamente 90% idéntica a cualquiera de las secuencias de oligonucleótido descritas en cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17; o aún pueden consistir esencialmente de una secuencia de oligonucleótido que es al menos aproximadamente 95% idéntica a cualquiera de las secuencias de oligonucleótido descritas en cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17.

En ciertas modalidades, cebadores de amplificación ilustrativos de la invención son al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud y comprenden, consisten esencialmente, o consisten de una secuencia de nucleótido que comprende una secuencia de nucleótido como se describe en cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17.

En otras modalidades, cebadores de amplificación ilustrativos de la invención son al menos aproximadamente 40 nucleótidos de longitud y comprenden, consisten esencialmente de, o consisten de una secuencia de nucleotido que comprende una secuencia de nucleotido como se describe en cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17.

En modalidades adicionales, cebadores de amplificación ilustrativos de la invención son al menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud y comprenden, consisten esencialmente o, o consisten de una secuencia de nucleotido que comprende una secuencia de nucleotido como se describe en cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17.

En todavía aspectos adicionales de la invención, cebadores de amplificación ilustrativos de la invención son al menos aproximadamente 25 nucleótidos de longitud y comprenden, consisten esencialmente de, o consisten de una secuencia de nucleotido que comprende una secuencia de nucleotido como se describe en cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17, mientras en otros aspectos, cebadores de amplificación ilustrativos de la invención son al menos aproximadamente 20 o menos nucleótidos de longitud y comprenden, consisten esencialmente de, o consisten de una secuencia de nucleotido que comprende una secuencia de nucleotido como se describe en cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17.

En ejemplos ilustrativos particulares, las composiciones cebadoras de oligonucleótido de la invención son de menos de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud y comprenden la secuencia de nucleotido de cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17, mientras en otros ejemplos ilustrativos, las composiciones cebadoras de oligonucleótido de la invención son de menos de aproximadamente 40 nucleótidos de longitud y comprenden la secuencia de nucleotido de cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17, y en otros ejemplos todavía, las composiciones cebadoras de oligonucleótido de la invención son de menos de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud y comprenden la secuencia de nucleotido de cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17.

En algunos aspectos de la invención, puede ser deseable emplear composiciones cebadoras de oligonucleótido en la práctica de los métodos descritos en la presente que son de menos de aproximadamente 45 o menos nucleótidos de longitud y que consisten esencialmente de la secuencia de nucleótido de cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID N0.11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17, o composiciones que son de menos de aproximadamente 35 o menos nucleótidos de longitud y que consisten esencialmente de la secuencia de nucleótido de cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17, mientras en otros ejemplos todavía, puede ser deseable emplear composiciones cebadoras de oligonucleótido que son de menos de aproximadamente 25 o menos nucleótidos de longitud y que consisten esencialmente de la secuencia de nucleótido de cualquiera de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:16, o SEC ID NO:17.

Sondas de detección virales específicas En la práctica de la invención, sondas de oligonucleótido para uso en la detección de secuencias de polinucleótido virales específicas (y secuencias de polinucleótidos específicas del BVDV en especifico) usando análisis RT-qPCR™ como se describe en la presente, preferiblemente comprenderán al menos aproximadamente 6 hasta al menos aproximadamente 25 (que incluye cada número entero entre estos) o más ácidos nucleicos contiguos de cualquiera de las secuencias de sonda de oligonucleótido descritas en la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18; o a partir de secuencias de oligonucleótido que son al menos aproximadamente 90% idénticas a cualquiera de las secuencias de sondas de detección de oligonucleótido descritas en las SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18; o aún a partir de secuencias de oligonucleótido que son al menos aproximadamente 95% idénticas a cualquiera de las secuencias de sondas de oligonucleótido descritas en las SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18.

En otras modalidades, las sondas de detección de oligonucleótido preferidas de la invención pueden comprender, consisten esencialmente de, o alternativamente, consisten de, cualquiera de las secuencias de sondas de oligonucleótido descritas en las SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18, mientras en otras modalidades, puede ser deseable emplear segmentos de ácido nucleico de sondas de detección que consisten esencialmente de cualquiera de los oligonucleótidos como se describe en la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID N0:9, SEC ID N0:12, SEC ID N0:15, o SEC ID NO:18, y mientras en todavía otras modalidades, puede ser deseable emplear secuencias de sonda que consisten de cualquiera de las secuencias de oligonucleótido descritas en las SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18.

En aún modalidades adicionales, y específicamente en donde el análisis de FRET se emplea para detectar los productos de amplificación así producidos, la sondas de detección de la presente invención preferiblemente comprenderán un par de sondas, la primera de las cuales es una sonda de "anclaje", y la segunda la cual es una sonda "sensora".

Las composiciones de sonda preferidas para la práctica de los métodos de la presente invención pueden comprender, consisten esencialmente de, o alternativamente, consisten de, un par de sondas de detección, los primeros y segundos miembros de los cuales pueden consistir de una secuencia de ácido nucleico que representa una secuencia de ácido nucleico contiguo de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 25 (que incluye cada número entero entre estos) o más nucleótidos como se describe en cualquiera de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18.

Del mismo modo, composiciones de sonda preferidas para la práctica de métodos de detección a base de FRET pueden comprender, consisten esencialmente de, o alternativamente, consisten de, un par de sondas de detección, el primer miembro de los cuales puede consistir de una secuencia de ácido nucleico que es aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81% idéntica, al menos aproximadamente 82% idéntica, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84% o al menos aproximadamente 85% idéntica a una secuencia de ácido nucleico contiguo de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 25 (que incluye cada número entero entre estos), o más nucleótidos como se describe en cualquiera de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18, mientras el segundo miembro de tal par de sondas de detección puede preferiblemente comprender, consiste esencialmente de, o alternativamente, consiste de, una secuencia de ácido nucleico que es aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91% idéntica, al menos aproximadamente 92% idéntica, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94% o al menos aproximadamente 95% idéntica a una secuencia de ácido nucleico contiguo de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 25 (que incluye cada número entero entre estos), o más nucleótidos como se describe en cualquiera de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18.

Adicionalmente, cuando se desea el análisis a base de FRET de los productos de amplificación, sondas de oligonucleótido preferidas para la práctica de los métodos de la presente invención pueden comprender, consisten esencialmente de, o alternativamente, consisten de, un par de FRET sondas de detección, los primeros y segundos miembros de los cuales pueden comprender secuencias de ácido nucleico que son al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96% idénticas, al menos aproximadamente 97% idénticas, o al menos aproximadamente 98% o 99% idénticas a cualquiera de las secuencias de oligonucleotido descritas en cualquiera de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18. En otras modalidades, las composiciones de sonda preferidas para la práctica de la invención pueden comprender, consisten esencialmente de, o alternativamente, consisten de, un par de sondas sensoras/de anclaje FRET, los primeros y segundos miembros de los cuales pueden consistir esencialmente de una secuencia de ácido nucleico que es al menos aproximadamente 6 hasta, al menos aproximadamente 25 (que incluye cada número entero entre estos) o más ácidos nucleicos contiguos seleccionados de cualquiera de las secuencias de oligonucleotido descritas en cualquiera de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18; o pueden consistir esencialmente de una secuencia de oligonucleotido que es al menos aproximadamente 90% idéntica a cualquiera de las secuencias de oligonucleotido descritas en cualquiera de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18; o aún pueden consistir esencialmente de una secuencia de oligonucleotido que es al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96% idéntica, al menos aproximadamente 97% idéntica, o al menos aproximadamente 98% o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de oligonucleotido descritas en cualquiera de la SEC ID N0:3, SEC ID N0:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID N0:15, o SEC ID NO:18.

En ciertas modalidades, composiciones de sondas de detección de ollgonucleótido específicas del producto de amplificación viral ilustrativas de la invención preferiblemente son al menos aproximadamente 50 o menos nucleótidos de longitud, que ya sea comprenden, consisten esencialmente de, o consisten de, una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18.

En otras modalidades, composiciones de sondas de detección ilustrativas de la invención preferiblemente son oligonucleótidos de al menos aproximadamente 40 o menos nucleótidos de longitud, que ya sea comprenden, consisten esencialmente de, o consisten de, una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18.

En otras modalidades, composiciones de sondas de detección pueden ser oligonucleótidos de al menos aproximadamente 30 o menos nucleótidos de longitud, que ya sea comprenden, consisten esencialmente de, o consisten de, una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18, mientras en otras modalidades todavía, oligonucleótidos de detección adecuados pueden ser al menos aproximadamente 20 o menos nucleótidos de longitud, que ya sea comprenden, consisten esencialmente de, o consisten de, una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18.

En ejemplos ilustrativos particulares, las composiciones de sondas de detección de oligonucleotido de la invención son de menos de aproximadamente 50 o menos nucleótidos de longitud y comprenden la secuencia de nucleótido de cualquiera de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18, mientras en otros ejemplos ilustrativos, las composiciones de sondas de detección de oligonucleotido son de menos de aproximadamente 40 nucleótidos de longitud y comprenden la secuencia de nucleótido de cualquiera de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18.

En otras aplicaciones, sondas de detección de oligonucleotido adecuadas pueden ser menos de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud y pueden comprender una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18.

En algunos aspectos de la invención, puede ser deseable emplear composiciones de sondas de oligonucleotido en la práctica de los métodos descritos en la presente que son de menos de aproximadamente 45 o menos nucleotidos de longitud y que consisten esencialmente de la secuencia de nucleotido de cualquiera de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18, o alternativamente, sondas de oligonucleótido que son de menos de aproximadamente 35 o menos nucleotidos de longitud y que consisten esencialmente de la secuencia de nucleotido de cualquiera de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18, mientras en otros ejemplos todavía, puede ser deseable emplear composiciones de sondas de oligonucleotidos de detección que son de menos de aproximadamente 25 o menos nucleotidos de longitud y que consisten esencialmente de la secuencia de nucleotido de cualquiera de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, o SEC ID NO:18.

En modalidades ilustrativas, la invención proporciona cebadores de amplificación virales específicos y sondas de detección que comprenden, consisten esencialmente de, o consisten de, secuencias de ácido nucleico que son preferiblemente al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% o más idénticas a cualquiera o más de las secuencias de oligonucleótido descritas en la SEC ID NO:1 hasta la SEC ID NO:18.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona series de cebadores y sondas diseñados con base en su enlace específico a una o más porciones de un producto de amplificación viral específico. Estas sondas y cebadores son particularmente útiles en un método para detectar e identificar rápidamente secuencias de polinucleótido virales específicas en una muestra biológica. En modalidades particulares, estos métodos involucran cuantificación en tiempo real, que incluye, sin limitación, PCT cuantitativa (qPCR), PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR), y/o métodos de amplificación, detección y/o cuantificación a base de Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente(FRET)/RT-PCR (RT-PCR/FRET).

