KR20220158774A - 코로나바이러스 질환 2019(covid-19) 검출을 위한 검정 - Google Patents

코로나바이러스 질환 2019(covid-19) 검출을 위한 검정 Download PDF

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아이오니안 테크놀로지스, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 증폭 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 프로브의 다양한 조합을 포함하는, 시료중 2019-CoV를 증폭 및 검출하기 위한 재료 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 COVID-19를 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 서열, 키트 및 방법에 관한 것이다.

Description

코로나바이러스 질환 2019(COVID-19) 검출을 위한 검정
관련 출원들에 대한 상호참조
본 출원은, 각각의 내용이 전체로서 본원체 참고문헌으로 포함된 출원들, 즉 미국 가명세서 특허출원 제63/000,304호(2020년 3월 26일 출원), 미국 가명세서 특허출원 제63/000,971호(2020년 3월 27일 출원), 미국 가명세서 특허출원 제63/004,773호(2020년 4월 3일 출원), 미국 가명세서 특허출원 제63/049,237호(2020년 7월 8일 출원) 및 미국 가명세서 특허출원 제63/155,599호(2021년 3월 2일 출원)의 이익을 주장한다.
전자 제출된 자료의 참고문헌으로서의 포함
본원과 함께 전자 제출된 것으로서, 하기와 같이 식별되는 컴퓨터 가독성 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록이 전체로서 본원에 참고문헌으로 통합되어 있다: 2021년 3월 24일 생성된 5,136 바이트 ASCII(텍스트) 파일 1개(파일명: “2021-03-24_38391-601_SQL_ST25.txt).
분야
본 발명은 SARS-CoV-2 유래 표적 핵산 서열을 증폭시켜, COVID-19을 검출하기 위한 방법에 관한 것이다.
발열, 중증호흡기질환 및 폐렴을 유발하는 인간 병원체 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2(2019-nCoV))가 2019년 후반 중국 후베이성에서 출현하였다. SARS-CoV-2와 연관된 질환은 COVID-19이라 명명되었다. 신종 코로나바이러스는 몇몇 박쥐 코로나바이러스 및 증중급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV)와 밀접하게 관련된 베타코로나바이러스속의 일원이다. 그러나 SARS-CoV와는 달리, SARS-CoV-2는 인간들간에 신속하게 전파된다.
2021년 2월 말 기준, 200개를 넘는 국가에서 250만명 이상의 개체를 사망에 이르게 한 COVID-19 합병증을 보이는 COVID-19 사례자들이 1억명 넘게 확인되었다.
본 발명은 시료중 코로나바이러스 SARS-CoV-2를 증폭 및 검출하기 위한 시약, 예컨대 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 세트는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드 적어도 1개, 제2 올리고뉴클레오티드 적어도 1개, 그리고 프로브 올리고뉴클레오티드 적어도 1개를 포함한다. 프로브 올리고뉴클레오디트는 검출가능 표지(예컨대 형광단)을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 세트는 시료중 SARS-CoV-2의 재조합효소-중합효소 증폭 및 검출을 위한 것이다. 몇몇 구현예에서, 시약은 올리고뉴클레오티드 세트 1개 이상을 포함하는 올리고뉴클레오티드 군을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 시료중 SARS-CoV-2의 재조합효소-중합효소 증폭 및 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 세트는 서열 번호 17에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 19에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 18에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드; 또는 서열 번호 20 또는 21에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 25 또는 26에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 22 ~ 24중 임의의 것에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드, 또는 이것들의 조합을 포함하고, 각각의 프로브 올리고뉴클레오티드는 검출가능 표지를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제1 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 20에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하고, 제2 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 25에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하고, 프로브 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 22 또는 23에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제1 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 21에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하고, 제2 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 25 또는 26에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하고, 프로브 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 24에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 시료중 SARS-CoV-2를 증폭 및 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 군은, 서열 번호 2에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 6에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 제1 세트를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 군은, 서열 번호 11 및 15중 임의의 것에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 3에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 5에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 제2 세트를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 시료중 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 방법도 제공한다. 시료는 비강 면봉(nasal swab) 또는 비강 브러쉬(nasal brush), 타액, 점액, 혈액, 혈청, 혈장 또는 대변을 포함할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 군 또는 세트 및 증폭을 위한 시약을 시료와 접촉시키는 단계; 시료중에 존재하는 SARS-CoV-2 표적 핵산 서열 1개 이상을, 재조합효소-중합효소 증폭(RPA)을 사용하여 증폭시키는 단계; 증폭된 표적 SARS-CoV-2 핵산 서열 1개 이상에 올리고뉴클레오티드 프로브 1개 이상을 혼성화하는 단계; 그리고 증폭된 SARS-CoV-2 표적 핵산 서열 1개 이상에 프로브 올리고뉴클레오티드 서열 1개 이상이 혼성화되었는지를, 검출가능 표지로부터 발생한 신호를 측정하여 검출하는 단계를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 본 방법은 올리고뉴클레오티드 세트로부터 유래한 제1 및 제2 증폭 올리고뉴클레오티드를, 재조합효소 제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 검출가능 표지로부터 신호 1개 이상이 발생함은, 증폭된 SARS-CoV-2 표적 핵산 서열 1개 이상에 프로브 올리고뉴클레오티드 1개 이상이 혼성화되었음을 나타낼 수 있다.
증폭을 위한 시약은 중합효소; 재조합효소 제제; 재조합효소 담지 단백질; 단일 가닥 결합 단백질; 닉형성 효소(nicking enzyme); 헬리카아제; 위치특이적재조합촉진효소(resolvase); 효소 보조인자; 완충제; 데옥시리보뉴클레오티드; 또는 리보뉴클레오티드 3인산염; 밀집화 제제(crowding agent); ATP, ATP 유사체 또는 ATP 발생 시스템; 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드 세트 적어도 1개, 본원에 개시된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 중 임의의 것, 핵산 서열을 증폭 및 검출하기 위한 시약 및/또는 사용 지침을 포함하는 키트로서, 시료중 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 키트도 추가로 제공한다.
본 발명의 기타 양태들과 구현예들은 이하 상세한 설명 및 첨부 도면에 비추어 볼 때 명백할 것이다.
본 특허 또는 특허 출원 파일은 컬러로 그려진 도면 적어도 1개를 포함한다. 컬러 도면(들)이 첨부된 이 특허 또는 특허 출원 공보의 복사본은 필요 경비를 지불하고 요청하면 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1a 및 도 1b는, 증폭 올리고뉴클레오티드 및 프로브 올리고뉴클레오티드의 다양한 조합이 사용되었을 때 재조합효소-중합효소 증폭(RPA) 그래프이다.
본 발명은 적어도 부분적으로 COVID-19의 신속한 검출을 용이하게 하는 올리고뉴클레오티드 서열 집합체의 개발에 기반을 둔다.
본원에 사용된 바와 같은 "~를 포함한다(comprise)", "~를 포함하다(include)", "가지는(having)", "가지다", "~할 수 있다", "함유하다" 및 이것들의 변형어는 추가적인 행위나 구조의 존재에 대한 가능성을 배제하지 않는 구, 용어 또는 단어로서, 제약을 두지 않는 구, 용어 또는 단어인 것으로 의도된다. 단수형을 나타내는 "한(a)", "및(and)" 그리고 "본(the)"은, 문맥에 달리 명시되어 있지 않는 한 복수의 언급대상을 포함한다. 본 발명은 또한 명시적으로 기술되었는지 여부에 관계없이 본원에 제시된 구현예 또는 요소를 "포함하는", 이것으로 "이루어진" 그리고 이것으로 "본질적으로 이루어진” 기타 구현예도 또한 고려된다.
본원의 숫자 범위에 관한 인용을 위해, 동일한 정밀도로 그 범위 사이에 있는 개입 숫자 각각이 명시적으로 고려된다. 예를 들어 범위 6 ~ 9에 있어서 6과 9에 더하여 숫자 7과 8이 고려되고, 범위 6.0 ~ 7.0에 있어서 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0은 명시적으로 고려된다.
"제1" 및 "제2"라는 용어는 본 발명에서 상대적인 의미로만 사용된다. 달리 언급되지 않는 한, 이러한 용어들은 단지 구현예 1개 이상에 관한 설명에서 편의상 사용되는 것으로 이해될 것이다. "제1" 및 "제2"라는 용어는, 단지 1개의 구성요소를 또 다른 구성요소와 구별하기 위해 사용된 것으로, 개시된 기술의 권리 범위가 이러한 용어에 의해 제한되어서는 안된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 지정될 수 있고, 마찬가지로 제2 구성요소도 제1 구성요소로 지정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 “올리고뉴클레오티드”라는 용어는, 약 2개 ~ 약 10개 뉴클레오티드(예컨대 약 5개, 약 10개, 약 15개, 약 20개, 약 25개, 약 30개, 약 35개, 약 40개, 약 45개, 약 50개, 약 55개, 약 60개, 약 65개, 약 70개, 약 75개, 약 80개, 약 85개, 약 90개, 약 95개, 약 99개 또는 약 100개의 뉴클레오티드 또는 상기 값들 중 임의의 값에 의해 한정되는 범위의 개수만큼의 뉴클레오티드)를 포함하는 짧은 핵산 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 “핵산” 및 “폴리뉴클레오티드”라는 용어는, 임의의 길이를 가지는 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드(RNA) 또는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 중 어느 하나)의 중합체 형태를 지칭한다. 이러한 용어는, 분자의 1차 구조를 지칭하므로, 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA와, 이중 가닥 및 단일 가닥 RNA를 포함한다. 이 용어들은 균등물로서, 뉴클레오티드 유사체로 제조된 RNA 또는 DNA 중 어느 하나, 유사체, 그리고 변형 폴리뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 및/또는 캡핑된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 기타 다수의 결합(예컨대 포스포로티오에이트 및 보라노포스페이트 등)이 당 분야에 공지되어 있지만, 핵산들은 통상 인산염 결합을 통해 연결되어, 핵산 서열이나 폴리뉴클레오티드를 형성한다.
