WO2022071648A1 - 미생물 농축 또는 핵산 추출용 조성물 및 이를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법 - Google Patents

미생물 농축 또는 핵산 추출용 조성물 및 이를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법 Download PDF

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WO2022071648A1
WO2022071648A1 PCT/KR2021/008541 KR2021008541W WO2022071648A1 WO 2022071648 A1 WO2022071648 A1 WO 2022071648A1 KR 2021008541 W KR2021008541 W KR 2021008541W WO 2022071648 A1 WO2022071648 A1 WO 2022071648A1
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WO
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group
formula
nucleic acid
unsubstituted
substituted
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PCT/KR2021/008541
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Inventor
김종철
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주식회사 에이아이더뉴트리진
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA

Definitions

  • the present invention relates to a composition for microbial concentration or nucleic acid extraction, and a microbial concentration or nucleic acid extraction method using the same. More specifically, by using a compound capable of forming a complex with microorganisms or nucleic acids, it is to provide a method for more efficiently concentrating microorganisms or extracting nucleic acids.
  • Nucleic acids are important analytical tools for identifying disease states, and DNA biomarkers such as single nucleotide polymorphisms (SNPs), mutations or DNA methylation can help researchers find the cause of cancer and disease during the early stages of disease. It provides important clues in diagnosing and observing the condition of the disease, as well as providing great opportunities for prognosis and surveillance.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • nucleic acids such as DNA exist in very low physiological concentrations compared to other components such as proteins (eg, tens of nanograms of DNA versus tens of micrograms of protein per microliter of whole blood), it is possible to effectively extract and prepare DNA from clinical samples. Concentration is very important for subsequent processes such as amplification and detection.
  • Patent Document 1 KR 10-2016-0013613 A
  • An object of the present invention is a compound of Formula 1;
  • a composition for concentration of microorganisms comprising any one selected from the group consisting of the compound of Formula 2 and mixtures thereof as an active ingredient, a method and kit for enriching microorganisms using the same; a composition for extracting nucleic acids, methods and kits for extracting nucleic acids using the same; And to provide a composition for concentration of microorganisms and nucleic acid extraction, methods and kits for extracting nucleic acids from the concentrated microorganisms at the same time as microbial concentration using the same.
  • the present invention provides a composition for concentration of microorganisms comprising a mixture of the compounds of Formulas 1 and 2 as an active ingredient.
  • the present invention provides a microorganism concentration kit comprising the composition.
  • the present invention provides a method for concentrating microorganisms comprising the step of contacting a sample containing microorganisms with the compounds of Chemical Formulas 1 and 2 above.
  • the present invention provides a composition for extracting nucleic acids comprising a mixture of the compounds of Formulas 1 and 2 as an active ingredient.
  • the present invention provides a nucleic acid extraction kit comprising the composition.
  • the present invention is a step of reforming by introducing an amine group to the object (first step); injecting a composition comprising a mixture of a nucleic acid sample and a compound of Formulas 1 and 2 as an active ingredient onto the modified object and forming a complex between the nucleic acid and the compound of Formulas 1 and 2 (second step); And it provides a nucleic acid extraction method comprising the step of extracting the nucleic acid by treating the elution buffer to the complex-formed object (third step).
  • the present invention provides a composition for concentration of microorganisms and nucleic acid extraction comprising a mixture of the compounds of Formulas 1 and 2 as an active ingredient.
  • the present invention provides a microbial concentration and nucleic acid extraction kit comprising the composition.
  • the present invention is a step of reforming by introducing an amine group to the object (first step); Concentrating the microorganism by contacting the sample containing the microorganism on the modified object with the composition for concentration and nucleic acid extraction of the microorganism (second step); separating nucleic acids from the concentrated microorganisms (third step); forming a complex between the isolated nucleic acid and the compounds of Formulas 1 and 2 (fourth step); And it provides a method of extracting nucleic acids from the concentrated microorganisms at the same time as the concentration of microorganisms comprising the step of extracting the nucleic acid by treating the object on which the complex is formed (fifth step) by treating the elution buffer.
  • composition for concentration of microorganisms may include any one selected from the group consisting of a compound of Formula 1, a compound of Formula 2, and mixtures thereof as an active ingredient.