Descripción detallada de la invención Modalidades ilustrativas de la invención se describen abajo. En el interés de claridad, no todas las características de una implementación actual se describen en esta especificación. Por supuesto se apreciará que en el desarrollo de tal modalidad actual, numerosas decisiones específicas de la implementación se deben hacer para lograr las metas específicas de los desabolladores, tales como cumplimiento con restricciones relacionadas con los negocios y relacionadas con el sistema, las cuales variarán de una implementación a otra. Sin embargo, se apreciará que tal esfuerzo de desarrollo debe ser complejo y agotador, pero podría ser un emprendimiento de rutina para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica teniendo el beneficio de esta descripción.

Pestivirus Los pestivirus causan enfermedades económicamente importantes en animales alrededor del mundo. El género Pestivirus, dentro de la familia Flaviviridae, comprende tres especies de virus de RNA de sentido positivo de filamento simple: Virus de Diarrea Viral Bovina (BVDV), virus de fiebre porcina clásica (CSFV), virus de enfermedad limítrofe (BDV). Recientemente, un cuarto grupo distinto de pestivirus ha sido identificado, que está genéticamente relacionado con el BVDV, y está referido en la literatura como el Virus de Diarrea Viral Bovina Tipo 2 (BVDV-2) (véase por ejemplo, Thiel et al., 1996; y Becher et al., 1995; cada uno de los cuales se incorpora específicamente en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta). Consecuentemente, los textos contemporáneos ahora se refieren a las especies originales de BVDV como "BVDV-1" para distinguirlas entre las dos especies.

Los tipos de especies de Pestivirus son BVDV Tipo 1 (BDVD-1), cuyo genoma es de aproximadamente 12.5-kb de longitud y contiene un marco lector abierto grande (ORF) (Collett et al., 1988, específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta). Los códigos ORF para una poliproteína grande de aproximadamente 450 kDa son procesados co- y post-traduccionalmente por proteasas hospederas o virales. El extremo N-terminal de poliproteína del BVDV estándar resulta en una proteína no estructural p20 (Npro), proteína cápsida p14 (C); glicoproteínas de envoltura gp48 (E0), gp25 (E1), gp53 (E2); proteínas no estructurales p125 (NS23), p10 (NS4A), p32 (NS4B), p58 (NS5A) y p75 (NS5B) (véase, por ejemplo, Tautz et al., 1997; Xu et al., 1997; Elbers et al., 1996; y Wiskerchen et al., 1991, cada una de las cuales está específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta). El BVDV-1 existe en dos biotipos, citopático (designado "cp") o no citopático ("ncp"), los cuales difieren típicamente por la producción de un polipéptido único de 80-kDa (la proteína no estructural p80, NS3) en la variante citopática (véase, por ejemplo, Gillespie et al., 1960, específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta).

Con base en los análisis f ilogenéticos de un número de aislados del BVDV, el BVDV-1 ha sido mostrado por comprender al menos 13 subgenotipos distintos (designados BVDV-1a a BVDV-11), mientras dos subgenotipos (BVDV-2a y BVDV-2b) han sido identificados para BVDV-2 (véase, por ejemplo, Pellerin et al., 1994; Ridpath et al., 1994, y Xue et al., 2010; cada una de las cuales está específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta).

En los pasados treinta años, cerca de ciento cincuenta vacunas para el BVDV, tanto virus vivo modificado (MLV) como partículas de virus o virus atenuados inactivados han sido comercializadas para la industria vacuna siendo varios grados de éxito; los brotes del BVDV son todavía reportados en una base anual debido a la disponibilidad distribuida y uso de formulaciones comerciales de vacunas. Los procedimientos actuales para manejar la enfermedad involucran inoculación repetida anual con vacunas para vacas, y las etapas adicionales son tomadas en general en un intento por asegurar que ningún becerro nazca como portador de Pl. Varios diferentes métodos de prueba han sido desarrollados para la detección del BVDV, y/o detección de animales infectados con el BVDV, que incluyen reacción en cadena de la polimerasa-transcripción inversa (RT-PCR), ¡nmunoensayo ligado a la enzima (ELISA), técnicas estándares de aislamiento del virus, y varios ensayos inmunohistoquímicos.

Ensayos de potencia viral Uno de los obstáculos principales para obtener la licencia para una vacuna dada es a menudo el desarrollo de una prueba de potencia dada. Históricamente, las pruebas de potencia del BVDV han sido conducidas de conformidad con el Método de Ensayo Complementario para la Titulación del Virus de Diarrea Viral Bovina en Vacunas (SAM 101). Métodos tales como SAM101 utilizan antisuero neutralizante, monoespecífico para neutralizar las fracciones del BHV, Pl3 y BRSV previo a la inoculación de una linea de células susceptible. Los cultivos son observados por su Efecto Citopático (CPE), y después se usó el teñido de Anticuerpo Fluorescente (FA) directo y/o FA indirecto (IFA) para determinar si una cavidad particular (dilución) es positiva o negativa para el BVDV Tipo 1 o Tipo 2. Un titulador es entonces calculado con base en las cavidades que son determinadas por ser positivas para el CPE/FA.

Métodos convencionales tales como estos, sin embargo, no son bien adecuados para diferenciar entre los subgenotipos del BVDV, principalmente debido a que existen anticuerpos para el BVDV-1a, BVDV-1b y BVDV-2 que carecen de la especificidad requerida para discriminar exactamente tituladores individuales entre estos genotipos y subgenotipos.

Este problema puede ser superado explotando diferencias que existen en la región 5'-no traducida del genoma del pestivirus. Estas diferencias han sido usadas para segregar pestivirus en genotipos y subgenotipos (Patón, 1995; and Hofmann et al., 1994). Ridpath y Bolin (1998) reportan un método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para diferenciar BVDV-1a, BVDV-1b y BVDV-2. Los ensayos de PCR cuantitativos de transcripción inversa (RT-qPCR) han llegado a ser incrementadamente comunes en biológicos humanos, siendo usados para determinar la potencia de virus del sarampión (Schalk et al., 2004); vacunas a base de adenovirus (Wang et al., 2005), vacunas de rotavirus (Ranheim et al., 2006), y vacunas trivalentes de paperas-sarampión-rubéola (MMR) (Schalk et al., 2005). Cada una de las referencias mencionadas anteriormente está específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta.

En la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense co-pendiente Número 61/427,361, titulada "Composiciones y Métodos de la Vacuna del Virus de Diarrea Viral Bovina Tipo 1b" (presentada conjuntamente con esta, y específicamente incorporada en la presente en su totalidad por referencia expresa a esta), los presentes inventores reportaron el desarrollo de un protocolo de ensayo de base genéticamente modificado útil en la obtención de cuantificación viral directa (es decir, "potencia") de cada uno de los componentes virales individuales en una vacuna multivalente. La invención reemplaza ensayos FA/IFA convencionales (tales como aquellos descritos en el ensayo actual SAM 101) con un ensayo RT-qPCR para determinar la presencia o ausencia de especies de virus particular, tipos, o subtipos en cavidades de ensayo individuales (es decir, diluciones).

Las pruebas de potencia para los componentes individuales de una vacuna multivalente, tal como la vacuna MLV hexavalente descrita en la presente, también pueden ser elaboradas más objetivas sustituyendo análisis RT-qPCR/qPCR de cavidades individuales para observación visual de CPE. Por ejemplo, la observación de CPE en ensayos de titulación viral puede ser preferentemente subjetiva, y es a menudo considerada por ser la fuente de diferencias en los tituladores de vacuna MLV entre las instalaciones de pruebas. Disminuyendo la objetividad del ensayo, sin embargo, la capacidad reproductiva entre los laboratorios también puede incrementar.

Las pruebas de potencia para Pl3 se pueden conducir usando un Método de Ensayo Complementario modificado para la Titulación de las Vacunas del Virus de Parainfluenza 3 (MVSAM102.01 ). Las pruebas de potencia para BRSV pueden ser conducidas usando un Método de Ensayo Complementario modificado para Titulación del Virus Sincitial Respiratorio Bovino en Vacunas (MVSAM0129.01 ). Estos ensayos son modificados sustituyendo análisis de qPCR en tiempo real de cavidades individuales para la observación visual de CPE. La titulación de la fracción del BHV se conduce usando un Método de Ensayo Complementario modificado para la Titulación del Virus de Rinotraqueítis Bovina Infecciosa en Vacunas (MVSAM0105.01 ). En este ensayo, un formato de 96 cavidades puede ser usado en lugar del formato de 6 cavidades estándar, con el fin de estandarizar los ensayos para análisis de vacunas multivalentes. De manera importante, este protocolo incluye sustituir análisis de qPCR de cavidades individuales para observación visual y conteo de placas BHV para proporcionar un ensayo más exacto y robusto.

Amplificación de Ácido Nucleico El ácido nucleico, usado como una plantilla para amplificación, se puede aislar de virus o células de acuerdo a metodologías estándar (Sambrook ef al., 1989). El ácido nucleico puede ser DNA genómico o RNA de célula completa o fraccionada. En donde se usa RNA, puede ser deseable convertir el RNA a un DNA complementario. En una modalidad, el RNA es RNA de célula completa y se usa directamente como la plantilla para amplificación.

Pares de cebadores que selectivamente hibridan a ácidos nucleicos que corresponden a los polinucleótidos específicos a virus (o para regiones de flanqueo conservadas) se ponen en contacto con el ácido nucleico aislado bajo condiciones que permiten la hibridación selectiva. El término "cebador", como se define en la presente, significa que abarca cualquier ácido nucleico que es capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un proceso dependiente de la plantilla.

Típicamente, los cebadores son oligonucleótidos de ocho o diez a cuarenta o más pares base (bp) en longitud, pero se pueden emplear secuencias más largas o más cortas en ciertas modalidades.

Los cebadores pueden ser proporcionados en forma de filamento doble o filamento sencillo, aunque se prefieren formas de filamento sencillo.

Una vez hibridado, el complejo ácido nucleíco ebador se pone en contacto con una o más enzimas que facilitan la síntesis de ácido nucleico dependiente de la plantilla. Se conducen múltiples de rondas de amplificación, también referidas como "ciclos", hasta que se produce una cantidad suficiente del producto de amplificación.

