KR20180022615A - Dtbp를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법 - Google Patents

Dtbp를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 DTBP를 이용한 미생물 농축 방법 및 핵산 추출 방법에 관한 것으로서, DTBP를 이용해서 미생물 농축이 가능한 기술을 개발하였으며, 또한 농축된 미생물에서 바로 핵산 추출할 수 있는 방법을 개발하였다. 미생물 농축과 핵산 추출 기술을 하나의 튜브(tube) 또는 칩(chip)에서 가능하게 함으로써, 외부로 오는 오염이나, 비용, 시간, 복잡성 등을 확연히 줄일 것으로 예상된다.

Description

DTBP를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법{Method for concentrating microorganism or extracting nucleic acid using DTBP}
본 발명은 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법에 대한 것이다.
핵산은 질병 상태를 확인하기 위한 중요한 분석 수단이며, DNA 생체표지자(biomarker) 예를 들어, 단일염기다형성(SNP), 돌연변이 또는 DNA 메틸화는 연구자가 암의 원인을 찾도록 돕고 질병의 초기 단계 동안 질병의 상태를 진단하고 관찰하는 것은 물론 예후와 감시에 대한 큰 기회를 제공하는 데 중요한 실마리를 제공한다.
DNA와 같은 핵산은 단백질과 같은 다른 성분에 비해 매우 낮은 생리적 농도로 존재하기 때문에(예를 들어, 전혈 마이크로리터당 수십 나노그람의 DNA 대 수십 마이크로그람의 단백질), 임상 시료로부터 DNA를 효과적으로 추출하고 예비 농축하는 것은 증폭 및 검출과 같은 이후의 공정에 매우 중요하다.
기존의 미생물 검출을 위한 방법들은 환자 샘플 1∼2 ㎖에서 전체 용액을 다 이용하지 못하고, 그 중 일부만을 이용해서 핵산을 추출하고 이를 이용한 검출을 진행해 왔다. 많은 양의 미생물의 경우에는 큰 문제가 없지만, 적은 양의 미생물의 경우, 정확한 검출이 되지 못해서 추가적 감염병에 대한 조절에 문제가 생기는데, 1∼2 ㎖ 샘플에서 최대한 모든 미생물을 이용하기 위한 농축 방법에 대한 연구가 필요하다.
또한, 최근 들어 생명공학을 비롯한 진단의학, 약물의학, 대사의학 등 다양한 분야에서 고순도로 정제된 핵산의 사용량이 늘어남에 따라 다양한 생물시료로부터 보다 신속하고 순수하게 핵산을 분리하고자 하는 노력이 계속되고 있다.
그러나 현재까지 핵산의 분리 방법에 있어 가장 크게 발전한 부분은 유전체 DNA, 플라스미드 DNA, 메신저 RNA, 단백질, 세포 잔해 입자등 세포 용해 용액내에 포함된 여러 종류의 물질들로부터 특이적으로 핵산만을 흡착시키는 담체에 관한 기술 등 거의 모든 연구의 초점은 핵산을 흡착시키는 물질에 관한 연구와 개발에 집중되어 있는 한계가 있었다.
이에, 보다 신속하고 순수하게 핵산을 분리하기 위하여 무엇보다 세포 잔해 입자와 단백질 변성 응집물, 기타 다양한 세포 분해 물질들로부터 신속하게 원하는 핵산만을 분리할 수 있는 기술의 개발이 절실한 실정이다.
대한민국 공개특허 제2016-0013613호
본 발명의 목적은 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate; 이하 'DTBP')를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축용 조성물, 이를 이용한 미생물 농축 방법 및 키트; DTBP를 유효성분으로 포함하는 핵산 추출용 조성물, 이를 이용한 핵산 추출 방법 및 키트; 및 DTBP를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물, 이를 이용한 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법 및 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 DTBP를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 미생물 농축 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DTBP에 미생물이 함유된 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는 미생물 농축 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 DTBP를 유효성분으로 포함하는 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 핵산 추출 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계); 상기 개질된 대상물 상에 핵산 시료와 DTBP를 주입하고 핵산과 상기 DTBP 간의 복합체를 형성시키는 단계(제2단계); 및 상기 복합체가 형성된 대상물에 용출 완충액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계(제3단계)를 포함하는 핵산 추출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 DTBP를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계); 상기 개질된 대상물 상에 미생물이 함유된 시료와 DTBP를 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계(제2단계); 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 분리하는 단계(제3단계); 상기 분리된 핵산과 상기 DTBP 간의 복합체를 형성시키는 단계(제4단계); 및 상기 복합체가 형성된 대상물에 용출 완충액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계(제5단계)를 포함하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 DTBP를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 DTBP를 이용해서 미생물 농축이 가능한 기술을 개발하였으며, 또한 농축된 미생물에서 바로 핵산 추출할 수 있는 방법을 개발하였다. 미생물 농축과 핵산 추출 기술을 하나의 튜브(tube) 또는 칩(chip)에서 가능하게 함으로써, 외부로 오는 오염이나, 비용, 시간, 복잡성 등을 확연히 줄일 것으로 예상된다.