  • R 1 to R 4 are the same as or different from each other, and each independently hydrogen, a halogen group, a substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 3 -C 10 cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted selected from the group consisting of a cyclic C 3 -C 10 heterocycloalkyl group and a substituted or unsubstituted C 6 -C 10 aryl group
  • X 1 and X 2 are the same as or different from each other, and are each independently O or S, and
  • the substituents are independently of each other halogen, cyano group, hydroxyl group, thiol group, oxo, nitro group, C 1 -C 3 alkyl group, C 1 -C 3 alkoxy group, C 3 -C 6 cycloalkyl group, and C 3 - It is selected from a C 6 heterocycloalky
  • R 1 is a substituted or unsubstituted C 3 -C 10 cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted C 3 -C 10 heterocycloalkyl group, and a substituted or unsubstituted C 6 -C 10 aryl group consisting of It is selected from the group, and R 2 to R 4 may be the same as or different from each other, and may be a substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl group.
  • the bioconcentration composition may include a mixture of the compound of Formula 1 and the compound of Formula 2 as an active ingredient.
  • the compound of Formula 1 may be a compound represented by Formula 3 below.
  • the compound of Formula 2 may be a compound represented by Formula 4 below.
  • the composition for concentration of microorganisms characterized in that the microorganisms are bacteria, viruses or cells.
  • a microbial concentration kit includes the composition for microbial concentration.
  • Microbial concentration method comprises the steps of introducing an amine group to the object to reform (first step); and contacting the sample containing the microorganism with the composition of claim 1 on the modified object (second step).
  • the object may be modified with a silane compound containing an amine group on the surface.
  • the silane compound may be a compound represented by the following formula (5).
  • R 5 to R 7 may be the same or different, respectively, and is any one of C 1 -C 4 alkyl or C 1 -C 4 alkoxy
  • R 8 is amino(C 1 -C 10 )alkyl, 3- (2-amino(C 1 -C 4 )alkylamino)(C 1 -C 4 )alkyl or 3-[2-(2-amino(C 1 -C 4 )alkylamino)(C 1 -C 4 )alkyl amino](C 1 -C 4 )alkyl.
  • the silane compound is (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES), (3-aminopropyl) trimethoxysilane ((3-aminopropyl) trimethoxysilane) , (1-aminomethyl)triethoxysilane ((1-aminomethyl)triethoxysilane), (2-aminoethyl)triethoxysilane ((2-aminoethyl)triethoxysilane), (4-aminobutyl)triethoxysilane ( (4-aminobutyl)triethoxysilane), (5-aminopentyl)triethoxysilane ((5-aminopentyl)triethoxysilane), (6-aminohexyl)triethoxysilane ((6-aminohexyl)triethoxysilane), 3-aminopropyl (diethoxy
  • APTES 3-a
  • composition for extracting nucleic acid may include any one selected from the group consisting of a compound of Formula 1, a compound of Formula 2, and mixtures thereof.
  • R 1 to R 4 are the same as or different from each other, and each independently hydrogen, a halogen group, a substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 3 -C 10 cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted selected from the group consisting of a cyclic C 3 -C 10 heterocycloalkyl group and a substituted or unsubstituted C 6 -C 10 aryl group
  • X 1 and X 2 are the same as or different from each other, and are each independently O or S, and
  • the substituents are independently of each other halogen, cyano group, hydroxyl group, thiol group, oxo, nitro group, C 1 -C 3 alkyl group, C 1 -C 3 alkoxy group, C 3 -C 6 cycloalkyl group, and C 3 - It is selected from a C 6 heterocycloalky
  • the composition for extracting nucleic acids may include a mixture of the compound of Formula 1 and the compound of Formula 2 as an active ingredient.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA.
  • a nucleic acid extraction kit may include a composition for extracting nucleic acids.
  • a nucleic acid extraction method comprises the steps of introducing an amine group into the object and modifying it (first step); injecting a nucleic acid sample and the composition of claim 11 onto the modified object and forming a complex between the nucleic acid and the compounds of Formulas 1 and 2 (second step); and extracting the nucleic acid by treating the object in which the complex is formed with an elution buffer (third step).