Después, se detecta el producto de amplificación. En ciertas aplicaciones, se puede realizar la detección por medios visuales. Alternativamente, la detección puede involucrar identificación directa de un producto vía quimioluminiscencia, escintigrafía radioactiva de radioetiqueta incorporada o radioetiqueta fluorescente o aún vía un sistema usando señales de impulso eléctrico o térmico.

Están disponibles un número de procesos dependientes de la plantilla para amplificar las secuencias marcadoras presentes en una muestra de plantilla proporcionada. Uno de los mejores métodos de amplificación mejor conocidos es la reacción en cadena de polimerasa (PCR), la cual se describe en detalle en la Patente Estadounidense No. 4,683,195, Patente Estadounidense No. 4,683,202 y Patente Estadounidense No. 4,800,159 (cada una es incorporada en la presente para referencia en su totalidad).

Brevemente, en PCR , se preparan dos secuencias de cebador que son complementarias a regiones o filamentos complementarios opuestos de la secuencia marcadora. Se agrega un exceso de desoxinucleósido trifosfatos a una mezcla de reacción junto con una polimerasa de DNA, por ejemplo, polimerasa Taq. Si la secuencia marcadora está presente en una muestra, los cebadores se unirán al marcador y la polimerasa provocará que los cebadores se extiendan a lo largo de la secuencia marcadora agregando nucleótidos. Elevando y disminuyendo la temperatura de la mezcla de reacción, los cebadores extendidos se disociarán del marcador para formar productos de reacción, los cebadores en exceso se unirán al marcador y a los productos de reacción y el proceso es repetido.

Se puede realizar un procedimiento de amplificación PCR™ de transcriptasa inversa para cuantificar la cantidad de mRNA amplificado. Son bien conocidos los métodos de transcripción inversa de RNA en cDNA y se describen en Sambrook et al. (1989). Métodos alternativos para transcripción inversa utilizan polimerasas de DNA dependientes de RNA, termoestables.

También se pueden usar métodos a base de ligadura de dos (o más) oligonucleótidos en la presencia de ácido nucleico que tiene la secuencia del "di-oligonucleótido" resultante, con ello se amplifica el di-oligonucleótido en la etapa de amplificación de la presente invención.

Después de cualquier amplificación, será deseable separar el producto de amplificación de la plantilla y el cebador en exceso para el propósito de determinar si ha ocurrido la amplificación específica. En una modalidad, los productos de amplificación son separados por electrofóresis en gel de agarosa, agarosa-acrilamida o poliacrilamida usando métodos estándares (véase por ejemplo, Sambrook et al., (1989), la cual es específicamente incorporada en la presente en su totalidad para referencia rápida a la misma.

Alternativamente, se pueden emplear técnicas cromatográficas para efecto de separación de productos de amplificación y/o de los dúos productos de amplificación ibridados:sonda etiquetada. Existen muchos tipos de cromatografías que se pueden usar en conexión con el análisis de los productos de amplificación de la presente invención, que incluye sin limitación, adsorción, partición, cromatografía de intercambio iónico, tamices moleculares y muchas técnicas especializadas para usarlas incluyendo cromatografía en columna, papel,, capa delgada y gas.

Los productos de amplificación pueden ser visualizados para confirmar la amplificación de las secuencias marcadoras. Un método de visualización típica involucra teñido de un gel con bromuro de etidio y visualización bajo luz UV. Alternativamente, si los productos de amplificación son integralmente etiquetados con nucleótidos radio o fluorométricamente etiquetados, los productos de amplificación pueden entonces ser expuestos a película de rayos X o visualizados bajo el espectro de estimulación apropiado, después de la separación.

En ciertas modalidades, la visualización se puede lograr indirectamente. Después de la separación de los productos de amplificación, una sonda de ácido nucleico, etiquetada es llevada a contacto con la secuencia marcadora amplificada. La sonda preferiblemente es conjugada a un cromóforo pero puede ser radioetiquetada. En una modalidad, la sonda es conjugada a una pareja de unión, tal como un anticuerpo o biotina, y los otros miembros del par de unió portan una porción detectable.

En una modalidad, la detección es por análisis de hibridación Southern ("blotting") con una sonda de detección de oligonucleótido adecuadamente etiquetado. Las técnicas involucradas en el manchado Southern son bien conocidas por aquellos de experiencia en la técnica y se pueden encontrar en muchos libros o protocolos moleculares estándar. Véase Sambrook et al., (1989). Brevemente, los productos de amplificación son separados por electrofóresis en gel. El gel es entonces puesto en contacto con una membrana, tal como nitrocelulosa, que permite la transferencia del ácido nucleico y unión no covalente. Subsecuentemente, la membrana se incuba con una sonda conjugada con cromóforo que es capaz de hibridación con un producto de amplificación objetivo. La detección es por exposición de la membrana a película de rayos X o dispositivos de detección que emiten el ión.

Un ejemplo de lo precedente se describe en la Patente Estadounidense No. 5,279,721 (específicamente incorporada en la presente en su totalidad para referencia rápida a la misma), la cual describe un aparato y método para la electrofóresis automatizada y transferencia de ácidos nucleicos. El aparato permite la electrofóresis y manchado sin manipulación externa del gel y es idealmente adecuado para llevar a cabo métodos de acuerdo con la presente invención.

Kits de amplificación de polinucleótido La presente invención también proporciona kits para amplificación de ácidos nucleicos derivados del virus, y en particular, ácidos nucleicos específicos para uno o más cepas, tipos o subtipos de BVDV, que incluyen sin limitación, BVDV-1a, BVDV-1b y BVDV-2. Estos kits típicamente comprenden dos o más componentes necesarios para amplificar uno o más ácidos nucleicos virales de una población de polinucleótidos. Por ejemplo, un contenedor dentro de un kit puede contener un primer cebador, mientras un segundo contenedor dentro del kit puede comprender un segundo cebador. Un tercer contenedor dentro del kit puede contener una o más sondas de hibridación y/o detección, y/o uno o más reactivos para etiquetación de uno o más de estas sondas de detección. Además, los kits de la invención pueden también comprender instrucciones de uso, por ejemplo, instrucciones para usar los cebadores en amplificación y/o reacciones de detección como se describen en la presente, así como también una o más molécula(s) fluorescente(s), u otros reactivos como puedan ser necesarios, incluyendo por ejemplo, pero no se limitan a, amortiguadores, enzimas, polimerasa, RNAsas y similares.

Kits para detección y cuantificación de nucleótidos virales específicos Los kits de diagnóstico representan otro aspecto de la invención. Estos kits pueden también comprender uno o más medios de contenedor distintos dentro del kit para las sondas, cebadores, etiquetas fluorescentes o amortiguadores de reacción, polimerasas, etc. El kit puede también además comprender instrucciones para usar las composiciones comprendidas dentro del kit en una o más metodologías en base a la reacción en cadena de polimerasa, que incluye, sin limitación PCR, PCRq, RT-PCR, RT-PCR/FRET y similares. También se pueden proporcionar instrucciones para el uso de los reactivos contenidos dentro del kit para la detección de una o más cepas, tipos o subtipos o un virus, tal como BVDV (que incluye, sin limitación, BVDV-1a, BVDV-1b, y BVDV-2) o uno o más patógenos virales de mamífero adicionales tal como, sin limitación, BHV-1, Pl3, BRSV y similares en una muestra sospechosa de contener uno o más de los polinucleótidos específicos al virus. En ciertas modalidades, el kits de ensayo de diagnóstico de la presente invención puede también preferiblemente comprender instrucciones para usar los artículos contenidos dentro de este kits en un ensayo PCR, PCRq, RT-PCR, RT-PCR/FRET como se describe en la presente, incluyendo, por ejemplo, PCRq en tiempo real.

Cualquiera de los kits antes mencionados pueden además ser opcionalmente incluir uno o más agente(s) de control "positivo" o "negativo" (sí es etiquetado o no etiquetado), para uso en la preparación de una curva estándar para el ensayo de detección. Los componentes de los kits pueden ser envasados en métodos convencionales, que incluye, por ejemplo, en medio acuoso, o como componentes secos, secado por congelamiento o liofilizados. Los medios de contenedor de los kits pueden generalmente incluir al menos un vial, tubos de ensayo, matraz, botella, jeringa u otro contenedor, en el cual los componentes del ensayo pueden ser colocados, y preferiblemente, de forma adecuada ser administrados en uno o más alicuota(s). En donde se proporciona un componente adicional, el kit puede también generalmente contener un segundo, tercero u otro contenedor adicional en el cual este componente puede ser colocado. El kits puede también incluir otros reactivos de diagnóstico para uso en la identificación, cuantificación, especificación y caracterización de MLVs contenido dentro de una muestra tal como una formulación de vacuna polivalente. El kits de la presente invención puede también típicamente incluir un medio para contener la sonda(s), cebador(es) y/o reactivo(s) de ensayo en confinamiento cerrado para venta comercial. Estos contenedores pueden incluir, por ejemplo, uno o más contenedores de plástico moldeados por inyección o soplado en los cuales los recipientes del reactivo deseado (por ejemplo, viales, tubos de ensayo, jeringas, etc.) son contenidos.

Definiciones ejemplares De acuerdo con la presente invención, polinucleótidos, segmentos de ácido nucleico, secuencias de ácido nucleico y similares, incluyen pero no se limitan a DNAs (que incluye, por ejemplo, y no se limita a DNAs genómico o extragenómico), genes, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs), RNAs (que incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, rRNA, mRNA y tRNA), nucleósidos y segmentos de ácido nucleico adecuados ya sea obtenidos de fuentes naturales, químicamente sintetizados, modificados o preparados o sintetizados de otra forma completa o en parte por la mano del hombre.

A menos que se define de otra forma, todos los términos técnicos o científicos usados en la presente tienen el mismo significado comúnmente entendidos por uno de experiencia ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. A pesar que se pueden usar cualquiera de los métodos y composiciones similares o equivalentes a aquellas descritas en la presente en la práctica o experimentación de la presente invención, se describen los métodos y composiciones preferidas en la presente. Para propósitos de la presente invención, se definen los siguientes términos abajo: Los términos "alrededor" y "aproximadamente" como se usan en la presente, son intercambiables, y deben en general ser entendidos por referirse a un intervalo de números alrededor de un número dado, así como también a todos los números en un rango mencionado de números (por ejemplo, "aproximadamente 5 a 15" significa "aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15" a menos que se declare de otro modo). Sin embargo, todos los rangos numéricos de la presente deben ser entendidos por incluir cada número entero completo dentro del intervalo.