도 1은 본 발명인 DTBP/Thin film Sample 분석의 개략적 모식도를 나타낸 도면이다.
도 2는 박막 장치의 구성을 나타낸 분해도이다.
도 3은 DTBP 농도 변화에 따른 DNA 추출 효율을 나타낸 도면이다.
도 4는 대장암 세포주(HCT116 cell line; 이하 'HCT116')로부터 추출한 DNA의 End-point PCR(a) 및 Real-time PCR(b)을 나타낸 도면이다.
도 5는 유방암 세포주(MCF cell line; 이하 'MCF')로부터 추출한 DNA의 End-point PCR(a) 및 Real-time PCR(b)을 나타낸 도면이다.
도 6은 브루셀라 오비스(Brucella Ovis)로부터 추출한 DNA의 PCR 결과를 나타낸 도면이다. M: DNA 마커(marker), Q: 기존 Qiagen 방법으로 추출한 DNA 샘플, DTBP: 본 발명의 DTBP 방식을 이용하여 추출한 DNA 샘플, N: 음성 대조군(negative control).
도 7은 RNA 추출 방법(a) 및 RNA와 cDNA의 동시 추출하는 방법(b)에 대해 나타낸 도면이다. (a) 동일한 샘플을 4회 반복하여 실험을 수행하였다. L: DNA 마커(marker), N: 음성 대조군(negative control). (b) 동일한 샘플을 2회 반복하여 실험을 수행하였다. L: DNA 마커(marker).
도 8은 DTBP를 이용한 병원균(대장균) 농축 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 DTBP를 이용하여 하나의 칩에서 병원균(대장균) 농축과 동시에 핵산 추출 분석을 진행한 결과를 나타낸다.
도 10은 DTBP를 이용한 병원균(PIV3-RNA 바이러스) 농축 분석 결과를 나타낸다. P: 양성 대조군(positive control), N: 음성 대조군(negative control), L: 50 bp DNA ladder, 1번 내지 4번 샘플: 기존 Qiagen 방법으로 추출한 DNA 샘플, 1-1번 내지 4-1번 샘플: DTBP 방식을 이용하여 농축하여 추출한 DNA 샘플. 1번 샘플의 경우, 기존 방법으로는 음성으로 진단되었으나, DTBP 농축한 1-1번 샘플에서는 양성으로 확인되었다. 2, 3번 샘플의 경우, 기존 방법 및 DTBP 농축한 샘플 모두 확실한 음성이며, 4번 샘플의 경우, 기존에 양성이던 샘플의 밴드 세기(intensity)를 DTBP 농축한 4-1번 샘플은 확연히 증가시킨 것을 확인하였다.
본 발명은 DTBP를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축용 조성물을 제공한다.
바람직하게는 상기 미생물은 박테리아, 바이러스 또는 세포 등 음전하를 띄는 모든 미생물일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 미생물 농축 키트를 제공한다. 상기 키트에는 효과적인 미생물 농축에 필요한 pH 조절 등을 위한 완충액 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계); 및 상기 개질된 대상물 상에 미생물이 함유된 시료와 DTBP를 접촉시키는 단계(제2단계)를 포함하는 미생물 농축 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 대상물은 표면에 실란 화합물로 개질된 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
보다 바람직하게는 상기 실란 화합물은 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES), (3-아미노프로필)트리메톡시실란((3-aminopropyl)trimethoxysilane), (1-아미노메틸)트리에톡시실란((1-aminomethyl)triethoxysilane), (2-아미노에틸)트리에톡시실란((2-aminoethyl)triethoxysilane), (4-아미노부틸)트리에톡시실란((4-aminobutyl)triethoxysilane), (5-아미노펜틸)트리에톡시실란((5-aminopentyl)triethoxysilane), (6-아미노헥실)트리에톡시실란((6-aminohexyl)triethoxysilane), 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane; APDMS), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine), [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란([3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane; AEAPTMS) 또는 3-[(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(3-[(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine; TMPTA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 더 바람직하게는 상기 실란 화합물은 본 발명의 실시예에서 기재한 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES) 또는 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(APDMS)이 가장 적합하다.