올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 또는 이중 가닥 서열 및 단일 가닥 서열 둘 다의 일부를 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 DNA, 즉 게놈 DNA 및 상보성 DNA(cDNA) 둘 다, RNA 또는 하이브리드일 수 있는데, 여기서 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드의 조합과, 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 비롯한 염기들의 조합을 함유할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 화학 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 “서열 동일성 %”이란 용어는, 최대의 동일성%를 달성하기 위해 서열 2개가 정렬되고, 필요하면 갭이 도입되었을 때, 참조기준 서열내 대응하는 뉴클레오티드와 동일한 핵산 서열내 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체의 백분율, 또는 최대의 동일성%를 달성하기 위해 서열 2개가 정렬되고, 필요하면 갭이 도입되었을 때, 참조기준 서열내 대응하는 아미노산과 동일한 아미노산 서열내 아미노산의 백분율을 지칭한다. 그러므로 본 기술에 따른 핵산이 참조기준 서열보다 더 긴 경우, 핵산내 추가의 뉴클레오티드로서, 참조기준 서열과 정렬되지 않는 뉴클레오티드는 서열 동일성 확정에 고려되지 않는다. 정렬을 위한 방법과 컴퓨터 프로그램, 예컨대 BLAST, Align 2 및 FASTA는 당 분야에 널리 공지되어 있다.
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 연관되어 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당 업자들에 의해 통상 이해되는 의미를 가질 것이다. 용어의 의미와 그 범위는 명백할 것이지만; 그러나 잠재적인 모호성이 있는 경우에 본원에 제공된 정의가 사전적 정의 또는 비본질적 정의보다 우선한다. 뿐 아니라, 맥락에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수를 나타내는 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수를 나타내는 용어는 단수를 포함할 것이다.
본원에 기재된 방법 및 재료와 유사하거나 균등한 방법 및 재료가 본 발명을 실시 또는 시험하는데 사용될 수 있지만, 이하에는 바람직한 방법 및 재료가 기재되어 있다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허출원, 특허 및 기타 참고문헌은 전체로서 참고문헌으로 포함되어 있다. 본원에 개시된 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것일뿐, 제한을 위한 것은 아니다. 본원에 사용된 단락의 표제들은 단지 체계의 조직화를 도모하기 위한 것일뿐, 어떤 방식으로든 본원에 기재된 특허대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
1. 증폭 및 프로브 올리고뉴클레오티드
일 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 핵산 증폭을 위해 사용될 수 있거나(예컨대 프라이머), 또는 핵산 혼성화 및 검출을 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 “프라이머”, “프라이머 서열”, “프라이머 올리고뉴클레오티드” 및 “증폭 올리고뉴클레오티드”란 용어는, 핵산 중합을 위한 뉴클레오티드 및 제제(예컨대 DNA 의존적 중합효소 또는 RNA 의존적 중합효소)가 존재하고 적합한 증폭 조건(예컨대 완충제, 염, 온도 및 pH)하에 놓일 때, 핵산(예컨대 모든 유형의 DNA 또는 RNA)의 상보성 가닥인 신장 생성물의 합성 개시점으로서의 역할을 할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드는 임의의 적합한 크기를 가질 수 있으며, 바람직하게는 약 15개 ~ 약 50개 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 20개 ~ 약 40개 뉴클레오티드를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어진 것일 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 본원에 기재된 것들 이외에도 추가적인 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 사용된 증폭 방법의 유형에 따라서, 증폭 올리고뉴클레오티드는, 예컨대 닉형성 효소 부위 및 안정화 영역 상류를 포함할 수 있다[예를 들어 각각이 본원에 전체로서 참고문헌으로 포함된 미국 특허 제9,689,031호; 동 제9,617,586호; 동 제9,562,264호; 그리고 동 제9,562,263호 참조].
“프로브”, “프로브 서열” 및 “프로브 올리고뉴클레오티드”란 용어는, 적당한 혼성화 조건하에서 적어도 표적 서열 일부(예컨대 증폭된 표적 서열 일부)와 선택적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일반적으로 프로브 서열은 “상보성”(예컨대 암호화 또는 센스 가닥(+)에 상보성)이거나, 또는 “역상보성”(예컨대 안티센스 가닥(-)에 상보성)인 것으로 동정된다. 본 발명의 프로브는 임의의 적합한 크기의 것일 수 있으며, 바람직하게는 약 10개 ~ 약 50개 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 12개 ~ 약 35개 뉴클레오티드를 포함하거나, 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 이것으로 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 “세트”, “프라이머 세트”, “프로브 세트” 및 “프라이머 및 프로브 세트”란 용어는, 관심 표적 서열 또는 관심 표적 핵산(예컨대 SARS-CoV-2내 표적 서열) 및/또는 표적 서열 또는 표적 핵산을 검출할 수 있는 프로브 적어도 1개의 증폭을 함께 프라이밍(priming)할 수 있는 올리고뉴클레오티드 2개 이상을 지칭한다. 임의의 구현예에서, “세트”란 용어는, 증폭될 표적 서열 또는 표적 핵산의 5' 말단과 혼성화하는 제1 올리고뉴클레오티드 및 증폭될 표적 서열 또는 표적 핵산의 상보체와 혼성화하는 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 쌍을 지칭한다.
본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 세트는 시료중 표적 SARS-CoV-2(2019-nCoV) 서열 1개 이상을 증폭 및 검출하는데 사용될 수 있다. “표적 서열” 및 “표적 핵산”이란 용어는 본원에서 호환되어 사용되며, 그 존재 또는 부재가 본원에 개시된 방법에 의해 검출될 특이적 핵산 서열을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 표적 서열은, 바람직하게 올리고뉴클레오티드 1개 이상이 혼성화되고, 증폭이 개시될 핵산 서열을 포함한다. 표적 서열은 또한 적당한 증폭 조건하에서 프로브가 안정적인 하이브리드를 형성할 수 있는, 프로브 혼성화 영역을 포함할 수 있다. 표적 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 표적 SARS-CoV-2 서열은 SARS-CoV-2 게놈중 임의의 일부, 예컨대 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 암호화하는 유전자 또는 RNA 의존적 RNA 중합효소(RDRP)를 암호화하는 유전자내에 존재할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 세트는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 제2 증폭 올리고뉴클레오티드 및 프로브 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 세트는 서열 번호 1 및 10 ~ 16 중 임의의 것에 대한 유사도가 적어도 70%(예컨대 75%., 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 3에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 5에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드; 또는 서열 번호 2에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 6에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드; 또는 서열 번호 7에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 8에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 9에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드; 또는 서열 번호 17에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 19에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 18에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드; 또는 서열 번호 20 또는 21에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 25 또는 26에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 22 ~ 24중 임의의 것에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드; 또는 이것들의 조합을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 세트는 서열 번호 1 및 10 ~ 16 중 임의의 것에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 3에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 5에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드; 및 서열 번호 2에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 6에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 세트는 서열 번호 20에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 25에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 22 또는 23에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 세트는 서열 번호 21에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 25 또는 26에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 24에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 세트는 서열 번호 17에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 19에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 18에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드; 또는 서열 번호 20 또는 21에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 25 또는 26에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 22 ~ 24중 임의의 것에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드; 또는 이것들의 조합을 포함하는, 시료중 SARS-CoV-2(2019-nCoV)의 재조합효소-중합효소 증폭 및 검출을 위한 올리고뉴클레오티드를 포함하는데, 여기서 각각의 프로브 올리고뉴클레오티드는 검출가능 표지를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제1 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 20에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하고, 제2 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 25에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하고, 프로브 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 22 또는 23에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제1 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 21에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하고, 제2 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 25 또는 26에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하고, 프로브 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 24에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 시료중 SARS-CoV-2(2019-nCoV)를 증폭 및 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 군은, 서열 번호 2에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 6에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 제1 세트를 포함하는데, 여기서 프로브 올리고뉴클레오티드는 검출가능 표지를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 이 군은 서열 번호 11 및 15중 임의의 것에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 3에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 5에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 제2 세트를 추가로 포함하는데, 여기서 프로브 올리고뉴클레오티드는 검출가능 표지를 포함한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
본원에 기재된 올리고뉴클레오티드들중 임의의 것은, 올리고뉴클레오티드의 자체 표적에 대한 결합 친화성을 안정화하거나 향상시키기 위한 임의의 적합한 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 서열은 변형 올리고뉴클레오티드 1개 이상을 포함할 수 있다. 뿐 아니라, 내부 스페이서(spacer) 또는 변형을 포함하는 서열로서, 나열된 서열들중 임의의 것은 변형 또는 스페이서 없이 사용될 수 있다.
본원에 기재된 올리고뉴클레오티드들중 임의의 것은, 예컨대 스페이서, 차단기 및 변형 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 조성 및/또는 구조면에서 천연 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 3인산염과 상이한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 3인산염이다. 변형은 뉴클레오티드를 변형시키는 효소, 예컨대 메틸기전이효소에 의한 변형으로 유발된 자연 발생 변형을 포함한다. 변형 뉴클레오티드는 또한 합성 또는 비자연 발생 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어 변형 뉴클레오티드는 2'-변형, 예컨대 2'-O-메틸 및 2'-플루오로 기를 가지는 것을 포함한다. 기타 2'-변형 뉴클레오티드가 당 분야에 공지되어 있으며, 예컨대 본원에 전체가 참고문헌으로 포함된 미국 특허 제9,096,897호에 기재되어 있다. 본원에 사용된 변형 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 3인산염은, 예컨대 변형이 이중 가닥 핵산의 한 가닥에 존재할 때, 그리고 이 가닥에 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위가 존재할 때, 변형 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 3인산염이 변형 뉴클레오티드 또는 변형 뉴클레오티드 3인산염을 제한 효소에 의한 절단에 대해 보호하는 방식으로 변형될 수 있다.
