CN1878863A - 核酸的浓缩精制方法及装置 - Google Patents

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Abstract

以往的核酸精制浓缩方法由于使用剧毒药品，因此需要尖端的化学设备，利用环境受到限制。而且，操作麻烦，需要高速离心等，难以自动化，难以得到高的精制精度。另外，使用了柱/过滤器的精制方法中，当为杂质混入较多的样品时，有可能引起堵塞，从而精制效率降低，需要进行离心或抽吸操作，难以自动化。而通过使表面活性剂(3和4)吸附试样中存在的杂质(2)，从而显示与核酸(1)不同的行为，则使杂质(2)与核酸(1)分离，通过利用阳离子表面活性剂(4)和非离子表面活性剂(3)使核酸(1)以外的杂质(2)带电并置于电场中，则从含有杂质(2)的检体中将核酸(1)分离精制，成为核酸(1)的浓缩或易于浓缩的状态。

Description

核酸的浓缩精制方法及装置
技术领域
本发明涉及进行检体前处理的装置。更详细地说是涉及在核酸检查中，用于通过菌体等将成为检查对象的核酸取出的前处理装置。
背景技术
近年来，人类基因组的解读取得发展，各种生命现象与基因之间的关联也日渐明朗。而且，由此成果，医学和医疗将视野从病态扩展到病因、从治疗扩展到预防。这里，基因检查技术成为重要的基础。
基因检查可进行培养困难的病原微生物的鉴定检查、抗生素治疗中和感染初期的病原微生物的检测、疑为转移抗体时的抗原检测、病原微生物的传染源调查、亲子鉴定等个体鉴别、以及白血病和实体瘤的基因水平的病型诊断、遗传病的确诊等以往在临床检查上困难的检查。并且，直至获得结果的时间短于使用菌的培养的方法，在培养花费时间的细菌的检测中发挥威力。而且，由于DNA随保存条件而稳定，因此也能够从冷冻活组织检查材料、骨等过去的检体中进行检查。
另外，在近年有增加倾向的性传染病的检查中，为了谋求扩大检查机会，基因检查引起人们的注意。
作为以往的核酸的精制浓缩方法，已知的有使用了苯酚/氯仿/乙醇的精制方法、使用了吸附核酸的柱/过滤器的精制方法、使用了磁性二氧化硅微珠的精制方法等。
作为从平板状的电泳凝胶中回收核酸的方法，已知的有在制成的凝胶中电泳核酸，将回收装置移动至凝胶中目标核酸的位置，进一步通过电泳回收目标核酸的方法(例如参照专利文献1)。
另外已知有在平板状的电泳凝胶中，将核酸进行电泳而分离目标核酸，在目标核酸的条带附近插入回收芯片从而将核酸回收的方法(例如参照专利文献2)。
但是，在以往核酸的精制浓缩方法中，使用了苯酚/氯仿/乙醇的精制方法由于使用剧毒药品，因此需要尖端的化学设备，利用环境受到限制。而且，操作上很费工夫，同时需要高速离心，自动化困难。并且，难以得到高的精制精度。
使用了吸附核酸的柱/过滤器的精制方法由于在流通溶液的同时来进行，因此杂质等混入量多的样品容易引起柱/过滤器的堵塞，精制效率有可能降低。而且，必须进行离心或抽吸操作，因此难以自动化。
使用了磁性二氧化硅微珠的精制方法中，当通过磁铁进行的微珠回收失败时、或二氧化硅微珠从磁性体上脱落时，二氧化硅有可能混入至样品中。而且难以得到高的回收率。
而且，在从平板状的电泳凝胶中回收核酸的以往技术中，必需平板状的电泳凝胶，同时必须在此平板状电泳凝胶中一端进行电泳、将目标核酸相应位置的凝胶进行处理。
用于电泳中的凝胶不耐冲击，随着生成过程的不同，有时特性有很大不同。因此，通常在进行了电泳之后，利用紫外线将电泳凝胶中目标核酸的位置进行识别，之后处理目标核酸含量多的部分。
因此，在基因检查等中利用此方法时，一次检查所需要的时间延长。另外，用于电泳的凝胶大且凝胶的不均导致核酸的条带中产生污点，由此有可能核酸的回收率降低。而且，凝胶大的时候，电泳所必需的电力也变大。
专利文献1：日本实开平5-88296号公报
专利文献2；日本特开平8-327595号公报
发明内容
本发明所要解决的问题为，在核酸的精制浓缩方法中，需要复杂且尖端的化学设备。