바람직하게는, 상기 미생물이 함유된 시료는 미생물에 감염된 것으로 의심되는 객체의 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액 및 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 DTBP를 유효성분으로 포함하는 핵산 추출용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 핵산 추출 키트를 제공한다. 상기 키트에는 시료 내 세포를 용해시켜 세포 내부로부터 핵산을 방출시키기 위한, 용해 완충액(lysis buffer) 또는 프로테아제(protease) 등이 추가로 포함될 수 있으며, 효과적인 핵산 추출에 필요한 pH 조절 등을 위한 완충액 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계); 상기 개질된 대상물 상에 핵산 시료와 DTBP를 주입하고 핵산과 상기 DTBP 간의 복합체를 형성시키는 단계(제2단계); 및 상기 복합체가 형성된 대상물에 용출 완충액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계(제3단계)를 포함하는 핵산 추출방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 대상물은 표면에 실란 화합물로 개질된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure pat00002
상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
보다 더 바람직하게는 상기 실란 화합물은 본 발명의 실시예에서 기재한 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES) 또는 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(APDMS)이 가장 적합하다.
또한, 본 발명은 DTBP를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
바람직하게는 상기 미생물은 박테리아, 바이러스 또는 세포 등 음전하를 띄는 모든 미생물일 수 있다.
바람직하게는, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출 키트를 제공한다. 상기 키트에는 효과적인 미생물 농축 및 핵산 추출에 필요한 pH 조절 등을 위한 완충액 등이 추가적으로 포함될 수 있으며, 시료 내 세포를 용해시켜 세포 내부로부터 핵산을 방출시키기 위한, 용해 완충액(lysis buffer) 또는 프로테아제(protease) 등이 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계); 상기 개질된 대상물 상에 미생물이 함유된 시료와 DTBP를 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계(제2단계); 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 분리하는 단계(제3단계); 상기 분리된 핵산과 상기 DTBP 간의 복합체를 형성시키는 단계(제4단계); 및 상기 복합체가 형성된 대상물에 용출 완충액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계(제5단계)를 포함하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 대상물은 표면에 실란 화합물로 개질된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure pat00003
상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
보다 더 바람직하게는 상기 실란 화합물은 본 발명의 실시예에서 기재한 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES) 또는 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(APDMS)이 가장 적합하다.
바람직하게는, 상기 미생물이 함유된 시료는 미생물에 감염된 것으로 의심되는 객체의 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액 및 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "대상물"은 박막장치, 자성 비드(magnetic bead), 링 공진기(ring resonator) 또는 나노입자(nanoparticle) 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 상기 대상물은 본 발명의 실시예서 기재한 입구홀과 출구홀이 각각 관통 형성된 상부박막; 상기 상부박막으로부터 이격 배치된 하부박막; 그 입구단 및 출구단이 상기 상부박막의 입구홀 및 출구홀에 각각 대응하여 연통하는 마이크로 채널이 내측에 패턴 형성되고, 상기 마이크로 채널의 입구부와 연통하는 주입로가 상기 입구단에 인접하도록 형성되며, 상기 상부박막과 하부박막 사이에 배치되는 마이크로 채널챔버; 및 상기 상부박막 및 하부박막의 각 측부를 밀봉하여 상기 마이크로 채널챔버를 밀봉시키는 밀봉수단을 포함하는 박막장치일 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 핵산 분석은 박막 장치 내에서 DTBP를 이용한 핵산 분석인 DTBP/Thin film Sample 분석으로서, 시료 용출/배양, 세척 및 용출의 세 단계를 포함하고 있으며, 원심분리하지 않고 수행한다. 예를 들어, 실란 화합물로서 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)을 통해 박막 장치를 개질하고, 이러한 개질로 인하여 소수성인 박막 장치를 친수성으로 전환시킨다.
상기 개질된 박막 장치 상에 핵산시료, 및 용출 완충액과 DTBP 용액을 주입한다. 상기 핵산의 아미노기와 DTBP의 이-기능성 아민 반응기와의 상호작용에 의한 핵산과 DTBP 사이에 가교 메카니즘을 이용하여 핵산과 DTBP 간의 복합체를 형성시키고 시료에서 DNA를 추출할 수 있다.
이때 DTBP는 하기 화학식 2 구조를 가지며, 이-기능성 이미도에스터(imidoesters) 및 이황화(disulfide) 결합을 포함하고 있기 때문에, 상기 DTBP는 가역적인 가교 구조를 형성함으로써 세포, 단백질 및 핵산의 아미노 반응성 가교제로 사용되었다. DTBP와 단백질과의 상호작용이 아니라 DTBP와 핵산 사이의 빠르고 강한 상호결합을 통해 핵산 시료로부터 고효율의 핵산 추출이 가능하다.