차단기 또는 중합효소 지연 분자(polymerase-arresting molecule)는, 중합효소에 의해 표적 서열 독립적 핵산 중합을 억제하는 화학기이다. 차단기는 올리고뉴클레오티드가, 표적 핵산 분자와 결합할 수 있지만, 검출가능 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하면서 주형 신장을 표적으로서 지지할 수 없도록 만들 수 있다. 예를 들어 중합효소의 진행을 허용하지 않는 기 1개 이상의 존재는 아마도 올리고뉴클레오티드에 비핵산 주쇄가 부가될 때 중합효소 지연을 유발할 수 있을 것이거나, 또는 복제 작업중인 중합효소를 멈추게 하여 중합효소 지연을 유발할 수 있을 것이다. 이러한 기를 가지는 올리고뉴클레오티드는 증폭 반응 도중 프로브의 변칙적 증폭을 막거나 감소시킬 수 있다. 차단기의 예로서는, 예컨대 알킬기, 비뉴클레오티드 링커, 포스포로티오에이트, 알칸-디올 잔기, 펩티드 핵산, 그리고 3'-OH가 결여된 뉴클레오티드 유도체, 예컨대 코르디세핀, 스페이서기 및 손상된 DNA 염기 등을 포함한다. 스페이서의 예로서는, 예컨대 C3 스페이서를 포함한다. 스페이서는, 예컨대 표지와 같은 기타 기를 부착시키기 위해, 예컨대 올리고뉴클레오티드 내부뿐만 아니라, 예컨대 말단에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 서열들중 임의의 것은 본원에 개시된 서열들중 임의의 것의 상보체를 포함할 수 있거나, 본질적으로 이것으로 이루어질 수 있거나, 또는 이것으로 이루어질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 “상보체” 또는 “상보성 서열”이란 용어는, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성 규칙을 통해 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드와 안정적인 이중체를 형성하는 핵산 서열을 지칭하고, 통상적으로는 개시된 올리고뉴클레오티드와 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 이상의 동일성을 공유한다. 핵산 서열 동일성은 당 분야에 공지된 임의의 적합한 산술적 알고리즘 또는 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 CLUSTAL-W, T-Coffee 및 ALIGN(핵산 및 아미노산 서열 정렬용), BLAST 프로그램(예컨대 BLAST 2.1, BL2SEQ, 및 이것들의 최신 버전) 및 FASTA 프로그램(예컨대 FASTA3x, FASTM 및 SSEARCH)(서열 정렬 및 서열 유사도 검색용)를 사용하여 확정될 수 있다. 서열 정렬 알고리즘도 또한, 예컨대 각각 전체로서 본원에 참고문헌으로 포함된 문헌들[Altschul et al., J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990); Beigert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin et al., eds., Biological Sequence Analysis: Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009); Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005); Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997); 및 Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997)]에 개시되어 있다.
본원에 기재된 올리고뉴클레오티드는 그 다양한 종류가 당 분야에 공지되어 있는 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다[예컨대 각각이 전체로서 본원에 참고문헌으로 포함된 문헌들(Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 1989, 2. Supp. Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York, N.Y.; M. A. Innis (Ed.), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press: New York, N.Y. (1990); P. Tijssen, Hybridization with Nucleic Acid Probes - Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (Parts I and II), Elsevier Science (1993); M. A. Innis (Ed.), PCR Strategies, Academic Press: New York, N.Y. (1995); and F. M. Ausubel (Ed.), Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons: Secaucus, N.J. (2002); Narang et al., Meth. Enzymol., 68: 90-98 (1979); Brown et al., Meth. Enzymol., 68: 109-151 (1979); 및 Belousov et al., Nucleic Acids Res., 25: 3440-3444 (1997))을 참조한다]. 올리고뉴클레오티드 쌍은 또한 다양한 도구, 예컨대 NCBI(National Center of Biotechnology Information)에 의해 제공된 Primer-BLAST 툴을 사용하여 디자인될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 합성은 올리고 합성기, 예컨대 Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc.(Foster City, CA), DuPont(Wilmington, DE) 또는 Milligen(Bedford, MA)로부터 시판되는 것들에서 수행될 수 있다. 대안적으로 올리고뉴클레오티드는 맞춤제작될 수 있으며, 당 분야에 널리 공지된 다양한 상업적 공급처, 예컨대 Midland Certified Reagent Company(Midland, TX), Eurofins Scientific(Louisville, KY) 및 BioSearch Technologies, Inc.(Novato, CA) 등으로부터 수득될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예컨대 원산 아크릴아미드겔전기영동, 음이온교환 HPLC(예컨대 본원에 참고분헌으로서 포함된 문헌(Pearson et al., J. Chrom., 255: 137-149 (1983) 참조), 그리고 역상 HPLC(예컨대 본원에 참고문헌으로 포함된 문헌(McFarland et al., Nucleic Acids Res., 7: 1067-1080 (1979)) 참조)를 사용하여 정제될 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 서열은 당 분야에 공지된 임의의 적합한 서열결정 방법, 예컨대 화학 분해(예컨대 본원에 참고문헌으로 포함된 문헌(Maxam et al., Methods of Enzymology, 65: 499-560 (1980)) 참조), 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행시간(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight; MALDI-TOF), 질량분광광도법(예컨대 본원에 참고문헌으로서 포함된 문헌(Pieles et al., Nucleic Acids Res., 21: 3191-3196 (1993)) 참조), 그리고 알칼리 포스파타아제 및 엑소뉴클레아제 분해 병행후 질량 분광광도법(본원에 참고문헌으로 포함된 문헌(Wu et al., Anal. Biochem., 290: 347-352 (2001)) 참조) 등(이에 한정되는 것은 아님)을 사용하여 인증될 수 있다.
2. 검출가능 표지
본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 서열들중 임의의 것 1개 이상은 검출가능 표지를 포함할 수 있어서, 증폭 올리고뉴클레오티드(들) 및/또는 프로브 올리고뉴클레오티드가 측정될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 프로브 올리고뉴클레오티드 서열 각각은 검출가능 표지를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 “검출가능 표지”란 용어는, 측정될 수 있고, 그 세기가 결합된 실체(entity)의 양과 관련된(양에 비례하는) 신호를 발생시키는 기 또는 화합물을 지칭한다. 표적 서열과 올리고뉴클레오티드의 결합을 검출하기 위하여 올리고뉴클레오티드에 접합 또는 결합될 수 있는 임의의 적합한 검출가능 표지가 사용될 수 있는데, 이것들 다수는 당 분야에 공지되어 있다. 일 구현예에서, 검출가능 표지는 간접적으로 검출될 수 있다. 간접적으로 검출가능한 표지는, 통상 직접적으로 검출가능 표지에 부착되었거나 이와 커플링된 “접합체”와 연관되어 사용되는, 특이적인 결합 일원이다. 이러한 접합체를 합성하기 위한 커플링 화학은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 특이적 결합 일원의 특이적 결합 특성과 표지의 검출가능 특성이 변성되지 않고 유지되도록 디자인된다. 본원에 사용된 바와 같은 “특이적 결합 일원” 및 “접합체”란, 결합쌍 일원 2개, 예컨대 상이한 분자 2개로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 결합쌍 일원(“특이적 결합 일원”) 및 이 특이적인 결합 일원에 특이적으로 결합하는 결합쌍 일원(“접합체”)을 지칭한다. 쌍의 일원 2개 사이의 결합은, 통상 본질적으로 화학적 결합 또는 물리적 결합이다. 이와 같은 결합쌍의 예로서는 항원과 항체, 아비딘/스트렙타비딘과 바이오틴, 햅텐과 햅텐에 특이적인 항체, 상보성 뉴클레오티드 서열들, 그리고 효소 보조인자/기질 및 효소 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
프로브 올리고뉴클레오티드 서열 각각은, 바람직하게 검출가능 표지를 포함한다. 프로브 각각은 동일한 검출가능 표지 또는 상이한 검출가능 표지로 표지화될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 검출가능 표지는 직접적으로 검출될 수 있다. 이와 같이 직접적으로 검출가능한 표지는, 예컨대 방사성동위원소, 형광단, 화학발광단, 효소, 콜로이드성 입자, 형광 미세입자, 끼어들기 염료(intercalating dye)(예컨대 SYBR Green 또는 브롬화에티디움) 등을 포함한다. 선택된 구현예에서, 검출가능 표지는 형광단, 예컨대 플루오로레세인 계열 염료, 폴리할로플루오레세인 계열 염료, 헥사클로로플루오레세인 계열 염료, 쿠마린 계열 염료, 로다민 계열 염료, 시아닌 계열 염료, 옥사진 계열 염료, 티아진 계열 염료, 스쿠아라인 계열 염료, 켈레이트화 란타니드 계열 염료, 아조 계열 염료, 트리페닐메탄 계열 염료 또는 BODIPY® 계열 염료일 수 있다. 형광단의 예로서는 FAMTM, CAL-FLUOR®, QUASAR®TM, HEXTM, JOETM, NEDTM, PET®, ROXTM, TAMRATM, TETTM, TEXAS RED® 및 VIC®를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 당 업자는, 직접적으로 검출가능한 표지는 표지의 검출을 가능하게 하는 추가의 구성성분, 예컨대 기질, 촉발 시약 및 광선 등을 필요로 할 수 있음을 이해할 것이다. 올리고뉴클레오티드, 예컨대 프로브를 표지화하기 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 예컨대 각각이 본원에 전체로서 참고문헌으로 포함된 문헌들[L. J. Kricka, Ann. Clin. Biochem., 39: 114-129 (2002); van Gijlswijk et al., Expert Rev. Mol. Diagn., 1: 81-91 (2001); Joos et al., J. Biotechnol., 35: 135-153 (1994); Smith et al., Nucl. Acids Res., 13: 2399-2412 (1985); Connoly et al., Nucl. Acids. Res., 13: 4485-4502 (1985); Broker et al., Nucl. Acids Res., 5: 363-384 (1978); Bayer et al., Methods of Biochem. Analysis, 26: 1-45 (1980); Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 6633-6637 (1981); Richardson et al., Nucl. Acids Res., 11: 6167-6184 (1983); Brigati et al., Virol., 126: 32-50 (1983); Tchen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3466-3470 (1984); Landegent et al., Exp. Cell Res., 15: 61-72 (1984); A. H. Hopman et al., Exp. Cell Res., 169: 357-368 (1987); 및 Temsamani et al., Mol. Biotechnol., 5: 223-232 (1996)]에 기재되어 있다.