为了解决上述课题进行了各种试验，结果发现，通过使表面活性剂吸附检体中存在的杂质，使其显示出与核酸不同的行为，由此使杂质与核酸分离。
而且，利用阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂使核酸以外的杂质带电，并置于电场中，由此从含有杂质的检体中分离精制核酸，成为核酸的浓缩状态或易于浓缩的状态。
图1为表示在表面活性剂存在下利用电泳的核酸浓缩构成的示意图。
检体中含有核酸1和杂质2。在此检体中混合表面活性剂。作为表面活性剂，使用非离子表面活性剂3和阳离子表面活性剂4。
混合于检体中的表面活性剂吸附杂质2。可通过非离子性表面活性剂进行带电量的调节，也可通过添加氯化钠等盐类、聚阴离子性物质(肝素、葡聚糖硫酸、DNA)来调节核酸与阳离子表面活性剂的吸附。
阳离子表面活性剂4所吸附的杂质2带上正电荷。然后，可以利用电泳将表面活性剂所吸附的杂质2与表面活性剂未吸附的或者吸附量少的核酸1分离。由此，能够容易地将杂质2从检体中除去，可将核酸1浓缩。
接着，对核酸浓缩的方法进行说明。
此核酸浓缩的方法中，通过进行2次电泳来确实地进行核酸的浓缩。在第一电泳中将检体中多余的离子除去，在第二电泳中进行检体中的核酸浓缩。
作为添加于含有核酸的检体中的非离子表面活性剂，可使用例如聚环氧乙烷对叔辛基苯基醚(Triton类表面活性剂等)、聚环氧乙烷山梨糖醇酐烷基酯(Tween类表面活性剂等)、聚环氧乙烷烷基醚(Brij类表面活性剂等)等非离子性表面活性剂，具体地说可举出例如TritonX-100、Tween-20、Brij35等。优选1％的TritonX-100。由于该表面活性剂的添加而细胞膜、核膜不被溶解时，加入非离子表面活性剂后在96℃下进行10分钟的加热处理。
作为检体中的阳离子表面活性剂，可列举出zephiramine、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基吡啶鎓甲基氯化铵、癸基吡啶鎓氯化物(DPC)，优选加入100μL0.2％DPC。
也可在检体中同时加入非离子表面活性剂和阳离子表面活性剂后，进行加热处理。
为了在检体中加入表面活性剂进行前处理，即便核酸在大肠杆菌等原核细胞中存在，由于细胞壁被表面活性剂破坏，因此也能够将大肠杆菌的培养液等作为检体使用，也能够容易地进行检体前处理的操作。
如此进行检体的前处理，施加100V的直流电压，进行10分钟电泳，除去检体中多余的离子。
其后，施加125～150V的直流电压，进行120分钟电泳，在正极侧获取核酸。
对进行检体电泳的电泳槽的构成进行说明。
首先，对第一电泳进行说明。
图2所示为第一电泳的泳动槽构成。
在电泳槽5中设有样品槽6、将正极侧和负极侧分开的隔壁9。样品槽6的构成为，与隔壁9相贯通，一端向正极侧突出、另一端向负极侧突出。样品槽6的两端开口，两端的开口部分别用凝胶8和8封闭。这样，在样品槽6内产生电位差，进行核酸和表面活性剂所吸附的杂质的电泳。
在检体中添加非离子表面活性剂和阳离子表面活性剂，进行加热处理后，将检体注入至样品槽6。
然后，在电极间施加100V的电压，进行10分钟的电泳。
由此，除去检体中所含的多余离子。
在将检体中所含的多余离子除去后，通过第二电泳进行核酸的浓缩。
对第二电泳进行说明。
在第二电泳中，将在于第一电泳中注入有检体的样品槽中连接有核酸回收槽的部分配置在电泳槽内，进行电泳。
图3所示为第二电泳的泳动槽构成。
在电泳槽5中设有样品槽6、回收槽7、将正极侧和负极侧分开的隔壁9。样品槽6插入在隔壁9中，向负极侧突出。回收槽7插入在隔壁9中，向正极侧突出。样品槽6和回收槽7在隔壁9的配设部连接，介由凝胶8连接在一起。
样品槽6的两端开口，两端的开口部分别用凝胶8和8封闭。回收槽7的两端开口，负极侧由凝胶8封闭，正极侧由超滤膜11封闭。
在如此构成的电泳槽中，在电极间施加120V的电压，进行120分钟的电泳。