[화학식 2]
Figure pat00004
<실시예 1> 박막 장치 제작 및 전처리
1. 박막 장치 제작
레이저 컷팅 기기(Universal Laser Systems, Scottsdale, USA)를 이용하여 본 발명의 박막 장치를 제작하였다[도 2(a) 참조]. 먼저, 상기 박막 장치는 상부 박막과 하부 박막, 그리고 상부 박막과 하부 박막 사이에 삽입된 마이크로 유체 챔버로 구성되며, 상기 마이크로 유체 챔버는 핵산 공급원으로부터 DNA를 추출하기 위해 챔버 내의 유로에 의해 서로 연결된 다수의 슬롯-형 마이크로 웰로 이루어져 있다.
상기 마이크로 유체 챔버를 제작하기 위해, 300 ㎛ 두께의 양면테이프(100 ㎛ 두께의 양면테이프 사이에 끼워진 100 ㎛ 두께의 폴리에스터 막)에 마이크로 유체 챔버 디자인을 레이저 컷팅 기기로 절단하여 마이크로 유체 챔버를 제작하였다. 박막(상부 및 하부)은 레이저 컷팅 기기를 이용하여 마이크로 유체 챔버와 동일한 치수로 절단하였다.
상기 상부 박막에 관통 구멍인 입구(inlet)와 출구(outlet)를 제작하였다. 레이저 컷팅 마이크로 유체 챔버의 상부 및 하부의 표면에 영구 접착제를 이용하여 각각 레이저 컷팅 박막(상부 및 하부)을 접착시켰다. 상기 마이크로 유체 챔버의 높이는 약 300 ㎛이며, 총 부피는 300 ㎕이었다(300 ㎕ 양, 8.4 cm × 3.7 cm).
핵산 공급원을 주입하기 위한 튜빙 어댑터는 3 mm 두께를 갖는 캐스트 아크릴 시트(MARGA CIPTA, Indonesia)를 양면테이프 한쪽 면에 부착하였고, 레이저 컷팅 기기로 절단 및 천공하여 제조하였다. 상기 제조된 튜빙 어댑터는 마이크로 유체 챔버의 유입구와 배출구에 각각 부착하였다. 이 후 미리 절단된 타이곤 튜빙(AAC02548; Cole-Parmer, Vernon Hills, USA)을 어댑터의 구멍에 위치시킨 후 에폭시를 사용하여 밀봉하였다.
이렇게 제작된 박막 장치는 다양한 용량의 핵산 시료들(100 ㎕, 300 ㎕, 및 500 ㎕)을 처리할 수 있는 장점이 있다.
2. 박막 장치 전처리
상기 박막 장치를 이용한 DNA 분석을 위하여, 박막 장치 내부를 10분 동안 산소 플라즈마로 처리한 후 상기 플라즈마 처리된 박막 장치를 65℃에서 10 내지 60분 동안 2% 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)을 함유한 수용액에 침지시킨 후 탈이온수로 완전히 세정하였다. 세정 후, 박막 장치를 경화(cure)시키기 위해, 상기 세정된 박막 장치를 신속하게 질소 기류 하에서 건조시켜 박막 장치를 아민으로 개질하였다.
Drop Shape Analyzer(DSA100, KRUSS, Germany)을 이용한 아민-개질된 박막 장치의 물 접촉각 측정을 통해 온도 및 배양시간에 따라 박막 장치의 친수성이 상당히 변화하였음을 알 수 있었다. 65 ℃에서 10분 동안 상기 박막 장치를 APTES로 실란화(silanization)한 후, 상기 박막 표면 친수성은 증가하였다(약 30 내지 40℃).
< 실시예 2> DTBP /Thin film Sample 분석
본 발명에서는 앞서 제작된 박막 장치에 디메틸3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP)를 적용한 핵산 분석법을 DTBP로 명명하였으며, 이하 실험에서 DTBP 분석을 수행하였다.
즉, 앞서 아민으로 개질된 박막 장치(300 ㎕ 양, 8.4 cm × 3.7 cm)를 이용하여 DNA를 추출하기 위해 먼저 최적화된 분석 용액을 준비하였다. 상기 최적화된 분석 용액은 100 mM 트리스-염산 (pH 8.0)을 함유하는 용출 완충액, 10 mM의 EDTA, 1% SDS, 10%의 트리톤 X-100을 DTBP (100 mg/㎖)와 혼합하여 준비한 후, 핵산 분석 시료로서 세포, 박테리아, 혈액 또는 소변 유래 각 시료 100 ㎕를 상기 분석 용액 200 ㎕와 혼합하였다.