몇몇 구현예에서, 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드들중 임의의 것 1개 이상은 또한 소광기(quencher moiety)를 포함할 수 있다. 검출가능 표지(예컨대 형광단) 및 소광기가 매우 근위, 예컨대 프로브 말단에 존재할 때, 소광기는 검출가능 표지로부터 신호(예컨대 형광)가 검출되는 것을 막는다. 기 2개가 물리적으로 분리될 때, 신호는 검출가능하게 된다. 소광자는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 소광자, 예컨대 BLACK HOLE QUENCHER® 1(BHQ-1®), BLACK HOLE QUENCHER® 2(BHQ-2®), BLACK HOLE QUENCHER® 3(BHQ-3®), IOWA BLACK® FQ 및 IOWA BLACK® RQ로부터 선택될 수 있다. 예를 들어 올리고뉴클레오티드 프로브는 FAM 형광단, CAL-FLUOR®또는 QUASAR 형광단 및 BHQ-1 또는 BHQ-2 소광자를 포함할 수 있다.
특정 표지 및 표지화 기술의 선택은 몇 가지 인자, 예컨대 표지화 방법의 용이성 및 비용, 사용되는 상이한 검출가능 표지들 사이의 스펙트럼 이격(spectral spacing), 바람직한 시료 표지화의 품질, 혼성화 반응(예컨대 혼성화 과정의 속도 및/또는 효율)에 대한 검출가능 기의 영향, 사용된 증폭 방법의 성질, 검출 시스템의 성질, 그리고 검출가능 표지에 의해 발생한 신호의 성질 및 세기 등에 의존할 것이다.
3. SARS-CoV-2(2019-nCoV)를 증폭 및 검출하기 위한 방법
본 발명은 시료중 SARS-CoV-2(2019-nCoV)를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 세트 및 증폭을 위한 시약을 시료와 접촉시키는 단계; 시료중 존재하는 표적 SARS-CoV-2 핵산 서열 1개 이상을 증폭시키는 단계; 증폭된 표적 SARS-CoV-2 핵산 서열 1개 이상에 올리고뉴클레오티드 프로브 1개 이상을 혼성화하는 단계; 및 검출가능 표지로부터 신호를 측정함으로써, 증폭된 SARS-CoV-2 표적 핵산 서열 1개 이상과 프로브 올리고뉴클레오티드 서열 1개 이상이 혼성화되었는지 검출하는 단계를 포함한다. 전술된 올리고뉴클레오티드 세트와 관련하여 본원에 제시된 올리고뉴클레오티드 세트에 관한 설명도 또한 개시된 방법에 적용될 수 있다.
시료는 임의의 적합한 대상체, 통상적으로 포유동물(예컨대 개, 고양이, 토끼, 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 돼지, 말, 인간이 아닌 영장류 또는 인간)로부터 수득된 임의의 적합한 시료일 수 있다. 바람직하게 대상체는 인간이다. 시료는 임의의 적합한 생물 공급원, 예컨대 비강 면봉 또는 비강 브러쉬, 또는 생리학적 유체, 예컨대 전혈, 혈청, 혈장, 간질액, 타액, 수정체 분비물, 뇌척수액, 땀, 소변, 모유, 복수액, 점액, 활액, 복막액, 질액, 월경혈, 양수, 정액 및 대변 등(이에 한정되는 것은 아님)으로부터 수득될 수 있다.
시료는 당업자들에게 공지된 일상적 기술이 사용되어 대상체로부터 수득될 수 있으며, 생물 공급원으로부터 수득되거나, 또는 시료의 특징을 개질하기 위한 전처리 이후 수득된 바와 같은 시료는 직접적으로 사용될 수 있다. 이러한 전처리는, 예컨대 혈액으로부터 혈장을 제조하는 처리, 점액을 희석하는 처리, 여과, 침전, 희석, 증류, 혼합, 농축, 방해 구성성분의 비활성화, 시약 부가 및 용해 등을 포함할 수 있다.
시료가 대상체로부터 수득된 후, 시료는, 본원에 기재된 바와 같은 증폭 올리고뉴클레오티드 및 프로브를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트와 접촉할 수 있으며, 그 결과 반응 혼합물이 형성될 수 있다. 그 다음, 반응 혼합물은 증폭 조건하에 놓인다. 본원에 사용된 바와 같은 “증폭 조건”이란 용어는, 증폭 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및/또는 신장을 촉진하는 조건을 지칭한다. 이러한 조건은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 선택된 증폭 방법에 의존한다. 증폭 조건은 모든 반응 조건, 예컨대 온도 및/또는 온도 순환, 완충제, 염, 이온 세기 및 pH 등(이에 한정되는 것은 아님)을 포함한다.
시료중 SARS-CoV-2 핵산 서열을 증폭하는 것은, 당 분야에 공지된 임의의 적합한 핵산 서열 증폭 방법이 사용되어 수행될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역전사효소 PCR(RT-PCR), 실시간 PCR, 전사 매개 증폭(TMA), 회전환증폭(rolling circle amplification), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 가닥 치환 증폭(SDA), 전사 매개 증폭(TMA), 단일 프라이머 등온 증폭(Single Primer Isothermal Amplification; SPIA), 헬리카아제 의존 증폭(HDA), 루프 매개 증폭(LAMP),　재조합효소-중합효소 증폭(RPA) 및 리가아제 연쇄 반응(LCR)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2(2019-nCoV) 핵산 서열의 증폭은 등온 증폭(예컨대 RPA 또는 NEAR)이 사용되어 수행된다. 몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 핵산 서열의 증폭 및 검출은 현장진단용 디바이스(point of care device)(예컨대 ID NOW 시스템(Abbott))가 사용되어 수행된다.
몇몇 구현예에서, SARS-CoV-2 핵산 서열의 증폭은 실시간 PCR이 사용되어 수행된다. 본원에 사용된 바와 같은 “실시간 PCR”이란, 반응이 진행됨에 따라 증폭 생성물의 축적이 실시간으로 측정되는 PCR 방법으로서, 증폭된 DNA 생성물이 종점 분석(end-point analysis)에서 검출되는 종래의 PCR과는 대조적으로 매회 주기를 거친후 생성물 정량화가 이루어지는 PCR 방법을 지칭한다. 실시간 PCR은 또한 당 분야에 “정량적 PCR(qPCR)”이라 공지되어 있다. PCR 생성물의 실시간 검출은, 통상적으로 임의의 이증 가닥 DNA 및 서열 특이적 형광 표지화 DNA 프로브 사이에 끼어드는 비특이적 형광 염료의 사용을 포함한다. 실시간 PCR 기술 및 시스템은 당 분야에 공지되어 있으며(예컨대 각각이 본원에 전체로서 참고문헌으로 포함된 문헌들(Dorak, M. Tevfik, ed. Real-time PCR. Taylor & Francis (2007); 및 Fraga et al., “Real-time PCR,”Current protocols essential laboratory techniques: 10-3 (2008))을 참조한다), 다양한 공급처(예컨대 m2000rt REALTIMETM PCR system(Abbott Molecular, Inc., Des Plaines, IL); CFX Real-Time PCR Detection Systems(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA); 및 TAQMANTM Real-Time PCR System(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA))로부터 상업적으로 입수될 수 있으며, 이것중 임의의 것은 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다.
증폭에 유용한 올리고뉴클레오티드 세트는 서열 번호 1 및 10 ~ 16중 임의의 것에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 3에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 5에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드; 및/또는 서열 번호 2에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 6에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
선택된 구현예에서, 등온 증폭 방법은, 통상의 증폭 반응보다 타임프레임이 더 짧은 타임프레임에서 더 짧은 서열을 증폭시키기 위한 닉형성 반응 및 신장 반응, 즉 “닉형성 및 신장 증폭”에 달려있을 수 있다. 이러한 방법은, 예컨대 증폭 올리고뉴클레오티드 오로지 2개, 닉형성 효소 1개 또는 2개, 그리고 중합효소가 등온 조건하에서 사용되는 반응을 포함할 수 있다. 닉형성 및 신장 증폭에 유용한 올리고뉴클레오티드 세트는 서열 번호 7에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 8에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 9에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
닉형성 및 신장 증폭에서 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 가지는 표적 핵산 서열은 증폭 올리고뉴클레오티드 쌍과 접촉한다. 제1 증폭 올리고뉴클레오티드는 표적 서열 안티센스 가닥의 3' 말단에 상보성인 3' 말단에 인지 영역을 포함하는 핵산 서열, 상기 인지 영역 상류에 있는 닉형성 효소 부위, 그리고 상기 닉형성 효소 부위 상류에 있는 안정화 영역을 포함한다. 제2 증폭 올리고뉴클레오티드는 표적 서열 센스 가닥의 3' 말단에 상보성인 3' 말단에 인지 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열, 상기 인지 영역 상류에 있는 닉형성 효소 부위, 그리고 상기 닉형성 효소 부위 상류에 있는 안정화 영역을 포함한다. 닉형성 효소 2개가 제공된다. 닉형성 효소 1개는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드의 닉형성 효소 부위에 닉을 형성할 수 있지만, 상기 표적 서열내에는 닉을 형성할 수 없다. 또 다른 닉형성 효소는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드의 닉형성 효소 부위에 닉을 형성할 수 있지만, 상기 표적 서열내에는 닉을 형성할 수 없다. DNA 중합효소는 증폭을 위한 조건, 즉 닉형성 효소에 의해 닉이 형성되는 증폭 올리고뉴클레오티드가 신장됨에 따라 이중 가닥 닉형성 효소 부위가 생성되고, 그 결과 증폭 생성물이 생성되는 것으로 이루어진 주기가 다수 회 진행되는 조건 하에서 사용된다. 예를 들어 각각이 본원에 전체로서 참고문헌으로 포함된 미국 특허 제9,689,031호, 동 제9,617,586호, 동 제9,562,264호 및 동 제9,562,263호; 미국 특허출원 제15/467,893호, 동 제15/600,951호 및 동 제16/243/829호를 참조한다.