  • composition for microbial concentration and nucleic acid extraction may include any one selected from the group consisting of the compound of Formula 1, the compound of Formula 2, and mixtures thereof as an active ingredient.
  • R 1 to R 4 are the same as or different from each other, and each independently hydrogen, a halogen group, a substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 3 -C 10 cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted selected from the group consisting of a cyclic C 3 -C 10 heterocycloalkyl group and a substituted or unsubstituted C 6 -C 10 aryl group
  • X 1 and X 2 are the same as or different from each other, and are each independently O or S, and
  • the substituents are independently of each other halogen, cyano group, hydroxyl group, thiol group, oxo, nitro group, C 1 -C 3 alkyl group, C 1 -C 3 alkoxy group, C 3 -C 6 cycloalkyl group, and C 3 - It is selected from a C 6 heterocycloalky
  • the composition for concentrating microorganisms and extracting nucleic acids may include a mixture of the compound of Formula 1 and the compound of Formula 2 as an active ingredient.
  • the microbial concentration and nucleic acid extraction kit may include the composition for microbial concentration and nucleic acid extraction.
  • a microbial concentration and nucleic acid extraction kit comprising the composition of claim 15 .
  • the method of extracting nucleic acids from the concentrated microorganisms at the same time as the concentration of microorganisms comprises the steps of introducing an amine group into a subject and reforming (first step); Concentrating the microorganisms by contacting the composition of claim 15 with the sample containing the microorganisms on the modified object (second step); separating nucleic acids from the concentrated microorganisms (third step); forming a complex between the isolated nucleic acid and the compounds of Formulas 1 and 2 (fourth step); and extracting the nucleic acid by treating the object on which the complex is formed with an elution buffer (the fifth step).
  • the present invention relates to a method for microbial concentration or nucleic acid extraction using a mixture of the compounds of Chemical Formulas 1 and 2, and provides a technology capable of microbial enrichment using the compounds of Chemical Formulas 1 and 2 above.
  • the present invention can be utilized as a method for directly extracting nucleic acids from concentrated microorganisms.
  • microbial concentration and nucleic acid extraction technology in one tube or chip, external contamination, cost, time, complexity, etc. can be significantly reduced.
  • MIX mixture of compound A and compound B
  • FIG. 2 is an exploded view showing the configuration of a thin film device.
  • 3 is a diagram showing the DNA extraction efficiency according to the compound.
  • the present invention relates to a compound of Formula 1; It relates to a composition for concentration of microorganisms comprising as an active ingredient any one selected from the group consisting of compounds of Formula 2 and mixtures thereof:
  • R 1 to R 4 are the same as or different from each other, and each independently hydrogen, a halogen group, a substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 3 -C 10 cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted selected from the group consisting of a C 3 -C 10 heterocycloalkyl group and a substituted or unsubstituted C 6 -C 10 aryl group,
  • X 1 and X 2 are the same as or different from each other, and each independently O or S,
  • the substituents are independently of each other, halogen, cyano group, hydroxyl group, thiol group, oxo, nitro group, C 1 -C 3 alkyl group, C 1 -C 3 alkoxy group, C 3 -C 6 cycloalkyl group, and C 3 -C 6 It is selected from the heterocycloalkyl group.
  • the present invention provides a composition for concentration of microorganisms comprising a mixture of the compounds of Formulas 1 and 2 as an active ingredient:
  • R 1 To R 4 are the same as or different from each other, and each independently hydrogen, a halogen group, a substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 3 -C 10 cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted selected from the group consisting of a C 3 -C 10 heterocycloalkyl group and a substituted or unsubstituted C 6 -C 10 aryl group,
  • X 1 and X 2 are the same as or different from each other, and each independently O or S,
  • the substituents are independently of each other, halogen, cyano group, hydroxyl group, thiol group, oxo, nitro group, C 1 -C 3 alkyl group, C 1 -C 3 alkoxy group, C 3 -C 6 cycloalkyl group, and C 3 -C 6 It is selected from the heterocycloalkyl group.
  • R 1 in Formulas 1 and 2 is a substituted or unsubstituted C 3 -C 10 cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted C 3 -C 10 heterocycloalkyl group, and a substituted or unsubstituted C 6 - It is selected from the group consisting of a C 10 aryl group, and R 2 to R 4 may be the same as or different from each other, and may be a substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl group.