상기 혼합된 핵산 분석 시료와 분석 용액이 혼합된 혼합액을 아민으로 개질된 박막 장치의 상부 기판 입구로 유입시키고, 마이크로 유체 챔버 내로 상기 혼합액이 이동하면서 DTBP의 2개의 아민기와 DNA가 결합하며 또한 박막 장치 내 개질된 아민기와 DNA가 결합하여 복합체를 형성하여 DNA를 분리할 수 있었다. 이때, 박막 장치는 핵산 분석 시료로부터 DNA를 충분히 추출하기 위하여 20분 동안 항온(56℃)을 유지한 배양기 또는 컨트롤러(Alpha Omega Instruments)를 포함한 열전냉각기(thermoelectric cooler; TEC) 중 어느 하나에 놓아 두었다.
DTBP-DNA 복합체 중 이물질을 제거하기 위해 PBS 완충액으로 세척한 후, 용출 완충액(10 mM의 중탄산나트륨, pH 10.6)을 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 양과 순도를 측정한 후 Enspire Multimode Plate Reader(PerkinElmer)를 이용하여 260 nm (DNA) 및 280 nm (단백질)에서의 시료의 광학 밀도 비율을 결정하였다. 종래 DNA 추출법과 본 발명의 DTBP 분석을 비교하기 위해, 알려진 방법(Qiagen, Hilden, Germany)에 따라 QIAmp DNA mini kit를 사용하여 분석하였다.
도 3과 같이, DTBP 농도별로 결합력을 확인한 결과, DTBP 농도가 100 mg/㎖일 때 DNA 결합 효율이 가장 높은 것으로 확인되었다.
<실시예 3> DTBP 분석을 이용한 진핵세로포부터의 DNA 추출
5% CO2 분위기, 37℃ 습한 배양기에서 10 % 태아우아혈청(fetal calf serum; 이하 'FCS')을 보충한 고 글루코오스 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium; DMEM, DMEM Life Technology)의 플라스틱 배양 플레이트에서 두개의 진핵 세포인 HCT116 및 MCF를 각각 배양한 후, 실시예 1과 동일한 방법으로 진핵세로포부터 DNA를 추출하되, 게놈성 DNA를 추출하기 위하여 단백질 분해효소인 프로테이나제 K를 처리하였다. 그리고, 비교를 위하여, QIAmp DNA 미니 키트를 이용하여 진핵세포로부터 DNA를 추출하였다. 본 실시예에서 사용한 HCT116 및 MCF는 미국 ATCC(https://www.atcc.org)에서 구입하여 사용하였다.
DNA의 양과 순도를 확인하기 위해 End-point PCR 및 실시간 PCR(real time-PCR)을 수행하였다. 일부 유전자(Actin)의 정방향 및 역방향 프라이머를 약 24 염기쌍의 정상 길이로 합성하였다. End-point PCR은 15분 동안 95℃에서 초기 변성 단계; 95℃에서 45초, 59℃에서 45초(Actin), 및 72℃에서 45초를 1사이클로하여 총 45 사이클; 및 72℃, 10분 동안 최종 연장 단계로 이루어져 있다. 5 내지 10 ㎕의 DNA를 1 × PCR 완충액(Qiagen), 2.5 mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.25 mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphate), 25 pmol의 각 프라이머, 및 Taq DNA 중합효소 1 유닛을 포함하는 총 부피 25 ㎕에서 증폭하였다.
실시간 PCR(real time-PCR) 분석을 위해, 다음 단계가 LightCycler 2.0(로슈 다이어그노스틱스)에서 제공된 방법을 하기와 같이 변형하였다. 5 내지 10 ㎕의 DNA를 4 ㎕의 LightCycler FastStart DNA Master 믹스, 25 pmol의 각 프라이머, 1 × PCR 완충액 2 ㎕(큐아젠, 힐덴, 독일), 2.5 mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.25 mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphate), 및 증류수를 포함하는 총 부피 20 ㎕에서 증폭하였다. 95℃에서 10분 동안 처음 예비 처리한 후 95℃에서 10초, 59℃에서 30초(Actin), 및 72℃에서 10초를 1사이클로하여 총 50 사이클을 수행하고, 30초 동안 40℃에서 냉각 단계를 거쳤다. SYBR 녹색 신호를 가진 증폭된 생성물은 LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics)에서 수행하였다.