몇몇 구현예에서, ID NOW COVID-19 검정은 SARS-CoV-2 RNA중 RdRp 유전자의 고도로 보존된 영역을 표적화하기 위해 닉형성 효소 증폭 반응(NEAR), 등온 핵산 증폭 기술을 이용한다. 몇몇 구현예에서, 검정 시스템은 용리/용해 완충제가 담긴 시료 수용기; 각각 동결건조 펠릿이 담긴 밀봉 반응 튜브 2개를 포함하는 시험 베이스(test base); 용리된 시료를 시험 베이스에 운반하기 위한 운반용 카트리지; 그리고 ID NOW 기기를 포함한다. ID NOW COVID-19 검정은 단지 5분 이내에 양성의 결과를, 그리고 13분 이내에 음성의 결과를 전달하므로, 다양한 헬스케어 환경에 신속한 COVID-19 결과를 제공한다.
몇몇 구현예에서, ID NOW COVID-19 POC 검정은 1 mL당 125개 이하의 복사체와 같은 검출 하한치(lower Limit Of Detection; LOD)를 제공한다. 컴퓨터 시뮬레이션 분석은, 45개 국가와 21개 도시 및 중국의 지방들로부터 보고된 957개 SARS-CoV-2 서열에 대한 모든 주형 및 프로브의 100% 상동성을 확인하였으며, 공통된 호흡기 질병을 유발시키는 미생물, 예컨대 기타 코로나바이러스, 인플루엔자, RSV 및 리노바이러스와의 유의미한 교차반응성은 없을 것으로 예측하였다.
임상 성능은 공지의 농도만큼의 SARS-CoV-2 RNA를 함유되도록 고안된 시료 30개와 고안된 음성 시료 30개를 대상으로 확정된다. SARS-CoV-2 RNA는 모든 양성의 시료중에서 검출되었지만(양성 일치율 100%[CI, 88.6% ~ 100%]), 음성 시료증에서는 검출되지 않았다(음성 일치율 100% [CI, 88.6% ~ 100%]).
선택된 구현예에서, SARS-CoV-2 핵산 서열의 증폭은 재조합효소-중합효소 증폭(RPA)이 사용되어 수행되는데, 이 방법은 재조합효소 및 관련 단백질의 특성, 즉 DNA 중합효소 반응의 서열 특이적 프라이밍을 허용하는 단일 가닥 상동성 DNA와 함께 이중 가닥 DNA에 침입하는 특성에 의존한다.
RPA에 유용한 올리고뉴클레오티드 세트는 서열 번호 17에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 19에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 18에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드; 또는 서열 번호 20 또는 21에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 25 또는 26에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 22 ~ 24중 임의의 것에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 제1 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 20에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하고, 제2 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 25에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하고, 프로브 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 22 또는 23에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 제1 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 21에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하고, 제2 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 25 또는 26에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하고, 프로브 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 24에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함한다.
RPA에서 재조합효소 제제는 제1 및 제2 증폭 올리고뉴클레오티드와 접촉하여 핵단백질을 형성한다. 이러한 핵단백질은 표적 서열과 접촉하여 상기 제1 가닥의 제1부에 제1 이중 가닥 구조를 형성하고, 상기 제2 가닥의 제2부에 이중 가닥 구조를 형성하므로, 상기 제1 증폭 올리고뉴클레오티드 및 제2 증폭 올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 표적 서열을 포함하는 DNA상에 서로를 향하여 배향된다. 핵단백질내 증폭 올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 DNA 중합효소에 의해 신장되고, 그 결과 제1 및 제2 이중 가닥 핵산과, 핵산의 제1 및 제2 치환 가닥이 생성된다. 단계들은 증폭 수준이 원하는 정도로 달성될 때까지 반복된다.
표적 핵산 서열의 RPA에 유용한 방법 및 재료는 당 분야에 공지되어 있다. 각각이 전체로서 본원에 참고문헌으로 포함되어 있는 미국 특허 제7,270,981호; 동 제8,460,875호; 동 제7,399,590호; 동 제7,666,598호; 동 제8,030,000호; 동 제8,426,134호; 동 제8,945,845호; 동 제9,663,820호; 동 제10,329,603호; 동 제10,329,602호; 동 제8,017,339호; 동 제8,574,846호; 동 제8,962,255호; 동 제10,036,057호; 동 제8,071,308호; 동 제10,093,908호; 및 동 제8,637,253호와, 미국 특허출원 제15/099,754호; 동 제 16/442,007호; 동 제14/705,150호; 및 동 제16/155,133호를 참조한다. 예를 들어 적합한 제조합효소 제제는 이.콜라이(E. coli　) RecA 단백질, T4 uvsX 단백질 또는 임의의 문(phyla)으로부터 유래하는 임의의 상동성 단백질 또는 단백질 복합체를 포함한다. 기타 비상동성 재조합효소 제제, 예컨대 RecT 또는 RecO가 RecA 대신에 사용될 수 있다. 적합한 재조합효소 담지 단백질은, 예컨대 T4uvsY,　이.콜라이 recO,　이.콜라이 recR 및 이 단백질들의 유도체 및 조합을 포함할 수 있다. 적합한 단일 가닥 DNA 결합 단백질은 이.콜라이 SSB 또는 T4 gp32 또는 이 단백질들의 유도체 또는 조합일 수 있다. DNA 중합효소는 진핵생물 또는 원핵생물 중합효소일 수 있다. 진핵생물 중합효소의 예로서는 pol-α, pol-β, pol-δ, pol-ε 및 이것들의 유도체와 조합을 포함한다. 원핵생물 중합효소의 예로서는 이.콜라이 DNA 중합효소 I Klenow 단편, 박테리오파아지 T4 gp43 DNA 중합효소, 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) 중합효소 I 대형 단편, Phi-29 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) Pol I, 이.콜라이 DNA 중합효소 I, 이.콜라이 DNA 중합효소 II, 이.콜라이 DNA 중합효소 III, 이.콜라이 DNA 중합효소 IV, 이.콜라이 DNA 중합효소 V 및 이의 유도체와 조합을 포함한다. RPA의 기타 구성성분은 ATP, ATP 유사체 또는 ATP 재생 시스템(ADP → ATP 전환)을 포함한다. 이러한 시스템은, 예컨대 포스포크레아틴 및 크레아틴 키나아제를 이용할 수 있다. ATP 또는 ATP 유사체는 ATP, ATP-γ-S, ATP-β-S, ddATP 또는 이것들의 조합중 임의의 것일 수 있다. RPA 반응은 또한 AMP로부터 ADP를 재생하고, 피로인산염을 인산염(피로인산염)으로 전환하는 시스템을 포함할 수 있다. RPA에 사용된 밀집화 제제로서, 적합한 제제는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 덱스트란 및 피콜(ficoll)을 포함한다.
개시된 방법은, 시료중에 존재하는 SARS-CoV-2 바이러스 핵산 서열 1개 이상이 증폭된 후 본원에 개시된 프로브 올리고뉴클레오티드 서열 1개 이상을, 증폭된 표적 SARS-CoV-2(2019-nCoV) 핵산 서열 1개 이상에 혼성화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 방법은, 프로브 올리고뉴클레오티드 서열 1개 이상이, 증폭된 표적 핵산 서열 1개 이상에 혼성화된 후, 증폭된 표적 핵산 서열 1개 이상에 프로브 올리고뉴클레오티드 서열 1개 이상이 혼성화되었는지를, 검출가능 표지 각각으로부터 유래하는 신호를 평가함으로써 검출하는 단계를 포함하는데, 여기서 (i) 신호 1개 이상의 존재는, 프로브 올리고뉴클레오티드 서열 1개 이상이 표적 SARS-CoV-2 핵산 서열과 혼성화되었는지와 시료중 SARS-CoV-2가 존재하는지를 나타내고, (ii) 신호의 부재는 시료중 SARS-CoV-2가 부재함을 나타낸다. 프로브 올리고뉴클레오티드 서열 1개 이상으로부터 유래한 신호의 검출은, 검출가능 표지의 유형에 따라 널리 공지된 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어 검출은 용액중 실시간 형광도 방법 또는 고체 표면 방법이 사용되어 수행될 수 있다.
4. SARS-CoV-2를 보유하는 것으로 동정된 대상체 치료 및 모니터링
본원에 기재된 방법에 따라 SARS-CoV-2를 보유하는 것으로 동정된 대상체는 당 분야에 공지된 일상의 기술이 사용되어 치료, 모니터링(예컨대 대상체 유래 시료중 확정된 SARS-CoV-2 핵산의 존재에 대한 모니터링), 치료 및 모니터링, 및/또는 모니터링 및 치료될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 본 방법이 사용되어 대상체로부터 수득된 시료 1개 이상중 SARS-CoV-2 핵산의 존재가 확정될 때 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.