Como se usa en la presente, el término "reactivos PCR" se refiere a los químicos, aparte de la secuencia de ácido nucleico objetivo, necesarios para realizar el ensayo de reacción en cadena de polimerasa. Estos químicos generalmente incluyen cinco categorías de componentes: (a) un amortiguador acuoso, (b) una sal de magnesio soluble en agua; (c) desoxirribonucleótido trifosfatos (dNTPs); (d) pares de cebadores de oligonucleótido delantero o inverso; y (e) una polimerasa de DNA termoestable (es decir, polimerasa de DNA que puede tolerar temperaturas entre aproximadamente 80 y aproximadamente 100°C por al .menos aproximadamente 10 minutos sin perder más de aproximadamente la mitad de su actividad enzimática. Los cuatro dNTPs convencionales son tímida trifosfato (dTTP), desoxiadenosina trifosfato (dATP), desoxicitidina trifosfato (dCTP) y desoxiguanosina trifosfato (dGTP), a pesar que pueden ser suplementados o reemplazados en la reacción PCR por uno o más dNTP que contiene análogos base que pares base en la forma Watson-Crick en una manera similar a uno de las bases convencionales (por ejemplo, desoxiuridina trifosfato [dUTP] y similares).

El término "oligonucleótido" como se usa en la presente incluye oligómeros lineales de monómeros o uniones naturales o modificados, que incluyen desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y similares, que son capaces de específicamente unirse a un ácido nucleico objetivo vía un patrón ordenado de interacciones monómero a monómero (por ejemplo, vía apareado base Watson-Crick o similares). Los monómeros están típicamente unidos vía uniones de fosfodiéster (o equivalente) para formar oligonucleotidos que varía en tamaño de unas pocas unidades monoméricas a varias decenas de unidades monoméricas. A través de la descripción, en cualquier momento un oligonucleótido es representado por una secuencia de letras (por ejemplo, "TTACGCAG"), se entenderá que los nucleótidos están representados en orden 5'->3', leídos de izquierda a derecha. En estas representaciones, "A" se entiende por adenosina (o en el caso de DNA, desoxiadenosina), mientras "C", "G", "T", y "U", denota citidina/desoxicitidina, guanosina/desoxiguanosina, desoxitimidina y uridina, respectivamente. Análogos de uniones de fosfodiéster incluyen, sin limitación, fosforotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares.

Los términos "sustancialmente corresponde a", "sustancialmente homólogo" o "sustancialmente idéntico" como se usan en la presente denotan una característica de un ácido nucleico o una secuencia de aminoácido, en donde una secuencia de ácido nucleico o aminoácido seleccionada tiene al menos aproximadamente 70 o aproximadamente 75 por ciento de identidad de secuencia comparada a una secuencia de ácido nucleico o aminoácido de referencia seleccionada. Más típicamente, la secuencia seleccionada y la secuencia de referencia pueden tener al menos aproximadamente 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 o aún 85 por ciento de identidad de secuencia, y más preferiblemente, al menos aproximadamente 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 o 95 por ciento de identidad de secuencia. Más preferiblemente todavía, las secuencias sumamente homologas a menudo comparten al menos aproximadamente 96, 97, 98 0 99 por ciento de identidad de secuencia entre la secuencia seleccionada y la secuencia de referencia a la cual se comparan.

El porcentaje de identidad de secuencia se puede calcular sobre la longitud completa de las secuencias a ser comparadas, o se puede calcular excluyendo supresiones o adiciones pequeñas que suman menos de aproximadamente 25 por ciento o tanto como la secuencia de referencia elegida. La secuencia de referencia puede ser una subserie de una secuencia grande, tal como una porción de un gen o secuencia de flanqueo, o una porción representativa de un cromosoma. Sin embargo, en el caso de homología de secuencia de dos o más secuencias de oligo o polinucleotido, la secuencia de referencia puede típicamente comprender al menos aproximadamente 10-15 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 16 a 25 nucleótidos, y aún más típicamente al menos aproximadamente 26-35 nucleótidos, al menos aproximadamente 40 nucleótidos, al menos aproximadamente 45 nucleótidos, al menos aproximadamente 50 nucleótidos o al menos aproximadamente 60, 70, 80, 90 o aún al menos aproximadamente 100 o más nucleótidos.

Preferiblemente, cuando se desean los fragmento sumamente homólogos, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias (a menudo referidas como secuencias "objetivo" y "sonda") será al menos aproximadamente 80% idénticas, preferiblemente al menos aproximadamente 85% idénticas, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90% idénticas, al menos aproximadamente 92% idénticas, al menos aproximadamente 93% idénticas, al menos aproximadamente 94% idénticas o aún al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más. El porcentaje de homología o porcentaje de identidad entre 2 o más secuencias de oligo o polinucleotido pueden fácilmente ser determinadas por un experto en la técnica, usando uno o más de los algoritmos de comparación de secuencia estándar, tal como, por ejemplo el programa de análisis FASTA descrito por Pearson and Lipman (1988).

El término "que se originan naturalmente" como se usan en la presente aplicado a un objeto referido al hecho que un objeto se puede encontrar en lá naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que se puede aislar de una fuente natural, y la cual no ha sido modificada intencionalmente por la mano del hombre, es una secuencia "que se origina naturalmente".

El término "sustancialmente complementario" cuando se usan para definir ya sea secuencias de aminoácido como de ácido nucleico, significa que una secuencia objetivo particular, por ejemplo, una secuencia de oligonucleótido, es sustancialmente complementaria a toda o una porción de la secuencia seleccionada, y así puede específicamente unir una porción de un mRNA que codifica la secuencia seleccionada. Como tal, típicamente las secuencias pueden ser sumamente complementarias a la secuencia "objetivo" mRNA, y puede tener no más que aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 desapareamientos base a través de la porción complementaria de la secuencia.

Las secuencias de oligonucleótido sustancialmente complementaria puede ser mayor de aproximadamente 80 por ciento complementaria, mayor de aproximadamente 85 por ciento complementaria, mayor de aproximadamente 90 porciento complementaria, o aún mayor de aproximadamente 95 porciento complementaria (o "% apareamiento exacto") a la secuencia de ácido nucleico objetivo correspondiente a la cual el oligonucleótido específicamente se une, y, más preferiblemente será mayor de aproximadamente 96% o superior complementaria a la secuencia de ácido nucleico correspondiente a la cual el oligonucleótido específicamente se une.

En ciertos aspectos, como se describe anteriormente, será deseable tener aún secuencias de oligonucleótido más sustancialmente complementarias para uso en la práctica de la invención, y en tales casos, las secuencias de oligonucleótido serán mayor de aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99%, o aún 100% complementarias a todas o a una porción de la secuencia de ácido nucleico objetivo a la cual la sonda o cebador de oligonucleótido diseñado específicamente se une.

El porcentaje de similitud o porcentaje complementario de cualquiera de las secuencias puede ser determinado, por ejemplo, comparando la información de secuencia usando el programa de computadora GAP, versión 6.0, disponible de la University of Wisconsín Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineamiento de Needleman y Wunsch. Brevemente, el programa define similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, divididos por el número total de símbolos en la más corta de las secuencias. Los parámetros de defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación uñaría (que contiene un valor de 1 para identidades de 0 y para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov et al., (2) una penalización de 3.0 para cada hueco y una penalización 0.10 adicional para cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalización para huecos finales.

En muchos casos, puede ser deseable para las secuencias ser apareadas exactas, es decir, ser completamente complementarias a la secuencia a la cual el oligonucleótido específicamente se une, y por lo tanto tener cero desapareamientos a lo largo del estiramiento complementario. Como tal, las secuencias de sonda o cebador típicamente se unirán casi específicamente a la región de secuencia objetivo de la pluralidad de polinucleótidos y por lo tanto serán altamente eficientes dirigiendo la amplificación de la secuencia objetivo vía PCR, qPCR, RT-qPCR, o RT-qPCR/FRET, etc.

"Mezcla de reacción de amplificación" se refiere a una solución acuosa que comprende uno o más varios reactivos necesarios para amplificar una o más secuencia(s) de ácido nucleico objetivo seleccionadas. Tales mezclas incluyen, sin limitación, una o más enzimas, uno o más amortiguadores acuosos, una o más sales, uno o más ácido(s) nucleico objetivo, y una pluralidad de nucleósidos trifosfatos convencionales. Dependiendo del contexto, la mezcla puede ser ya sea una mezcla de reacción de amplificación completa o incompleta.

"Reacción de amplificación" se refiere a cualquier método in vitro para multiplicar una secuencia de ácido nucleico objetivo para producir una población de tales secuencias. Los métodos de amplificación convencionales incluyen, pero no se limitan a PCR, ligasa de DNA, replicasa de ?ß, sistemas de amplificación a base de transcripción de RNA, y similares.

Como se usa en la presente, el término "reactivos de amplificación" se refiere a los varios amortiguadores, enzimas, cebadores, nucleósidos trifosfatos (tanto convencionales como no convencionales), y sondas usadas para realizar la reacción de amplificación seleccionada.

Como se usa en la presente, "amplificar" o "amplificación" típicamente se refiere a un incremento exponencial en el ácido nucleico objetivo que está siendo usado en la presente para describir tanto incrementos lineales como exponenciales en los números de una secuencia objetivo seleccionada de un ácido nucleico.

"Une(n) sustancialmente" se refiere a hibridación complementaria entre oligonucleótidos y abarca desapareamientos menores los cuales pueden ser acomodados reduciendo la rigurosidad del medio de hibridación para lograr la cebación deseada de las polimerasas de PCR.

Como se usa en la presente, "biotinilado" se refiere a una porción de biotina covalentemente unida al extremo 5' de un oligonucleótido con el propósito de reaccionar con estreptavidina en un ensayo de detección.

En el contexto de ácidos nucleicos, los términos "une, "que se une", y "unido" se refieren a la hibridación de dos o más secuencias de ácido nucleico a través del apareamiento de base complementaria de Watson-Crick.

Como se usa en la presente, "ácido nucleico" se refiere a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma ya sea de filamento simple o doble y a menos que se limite de otro modo podría abarcar análogos de nucleótidos naturales conocidos los cuales pueden funcionar en una manera similar como los nucleótidos que se originan naturalmente.