  • the halogen group may be F, Cl, Br, or I.
  • the alkyl group may be linear or branched, and specific examples include methyl, ethyl, propyl, n-propyl, isopropyl, butyl, n-butyl, isobutyl, t-butyl, sec-butyl, 1-methylbutyl, 1 -Ethylbutyl, pentyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, t-pentyl, hexyl, n-hexyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3,3-dimethylbutyl, 2-ethylbutyl, heptyl, n-heptyl, 1-methylhexyl, cyclopentylmethyl, cyclohexylmethyl, octyl, n-octyl, t-octyl, 1-methylheptyl, 2-ethylhexyl, 2-prop
  • the cycloalkyl group is cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, 3-methylcyclopentyl, 2,3-dimethylcyclopentyl, cyclohexyl, 3-methylcyclohexyl, 4-methylcyclohexyl, 2,3-dimethylcyclohexyl, 3,4,5-trimethylcyclohexyl, 4-t-butylcyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, and the like, but are not limited thereto.
  • the heterocycloalkyl group includes a hetero atom such as O, S, Se, N, P or Si, and includes monocyclic or polycyclic ones.
  • the aryl group refers to a monocyclic or polycyclic unsaturated aromatic ring compound having 6 to 10 carbon atoms, for example, phenyl, naphthyl, tolyl, xylin, and the like, but is not limited thereto.
  • the compound of Formula 1 may be a compound represented by Formula 3 below.
  • the compound of Formula 2 may be a compound represented by Formula 4 below:
  • the microorganism may be any microorganism having a negative charge, such as bacteria, viruses, or cells.
  • the compounds of Formulas 1 and 2 may be used as a mixture.
  • the ratio of the two compounds may be, for example, 0.1 to 10:1, 0.5 to 5:1, or 0.8 to 2:1 in the weight ratio of Formula 1 to Formula 2 (Formula 1: Formula 2).
  • the compound exhibits a significantly superior microbial concentration effect and nucleic acid extraction ability in the case of a mixture as compared to the case of a single substance, and when exceeding the ratio, it approaches a single substance and the efficiency may decrease again.
  • the present invention provides a microorganism concentration kit comprising the composition.
  • the kit may additionally include a buffer for pH adjustment, etc. necessary for effective concentration of microorganisms.
  • the present invention is a step of reforming by introducing an amine group to the object (first step); And it provides a microorganism concentration method comprising the step (second step) of contacting the sample containing the microorganism on the modified object and the composition for concentration of the microorganism.
  • the object may be modified with a silane compound on the surface.
  • the silane compound may be a compound represented by the following Chemical Formula 5, but is not limited thereto.
  • R 5 to R 7 may be the same or different, respectively, and is any one of C 1 -C 4 alkyl or C 1 -C 4 alkoxy
  • R 8 is amino(C 1 -C 10 )alkyl, 3- (2-amino(C 1 -C 4 )alkylamino)(C 1 -C 4 )alkyl or 3-[2-(2-amino(C 1 -C 4 )alkylamino)(C 1 -C 4 )alkyl amino](C 1 -C 4 )alkyl.
  • the silane compound is (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES), (3-aminopropyl) trimethoxysilane ((3-aminopropyl) trimethoxysilane), (1 -Aminomethyl) triethoxysilane ((1-aminomethyl) triethoxysilane), (2-aminoethyl) triethoxysilane ((2-aminoethyl) triethoxysilane), (4-aminobutyl) triethoxysilane ((4- aminobutyl)triethoxysilane), (5-aminopentyl)triethoxysilane ((5-aminopentyl)triethoxysilane), (6-aminohexyl)triethoxysilane ((6-aminohexyl)triethoxysilane), 3-aminopropyl (diethoxysilane) ) Me
  • silane compound 3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) or 3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane (APDMS) described in Examples of the present invention is most suitable.
  • APTES 3-aminopropyl)triethoxysilane
  • APIDMS 3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane
  • the sample containing the microorganism is feces, urine, tears, saliva, external secretions of the skin, external secretions of the respiratory tract, external secretions of the intestinal tract, external secretions of the digestive tract, plasma, It may be serum, blood, spinal fluid, lymph fluid, body fluid, and tissue, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for extracting nucleic acids comprising a mixture of the compounds of Formulas 1 and 2 as an active ingredient.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a nucleic acid extraction kit comprising the composition.