치료는, 대상체가 무증상이든, SARS-CoV-2 감염에 따른 증상을 경도, 중등도 또는 중증으로 겪는지 여부에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어 경도의 증상을 겪는 대상체는 발열, (가래를 동반하거나 동반하지 않는) 기침, 식욕부진, 권태감, 근육통, 인후염, 호흡곤란, 코막힘, 두통, 설사, 오심, 구토 또는 이러한 증상들의 임의의 조합을 겪을 것이다. 중등도 증상을 겪는 대상체는 수 일간 지속되는 100.4℉ 이상의 발열, 오한, 숨가쁨 또는 이러한 증상들의 임의의 조합을 겪게될 것이다. 이러한 대상체는 또한 폐렴을 앓을 수도 있다. 중증 감염을 겪는 대상체는 호흡 곤란, 지속적인 가슴 통증 또는 압박감, 정신착란, 각성불능, 입술 또는 얼굴의 청색증, 또는 이러한 증상들의 임의의 조합을 겪게될 것이다. 이러한 대상체는 또한 중증의 폐렴을 앓을 수도 있다.
만일 대상체가 무증상이거나 경도의 증상을 앓으면, 해당 대상체는 휴식 또는 수면을 취하거나, 몸을 따뜻하게 유지하거나, 수분을 섭취하거나(예컨대 체내 수분을 유지시키거나), 타 대상체와의 사회적 상호작용을 최소화하거나(예컨대 집에서 고립상태 또는 격리상태를 유지하거나) 또는 이러한 처치를 임의로 조합 처치함으로써 치료될 수 있다. 또한 대상체는 증상이 나타나기 시작하는지 및/또는 악화되는지 여부를 관찰하기 위해 모니터링될 수 있다.
SARS-CoV-2 감염의 중등도 또는 중증 증상을 보이는 대상체는 1개 이상의 약물(예컨대 렘데시비르), 백신, 회복기환자혈장치료(convalescent plasma therapy)(예컨대 SARS-CoV-2 감염에서 생존한 대상체로부터 채혈된 혈액 유래 혈장을 투여받는 치료법), 호흡 지원 또는 보조(예컨대 비강 캐뉼러, 페이스 마스크, 또는 비침습 또는 침습(예컨대 기관내삽관) 환기) 또는 이러한 처치의 병행으로 치료될 수 있다. 전술된 처치중 임의의 처치를 받은 대상체는 또한 당 분야에 공지된 일상적 기술이 사용되어 추가로 모니터링될 수 있다.
5. 백신화
또 다른 구현예에서, 본 발명은 SARS-CoV-2(2019-nCoV)에 대한 대상체 적어도 1회의 백신화 및/또는 재백신화(예컨대 추가 백신화)와 연계되어 본원에 기재된 방법을 사용하는 것에 관한 것이다. 몇몇 구현예에서, 본 방법은 대상체가 SARS-CoV-2에 대해 적어도 1회의 백신(예컨대 1회차 또는 초회 백신, 1회 이상의 후속 또는 추가 백신 등)을 투여받아야 하거나 투여받을 수 있는지 여부를 확정하기 위해, 대상체로부터 수득된 시료 적어도 1개중 SARS-CoV-2 핵산의 존재를 검출하는데 사용된다. 몇몇 구현예에서, 치료된 대상체는 면역공격 경험이 없는(naive) 대상체, 즉 SARS-CoV-2에 대하여 그 어떤 면역성도 가지지 않거나, SARS-CoV-2에 대한 면역학적 면역성을 가지지 않고, SARS-CoV-3에 대하여 사전 백신화되지 않았던 대상체일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 대상체는 SARS-CoV-2에 대해 사전 백신화되지 않았으면서 면역공격 경험이 없을 수 있다. 몇몇 구현예에서, 대상체는 현재 SARS-CoV-2로 감염된 대상체로서, 증상을 보이지 않거나 경도 증상을 보이며, 그 어떠한 사전 백신화도 수행되지 않았던 대상체일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 대상체는 현재 SARS-CoV-2로 감염된 대상체로서, 증상을 보이지 않거나 경도 증상을 보이며, SARS-CoV-2에 대한 사전 백신화가 이루어졌던 대상체일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 대상체는 앞서 SARS-CoV-2로 감염되었다가 회복되었지만, SARS-CoV-2에 대한 사전 백신화가 수행되지 않았던 대상체일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 대상체는 앞서 SARS-CoV-2로 감염되었다가 회복되었지만, SARS-CoV-2에 대한 사전 백신화가 수행되었던 대상체일 수 있다.
상기 방법은 앞서 SARS-CoV-2로 감염되었을 때의 중증도 및/또는 타이밍 변화에 상관없이 수행될 수 있다. 본원에 기재된 방법이 사용될 때, 만일 SARS-CoV-2 핵산의 존재가 시료중에서 검출되면, 대상체는 투여될 백신이 백신 1회차 용량인지, 백신 2회차(예컨대 부스터) 용량인지, 백신 3회차 또는 그 이상의 추가 회차(예컨대 부스터) 용량인지 여부에 따라 SARS-CoV-2에 대한 백신을 적어도 1회 투여받기 위해 일정 기간(예컨대 30일, 60일, 90일 등)을 기다려야할 수도 있다. 대안적으로 만일 SARS-CoV-2 핵산의 존재가 시료중에서 검출되지 않으면, 백신은 대상체에 적어도 1회 투여될 수 있다.
“적어도 1회의 후속 백신 또는 백신화” 또는 “적어도 1회의 추가 백신 또는 백신화”란 어구는, 초회 또는 현재 백신이 대상체에 투여되고 나서, 시간상 어느정도 기간이 지난후 추가 또는 후속 백신 또는 백신화가 적어도 1회(예컨대 N + 1(여기서 N은 초회 또는 현재 백신 + 추가 또는 후속 백신), N+2(여기서 N은 초회 또는 현재 백신 + 추가 백신 2회), N+3, N+4, N+5, N+6, N+7, N+8, N+9, N+10 ~ N + N'(여기서 N'는 1 ~ 1000, 1 ~ 500, 1 ~ 100의 정수임))가 투여 또는 수행되는 시나리오를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 방법은, 대상체가 SARS-CoV-2에 대한후속 백신을 적어도 1회 투여받아야 할지 여부(예컨대 부스터샷을 1회 이상 맞아야 할지 여부)를 결정하고/결정하거나; SARS-CoV-2에 대한 백신을 적어도 1회 투여받은 후의 대상체를 모니터링하기 위해, 대상체가 SARS-CoV-2에 대힌 백신을 적어도 1회 투여받은 후 시간 프레임내에 대상체로부터 수득된 시료 적어도 1개중 SARS-CoV-2 핵산의 존재를 검출하는데 사용된다. 몇몇 구현예에서, 본 방법은 대상체가 SARS-CoV-2에 대한 백신을 적어도 1회 투여받은 후 시간 프레임(time frame)내에 시료를 수득하는 단계를 포함한다. 대상체가 SARS-CoV-2에 대한 백신을 적어도 1회 투여받은 후의 시간 프레임은 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일, 적어도 21일, 적어도 22일, 적어도 23일, 적어도 24일, 적어도 25일, 적어도 26일, 적어도 27일, 적어도 28일, 적어도 29일, 적어도 30일, 적어도 31일, 적어도 32일, 적어도 33일, 적어도 34일, 적어도 35일, 적어도 36일, 적어도 37일, 적어도 38일, 적어도 39일, 적어도 40일, 적어도 41일, 적어도 42일, 적어도 43일, 적어도 44일, 적어도 45일, 적어도 46일, 적어도 47일, 적어도 48일, 적어도 49일, 적어도 50일 등일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 시료는 대상체가 SARS-CoV-2에 대한 백신을 적어도 1회 투여받은 후 약 7일 ~ 약 21일 이내에 수득된다. 뿐만 아니라 또 다른 구현예에서, 대상체의 모니터링은 대상체가 SARS-CoV-2에 대한 백신을 1회 이상 투여받은 후(예컨대 SARS-CoV-2에 대한 백신 1회차 용량, SARS-CoV-2에 대한 백신 2회차 용량만큼을 투여받은 후), 백신 투여후 증상 또는 부작용(예컨대 피로감 또는 권태감, 두통, 현기증 또는 경증의 현기증, 발열 또는 오한, 근육, 뼈, 관절 또는 신경 증상, 오심, 구토, 설사 또는 기타 소화기 증상, 수면 변화, 림프절 부종, 피부/손톱 또는 얼굴 변화, 눈, 귀, 입 또는 인후 변화, 기침, 가슴이나 호흡 증상 및/또는 기억력 또는 기분 변화 중 1가지 이상)을 모니터링하는 단계를 포함한다.
만일 SARS-CoV-2 핵산이 시료중에서 검출되지 않으면, 본원에 기재된 방법이 사용되어, 적어도 1회의 후속 백신이 대상체에 투여될 수 있다(예컨대 1회 이상의 부스터샷). 대안적으로 만일 SARS-CoV-2 핵산이 시료중에서 검출되면, 적어도 1회의 후속 백신이 대상체에 투여될 수 있거나 투여되지 않을 수 있다.
6. 키트
본 발명은 또한 시료중 SARS-CoV-2(2019-nCoV)를 증폭 및 검출하기 위한 키트를 제공한다. 이 키트는 본원에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 적어도 1개를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 올리고뉴클레오티드 세트 또는 군을 포함한다. 키트는 핵산 서열을 증폭 및 검출하기 위한 시약과, SARS-CoV-2를 증폭 및 검출하기 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다. 전술된 방법과 관련하여 본원에 제시된 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 세트에 관한 설명은 또한 본원에 기재된 키트의 양태와 동일한 양태에 적용될 수 있다. 이러한 시약 다수가 본원에 기재되어 있거나, 또는 당 분야에 공지되어 있으며, 상업적으로 입수 가능하다. (본원에 기재된 올리고뉴클레오티드에 더하여) 키트에 포함되기 적합한 시약의 예로서는 핵산 증폭 반응에 사용된 종래의 시약, 예컨대 중합효소 활성을 가지는 효소 1개 이상, 효소 보조인자(예컨대 마그네슘 또는 니코틴아미드 아데닌 2뉴클레오티드(NAD)), 염, 완충제, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 3인산염(dNTP/rNTP; 예컨대 데옥시아데노신 3인산염, 데옥시구아노신 3인산염, 데옥시시토신 3인산염 및 데옥시티미딘 3인산염) 차단제 및 표지화제 등을 포함한다. 증폭 반응에 사용된 기타 시약은 닉형성 효소, 단일 가닥 결합 단백질, 헬리카아제 및 위치특이적재조합촉진효소 등을 포함한다.