그리고, 도 4 및 도 5의 End-point PCR(도 4(a) 및 도 5(a))과 실시간 PCR(도 4(b) 및 도 5(b))을 참조하면, DTBP를 이용하여 추출한 DNA의 End-point PCR 결과, Qiagen 제품에 비해 HCT116는 약 1.3배, MCF는 약 2.6배 높은 양의 DNA가 추출된 것을 확인할 수 있었고, 실시간 PCR 결과는 Qiagen 제품과 크게 차이가 나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 4> DTBP 분석을 이용한 박테리아 세포로부터의 DNA 추출
박테리아 세포에서 DTBP 분석 성능을 확인하기 위해, DTBP 분석을 이용하여 추출된 DNA를 사용하여 PCR 기반 DNA 증폭을 실시하였다. 모든 프라이머는 대장균 (Escherichia coli), 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 고르도니에(Mycobacterium gordonae) 및 살모넬라 균주(Salmonella Strains) (살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 살모넬라 뉴폴트(Salmonella Newport), 및 살모넬라 세인트폴(Salmonella Saintpaul))의 상용 프라이머를 사용하였다. 본 실시예에서 사용한 해당 균주의 상용 프라이머는 미국 IDT(https://www.idtdna.com)에서 구입하여 사용하였다.
최적화 반응을 위해, 100 mM 트리스-염산 (pH 8.0)을 함유하는 용출 완충액, 10mM의 EDTA, 1%의 SDS, 10%의 트리톤 X-100 및 리소자임 20 mg/㎖을 DTBP(50 mg/㎖)와 혼합하였다. 본 발명의 DTBP 방법의 유효성을 검증하기 위해 일반적인 PCR을 수행하였다. 대장균(E. coli) XL1 블루 균주(한국미생물자원센터로부터 구입; https://kctc.kribb.re.kr)를 50 ㎍/㎖의 테트라사이클린(tetracycline)과 Luria-Bertani(LB) 배지에 접종하고, 쉐이킹 상태(shaking condition)로 37℃에서 하루 동안 배양하였고, 103∼107의 콜로니 형성 단위(colony forming unit; CFU)의 시료를 시험을 위해 사용하였다. DTBP 분석 및 큐아젠 키트 분석에서 사용하기 위해 배양시킨 대장균(Escherichia coli), 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 고르도니에(Mycobacterium gordonae) 및 살모넬라 균주(Salmonella Strains)(살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 살모넬라 뉴폴트(Salmonella Newport), 살모넬라 세인트폴(Salmonella Saintpaul)) 및 브루셀라 오비스(Brucella Ovis)에서 박테리아 DNA를 추출하였다. 본 실시예에서 사용한 균주는 한국미생물자원센터(https://kctc.kribb.re.kr)로부터 구입하여 사용하였다.
박테리아 유전자의 유전학적 분석을 위해, DTBP 분석 및 큐아젠 키트 분석에서 추출된 DNA 2 ㎕를 1 × PCR 완충액(큐아젠, 힐덴, 독일), 2.5 mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.25 mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphate), 각 프라이머 25 pmol, 및 Taq DNA 중합효소 1 유닛을 포함하는 총 부피 25 ㎕를 사용하여 15분 동안 95℃에서 증폭하였다; 95℃에서 30초, 60℃에서 30초(마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 고르도니에(Mycobacterium gordonae), 살모넬라 균주(Salmonella Strains) 및 브루셀라 오비스(Brucella Ovis)), 및 72℃에서 30초를 1 사이클로하여 총 45 사이클; 및 72℃, 7분 동안 최종 연장 단계. PCR 증폭물들은 PCR 생성물을 에티듐 브로마이드(EtBr)(시그마-알드리치)를 함유한 2% 아가로즈 젤 상에서 분리하는 젤 전기영동법으로 가시화되었다. 상기 젤은 Gel Doc System(Bio-Rad)을 사용하여 가시화되었다. DNA 농도 및 순도의 측정은 UV 분광분석기(Perkin-Elmer)로 수행되었다.
DTBP를 이용하여 브루셀라 오비스(Brucella Ovis)로부터 추출된 DNA로 PCR 분석을 수행한 결과, Qiagen 제품과 크게 차이가 나지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 6).