  • the kit may further include a lysis buffer or protease for dissolving the cells in the sample to release the nucleic acid from the inside of the cell, and a buffer solution for controlling the pH required for effective nucleic acid extraction, etc. may additionally be included.
  • the present invention is a step of reforming by introducing an amine group to the object (first step); injecting a nucleic acid sample and the composition for extracting the nucleic acid onto the modified object and forming a complex between the nucleic acid and the compounds of Formulas 1 and 2 in the composition (second step); And it provides a nucleic acid extraction method comprising the step of extracting the nucleic acid by treating the elution buffer to the complex-formed object (third step).
  • the object may be modified with a silane compound on the surface.
  • the silane compound may be a compound represented by the following Chemical Formula 5, but is not limited thereto.
  • R 5 to R 7 may be the same or different, respectively, and is any one of C 1 -C 4 alkyl or C 1 -C 4 alkoxy
  • R 8 is amino(C 1 -C 10 )alkyl, 3- (2-amino(C 1 -C 4 )alkylamino)(C 1 -C 4 )alkyl or 3-[2-(2-amino(C 1 -C 4 )alkylamino)(C 1 -C 4 )alkyl amino](C 1 -C 4 )alkyl.
  • silane compound 3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) or 3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane (APDMS) described in Examples of the present invention is most suitable.
  • APTES 3-aminopropyl)triethoxysilane
  • APIDMS 3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane
  • the present invention provides a composition for concentrating microorganisms and extracting nucleic acids while at the same time including a mixture of the compounds of Formulas 1 and 2 as an active ingredient.
  • the microorganism may be any microorganism having a negative charge, such as bacteria, viruses, or cells.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a microbial concentration and nucleic acid extraction kit comprising the composition.
  • the kit may additionally include a buffer for effective concentration of microorganisms and pH adjustment required for nucleic acid extraction, and a lysis buffer or protease for dissolving the cells in the sample to release the nucleic acids from the inside of the cells. and the like may be further included.
  • the present invention is a step of reforming by introducing an amine group to the object (first step); Concentrating the microorganism by contacting the sample containing the microorganism on the modified object with the composition for concentration and nucleic acid extraction of the microorganism (second step); separating nucleic acids from the concentrated microorganisms (third step); forming a complex between the isolated nucleic acid and the compounds of Formulas 1 and 2 (fourth step); And it provides a method of extracting nucleic acids from the concentrated microorganisms at the same time as the concentration of microorganisms comprising the step of extracting the nucleic acid by treating the object on which the complex is formed (fifth step) by treating the elution buffer.
  • the object may be modified with a silane compound on the surface.
  • the silane compound may be a compound represented by the following Chemical Formula 5, but is not limited thereto.
  • R 5 to R 7 may be the same or different, respectively, and is any one of C 1 -C 4 alkyl or C 1 -C 4 alkoxy
  • R 8 is amino(C 1 -C 10 )alkyl, 3- (2-amino(C 1 -C 4 )alkylamino)(C 1 -C 4 )alkyl or 3-[2-(2-amino(C 1 -C 4 )alkylamino)(C 1 -C 4 )alkyl amino](C 1 -C 4 )alkyl.
  • silane compound 3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) or 3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane (APDMS) described in Examples of the present invention is most suitable.
  • APTES 3-aminopropyl)triethoxysilane
  • APIDMS 3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane
  • the sample containing the microorganism is feces, urine, tears, saliva, external secretions of the skin, external secretions of the respiratory tract, external secretions of the intestinal tract, external secretions of the digestive tract, plasma, It may be serum, blood, spinal fluid, lymph fluid, body fluid, and tissue, but is not limited thereto.
  • the "object” may be any one of a thin film device, a magnetic bead, a ring resonator, or a nanoparticle, but is not limited thereto. More preferably, the object includes an upper thin film through which the inlet hole and the outlet hole described in the embodiment of the present invention are respectively penetrated; a lower thin film spaced apart from the upper thin film; A microchannel having an inlet end and an outlet end communicating with the inlet hole and the outlet hole of the upper thin film, respectively, is patterned inside, and an injection path communicating with the inlet portion of the microchannel is formed adjacent to the inlet end. and a micro-channel chamber disposed between the upper thin film and the lower thin film; and sealing means for sealing the microchannel chamber by sealing each side of the upper thin film and the lower thin film.