키트는 본원에 기재된 증폭 시약 및 올리고뉴클레오티드를 사용하기 위한 지침, 예컨대 시험 시료를 가공하고, 핵산 분자를 추출하고/추출하거나 시험을 수행하기 위한 지침; 그리고 수득된 결과를 해석하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 지침은 인쇄될 수 있거나 전자 제공될 수 있다(예컨대 DVD 또는 CD로 제공될 수 있거나, 인터넷 자원을 통한 검토 또는 획득을 위해 입수 가능하다).
키트는 고체 형태(예컨대 동결건조된 형태) 또는 액체 형태로 공급될 수 있다. 본 발명의 키트의 다양한 구성성분은, 선택적으로 각각의 구성성분(예컨대 증폭 올리고뉴클레오티드, 프로브 올리고뉴클레오티드 또는 완충제)별로 상이한 용기(예컨대 바이알, 앰플, 시험관, 플라스크 또는 보틀)내에 담길 수 있다. 각각의 구성성분은, 일반적으로 자체의 용기 각각에 분액되거나, 농축된 형태로 제공되기에 적합할 것이다. 증폭/검출 검정의 임의의 단계를 수행하기 적합한 기타 용기도 또한 제공될 수 있다. 개별 용기는, 바람직하게 시판을 위해 밀폐된 포장으로 유지된다.
키트는 생물 시료를 수득하기 위한 면봉을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 키트는 생물 시료에 접근하기 위한 시약, 및/또는 생물 시료로부터 핵산을 추출/단리하기 위한 시약을 포함한다.
7. 실시예
실시예 1
서열 번호 3을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 5를 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드와 함께 다양한 제1 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR에 의해 SARS-CoV-2(2019-nCoV) 핵산 서열의 증폭을 수행하였다.
SARS-CoV-2 시료는 SARS 관련 코로나바이러스 2, 즉 단리주 USA-WA1/2020(BEI Resources)로부터 유래한 게놈 RNA였다. 게놈 RNA는, SARS-CoV-2, 즉 단리주 USA-WA1/2020 감염된 세르코피테쿠스 아에티옵스(Cercopithecus aethiops) 신장 상피(Vero E6, ATCC®CRL-1586TM) 세포로부터 수득한 상청액 및 세포 용해 제조물로부터 추출하였다. 바이러스 게놈 RNA는 세포 핵산 및 담체 RNA를 바탕으로 한다.
PCR 순환 매개변수
Figure pct00003
PCR 반응 혼합물은 SARS-CoV-2, 서열 번호 3과, 서열 번호 1, 10, 12 ~ 14 또는 16중 하나를 포함하는 COVID-19 프라이머 세트(프라이머 세트 1)와, 서열 번호 5의 프로브 올리고뉴클레오티드를 포함하였다. 특히 내부 대조군 핵산과 이 내부 대조군에 대한 프라이머 세트도 또한 양성 대조군으로서 포함시켰다. 반응 혼합물은 또한 반응 완충제, dNTP, 참조기준 염료, DNA 중합효소(rTth)를 당 분야에 통상 사용되는 농도만큼 포함하였다.
표 3은 각각의 프라이머 세트에 대한 결과를 보여준다. SARS-CoV-2 표적 및 내부 대조군 RNA 둘 다를 순환 조건하에서 증폭하였다.
Figure pct00004
제2 COVID-19 프라이머 세트(프라이머 세트 2)를 포함하는 추가 PCR 반응을, 제1 COVID-19 프라이머 세트 선별군으로 수행하였다. 제2 COVID-19 프라이머 세트는 서열 번호 2 및 서열 번호 4를 포함하였다. 반응은 또한 프로브 올리고뉴클레오티드로서 서열 번호 6을 포함하였다. 표 4에 보인 바와 같이, 프라이머 세트 2는 임의의 프라이머 세트 1에 비해 더 강력한 신호(dRn)를 제공하였지만, 프라이머 세트 1을 프라이머 세트 2에 부가하였을 경우에 가장 강력한 전체 신호가 제공되었다.
Figure pct00005
실시예 2
증폭 올리고뉴클레오티드 및 프로브 올리고뉴클레오티드의 다양한 조합과 함께, 재조합효소-중합효소 증폭(RPA)을 사용하여 SARS-CoV-2(2019-nCoV) 핵산 서열의 증폭을 수행하였다. 시험한 조합들을 표 5에 보였다. 조합 1은 표적 영역에 인도되었던 반면에, 조합 2 ~ 5는 제2 표적 영역에 인도되었다.
Figure pct00006
도 1a 및 도 1b는 5개의 조합 각각에 대한 경시적 dRn 값 그래프를 보여준다. SARS-CoV-2 표적을 반응 조건하에서 조합 모두에 대해 증폭하였는데, 이때 반응 개시시부터 10분 이내에 일어난 증폭 수준은 검출 가능한 정도였다. 조합 1, 4 및 5에 있어서 표적 증폭은 4분 ~ 6분 이내에 검출되었다(도 1a 및 도 1b).
실시예 3
GenBank(2020년 4월 28일)에서 입수가능한 전장 SARS-CoV-2 서열 모두와의 상동성에 대하여 SARS-CoV-2 프라이머 및 프로브 각각의 서열을 분석함으로써 포괄성을 입증하였다. 26개 국가/지역(오스트레일리아, 브라질, 중국, 콜롬비아, 체코공화국, 프랑스, 그리스, 홍콩, 인도, 이란, 아스라엘, 이탈리아, 말레이지아, 네팔, 네덜란드, 파키스탄, 페루, 남아프리카, 대한민국, 스페인, 스리랑카, 스웨덴, 대만, 터키, 미국 및 베트남)으로부터 얻은 전장 SARS-CoV-2 게놈 서열 총 1383개를 분석하였다. 99.5%(1376/1383)가 SARS-CoV-2 프라이머 및 프로브 서열 모두에 대하여 100%의 동일성을 보였고, 0.5%(7/1383)는 프라이머 또는 프로브중 1개에 대하여 1개의 미스매칭부를 함유하였다.
GISAID 데이터베이스(2020년 5월 5일)에서 입수가능한 전장 SARS-CoV-2 서열 모두와의 상동성에 대하여 SARS-CoV-2 프라이머 및 프로브 각각의 서열을 분석함으로써 포괄성을 추가로 입증하였다. 81개 국가/지역으로부터 얻은 전장 SARS-CoV-2 게놈 서열 총 14,964개를 분석하였는데; 1.1%(170/14,964)는 1개의 미스매칭부를 함유하였고; 0.04%(6/14964)는 2개의 미스매칭부를 함유하였고; 0.007%(1/14964)는 4개의 미스매칭부를 함유하였다.
실시예 4
공지의 SARS CoV-2 양성 시료, 음성 시료 및 비 SARS CoV-2 호흡기 유래 시료를 사용하여 실시간 RT-PCR(Abbott Alinity m System)를 통해, 개시된 프라이머 세트를 평가하였다. 표 6에 보인 바와 같이, 공지된 일련의 양성 시료 희석물은 검출 한계가 1 mL당 100개 복사체임이 확정되었다. 검출 한계(LOD)는, 모든(진양성(true positive)인) 반복실험대상중 95% 이상이 시험 결과 양성으로 판정될 때 SARS-CoV-2의 검출가능 최저 농도로서 정의되었다.
Figure pct00007
앞서 시험한 동결 비인두 면봉 109개를, 양성(PPA) 및 음성(NPA) 일치율 %에 대해 상기 사용된 바와 같이 실시간 PCR 검정에서 재시험하였다(표 7). PPA는 89.8%(53/59)이고, NPA는 98%(49/50)인 것으로 확인되었다
Figure pct00008
Abbott m2000 RealTime SARS-CoV-2 검정을 사용하여 임상 상관관계, 교차반응성 및 검출한계(표 8)도 또한 평가하였다.
Figure pct00009
Abbott m2000 RealTime SARS-CoV-2 및 Alinity m SARS-CoV-2 실시간 RT-PCR 검정 둘 다에 의해 총 104개의 표본을 분석하였다. 2회 검정간 양성 일치율(PPA) %는 100%(47/47)였고, 음성 일치율(NPA) %는 96.5%(55/57)였다. 그 결과를 표 9 및 표 10에 요약하여 두었다.
Figure pct00010
Figure pct00011
실시예 5
영국에서 처음 동정된 SARS-CoV-2 B.1.1.7 균종은, 증가한 전파력과 스파이크 유전자 돌연변이간 연계성이 관찰되었던 관계로 평가의 가장 큰 관심사였다. 스파이크 유전자 돌연변이가 주로 B.1.1.7 계통을 한정할 때, 게놈 전반에 걸쳐 추가 돌연변이가 존재함은 다양한 진단 검정에서 그 결과에 영향을 미칠 수 있었다.