这样，通过在电泳槽中进行第二电泳，能够将除去多余离子的检体进行电泳，可以在回收槽7中有效地将核酸回收。另外，在回收槽7的正极侧上设有超滤膜11，核酸不会从回收槽7中被排出，而是留在回收槽7中。因此，能够提高核酸的回收效率。
根据检体状态，也可不进行第一电泳，而进行第二电泳。通过在连接于回收槽7的样品槽6中注入进行了前处理的检体并进行电泳，能够容易地进行核酸的浓缩。由于检体中存在的多余离子可透过超滤膜，因此不会影响核酸的回收。
即本发明的第一发明为，使用了电泳的核酸的浓缩精制方法，对含有核酸的试样中的杂质进行带电量的调节后，将试样置于电场中，进行核酸的浓缩精制。
第二发明为，利用电泳进行的核酸的浓缩精制方法，在含有核酸的试样中加入阳离子表面活性剂，对试样中杂质的带电量进行调节，将该试样置于电场中进行电泳，由此进行核酸的浓缩精制。
第三发明为，利用电泳进行的核酸的浓缩精制方法，在含有核酸的试样中加入阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂，对试样中杂质的带电量进行调节，将该试样置于电场中进行电泳，由此进行核酸的浓缩精制。
第四发明为，在通过阳离子表面活性剂的吸附来对核酸以外的带电量进行调节的同时，通过非离子表面活性剂的添加量来调节阳离子表面活性剂的吸附量。
第五发明为，构成一种装置，其为在试样中添加非离子表面活性剂和阳离子表面活性剂，将该试样进行电泳，在阳极侧进行核酸的浓缩精制的装置。
第六发明为，进行电泳的核酸的浓缩精制装置，此装置的构成为，通过抑制扩散的导电性分离体将侧面由绝缘体构成的容器内隔开，在该容器内构成试样投入室和核酸回收室，该容器的端部分别经由缓冲液槽与电极相连接。
本发明的第一发明为使用了电泳的核酸的浓缩精制方法，由于采取对含有核酸的试样中的杂质进行带电量的调节后，将试样置于电场中进行核酸的浓缩精制的方法，因此，能够使电泳中核酸和杂质的行为有所不同，从而有效地将核酸分离。杂质和核酸的行为差异可通过电荷进行调节，可容易地进行行为的控制。
可以不需利用离心分离装置等就紧凑地构成进行核酸浓缩的装置。
第二发明为利用电泳的核酸的浓缩精制方法，在含有核酸的试样中加入阳离子表面活性剂，对试样中杂质的带电量进行调节，将该试样置于电场中进行电泳，由此可进行核酸的浓缩精制，由于使用阳离子表面活性剂，因此操作容易，可容易地确保操作安全。
并且，通过使对杂质的吸附量增大，能够增大电泳中核酸和杂质的行为差别，可有效地分离核酸。而且，由于杂质向与核酸相反的方向泳动，因此能够防止杂质对精制的阻碍，可容易地进行核酸的精制。
第三发明为利用电泳进行的核酸的浓缩精制方法，由于在含有核酸的试样中加入阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂，对试样中杂质的带电量进行调节，将该试样置于电场中进行电泳，由此进行核酸的浓缩精制，因此可通过阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂的比例来调节阳离子表面活性剂的吸附量，可容易地调节电泳中的杂质的行为。
另外，通过使非离子表面活性剂吸附核酸，还有可能阻碍阳离子表面活性剂对核酸的吸附。
第四发明中，由于在通过阳离子表面吸附剂的吸附来对核酸以外的带电量进行调节的同时，通过非离子表面活性剂的添加量来调节阳离子表面活性剂的吸附量，因此通过容易的操作，就可操作阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂对杂质的吸附比例。而且通过容易的操作可进行杂质带电量的调节。另外，通过使非离子表面活性剂吸附核酸，还有可能阻碍阳离子表面活性剂对核酸的吸附。
第五发明中，由于构成一种装置，其为在试样中添加非离子表面活性剂和阳离子表面活性剂，将该试样进行电泳，在阳极侧进行核酸的浓缩精制的装置，因此通过简单的构成，就能精制试样中的核酸，同时能够控制核酸的行为，因此在维持安全性的同时，可紧凑地构成浓缩精制装置。