<실시예 5> DTBP 분석을 이용한 인간 체액로부터의 DNA 추출
인간의 체액으로 DTBP 분석 능력을 검증하기 위해, 체액 시료 200 ㎕(전혈 및 소변)을 상기 박막 장치에 유입하여 DNA를 추출하였다. 먼저, 앞서 제작된 박막 장치 내로 프로테이나제 K와 DTBP를 포함한 용출 완충액과 체액 시료를 각각 유입한 후, 마이크로 채널 챔버로 이동시켜 체액 시료 내 DNA와 DTBP 간의 복합체를 형성시킨 후, 실시예 2와 동일한 방법으로 DNA를 추출하였다. 이때, 용출 완충액과 체액 시료는 시린지 펌프(KD Scientific, MA)를 사용하여 2개의 다른 입구에 각각 1.5 ㎖/hr의 유속으로 10분간 유입시켰으며, DNA의 추출 및 정제를 위하여, 카트리지를 20분 동안 56℃에서 배양하였다. 그리고, 시린지 펌프에 의한 PBS 완충액 유입을 위한 입구의 유속은 4 ㎖/hr으로 10분간 증가시켰다. 마지막으로, 추출된 DNA를 100 ㎕의 용출 완충액으로 용출하였다. 또한, 비교를 위해 QIAmp DNA 미니 키트(힐덴, 독일)를 사용한 게놈성 DNA 추출에 200 ㎕의 전혈 또는 소변을 사용하였다. 모든 추출된 DNA는 UV 분광 광도계(Perkin-Elmer)에 의해 DNA 농도 및 순도가 결정되었다.
< 실시예 6> DTBP 분석을 이용한 RNA 추출
실시예 2와 동일한 방법으로 DTBP 분석을 이용하여 RNA를 추출하였고, 도 7(a)와 같이 외부에서 cDNA 합성 후 18S rRNA의 증폭을 통해 RNA 추출이 잘 되었음을 확인하였다.
그리고, 도 7(b)와 같이 DTBP 분석을 통해 RNA 추출과 cDNA 합성을 하나의 박막 장치 상에서 진행할 수 있었고, 추후 18S rRNA의 증폭을 통해 이러한 방법이 잘 개발된 것을 확인하였다.
< 실시예 7> DTBP를 이용한 병원균(대장균) 농축 및 핵산 추출
앞서 제작한 박막 장치를 65℃에서 1시간 동안 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(APDMS)로 표면 처리하였다. 병원균을 농축시키기 위해서, DTBP(100 mg/㎖)와 함께 병원균 시료를 1∼2 ㎖ 주입하였으며 100 ㎕/min의 유속으로 상온에서 농축시켰다. 농축된 시료는 100 ㎕에 현탁하였다. 본 실시예에서는 병원균 시료로 대장균(E. coli)을 사용하였다. 한편, Qiagen DNA Kit으로 DNA를 추출하여 비교하였다.
그 결과, DTBP로 농축을 진행하면, 기존 Qiagen 방법으로 농축 단계 없이 핵산 추출을 하는 경우보다 RT-PCR Ct 값이 절대값(absolute)에 근접하게 단축되는 것을 확인하였다(도 8).
한편, 본 발명의 하나의 칩에서 병원균(대장균) 농축 및 핵산 추출을 동시에 진행했을 때, 다른 방법에 비해서 훨씬 Ct 값이 단축되고, 절대값(absolute)과 비슷하게 나오는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 방법이 1∼2 ㎖ 내에 있는 병원체를 효과적으로 농축할 수 있었으며, 동시에 핵산 추출 효율도 높은 것을 확인할 수 있었다(도 9).
< 실시예 8> DTBP를 이용한 병원균( PIV3 -RNA 바이러스) 농축
본 발명에 따른 방법의 병원균(바이러스) 검출 효율을 확인하기 위하여 PIV3-RNA 바이러스 감염이 의심되는 4개의 샘플에 대하여 기존에 널리 사용되는 방법인 Qiagen 키트와의 비교 실험을 수행하였다.
즉, 각 샘플을 1 ㎖씩 취하여 Qiagen 키트로 추출하여 PIV3-RNA 바이러스 검출을 테스트한 경우(도 10의 1, 2, 3, 4 레인)와 본 발명에 따라 DTBP로 농축하여 추출 후 PIV3-RNA 바이러스 검출을 테스트한 경우(도 10의 1-1, 2-1, 3-1, 4-1 레인)를 비교하였다.
그 결과, 1 ㎖의 시료에서 PIV3-RNA 바이러스를 DTBP 방식을 이용하여 농축했을 때, 1번 샘플의 경우, 기존 방법으로는 음성으로 진단되었으나, 본 발명에 따른 DTBP 농축 후에 양성으로 확인되었다. 2, 3번 샘플의 경우 확실한 음성이며, 4번 샘플은 기존에 양성이던 샘플의 밴드 세기(intensity)를 확연히 증가시킨 것을 확인할 수 있었다(도 10).
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims (26)

  1. 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate; DTBP)를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 바이러스 또는 세포인 것을 특징으로 하는 미생물 농축용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 미생물 농축 키트.