GISAID(N=1787, 2020년 12월 21일 승인)의 B.1.1.7 계통 서열의 초기 컴퓨터 시뮬레이션 관찰은, 본원에 기재된 프라이머, 프로브 및 방법의 성능/결과에 있어 계통 한정 돌연변이 우려가 없음을 규명하였다. 바이러스 배양액(BEI NR-54011, EPI_ISL_751801)을 65℃에서 30분 동안 열 비활성화한 다음, 일련의 희석배수로 희석시켜 시험하였다. 여러 희석농도가, 앞서 다른 균종을 통해 관찰된 “예상 범위”내에 속함이 확인되었다(표 11). 이러한 결과는, 본 프라이머, 프로브 및 방법이 B.1.1.7 균종을, 신뢰할 수 있을 정도로 검출할 수 있을 것이라는 컴퓨터 시뮬레이션 예측을 확증시켜 주었으며, 이는 영국 공중보건국에 의해 수행된 최근의 평가 결과와 일치한다.
나머지 환자의 비인두 면봉 표본으로 추가 평가를 수행하였다. 모든 표본에 대한 게놈 서열이 완성되었는데, 이는 B.1.1.7 계통에 속하는 것으로 확인되었다. 잔여 부피(remaining volume)는 제한되어 있기 때문에, 나머지 VTM(바이러스 운반 매체)을 시험전 5배 ~ 62.5배 희석하였다. 모든 표본에서 충분한 양만큼 검출되었다(표 11).
Figure pct00012
B.1.351 계통은 남아프리카에서 처음에 동정된 이래 수십 개 국가로 확산되어 나갔는데, 초기 보고서에는 이 변이체가 중화 항체를 회피할 수 있다고 명시되어 있었다. B.1.351 계통의 독특한 돌연변이 프로필은 주로 스파이크 유전자 돌연변이 K417N, E484K 및 N501Y에 의해 한정되었지만, 게놈 전반에 추가 돌연변이가 존재함은 다양한 진단 검정 결과에 영향을 미칠 수 있었다.
GISAID(N=195, 2020년 12월 27일 승인)의 B.1.351 계통 서열을 대상으로 한 컴퓨터 시뮬레이션 초기 관찰은, 어떤 계통 한정 돌연변이가 본원에 기재된 프라이머, 프로브 및 방법의 성능/결과에 우려가 될지 규명하지 못했다. 바이러스 배양액 2개(BEI NR-54008, NR-54009)를 열 비활성화한 다음, 일련의 희석배수로 희석시켜 시험한 결과, 앞서 다른 균종을 통해 관찰된 범위내에 속함이 확인되었다(표 12). 이러한 결과는, 본 프라이머, 프로브 및 방법이 B.1.351 계통을, 신뢰할 수 있을 정도로 검출할 수 있을 것이라는 컴퓨터 시뮬레이션 예측을 확증시켜 주었다.
Figure pct00013
전술된 상세한 설명 및 첨부된 실시예는 단지 예시적인 것으로서, 첨부된 특허청구범위 및 그 균등범위에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위에 대한 제한으로 간주되어서는 안 된다는 것이 이해된다.
개시된 구현예에 대한 다양한 변경 및 변형예는 당업자에게 자명할 것이며, 그것의 사상 및 범위를 벗어나지 않고도 달성될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Ionian Technologies, LLC <120> ASSAYS FOR DETECTING CORONAVIRUS DISEASE 2019 (COVID-19) <130> ALERE-38391.206 <150> 63/155,599 <151> 2021-03-02 <150> 63/049,237 <151> 2020-07-08 <150> 63/004,773 <151> 2020-04-03 <150> 63/000,971 <151> 2020-03-27 <150> 63/000,304 <151> 2020-03-26 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 aaagaagaag gctgatgaaa ct 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 tgcttagaat tatggcctca ct 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 tggagaaatc atccaaatct g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 atacttgagc acactcatta g 21 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 ccttaccgca gagacagaag aaacagc 27 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 cgtgttgtag cttgtcacac cgtttcta 28 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 cgactccaca cggagtcgca ttgtgcaaac ttt 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 cgactccaca cggagtcgtg ggaacactgt aga 33 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 ctttaatgtt tactgtagag aataaaacat taaag 35 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 aaagaagaac gctgatgaaa ct 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 aaagaagaag cctgatgaaa ct 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 aaagaagaac gctgatgaaa c 21 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 gagcctaaaa aggacaaaaa gaag 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 gagcctaaat aggacaaaaa gaag 24 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 ggctgatgaa actcaagc 18 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 attcccacca acagagcct 19 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 taacatgctt agaattatgg cctcacttgt tc 32 <210> 18 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 cttgctcgca aacatacaac gtgttgtagc tgtcacaccg tttctat 47 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 tgaccatttc actcaatact tgagcacact c 31 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 aaagaagaag gctgatgaaa ctcaagcctt ac 32 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 gctgatgaaa ctcaagcctt accgcagaga ca 32 <210> 22 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 agccttaccg cagagacaga agaaacagca aacttgactc ttcttcctg 49 <210> 23 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 cgcagagaca gaagaaacag caaactgtga ctctcttcct gctgcaga 48 <210> 24 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 agacagaaga aacagcaaac tgtgactctt cttctgctgc agatttgga 49 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 actgctcatg gattgttgca attgtttgga ga 32 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 ttgagtcagc actgctcatg gattgttgca at 32

Claims (21)

  1. 서열 번호 17에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 19에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 18에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드; 또는
    서열 번호 20 또는 21에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 25 또는 26에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 22 ~ 24중 임의의 것에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드; 또는
    이것들의 조합
    을 포함하되, 각각의 프로브 올리고뉴클레오티드는 검출가능 표지를 포함하는, 시료중 SARS-CoV-2의 재조합효소-중합효소 증폭 및 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 20에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 중폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 25에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하며, 상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 22 또는 23에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 세트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 증폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 21에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하고, 상기 제2 중폭 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 25 또는 26에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하며, 상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 24에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 세트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출가능 표지는 형광단인 세트.
  5. 시료중 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 방법으로서,
    제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 세트 및 증폭을 위한시약을 시료와 접촉시키는 단계;
    재조합효소-중합효소 증폭을 이용하여 시료중 존재하는 표적 SARS-CoV-2 핵산 서열 1개 이상을 증폭시키는 단계;
    증폭된 표적 SARS-CoV-2 핵산 서열 1개 이상에 올리고뉴클레오티드 프로브 1개 이상을 혼성화하는 단계; 및
    검출가능 표지로부터 신호를 측정함으로써, 증폭된 SARS-CoV-2 표적 핵산 서열 1개 이상과 프로브 올리고뉴클레오티드 서열 1개 이상이 혼성화되었는지 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 검출가능 표지로부터 신호 1개 이상이 발생함은, 상기 증폭된 SARS-CoV-2 표적 핵산 서열 1개 이상에 상기 프로브 올리고뉴클레오티드 1개 이상이 혼성화되었음을 나타내는 것인 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 세트로부터 유래한 상기 제1 증폭 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드를, 재조합효소 제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭을 위한 시약은 중합효소; 재조합효소; 재조합효소 담지 단백질; 단일 가닥 결합 단백질; 완충제; 데옥시리보뉴클레오티드; 또는 리보뉴클레오티드 3인산염; 밀집화 제제; ATP, ATP 유사체 또는 ATP 발생 시스템; 또는 이의 조합을 포함하는 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료는 비강 면봉 또는 비강 브러쉬, 타액, 점액, 혈액, 혈철, 혈장 또는 대변을 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 세트 적어도 1개; 또는
    서열 번호 17 ~ 26중에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는올리고뉴클레오티드 임의의 것
    을 포함하는, 시료중 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 키트.
  11. 제10항에 있어서, 핵산 서열을 증폭 및 검출하기 위한 시약 및/또는 사용 지침을 추가로 포함하는 키트.
  12. 시료중 SARS-CoV-2를 증폭 및 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 군으로서,
    서열 번호 2에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 그리고 서열 번호 6에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 제1 세트를 포함하되, 여기서 프로브 올리고뉴클레오티드는 검출가능 표지를 포함하는 올리고뉴클레오티드 군.
  13. 제12항에 있어서,
    서열 번호 11 및 15중 임의의 것에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제1 증폭 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 3에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 및 서열 번호 5에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 프로브 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 제2 세트를 추가로 포함하되, 상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 검출가능 표지를 포함하는 올리고뉴클레오티드 군.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 검출가능 표지는 형광단인 올리고뉴클레오티드 군.
  15. 시료중 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 방법으로서,
    제12항 내지 제14항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 군 및 증폭을 위한 시약을 시료와 접촉시키는 단계;
    시료중 존재하는 표적 SARS-CoV-2 핵산 서열 1개 이상을 증폭시키는 단계;
    증폭된 표적 SARS-CoV-2 핵산 서열 1개 이상에 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 1개 이상을 혼성화하는 단계; 및
    검출가능 표지로부터 신호를 측정함으로써, 증폭된 SARS-CoV-2 표적 핵산 서열 1개 이상과 프로브 올리고뉴클레오티드 서열 1개 이상이 혼성화되었는지 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 검출가능 표지로부터 신호 1개 이상이 발생함은, 상기 증폭된 SARS-CoV-2 표적 핵산 서열 1개 이상에 상기 프로브 올리고뉴클레오티드 1개 이상이 혼성화되었음을 나타내는 것인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 세트로부터 유래한 상기 제1 증폭 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드를, 재조합효소 제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭을 위한 시약은 닉형성 효소, 중합효소, 단일 가닥 결합 단백질, 재조합효소 제제, 헬리카아제, 위치특이적재조합촉진효소, 효소 보조인자, 완충제, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 3인산염 또는 이것들의 조합을 포함하는 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료는 비강 면봉 또는 비강 브러쉬, 타액, 점액, 혈액, 혈청, 혈장 또는 대변을 포함하는 방법.
  20. 시료중 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 키트로서,
    제12항 내지 제14항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 군 적어도 1개; 또는
    서열 번호 2 ~ 6, 11 및 15에 대한 유사도가 적어도 70%인 핵산 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 임의의 것을 포함하는 키트.
  21. 제20항에 있어서, 핵산 서열을 증폭 및 검출하기 위한 시약 및/또는 사용 지침을 추가로 포함하는 키트.
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