第六发明为进行电泳的核酸的浓缩精制装置，由于此装置的构成为，通过抑制扩散的导电性分离体将侧面由绝缘体构成的容器内隔开，在该容器内构成试样投入室和核酸回收室，该容器的端部分别经由缓冲液槽与电极相连接，因此通过简单的构成就能构成浓缩精制装置，可构成在降低制作所需成本的同时、控制容易且安全性高的装置。
附图说明
[图1]为表示在表面活性剂存在下利用电泳的核酸浓缩构成的示意图。
[图2]为表示第一电泳的泳动槽构成的图。
[图3]为表示第二电泳的泳动槽构成的图。
[图4]为表示第一电泳槽的构成的图。
[图5]为表示第二电泳槽的构成的图。
[图6]为表示取样单元构成的立体图。
[图7]为取样单元的平面图。
[图8]为取样单元的侧面图。
[图9]为取样单元的侧面剖面图。
[图10]为连接部的立体图。
[图11]为连接部的侧面剖面图。
[图12]为过滤部的侧面剖面图。
[图13]为表示分离单元的组合构成的图。
[图14]为回收溶液的UV光谱。
[图15]为显示电泳装置整体构成的图。
[图16]为电泳单元的立体图。
[图17]为电泳单元的侧面剖面图。
[图18]为利用电泳单元的精制过程前期的示意图。
[图19]为同一精制过程后期的示意图。
[图20]为表示电泳单元的组装构成的侧面剖面图。
[图21]为表示电泳单元的组装构成的立体图。
[图22]为显示第1模块的构成的图。
[图23]为显示第2模块的构成的图。
[图24]为密封件的正面图。
[图25]为显示淋菌基因组精制的比较结果的图。
[图26]为将显示DNA浓缩结果的样品进行电泳后的凝胶的图。
符号说明
1核酸                2杂质
3非离子表面活性剂    4阳离子表面活性剂
5电泳槽              6样品槽
9隔壁
具体实施方式
通过使用了表面活性剂和电泳的方法，实现了构成一种不使用危险药品、且精制率高的核酸浓缩装置的目的。
实施例1
接着，对本发明的实施例进行说明。
首先，对用于电泳的电泳槽的构成进行说明。
图4为显示第一电泳槽的构成的图。
电泳槽21被隔壁24和25分成负极侧槽22和正极侧槽23。隔壁24和25设置于电泳槽21的中央部，在隔壁24和25上装有取样单元26。取样单元26的一端向负极侧槽22突出，另一端向正极侧槽23突出。在取样单元26的负极侧填充有凝胶，在侧面上开有样品注入用的注入孔。注入孔在电泳时由栓封闭。
然后，在负极侧槽22插入负极，在正极侧槽23插入正极，对电泳槽21施加电压。
接着，对电泳槽的另一构成例进行说明。
图5为显示第二电泳槽的构成的图。
在第二电泳中，电泳槽21被隔壁24和25分成负极侧槽22和正极侧槽23。隔壁24和25设置于电泳槽21的中央部，在隔壁24和25上装有分离单元32。分离单元32的一端向负极侧槽22突出，另一端向正极侧槽23突出。在负极侧槽22插入负极，在正极侧槽23插入正极，对电泳槽21施加电压。
分离单元32连接三个构件而构成，由取样单元26、连接部33和过滤部34构成。在取样单元26和连接部33之间，以及连接部33和过滤部34之间装有O形环来确保连接，同时防止缓冲液的流出。
在取样单元26的负极侧填充有凝胶，在连接部33的正极侧也填充有凝胶。而且，在过滤部34上装有超滤膜。
使用这种电泳槽进行核酸的浓缩。
首先，在第一电泳中，将前处理过的样品从注入孔注入，用栓封闭。然后，在电泳槽21上按照取样单元26的上面稍露出液体的方式设置取样单元26。其后，施加100V的直流电压，进行20分钟的电泳。由此将样品中的多余离子除去。缓冲液为1×TAE溶液，由40mM Tris、40mM冰醋酸、1mM EDTA制备，pH为8.0。
然后，在第一电泳槽21中将多余离子除去后，将连接部33和过滤部34连接于取样单元26。各连接处安装O形环防止漏液。
在连接部33中预先装入以6∶4的比例混合有100％乙醇和1×TAE的溶液，在取样单元26内预先装入TE-1(10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、pH为8.0)。在过滤部34内预先装入TE-1。