Una "polimerasa de nucleótido" es una enzima capaz de catalizar la síntesis de DNA o RNA a partir de una población de precursores de nucleósidos trisfosfatos. En las reacciones de amplificación de esta invención las polimerasas son dependientes de la plantilla y típicamente extendidas desde el extremo 21 del polímero a ser formado. En aplicaciones preferidas, la polimerasa empleada es una polimerasa termoestable.

Como se usa. en la presente, "cebador" o "cebador(es) de oligonucleótido" se refiere a un oligonucleótido, ya sea natural o sintético, capaz de actuar como un punto de inicio de síntesis de DNA bajo condiciones en las cuales la síntesis de un producto de extensión de cebador complementario a un filamento de ácido nucleico es iniciado (es decir, en la presencia de cuatro diferentes trifosfatos de nucleótido, y un agente para polimerización, tal como una polimerasa de DNA o transcriptasa inversa) en un amortiguador apropiado y a una temperatura adecuada. En el contexto de la invención, un cebador es preferiblemente- un oligodesoxirribonucleótido, y preferiblemente de filmaneto simple para máxima eficacia en la amplificación. Como se conoce por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, tales cebadores no necesitan reflejar la secuencia exacta de la plantilla objetivo, sino deben ser suficientemente complementarios a la secuencia, sin embargo, para permitir la hibridación (es decir, unión) a la plantilla bajo condiciones de reacción adecuadas.

Como se usa en la presente, a "vacuna viva modificada" es una vacuna que comprende un virus que ha sido alterado, típicamente pasando en células del cultivo de tejido, para atenuar su capacidad para causar la enfermedad, pero el cual retiene su capacidad para proteger contra la enfermedad o infección cuando se administra subsecuentemente a un animal.

El término "patógeno" se define en la presente como cualquier clase de agente infeccioso, que incluye por ejemplo, virus, priones, protozoarios, parásitos, así como también microbios tales como bacterias, levaduras, mohos, hongos, y similares.

Como se usa en la presente, el término "individual" (también intercambiablemente referido como "hospedero", "sujeto", "recipiente, "paciente", etc.) se refiere a cualquier animal que puede recibir una o más de las composiciones farmacéuticas o formulaciones de vacunas como se describe en la presente. Preferiblemente, el sujeto es un animal vertebrado, el cual está propuesto para denotar cualquier especie animal (y preferiblemente, especies de mamíferos). En ciertas modalidades, el individuo es preferiblemente cualquier hospedero mamífero, que incluye pero no se limita a, primates no humanos, bovinos, caninos, caprinos, cavinos, córvidos, epinos, equinos, felinos, hircinos, lapinos, leporinos, lupinos, ovinos, porcinos, racinos, vulpinos, y similares, que incluyen ganado, especímenes zoológicos, exóticos, así como también animales de compañía, mascotas, y cualquier animal bajo el cuidado de un practicante veterinario.

Como se usa en la presente, el término "vacuna" se refiere a una composición o formulación que contiene una composición inmunogénica de la presente invención en una forma que es capaz de ser administrada a un vertebrado, y preferiblemente a un animal tal como un mamífero. Típicamente, las vacunas de la presente invención incluirán una o más de las composiciones inmunogénicas (que incluyen uno o más partículas de virus vivo, modificado, o pluralidades de las mismas) descritas en la presente, formuladas para administración a un animal en necesidad del mismo. Tales composiciones pueden ser de cualquier formulación adecuada, que incluye, sin limitación, aquellas preparadas en un vehículo acuoso, así como también aquellas en forma congelada, secada por congelamiento, liof ¡tizada o deshidratada que son entonces subsecuentemente rehidratadas o suspendidas en un vehículo farmacéuticamente aceptable convencional {por ejemplo, salina estéril o una solución acuosa amortiguada similar) previo a la administración. En tales formas, las composiciones de vacuna de la presente invención pueden ser manufacturadas en alícuotas de dosis únicas o múltiples convenientes que pueden ser fácilmente empleadas en uno o más de los métodos o regímenes de vacunación descritos en la presente para prevenir, manejar o de otro modo tratar una o más condiciones o uno o más síntomas de infección viral y/o microbiana en un animal susceptible.

El término "por ejemplo," como se usa en la presente, se usa solamente por medio del ejemplo, sin cualquier limitación propuesta; como tal, no debe ser construido como referente solamente a aquellos puntos explícitamente enumerados en la especificación.

Una "secuencia objetivo" o "secuencia de nucleótido objetivo" como se usa en la presente incluye cualquier secuencia de nucleótido en la cual una de tales secuencias cebadoras híbrida bajo condiciones que permiten a una enzima que tiene actividad de polimerasa alargar la secuencia cebadora, y de este modo replicar el filamento complementario.

Una molécula de ácido nucleico (típicamente comprendida de DNA) capaz de replicacion en una célula hospedera y/o en la cual otro segmento de ácido nucleico puede ser operativamente ligado para así llevar aproximadamente la replicacion del segmento unido. Un plásmido, cósmido o un virus es un vector ejemplar.

Un "cebador" o "secuencia cebadora" puede incluir cualquier secuencia de ácido nucleico o segmento que selectivamente híbrida a un filamento de ácido nucleico de plantilla complementaria ("secuencia objetivo") y funciona como un punto de inicio para la adición de nucleótidos para replicar el filamento de la plantilla. Las secuencias cebadoras de la presente invención pueden ser etiquetadas o contener otras modificaciones las cuales permiten la detección y/o análisis de productos de amplificación. Además de servir como iniciadores para duplicación mediada por la polimerasa de secuencias de DNA objetivo, las secuencias cebadoras pueden también ser usadas para la transcripción inversa de RNAs de plantillas en DNAs correspondientes.

Como se usa en la presente, "par de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia" o "par FRET" se refiere a un par de fluoróforos que comprenden un fluoróforo donador y un fluoróforo aceptor, en donde el fluoróforo donador es capaz de transferir energía de resonancia al fluoróforo aceptor. En pares de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia preferidos, el espectro de absorción del fluoróforo donador no traslapa sustancialmente el espectro de absorción del fluoróforo aceptor. Como se usa en la presente, "una sonda de oíigonucleótido donador" se refiere a un oíigonucleótido que es etiquetado con un fluoróforo donador de un par FRET. Como se usa en la presente, "una sonda de oíigonucleótido aceptor" se refiere a un oíigonucleótido que es etiquetado con un fluoróforo aceptor de un par FRET. Como se usa en la presente, un "par de oíigonucleótido FRET" típicamente comprenderá una sonda de oíigonucleótido "anclaje" o "donadora" y una sonda de oíigonucleótido "aceptora" o "sensora", y tal par forma una relación FRET cuando la sonda de oíigonucleótido donador y la sonda de oíigonucleótido aceptor son ambas hibridadas a sus secuencias de ácido nucleico objetivo complementarias. Los pares de fluoróforo aceptables para uso como pares FRET son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína/rodamina, ficoeritrina/Cy7, fluoresceína/Cy5, fluoresceína/Cy5.5, fluoresceína/LC Red 640, y fluoresceína/LC Red 705.

De conformidad con la convención de leyes de patente desde hace mucho tiempo, las palabras "un" y "uno" cuando se usan en esta solicitud, que incluyen las reivindicaciones, denotan "uno o más".

Ejemplos El ejemplo siguiente está incluido para demostrar modalidades ilustrativas de la invención. Se debe apreciar por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica que las técnicas descritas en el ejemplo que sigue representa técnicas descubiertas para funcionar bien en la práctica de la invención, y de este modo pueden ser consideradas por constituir los modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos de habilidad ordinaria en la técnica deben, en vista de la presente descripción, apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas las cuales son descritas y todavía obtienen un resultado similar o igual sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Protocolo de ensayo de potencia para componentes de vacunas multifactoriales El presente ejemplo demuestra el uso de un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativo (en tiempo real) (qPCR) para determinar exitosamente la potencia de componentes virales individuales de una vacuna del virus vivo, modificado (MLV) multivalente.

En la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense co-pendiente de los inventores No. 61/427,361, los presentes inventores han desarrollado una vacuna del virus vivo (MLV) modificado de seis formas (es decir, hexavalente), efectiva contra el BRDC y fiebre del embarque. El presente ejemplo describe ensayos útiles en la cuantificación de los componentes virales individuales de tal vacuna. Los inventores muestran que el ensayo es particularmente ventajoso sobre metodologías existentes en la determinación de las potencias individuales de cepas genéticamente relacionadas en una vacuna multivalente (es decir, · polivalente o multicomponente). Usando la vacuna BRDC MLV hexavalente como un modelo, los inventores han demostrado que el ensayo es efectivo en diferenciar entre y cuantificar las potencias de componentes de vacunas individuales, aún cuando la vacuna contiene tres subgenotipos de un tipo de virus único. Tales ensayos ofrecen nuevos y más confiables métodos para cuantificar exactamente la presencia de BVDV-1a, BVDV-1b, y BVDV-2 en formulaciones de vacunas polivalentes.

Materiales y métodos Cultivo celular Todos los cultivos se prepararon usando técnicas convencionales y suministradas como se describe por Freshney (1987). La Línea de Células de Riñon Bovino TVL, la cual presenta una morfología similar epitelial típica en cultivo, se usó para todos los ensayos de cultivo.

El cultivo de Siembra Principal BVDV-1b (designados "TVL-BVDVIb MS 04/27/2007 DW3-095," en la solicitud de patente provisional Estadounidense copendiente del Solicitante no. 61/427,361, presentada actualmente junto con esta, ha sido depositada bajo condiciones que aseguran que el acceso a los cultivos será disponible durante la dependencia de esta solicitud de patente a una determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas para ser titulada a esta bajo el 37 C.F.R. § 1.14 y 35 U.S.C. § 122. El depósito está disponible como se requiere por las leyes de patente extranjeras en países en donde son presentadas las contrapartes de la presente solicitud, o su progenie. Sin embargo, se debe entender que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la presente invención en la derogación de los derechos de patente otorgados por la acción gubernamental. El presente depósito de cultivo será almacenado y hecho disponible para el público de conformidad con las provisiones del Tratado de Budapest para el Depósito de Microorganismos, es decir, será almacenado con todo el cuidado necesario para mantenerlo disponible y descontaminado por un periodo de al menos cinco años después de la petición más reciente para el acabado de una muestra del depósito, y en cualquier caso, por un periodo de al menos 30 (treinta) años después de la fecha del depósito o por la vida ejecutable de cualquier patente la cual puede emitir la divulgación del cultivo depositado. El depositante reconoce el derecho a sustituir el depósito y el depositario debe ser incapaz de terminar una muestra cuando la solicite, debido a la condición del depósito. Todas las restricciones en la disponibilidad al público del presente depósito de cultivo serán irrevocablemente removidas del otorgamiento de una patente que la describe. Un depósito del virus TVL BVDVIb MS 04/27/2007 DW3-095 se ingresó en la colección permanente del Depositario de Patentes del Laboratorio de Cultivo de Tipo Americano, localizado en 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110-2209, USA, el 21 de Diciembre de 2010 bajo los términos del Tratado de Budapest, después de lo cual se asignó un número de acceso de ATCC PTA-11553 por el repositorio.