  4. 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계); 및
    상기 개질된 대상물 상에 미생물이 함유된 시료와 DTBP를 접촉시키는 단계(제2단계)를 포함하는 미생물 농축 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 대상물은 박막장치, 자성 비드(magnetic bead), 링 공진기(ring resonator) 또는 나노입자(nanoparticle) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 미생물 농축 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 대상물은 표면에 실란 화합물로 개질된 것을 특징으로 하는 미생물 농축 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 미생물 농축 방법.
    [화학식 1]
    Figure pat00005

    상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
  8. 제7항에 있어서, 상기 실란 화합물은 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES), (3-아미노프로필)트리메톡시실란((3-aminopropyl)trimethoxysilane), (1-아미노메틸)트리에톡시실란((1-aminomethyl)triethoxysilane), (2-아미노에틸)트리에톡시실란((2-aminoethyl)triethoxysilane), (4-아미노부틸)트리에톡시실란((4-aminobutyl)triethoxysilane), (5-아미노펜틸)트리에톡시실란((5-aminopentyl)triethoxysilane), (6-아미노헥실)트리에톡시실란((6-aminohexyl)triethoxysilane), 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane; APDMS), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine), [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란([3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane; AEAPTMS) 및 3-[(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(3-[(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine; TMPTA)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 미생물 농축 방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 미생물이 함유된 시료는 미생물에 감염된 것으로 의심되는 객체의 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액 및 조직으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 미생물 농축 방법.
  10. DTBP를 유효성분으로 포함하는 핵산 추출용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 핵산 추출용 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항의 조성물을 포함하는 핵산 추출 키트.
  13. 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계);
    상기 개질된 대상물 상에 핵산 시료와 DTBP를 주입하고 핵산과 상기 DTBP 간의 복합체를 형성시키는 단계(제2단계); 및
    상기 복합체가 형성된 대상물에 용출 완충액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계(제3단계)를 포함하는 핵산 추출방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 대상물은 박막장치, 자성 비드(magnetic bead), 링 공진기(ring resonator) 또는 나노입자(nanoparticle) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 핵산 추출방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 대상물은 표면에 실란 화합물로 개질된 것을 특징으로 하는 핵산 추출방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 핵산 추출방법.
    [화학식 1]
    Figure pat00006

    상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
  17. 제16항에 있어서, 상기 실란 화합물은 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES), (3-아미노프로필)트리메톡시실란((3-aminopropyl)trimethoxysilane), (1-아미노메틸)트리에톡시실란((1-aminomethyl)triethoxysilane), (2-아미노에틸)트리에톡시실란((2-aminoethyl)triethoxysilane), (4-아미노부틸)트리에톡시실란((4-aminobutyl)triethoxysilane), (5-아미노펜틸)트리에톡시실란((5-aminopentyl)triethoxysilane), (6-아미노헥실)트리에톡시실란((6-aminohexyl)triethoxysilane), 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane; APDMS), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine), [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란([3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane; AEAPTMS) 및 3-[(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(3-[(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine; TMPTA)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 추출 방법.
  18. DTBP를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 바이러스 또는 세포인 것을 특징으로 하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출 키트.
  22. 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계);
    상기 개질된 대상물 상에 미생물이 함유된 시료와 DTBP를 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계(제2단계);
    상기 농축된 미생물로부터 핵산을 분리하는 단계(제3단계);
    상기 분리된 핵산과 상기 DTBP 간의 복합체를 형성시키는 단계(제4단계); 및
    상기 복합체가 형성된 대상물에 용출 완충액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계(제5단계)를 포함하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 대상물은 표면에 실란 화합물로 개질된 것을 특징으로 하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법.
    [화학식 1]
    Figure pat00007

    상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
  25. 제24항에 있어서, 상기 실란 화합물은 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES), (3-아미노프로필)트리메톡시실란((3-aminopropyl)trimethoxysilane), (1-아미노메틸)트리에톡시실란((1-aminomethyl)triethoxysilane), (2-아미노에틸)트리에톡시실란((2-aminoethyl)triethoxysilane), (4-아미노부틸)트리에톡시실란((4-aminobutyl)triethoxysilane), (5-아미노펜틸)트리에톡시실란((5-aminopentyl)triethoxysilane), (6-아미노헥실)트리에톡시실란((6-aminohexyl)triethoxysilane), 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane; APDMS), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine), [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란([3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane; AEAPTMS) 및 3-[(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(3-[(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine; TMPTA)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 미생물이 함유된 시료는 미생물에 감염된 것으로 의심되는 객체의 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액 및 조직으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법.
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