接着，对取样单元26、连接部33、过滤部34的构成进行说明。
首先说明取样单元26的构成。
图6为显示取样单元的构成的立体图，图7为取样单元的平面图，图8为取样单元的侧面图，图9为取样单元的侧面剖面图。
取样单元26是在容器中保持凝胶的构成，是对Millipore公司生产的Microcon(注册商标)YM-3Microcon离心式过滤部件进行加工利用的单元，拆掉内部的超滤膜，在内部开有直径为5mm的孔。当然，只要可得到同样效果，并不限定于此。
取样单元26由筒体41和底座43构成。筒体41连接于底座43，设有用于注入样品的注入孔42。底座43构成为阶梯式圆柱状，在底座43中构成有连通于上下面的孔44。
筒体41内设有凝胶48。凝胶48的厚度为数mm左右，为堵塞筒体41的开口部的构成。由此，从注入孔42被供给的检体被供给至凝胶48的内侧。
对连接部33的构成进行说明。
图10为连接部的立体图，图11为连接部的侧面剖面图。
连接部33也与取样单元26同样，是加工利用Millipore公司生产的离心式过滤部件的部分，拆掉内部的超滤膜，在内部开有直径为5mm的孔。
连接部33由筒体41和底座43构成。筒体41与底座43相连接。底座43构成为阶梯式圆柱状，在底座43中构成有连通于上下面的孔44。
筒体41内设有厚度为数mm左右的凝胶48。凝胶48在筒体41中位于底座43的上面，防止与取样单元26之间的液体流动。
对过滤部34进行说明。
图12为过滤部的侧面剖面图。
过滤部35也是加工利用Millipore公司生产的离心式过滤部件的部分。
过滤部35由筒体41和底座43构成。筒体41底座43相连接，筒体41的长度短于取样单元26和连接部33而构成，大约短5mm。底座43构成为阶梯式圆柱状，在底座43中构成有连通于上下面的孔44。
在筒体41内，底座43的上面设有超滤膜49。由此可防止核酸的流出，进行核酸的浓缩。
接着，对核酸的浓缩操作例进行说明。
使用大肠杆菌培养液作为检体。通过上述第一电泳和第二电泳进行核酸的浓缩，利用吸光度测定对回收的核酸浓度进行研究。
检体使用100μL的大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)培养液。
在检体中加入100μL 1％Triton(注册商标)X-100溶液，在96℃下加热处理10分钟。
其后，加入100μL 0.2％DPC，制备电泳用试样。
使用0.5×TAE作为电泳用缓冲液。
使用1×TAE溶解琼脂糖。
1×TAE溶液由40mM Tris、40mM冰醋酸、1mM EDTA制备，pH为8.0。
将筒体41的开口侧置于上方静置连接部33，从筒体41的开口侧注入1％琼脂糖凝胶(SeaKem Gold agarose：TaKaRa)，以使得凝胶厚度达到3～7mm左右，使凝胶凝固。
将取样单元26也与连接部33同样，将筒体41的开口侧置于上方静置，从筒体41的开口侧注入1％琼脂糖凝胶(SeaKem Gold agarose：购自TaKaRa)，以使得凝胶厚度达到数mm左右。然后，在凝胶凝固后，将取样单元26翻过来，将凝固的凝胶流入至筒体41的开口侧。
电泳槽使用HU-6(AR BROWN公司生产)，电源使用MPSU-200(AR BROWN公司生产)。
将制备的电泳用试样从取样单元26的注入孔42注入，用栓封闭。
利用油灰将电泳槽分为正极侧和负极侧，在正极侧和负极侧中加入0.5xTAE。
然后，在油灰上按照取样单元26的上面稍露出缓冲液的方式设置取样单元26。
其后，施加100V直流电压，进行20分钟的第一电泳。
接着，在进行了第一电泳后的取样单元26上连接连接部33和过滤部34，构成分离单元，进行第二电泳。
说明第二电泳的操作例。
在连接部33中加入以6∶4的比例混合有100％乙醇和1×TAE的溶液。