  • nucleic acid analysis according to the present invention is a thin film analysis using a compound that is an active ingredient of the composition of the present invention in a thin film device, and includes three steps of sample elution/culturing, washing and elution, and centrifugation.
  • a thin film device is modified through 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) as a silane compound, and this modification converts a hydrophobic thin film device into a hydrophilic one.
  • APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • a nucleic acid sample, an elution buffer, and the composition of the present invention are injected onto the modified thin film device.
  • a crosslinking reaction occurs between the nucleic acid and the compound by the interaction of the amino group of the nucleic acid with the di-functional amine reactive group in the structure of the compounds of Formulas 1 and 2, and a complex between the nucleic acid and the compound is formed using this, and in the sample DNA can be extracted.
  • the compound as an active ingredient in the composition of the present invention contains di-functional imidoesters and disulfide or ether bonds, it can form a reversible cross-linked structure, so cells, proteins and nucleic acids It can be used as an amino-reactive crosslinking agent of
  • the thin film device of the present invention was manufactured using a laser cutting device (Universal Laser Systems, Scottsdale, USA) (see FIG. 2 ).
  • the thin film device consists of an upper thin film and a lower thin film, and a microfluidic chamber inserted between the upper and lower thin films, and the microfluidic chamber is a plurality of microfluidic chambers connected to each other by a flow path in the chamber to extract DNA from a nucleic acid source. of slot-type microwells.
  • the microfluidic chamber was manufactured by cutting the microfluidic chamber design on a 300 ⁇ m thick double-sided tape (100 ⁇ m thick polyester film sandwiched between 100 ⁇ m thick double-sided tape) with a laser cutting device. did. The thin films (top and bottom) were cut to the same dimensions as the microfluidic chamber using a laser cutting machine.
  • Laser-cut thin films (upper and lower) were respectively adhered to the upper and lower surfaces of the laser-cut microfluidic chamber using a permanent adhesive.
  • the height of the microfluidic chamber was about 300 ⁇ m, and the total volume was 300 ⁇ l (300 ⁇ l amount, 8.4 cm ⁇ 3.7 cm).
  • a tubing adapter for injecting a nucleic acid source was prepared by attaching a cast acrylic sheet (MARGA CIPTA, Indonesia) having a thickness of 3 mm to one side of a double-sided tape, cutting and perforating with a laser cutting machine.
  • the prepared tubing adapter was attached to the inlet and outlet of the microfluidic chamber, respectively. Thereafter, pre-cut Tygon tubing (AAC02548; Cole-Parmer, Vernon Hills, USA) was placed in the hole of the adapter and sealed using epoxy.
  • the thin film device thus fabricated has the advantage of being able to process nucleic acid samples (100 ⁇ l, 300 ⁇ l, and 500 ⁇ l) of various capacities.
  • the plasma-treated thin film device was heated at 65° C. for 10 to 60 minutes with 2% 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) ) was immersed in an aqueous solution containing After cleaning, in order to cure the thin film device, the cleaned thin film device was quickly dried under a nitrogen stream to modify the thin film device with an amine.
  • APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • the binding force with nucleic acids was tested by applying the composition of the present invention to the thin film device prepared above.
  • an optimized assay solution was first prepared.
  • the optimized assay solution contains an elution buffer containing 100 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0), 10 mM EDTA, 1% SDS, and 10% Triton X-100 at the same concentration as T1 to T3 in Table 1 below.
  • 100 ⁇ l of each sample derived from blood or urine as a nucleic acid analysis sample was mixed with 200 ⁇ l of the assay solution.
  • the mixture was treated with proteinase K, a proteolytic enzyme, to extract genomic DNA.
  • the mixed solution in which the mixed nucleic acid analysis sample and the analysis solution are mixed is introduced into the upper substrate inlet of the amine-modified thin film device, and as the mixed solution moves into the microfluidic chamber, the two amine groups of the compound bind to DNA and also the thin film DNA was isolated by combining the modified amine group in the device to form a complex.