Especificidad de series de cebador/sonda El RNA es extraído de fluidos virales de cada uno de las siguientes siembras virales aprobadas por el Departamento de Agricultura Estadounidense (USDA): BVDV-1a (cepa Singer), BVDV-1b (cepa TGAC), BVDV-2 (125), Pl3 (Reisinger SF-4), y BRSV (N375) (no se realizó proceso de extracción en BHV-1 [cepa Cooper] puesto que es un virus de DNA). Las extracciones son realizadas usando RNAqueous®-4PCR (Ambion; Austin, TX, USA).

Cada una de las muestras virales de . RNA se usó como plantilla (muestra) en reacciones de RT-qPCR separadas para cada una de las seis series de cebador/sonda usando química de RT-PCR de una etapa TaqMan®. El virus de DNA (BHV-1) también se usó como una plantilla (muestra) en reacciones de qPCR separadas con cada una de las seis series de cebador/sonda descritas anteriormente. Los análisis de la serie de sonda/cebador de BRSV contra todas las seis fracciones virales de la vacuna hexavalente indican que no existe reactividad cruzada para cada una de las series de sonda/cebador con cualquiera de las otras fracciones virales.

Ensayos de qpcr Se condujeron ensayos de qPCR usando un Sistema de PCR en Tiempo-Real de Applied Biosystems 7500.

Cebadores de oligonucleótido y sondas moleculares etiquetadas Se fabricaron los siguientes pares de cebadores inverso y delantero específicos del virus y sondas habituales de TaqMan® por Applied Biosystems (Foster City, CA, USA).

BVDV-1b (primero): Cebador delantero: 5'-CACCCTATCAGGCTGTATTCATAGC-3' ,(SEC ID NO: 1 ); Cebador inverso: 5'-TGCCCACAGCACATCTTAACC-3' (SEC ID NO:2); y Sonda de detección del BVDV-1b: 5'-TCACCTGGACGACCC-3' (SEC ID NO:3).

BVDV-1b (segundo): Segundo Cebador delantero: 5'- GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (SEC ID NO:19); Segundo Cebador inverso: 5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (SEC ID NO:20)¡ y Segunda Sonda de detección del BVDV-1b: 5'-GTCGTCCAGGTGAAAACGGT-3' (SEC ID NO:21).

Mientras BVDV-1b (primero) proporciona resultados aceptables, BVDV-1b (segundo) presenta mejores resultados.

BRSV: Cebador delantero: 5'-GCAATGCTGCAGGACTAGGTATAAT-3' (SEC ID NO:4); Cebador inverso: 5'-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCT-3' (SEC ID NO:5); y Sonda de detección del BRSV: 5'-AAGACTTGTATGATGCTGCCAA-3' (SEC ID NO:6).

BVDV-1a: Cebador delantero: 5'-GGTCGCCCAGGTAAAAGCA-3' (SEC ID NO:7); Cebador inverso: 5'-GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3' (SEC ID NO:8); y Sonda de detección del BVDV-1a: 5'-AACCGACTGTTACGAATAC-3' (SEC ID NO:9).

BVDV-2: Cebador delantero: 5'-GCTAGCCATGCCCTTAGTAGGAC-3' (SEC ID NO:10); Cebador inverso: 5'-GACGAGTCCCCTGTACTCAGG-3' (SEC ID NO:11); y Sonda de detección del BVDV-2: 5'-CAGTGAGTCCATTGGATGG-3' (SEC ID NO:12).

Pl3: Cebador delantero: 5'-GGAGACCAAGACCAAGGAGATG-3' (SEC ID NO:13); Cebador inverso: 5'-CGTCTGCCCATGCATAAGG-3' (SEC ID NO:14); y Sonda de detección del Pl3: 5'-ACCTCGGTCATCCATAG-3' (SEC ID NO:15).

BHV-1: Cebador delantero: 5'-CCATGTTAGCGCTCTGGAACC-3' (SEC ID NO:16); Cebador inverso: 5'CGTCTTTACGGTCGACGACTCC-3' (SEC ID NO:17); y Sonda de detección del BHV-1: 5'-ACGGACGTGCGCGAA-3' (SEC ID NO:18).

Ensayo de potencia para vacunas monovalentes Los protocolos para cada uno de los siguientes ensayos utilizan metodología de Ciclo de Umbral Comparativo (CT) de Biosystems 7500 para determinar si una cavidad individual de una placa de titulación contiene una mayor cantidad de virus que la cavidad de referencia equivalente. La mayoría de las muestras virales contiene algunas partículas virales no viables que podrían ser detectadas por el ensayo de PCR, de este modo dando resultados potencialmente falso-positivos. Este problema es resuelto por el uso de una placa de referencia sin células. La muestra es diluida en la placa de referencia exactamente como tal en la placa de ensayo pero sin células como para eliminar la posibilidad para replicación viral. La placa de referencia se usa para generar como valor de referencia o valor antecedente de CT para cada una de las cavidades en cada ensayo. Si una cavidad en la placa de ensayo tiene un valor CT superior que la cavidad antecedente correspondiente, la replicación viral ha ocurrido y la cavidad es considerada positiva. Si no se determina el valor de CT para una cavidad, o el valor CT es equivalente al valor CT antecedente, entonces la cavidad es considerada negativa.

Ensayo de potencia para vacunas multivalentes Una serie piloto de vacuna hexavalente IBR/BVDV-1 a, -1b, -2/PI3/RSV, virus vivo modificado, se preparó como se describe en la presente. Brevemente, BHV-1 (cepa Cooper), BVDV-1a (cepa Singer), BVDV-1b (cepa TGAC), BVDV-2 (125), Pl3 (Reisinger SF-4), y BRSV (N375) se propagaron en la linea de células TVL-BK (20avo paso). Las fracciones individuales se recolectaron en el 10mo pasaje y combinaron en conjunto en el producto de seis formas. Una prueba de potencia para cada fracción de la vacuna de 6 formas puede ser conducida como se describe en la presente con la adición de antisueros neutralizantes apropiados. El TCID50 de cada fracción viral se determina con base en los resultados CPE/FA/IFA y compara con aquellos con base en el RT-qPCR/qPCR.

Pruebas de potencia BVDV-1A, BVDV-1 B Y BVDV-2 Muestras BVDV-1a, BVDV-1b y BVDV-2 monovalentes pueden ser tituladas separadamente de conformidad con el Método de Ensayo Complementario para la Titulación del Virus de Diarrea Viral Bovina en Vacuna (SAM 101). Brevemente, el ensayo se conduce- por duplicado con una de las placas siendo usada para el cálculo de titulación con base en el CPE y/o FA/IFA como se describe. La otra placa se usa para determinar un titulador con base en el RT-qPCR. Una placa de referencia deficiente de la célula se incluye como se describe anteriormente para cada uno de los virus.

Prueba de potencia Pl3 Las pruebas de potencia para Pl3 se condujeron por duplicado con una de las placas siendo usada para cálculos de titulación con base en el CPE. La otra placa se usó para determinar un titulador con base en los valores comparativos de CT de Pl3 como se determina por RT-qPCR. Una placa de referencia deficiente de células se incluyó como se describe anteriormente.

Prueba de potencia del BRSV La prueba de potencia para el BRSV se condujo por duplicado con una de las placas siendo usada para el cálculo de titulador con base en CPE como se describe anteriormente, con la placa restante siendo usada para determinar un titulador con base en los valores CT comparativos de BRSV como se determina por RT-qPCR. Como se discute anteriormente, una placa de referencia deficiente de células también se incluye en el ensayo.

Ensayos de potencia del BHV Las pruebas de potencia para BHV se conducen en un formato de 96 cavidades, sustituyendo análisis de qPCR de cavidades individuales para observación visual convencional y conteo de placas. El ensayo se realizó por duplicado, con una de las placas siendo usada para cálculos de titulación con base en la presencia o ausencia de CPE en una cavidad individual (dilución), mientras la placa restante se usa para calcular un titulador con base en los valores CT comparativos de BHV como se determina por QPCR. Una placa de referencia deficiente de célula se incluye como se describe anteriormente.

Resultados de prueba Los resultados de las pruebas anteriores se proporcionan abajo.