在过滤部34内加入TE-1(10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、pH为8.0)溶液。
接着将连接部33和过滤部34连接于取样单元26，组合分离单元。
图13为显示分离单元的组合构成的图。
分离单元为将取样单元26、连接部33和过滤部34朝向同一方向组合的单元，在连接部33和过滤部34之间、以及连接部33和过滤部34之间分别装有O形环51，防止从分离单元的漏液。
利用油灰将电泳槽分为正极侧和负极侧，在正极侧和负极侧中加入0.5×TAE。
将组合的分离单元的取样单元26侧端作为负极侧，过滤部34作为正极侧，配置于油灰上。
其后，施加200V直流电压，进行240分钟的第二电泳。
接着，在过滤部34中将核酸溶液回收，测定吸光度，由UV光谱计算回收的核酸浓度。
图14为回收溶液的UV光谱。
求得的核酸浓度为32.3ng(6.7×106copies/μL)。
核酸浓度如下计算，即260nm的吸光度(A260)乘以核酸的性状固有系数，再乘以吸光池的光路长度(mm)，然后除以10。
回收的核酸的纯度由UV光谱求出。
求出的核酸纯度为1.91。
纯度的计算通过260nm的吸光度(A260)除以280nm的吸光度(A280)而求得。样品为纯度100％的DNA时，此值约为1.8；样品为纯度100％的RNA时，此值为2.0。A280的值反映混入在被测物中的蛋白质、苯酚的量，当吸光度比远远小于1.5时，可认为混入了蛋白质等低分子物质。
实施例2
接着，对第2实施例中的电泳装置进行说明。
图15为显示电泳装置的整体构成的图。
电泳装置50通过配置于电泳槽50b内的电泳单元51来进行检体中所含核酸的浓缩。电泳槽50b具有缓冲液槽55和56以及冷却水槽57，在缓冲液槽55和56中装满用于电泳的缓冲液，在冷却水槽57中装满用于冷却电泳单元51的冰水等冷却水。缓冲液槽55上设有正极53，缓冲液槽56上设有负极54。电泳单元51的端部分别露出至缓冲液槽55和56内，将检体导入至此电泳单元51中，在正极53和负极54之间施加电压，由此进行检体中的核酸的浓缩。
缓冲液槽55和56以及冷却水槽57是通过隔壁52隔开的，隔壁52和电泳槽50b使用具有绝缘性的物质，隔壁52可以使用硅酮类填充材或环氧树脂类的油灰。通过隔壁52，电泳单元51的侧部连接于冷却水而被冷却。由此，消除了电泳时的发热，可在稳定的温度环境下进行检体的精制。
接着，对电泳单元51进行说明。
图16为电泳单元的立体图，图17为电泳单元的侧面剖面图，图18为利用电泳单元的精制过程前期的示意图，图19为相同精制过程的后期的示意图。
电泳单元51主要由丙烯酸树脂等绝缘材料构成，多个构件由螺栓等固定，作为1个电泳单元51而构成。电泳单元51设有沿着向内部延伸方向的圆柱上的空间51b，按照与此空间51b的延伸方向垂直的方式设置了2个孔。1个为用于将检体导入至空间51b内的导入孔67，另一个为用于采集经空间51b浓缩过的检体的采集孔66。导入孔67和采集孔66分别连通于空间51b。
在电泳单元51的内部，设有回收槽71和样品槽72，导入孔67和采集孔66分别连接于样品槽72和回收槽71。样品槽72和回收槽71之间设有凝胶壁64，样品槽72的负极侧上也设有凝胶壁64。在回收槽71的正极侧设有超滤膜65。即，样品槽72在2个凝胶壁64和64之间构成，回收槽71在凝胶壁64和超滤膜65之间构成。
接着，说明利用电泳单元51的精制过程。
进行检体的精制时，电泳单元51内的空间51b装满有电泳用缓冲液，样品槽72和回收槽71也装满有缓冲液。如图18(a)所示，将检体导入至样品槽72后，对电泳单元51的两端施加电压。检体中含有以精制为目标的核酸和杂质，以及比目标核酸小的核酸。
对电泳单元51施加电压，如图18(b)所示，核酸1和多余的电解物2b向正极侧移动，杂质2向负极侧移动。通过施加一定时间的电压，如图19(c)所示，核酸1和多余的电解物2b通过凝胶壁64到达回收槽71。接着，继续施加电压，如图19(d)所示，分子量小的多余电解物2b通过超滤膜65从回收槽71排出。作为目标物的核酸1留在回收槽71内。
这样，通过在电泳单元51中使用电泳和超滤膜，能够从检体中容易地将目标核酸1分离。
接着，对电泳单元51的各部分构成进行说明。
图20为显示电泳单元组装构成的侧面剖面图，图21为相同构成的立体图。图22为显示第1模块的构成的图，图23为显示第2模块的构成的图，图24为密封件的正面图。
电泳单元51由第1模块61、第2模块62、第3模块63、密封件73和超滤膜65组合而成。第1模块61、第2模块62、第3模块63中，中央设有连通于用于构成电泳单元51的空间51b的前后面的孔，四个角上设有连通于用于螺栓固定各部件的前后面的孔。
第1模块61构成了电泳单元51的端部，第2模块62构成了样品槽72和回收槽71，第3模块63保持凝胶壁64。各模块之间设有密封件73，防止模块间的冷却水流入到电泳单元51中。在电泳单元51的一端侧，超滤膜65被密封件73和73夹住。
第1模块61的中央部中，如图22所示，设有孔61b，此孔构成了电泳单元51的空间51b的一部分。在第1模块61的四角上设有用于插入螺栓的孔61c。
在第2模块62的中央部，如图23所示，设有孔62b，此孔构成了电泳单元51的空间51b的一部分。在第2模块62的四角上也设有用于插入螺栓的孔62c。在第2模块62中设有孔62d，孔62d设在了连通于孔62b的上下方向上。此孔62d成为电泳单元51的导入孔67和采集孔66。
第3模块63的形状为减小了第1模块61的前后方向厚度的形状，在设于中央的孔中保持凝胶壁64。
密封件73由正面看为十字形的片材构成。中央部上设有孔73b，本实施例中，由厚度为0.5mm的硅酮片材构成。密封件73如图24所示，为四角欠缺的构成，成为不与用于连接部件的螺栓相接触的形状。孔73b的径与第1模块61的孔61b、第2模块62的孔62b的径一致。
超滤膜65使用比孔73b大的滤膜，为可被密封件73和73夹住的构成。
接着，对使用本实施例的电泳装置的核酸的浓缩精制分离试验进行说明。
[比较试验1]
比较试验1对使用本实施例的电泳装置和使用磁性二氧化硅微珠法从培养淋菌添加尿中精制淋菌基因组进行了比较。
首先，对使用本实施例电泳装置的操作进行说明。
在巧克力培养基EX(日水制药株式会社)上、37℃下培养淋菌(Nesseria gonorrhoeae)2天。
将所得到的菌落混悬于生理盐水中，将吸光度调节为OD530＝0.18后，用生理盐水稀释100倍，得到菌体稀释液。
然后，在60μL健康人混合尿中添加1.2μL菌体稀释液。在其中，添加60μL表1所示组成的溶解缓冲液A并混合。
将混合液在96℃下加热10分钟。从混合液中取100μL作为样品，导入至本实施例的电泳装置中，在150V电压下进行60分钟的电泳。
对100μL回收样品中的5μL进行聚合酶链反应(PCR)处理，测定荧光强度。
PCR处理的处方如表2所示。
第1模块61的尺寸为宽20mm、高20mm、厚5mm，孔61b的直径为5mm，第2模块62同样，孔62d的直径为2mm。第3模块63的尺寸为，宽和高与第1模块61相同，厚为2.5mm，凝胶壁使用琼脂糖凝胶，琼脂糖使用SeaKem Gold agarose(TaKaRa)，溶解液使用10mMTris-HCl(pH为8.0)。超滤膜使用YM-100(Millipore)。密封件73的厚度为0.5mm。
接着，对使用磁性二氧化硅微珠的操作进行说明。
使用MagExtractor(东洋纺织株式会社)作为磁性二氧化硅微珠。
到96℃下加热混合液10分钟为止的操作与上述使用电泳装置的操作同样。从混合液中取100μL作为样品，按照MagExtractor的操作规程进行处理。对所得100μL回收样品中的5μL进行PCR处理，测定荧光强度。
PCR处理的热循环如表3所示，在50℃下保持2分钟后，95℃下保持2分钟，之后进行在95℃下保持10秒和56℃C下保持60秒的50个循环。