Tabla 1: Muestras de los virus conocidos de cada uno de los seis virus bajo investigación se corrieron contra una serie de sonda-cebador del BVD 1a por RT-PCR (1A pp). La serie de sonda-cebador del BVD 1a no tiene reactividad cruzada con cualquiera de los otros virus bajo investigación. (nd= sin dilución, pp= serie de sonda-cebador) Tabla 2: Dilución log de BVD 1a (1A) con TCID50 conocido con sus registros correspondientes CT de reacción con una serie de sonda-cebador del BVD 1a por RT-PCR y los valores extrapolados TCID50 para cada dilución. (nd= sin dilución, pp= serie de sonda-cebador) Tabla 3: Muestras de los virus conocidos de cada uno de los seis virus bajo investigación se corrieron contra una serie de sonda-cebador del BRSV por RT-PCR (pp). La serie de sonda-cebador del BRSV no tiene reactividad cruzada con cualquiera de los otros virus bajo investigación. (nd= sin dilución, pp= serie de sonda-cebador) Tabla 4: Dilución log de BRSV con TCID50 conocido con sus registros correspondientes CT de reacción con una serie de sonda-cebador del BRSV por RT-PCR y los valores extrapolados TCID50 para cada dilución. (nd= sin dilución, pp= serie de sonda-cebador) Tabla 5: Muestras de los virus conocidos de cada uno de los seis virus bajo investigación se corrieron contra una serie de sonda-cebador del BVD 1b por RT-PCR (1B pp). La serie de sonda-cebador del BVD 1b no tiene reactividad cruzada con cualquiera de los otros virus bajo investigación. (nd= sin dilución, pp= serie de sonda-cebador, += positive control) Tabla 6: Dilución log de BVD 1b (1B) con TCID50 conocido con sus registros correspondientes CT de reacción con una serie de sonda-cebador del BVD 1b por RT-PCR y los valores extrapolados TCID50 para cada dilución. (nd= sin dilución, pp= serie de sonda-cebador) Tabla 7: Muestras de los virus conocidos de cada uno de los seis virus bajo investigación se corrieron contra una serie de sonda-cebador de PI3 por RT-PCR. La serie de sonda-cebador de PI3 no tiene reactividad cruzada con cualquiera de los otros virus bajo investigación. (nd= sin dilución, pp= serie de sonda-cebador) Tabla 8: Dilución log de PI3 con TCID50 conocido con sus registros correspondientes CT de reacción con una serie de sonda-cebador de PI3 por RT-PCR y los valores extrapolados TCID50 para cada dilución. (nd= sin dilución, pp= serie de sonda-cebador) Tabla 9: Muestras de los virus conocidos de cada uno de los seis virus bajo investigación se corrieron contra una serie de sonda-cebador del BHV por RT-PCR. La serie de sonda-cebador del BHV no tiene reactividad cruzada con cualquiera de los otros virus bajo investigación. (nd= sin dilución, pp= serie de sonda-cebador) Tabla 10: Dilución log de BHV con TCID50 conocido con sus registros correspondientes CT de reacción con una serie de sonda-cebador del BHV por RT-PCR y los valores extrapolados TCID50 para cada dilución. (nd= sin dilución, pp= serie de sonda-cebador) Referencias Las siguientes referencias, en la extensión en que son procedimientos ejemplares proporcionados u otros detalles complementarios a aquellos expuestos en la presente, están específicamente incorporadas en la presente en su totalidad por referencia expresa a estos: Patente Estadounidense No.4,415,732 por Caruthers eí al.

Patente Estadounidense No. 4,458,066 por Caruthers eí al.

Patente Estadounidense No. 4,683,195 por Mullís eí al.

Patente Estadounidense No. 4,683,202 por Mullís eí al.

Patente Estadounidense No. 4,725,677 por Koster et al.

Patente Estadounidense No. 4,973,679 por Caruthers eí al.

Patente Estadounidense No. 4,980,460 por Molko eí al.

Patente Estadounidense No. 5,614,388 por Picone eí al.

Agrawal eí al., Nucí. Acids Res., 18:5419-5423, 1990 Baker, J.C., "The clinical manifestations of bovine viral diarrhea infection," Vet. Clin. N. Am. Food Anim. Pract., 11:425-445, 1995.

Baker, J.C., Werdin, R.E., Ames, T.R., Markham, R.J., y Larson, V.L., "Study on the etiologic role of bovine respiratory syncytial virus in pneumonía of dairy calves," J. Am. Vet. Meó. Assoc, 189(1 ):66-70, 1986.

Barber, D.M., Nettleton, P.F., y Herring, J.A., "Disease in a dairy herd associated with the introduction and spread of bovine diarrhoea virus," Vet. Rec, 117(18):459-464, 1985.

Beaucage e lyer, Tetrahedron, 48:2223-2311, 1992.

Becher, P., Konig, M., Patón, D.J., y Thiel, H.J., "Further characterization of border disease virus isolates: evidence for the presence of more than three species within the genus pestivirus," Virology, 209(1 ):200-206, 1995.

Collett, M.S., R. Larson, S.K. Belzer, y E. Retzel, "Proteins encoded by bovine viral diarrhea virus: the gehomic organization of a pestivirus," Virology, 165(1):200-208, 1988.

Elbers, K., N. Tautz, P. Becher, D. Stoll, T. Rumenapf, y H.J. Thiel, "Processing in the pestivirus E2-NS2 región: ¡dentification of proteins p7 and E2p7," J. Virol., 70(6):4131 -4135, 1996.

Fergen, B.J., "Estimating an Intervention Effect on Outcome Severity," USDA Center for Veterinary Biologics, Ames, IA, USA; Personal communication, 2004.

Finney, D.J., "Statistical method in biological assay," 3a Ed., Charles Griffin and Company Ltd., London, 1978.

Flores, E.F., Ridpath, J.F., Weiblen, R. et al., "Phylogenetic analysis of Brazilian bovine viral diarrhea virus type 2 (BVDB-2) isolates: evidence of subgenotype within BVDV-2," Virus Res., 87:51-60, 2002.

Freshney, R.I., "Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique," Segunda Edición, Dept of Medical Oncology, University of Glasgow, Alan R. Liss, Inc., Publisher, New York, NY, USA, 1987.

Fulton, R.W., Hessmand, B, Johnson, B.J. et al. "Evaluation of diagnostic test used for detection of bovine viral diarrhea virus and prevalence of subtypes 1a, 1b and 2a in persistently infected cattle entering a feedlot," J. Am. Vet. Med. Assoc, 228(4):578-584, 2006.

Gillespie, J.H., J.A. Baker, y K. McEntee, "A cytopathogenic strain of virus diarrhea virus," Cornell Vet., 50:73-79, 1960.

Hofmann, M.A., Brechtbuhl, K., y Stauber, N., "Rapid characterization of new pestivirus strains by direct sequencing of PCR-amplified cDNA from the 5' non-coding región," Arch. Virol., 139:217-229, 1994.

Holland et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:7276-7280, 1991.

Liess, B., H.R. Frey, H. Kittsteiner, F. Baumann, y W. Neumann, "Bovine mucosal disease, an immunobiological explainable late stage of BVD-MD virus infection with criteria of a 'slow virus infection,"' Dtsch. Tieraerzti. Wschr., 81(2):481-487, 1974.

Malmquist, W.A., "Bovine viral diarrhea mucosal disease: etiology, pathogenesis, and applied immunity," J. Am. Vet. Meó. Assoc, 152:763-768, 1968.

McNulty M.S., Alian G.M., "Application of immunofluorescence in veterinary viral diagnosis," In: Recent advances in virus diagnosis, McNulty MS, McFerran JB (Eds.), pp. 15-26. Martinus Nijhoff, The Hague, Netherlands, 1984.

Olafson, P., A.D., MacCallum, y F.H. Fox, "An apparently new transmissible disease of cattle," Cornell Vet., 36:205-213, 1946.

Ozaki et al., Nucí. Acids Res., 20:5205-5214, 1992.

Patón, D.J., "Pestivirus diversity," J. Comp. Pathol., 112(3):215-236, 1995.

Pellerin, C, J. van den Hurk, J. Lecomte, y P. Tussen, "Identification of a new group of bovine viral diarrhea virus strains associated with severe outbreaks and high mortalities," Virology, 203(2):260-268, 1994.

Ramsey, F.K., y W.H. Chivers, "Mucosal disease of cattle," North Am. Vet., 34:629-633, 1953.

Ranheim, T, Mathis, P.K., Joelsson, D.B. et al., "Development and application of a quantitative RT-PCR potency assay for a pentavalent rotavirus vaccine (Rota Teq®)," J. Virol. Meth., 131:193-201, 2006.

Ridpath, J.F., y Bolín, S.R., "Differentiation of types 1a, 1b, and 2 bovine virus diarrhea virus by PCR," Molec. Cell. Probes, 12:101-106, 1998.

Ridpath, J.F., S.R. Bolin, y E.J. Dubovi, "Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes," Virology, 205(1 ):66-74, 1994.

Ridpath, J.F., Bolin, S.R., y Dubovi, E.J., "Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes," Virology, 205:66-74, 1994.

Ross, CE., Dubovi, E.J., y Donis, R.O., "Herd problems of abortions and malformed calves attributed to bovine viral diarrhea," J.

Am. Vet. Med. Assoc, 188(6):618-619, 1986.

Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989.

Sambrook y Russell, Molecular cloning: a laboratory manual, 3a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2001.

Schalk, J.A.C., de Vries, C.G.J.C.A., y Jongen, P.M.J.M., "Potency estimation of measles, mumps and rubella trivalent vaccines with quantitative PCR infectivity assay," Biologicals, 33(2):71-79, 2005.

Schalk, J.A.C., Elzen .C.V.D., Ovelgonne, H, et al., "Estimation of the number of infectious measles viruses in live virus vaccines using quantitative real-time PCR," J. Virol. Meth., 117:179-187, 2004.

Schefers, J., Munoz-Zanzi, C, Collins, J.E., Goyal, S.M., y Ames, T.R., "Serological evaluation of precolostral serum samples to detect Bovine viral diarrhea virus infections in large commercial dairy herds," J. Vet. Diagn. Invest., 20:625-628, 2008.

Tanner, J.E., y A. P. Morgan, "Design and analysis of veterinary vaccine efficacy triáis," Vet. Microbiol. , 37(3-4):221 -230, 1993.

Tautz, N., Elbers, K., Stoll, D., Meyers, G., y Thiel, H.J., "Serine protease of pestiviruses: determination of cleavage sites," J.

Virol., 71(7):5415-5422, 1997.

Thiel et al., "The pestiviruses," In Virology, Fields et al., (eds.) (Lippincott-Raven, Philadelphia, PA, USA), pp.1059-1073, 1996.

Vilcek, S, Patón, D.J., Durkovic, B, et al. "Bovine viral diarrhea virus genotype 1 can be separated into at least eleven genetic groups. " Arch. Virol., 146:99-115, 2001.

Wang, F, Puddy, A.C., Mathis, B.C., et al., "Using QPCR to assign infectious potencies to adenovirus based vaccines and vectors for gene therapy: to ard a universal method for the facile quantitation of virus and vector potency," Vaccine, 23:4500-4508, 2005.

Wiskerchen, M., y M.S. Collett, "Pestivirus gene expression: protein p80 of bovine viral diarrhea virus is a proteinase involved in polyprotein processing," Virology, 184(1):341-350, 1991.

Wren, G., "New Thinking on BRSV: Research into BRSV and vaccines reveáis new information about how the virus behaves and how it may interact with killed vaccines," Bovine Veterinarian, (February) pp. 16-19, 2001.

Xu, J., E. Méndez, P.R. Carón, C. Lin, M.A. Murcko, M.S. Collett, y C.M. Rice, "Bovine viral diarrhea virus NS3 serine proteinase: polyprotein cleavage sites, cofactor requirements, and molecular model of an enzyme essential for pestivirus replication," J. Virol., 71(7):5312-5322, 1997.

Xue, W., D. Mattick, L. Smith, J. Umbaugh, y E. Trigo., "Vaccination with a modified-live bovine viral diarrhea virus (BVDV) type 1a vaccine completely protected calves against challenge with BVDV type 1 b strains," , Vaccine, 29(1):70-76, Dec. 10, 2010, [epub ahead of print Oct. 27, 2010].