                          表1  溶解缓冲液A组成
  2％(重量)   TritonX-100
  0.1％   十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)
  10mM   Tris-HCl(pH为8.0)
  10mM   EDTA(pH为8.0)
  300mM   NaCl
  16.6copies/μL   人基因组
                       表2  PCR处方
每1个反应的处方
  H2O   15.15μL
  10X Gene Taq Buffer   2.5μL
  10mM  AUGC   0.5μL
  100mM MgCl2   0.375μL
  5μM    F-D-NG-R1-32   1μL
  100μM  NG-F3405-20   0.125μL
  100μM  NG 3526-20R   0.125μL
  2U/μL  UNG   0.1μL
  5U/μL  Gene Taq NT   0.125μL
  20μL+回收样品5μL
                 表3  热循环
图25为显示淋菌基因组精制的比较结果的图。图25中的粗线为使用本实施例的结果、细线为使用磁性二氧化硅微珠法的结果。虚线为标准。
其结果是，使用本实施例与使用磁性二氧化硅微珠相比，可更快地进行检测。这说明，本发明与磁性二氧化硅微珠法相比，核酸的精制和分离的效率更高。
[浓缩试验]
接着，对使用本实施例的电泳装置的DNA的浓缩操作进行说明。
在本实施例的电泳装置中，样品槽的容积为200μL，回收槽的容积为50μL。
将2.7ng/μL的λ/HindIII DNA制成100μL，与100μL的溶解缓冲液A混合，制备样品。将样品导入至电泳装置的样品槽，施加100V电压进行30分钟的电泳并浓缩。
其后，对浓缩前的样品和浓缩后的回收样品分别取样2μL、4μL、6μL、8μL，进行凝胶电泳。将浓缩后的回收样品也进行电泳，样品量为10μL。
图26为将显示DNA浓缩结果的样品进行电泳后的凝胶的图。
图26中，A为浓缩前的样品，B为浓缩后被回收的样品。如图26所示，对于各样品量，浓缩后回收的样品与浓缩前的样品相比，得到更清晰的条带。
图26中，回收样品2μL的条带状态与浓缩前的6μL的条带状态相当。
由此，使用本实施例的电泳装置可进行DNA的浓缩。
本发明由于操作简单且装置构成简单，因此可适用于自动进行核酸浓缩和检查的检查装置等用途中。

Claims (6)

1.一种使用了电泳的核酸的浓缩精制方法，其特征在于，对含有核酸的试样中的杂质进行带电量的调节后，将试样置于电场中来进行核酸的浓缩精制。
2.一种利用电泳进行的核酸的浓缩精制方法，其特征在于，在含有核酸的试样中加入阳离子表面活性剂，对试样中杂质的带电量进行调节，将该试样置于电场中进行电泳，由此进行核酸的浓缩精制。
3.一种利用电泳进行的核酸的浓缩精制方法，其特征在于，在含有核酸的试样中加入阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂，对试样中杂质的带电量进行调节，将该试样置于电场中进行电泳，由此进行核酸的浓缩精制。
4.如权利要求3所述的核酸的浓缩精制方法，其特征在于，在通过阳离子表面活性剂的吸附来对核酸以外的带电量进行调节的同时，通过非离子表面活性剂的添加量来调节阳离子表面活性剂的吸附量。
5.一种核酸的浓缩精制装置，其特征在于，在试样中添加非离子表面活性剂和阳离子表面活性剂，将该试样进行电泳，在阳极侧进行核酸的浓缩精制。
6.一种进行电泳的核酸的浓缩精制装置，其特征在于，通过抑制扩散的导电性分离体将侧面由绝缘体构成的容器内隔开，在该容器内构成试样投入室和核酸回收室，该容器的端部分别经由缓冲液槽与电极相连接。
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