Todas las composiciones y métodos descritos y reivindicados en la presente pueden ser elaborados y ejecutados sin experimentación indebida en vista de la presente descripción. Mientras las composiciones y métodos de esta invención han sido descritos en términos de modalidades ejemplares, será aparente para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica que las variaciones pueden ser aplicadas a la composición, métodos y en la secuencia de etapas de los métodos descritos en la presente sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será aparente que ciertos agentes que son tanto químicamente como fisiológicamente relacionados pueden ser sustituidos por los agentes descritos en la presente mientras se pueden lograr los mismos o similares resultados. Todas los sustitutos y modificaciones similares aparentes para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica son considerados por estar dentro del espíritu, campo y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones adjuntas. Por consiguiente, los derechos exclusivos deben ser patentados como se describe en las reivindicaciones siguientes.

Claims (40)

REIVINDICACIONES

1. Una composición adaptada para detectar un ácido nucleico viral específico, si está presente, dentro de upa pluralidad de partículas de virus vivo, atenuado, caracterizada porque comprende: (a) un primer cebador de amplificación de oligonucleótido viral-específico de menos de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:4, SEC ID NO:7, SEC ID NO:10, SEC ID NO:13, y SEC ID NO:16; (b) un segundo cebador de amplificación de oligonucleótido específico viral de menos de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:20, SEC ID NO:5, SEC ID NO:8, SEC ID NO:11, SEC ID NO:14, y SEC ID NO:17; y (c) al menos una primera sonda de detección viral-específica, etiquetada, de menos de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, la sonda de detección viral-específica comprende una secuencia de nucleótido etiquetada seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, y SEC ID NO:18.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las partículas del virus están comprendidas dentro de una vacuna veterinaria.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizada porque uno o más del primero y segundo cebadores de amplificación de oligonucleótido viral específico y primera sonda de detección viral específica, etiquetada es de menos de aproximadamente 40 nucleótidos de longitud.

4. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque uno o más del primero y segundo cebadores de amplificación de oligonucleótido viral específico y primera sonda de detección viral específica, etiquetada es de menos de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud.

5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque uno o más del primero y segundo cebadores de amplificación de oligonucleótido viral específico y primera sonda de detección viral específica, etiquetada es de menos de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud.

6. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el primer cebador de amplificación de oligonucleótido viral especifico consiste esencialmente de una secuencia de nucleotido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:4, SEC ID NO:7, SEC ID NO:10, SEC ID NO:13, y SEC ID NO:16.

7. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el segundo cebador de amplificación de oligonucleótido viral específico consiste esencialmente de una secuencia de nucleotido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:20, SEC ID NO:5, SEC ID NO:8, SEC ID NO:11, SEC ID NO:14, y SEC ID NO:17.

8. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque al menos una primera sonda de detección viral específica etiquetada consiste esencialmente de una secuencia de nucleótido etiquetada seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, y SEC ID NO:18.

9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque al menos una primera sonda de detección viral específica etiquetada además comprende al menos una porción cromogénica, fluorogénica, de etiqueta giratoria o radioactiva.

10. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la pluralidad de partículas virales vivas, atenuadas comprende uno o más virus seleccionados de BRSV, BHV-1, Pl3, y BVDV.

11. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la pluralidad de partículas virales vivas, atenuadas comprende uno o más virus seleccionados de BVDV-1a, BVDV-1b, y BVDV-2.

12. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la pluralidad de partículas virales vivas, atenuadas comprende BVDV-1b.

13. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el primer cebador de amplificación de oligonucleótido viral específico consiste esencialmente de la secuencia de nucíeótido de la SEC ID NO:1, o SEC ID NO: 19, el segundo cebador de amplificación consiste esencialmente de la secuencia de nucíeótido de la SEC ID NO:2 o SEC ID NO:20, y al menos una primera sonda de detección viral específica etiquetada consiste esencialmente de la secuencia de nucíeótido de la SEC ID NO:3 o SEC ID NO:21.

14. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para uso en la detección la presencia de un polinucleótido viral-específico en una población de polinucleótidos obtenida de una muestra biológica de origen veterinario o de una pluralidad de partículas de virus vivo, atenuado comprendidas dentro de una vacuna multivalente de fiebre del embarque bovino.

15. Una composición para la detección de una secuencia de ácido nucleico viral específica en una muestra biológica sospechosa de contener ácidos nucleicos virales específicos, caracterizada porque composición comprende: (a) un primer cebador de amplificación delantero viral específico seleccionado del grupo que consiste de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:4, SEC ID NO:7, SEC ID NO:10, SEC ID NO:13, y SEC ID NO:16; y (b) un primer cebador de amplificación inversa viral específico seleccionado del grupo que consiste de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:5, SEC ID NO:8, SEC ID NO:11, SEC ID NO:14, y SEC ID N0:17.

16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque además comprende uno o más amortiguadores, una o más polimerasas, y uno o más dNTPs suficientes para amplificar la secuencia de ácido nucleico vía una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la reacción en cadena de la polimerasa se realiza en tiempo real.

18. La composición de conformidad con la reivindicación 16 o reivindicación 17, caracterizada porque además comprende al menos una primera sonda de detección de oligonucleótido etiquetado seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, y SEC ID NO:18 que específicamente se une a un producto de amplificación así producido por la PCR.

19. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 hasta 18, caracterizada porque la primera sonda de detección de oligonucleótido etiquetada comprende una etiqueta fluorescente, cromogénica, radioactiva, quimioluminiscente, luminiscente o de giro de resonancia.

20. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 hasta 19, caracterizada porque la sonda de detección etiquetada específicamente se une a un ácido nucleico específico de un BVDV-1a-, BVDV-1b-, BVDV-2-, BHV-1-, PI3- o un BRSV.

21. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 hasta 20, caracterizada porque además comprende uno o más componentes adicionales para cuantificar la cantidad de producto de amplificación producido durante la PCR en tiempo real.

22. Un kit caracterizado porque comprende la composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, para realizar una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar una secuencia de ácido nucleico viral específica a partir de una muestra que comprende una vacuna del virus vivo, modificado veterinario.

23. Un método para detectar la presencia de un polinucleótido viral-específico en una población de polinucleótidos, caracterizado porque el método que comprende: realizar al menos una etapa cíclica, en donde la etapa cíclica comprende al menos una primera etapa de amplificación y al menos una primera etapa de hibridación, y en donde al menos una primera etapa de amplificación comprende poner en contacto la muestra con una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para producir un producto de amplificación viral específico si una molécula de ácido nucleico viral específica está presente en la muestra, en donde al menos una primera etapa de hibridación comprende poner en contacto la muestra con la composición; y poner en contacto el producto de amplificación así producido con al menos una primera sonda de detección de oligonucleótido etiquetado bajo condiciones efectivas para detectar específicamente el producto de hibridación resultante.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el par de cebadores de amplificación virales específicos comprende: (a) una primera sonda de amplificación de oligonucleótido de menos de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:1, SEC ID NO:19, SEC ID NO:4, SEC ID NO:7, SEC ID NO:10, SEC ID NO:13, y SEC ID NO:16; y (b) un segundo cebador de amplificación de oligonucleótido de menos de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:20, SEC ID NO:5, SEC ID NO:8, SEC ID NO:11, SEC ID NO:14, y SEC ID NO:17.

25. El método de conformidad con la reivindicación 23 o reivindicación 24, caracterizado porque al menos una primera sonda de detección viral específica etiquetada comprende un oligonucleótido de menos de aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, que comprende la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de la SEC ID NO:3, SEC ID NO:21, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, SEC ID NO:12, SEC ID NO:15, y SEC ID NO:18.

26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, caracterizado porque la primera etapa cíclica comprende poner en contacto la población de polinucleótidos con un par de cebadores de amplificación virales específicos para producir un producto de amplificación cuando una molécula de ácido nucleico viral específica está presente en la población de polinucleótidos, y además en donde al menos una primera etapa de hibridación comprende poner en contacto la población de polinucleótidos con al menos una primera sonda de detección viral específica etiquetada bajo condiciones efectivas para detectar el producto de amplificación así producido.

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, caracterizado porque la etapa de detección se realiza en tiempo real.

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizado porque además comprende la etapa adicional de determinar la temperatura de fusión entre la sonda de detección viral específica y el producto de amplificación viral.

29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, caracterizado porque la población de polinucleótidos se obtiene de una pluralidad de partículas de virus vivo, atenuado.

30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, caracterizado porque la población de polinucleótidos se obtiene de una pluralidad de partículas de virus vivo, atenuado contenido dentro de una muestra biológica de origen veterinario.

31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, caracterizado porque la población de polinucleótidos es obtenida de una muestra biológica seleccionada del grupo que consiste de sangre, plasma, células, tejidos, suero, y cualquier combinación de los mismos.

32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 31, caracterizado porque la población de polinucleótidos se obtiene de una pluralidad de partículas de virus vivo, atenuado contenido dentro de una vacuna de mamífero.

33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, caracterizado porque la pluralidad de partículas de virus vivo, atenuado comprende uno o más virus seleccionados del grupo que consiste de BHV-1, Pl3, BRSV, y BVDV.

34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 33, caracterizado porque la pluralidad de partículas de virus vivo, atenuado comprende uno o más del BVDV Tipo 1a, BVDV Tipo 1b, y BVDV Tipo 2.

35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 34, caracterizado porque la vacuna de mamífero es una vacuna bovina del BRDC o fiebre del embarque.

36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 35, caracterizado porque la sonda de detección etiquetada además comprende un apagador no fluorescente o un aglutinante de ranura menor.

37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 36, caracterizado porque la sonda de detección es fluorescentemente etiquetada con 6-carboxi-fluoresceína (FAM).

38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 37, caracterizado porque la sonda de detección etiquetada específicamente de une a un ácido nucleico viral del BVDV-1a, BVDV-1b, BVDV-2, BHV-1, Pl3, o BRSV.

39. Uso de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en la amplificación y detección de un polinucleótido viral-específico en una población de polinucleótidos obtenida de una muestra biológica.

40. Uso de conformidad con la reivindicación 39, en la amplificación y detección de un polinucleótido específico del BVDV Tipo 1a, Tipo 1b, o Tipo-2 a partir de una pluralidad de partículas de virus vivo, atenuado comprendidas dentro de una vacuna multivalente de fiebre del embarque bovino.