  • the thin film device was placed in either an incubator maintained at a constant temperature (56° C.) for 20 minutes or a thermoelectric cooler (TEC) including a controller (Alpha Omega Instruments) in order to sufficiently extract DNA from the nucleic acid analysis sample. .
  • TEC thermoelectric cooler
  • DNA was extracted using an elution buffer (10 mM sodium bicarbonate, pH 10.6). After measuring the amount and purity of the extracted DNA, the ratio of optical density of the sample at 260 nm (DNA) and 280 nm (protein) was determined using Enspire Multimode Plate Reader (PerkinElmer). In order to compare the analysis results using the conventional DNA extraction method and the composition of the present invention, analysis was performed using the QIAamp DNA mini kit according to a known method (Qiagen, Hilden, Germany).
  • Plastic of high glucose Dulbecco's modified eagle medium (DMEM, DMEM Life Technology) supplemented with 10% fetal calf serum (hereinafter 'FCS') in a humidified incubator at 37 °C in a 5% CO 2 atmosphere.
  • DMEM high glucose Dulbecco's modified eagle medium
  • 'FCS' 10% fetal calf serum
  • End-point PCR and real time-PCR were performed to confirm the amount and purity of DNA. Forward and reverse primers of some genes (Actin) were synthesized with a normal length of about 24 base pairs. End-point PCR was initial denaturation step at 95°C for 15 minutes; 45 cycles at 95° C., 45 seconds at 59° C. (Actin), and one cycle of 45 seconds at 72° C. for a total of 45 cycles; and a final extension step at 72° C. for 10 minutes.
  • nucleic acids were successfully extracted from eukaryotic cells, and as a result of quantifying and comparing the extracted nucleic acids, it was confirmed that the DNA extraction efficiency of T1 was significantly higher than that of T2 and T3 using a single compound. .
  • DNA extraction efficiency was also confirmed in bacterial cells.
  • elution buffer containing 100 mM Tris-hydrochloric acid (pH 8.0), 10 mM EDTA, 1% SDS, 10% Triton X-100 and 20 mg/ml lysozyme were mixed with T1.
  • a general PCR was performed to verify the validity. Inoculate E. coli XL1 blue strain (purchased from Korea Microorganism Resource Center; https://kctc.kribb.re.kr) into 50 ⁇ g/ml tetracycline and Luria-Bertani (LB) medium. and incubated for one day at 37° C. under shaking conditions, and samples of 10 3 to 10 7 colony forming units (CFU) were used for testing.
  • CFU colony forming units
  • Escherichia coli, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium gordonae and Salmonella strains Salmonella typhimurium ( Bacterial DNA was extracted from Salmonella Typhimurium), Salmonella Newport, Salmonella Saintpaul) and Brucella Ovis.
  • the strains used in this test example were purchased from the Korea Microorganism Resource Center (https://kctc.kribb.re.kr), and all primers were commercial primers from each strain.
  • Commercial primers of the strain used in this example were purchased from IDT (https://www.idtdna.com) in the United States and used.
  • RNA was extracted in the same manner as in Test Example 1, and the amount of synthesized DNA was quantified as in Test Example 2 through the amplification of 18S rRNA after cDNA synthesis using this.
  • RNA extraction was well performed by T1(1) at a level similar to that of the control (Q).
  • RNA extraction and cDNA synthesis could be performed on a single thin film device, and it was confirmed that this method was well developed through the amplification of 18S rRNA later.
  • the previously fabricated thin film device was surface-treated with 3-aminopropyl (diethoxy) methylsilane (APDMS) at 65° C. for 1 hour.
  • ADMS 3-aminopropyl (diethoxy) methylsilane
  • 1 to 2 ml of the pathogen sample was injected together with T1 and concentrated at room temperature at a flow rate of 100 ⁇ l/min.
  • the concentrated sample was suspended in 100 ⁇ l.
  • E. coli was used as the pathogen sample. Meanwhile, DNA was extracted and compared with Qiagen DNA Kit.
  • the present invention relates to a composition for microbial concentration or nucleic acid extraction and a microbial concentration or nucleic acid extraction method using the same. More specifically, by using a compound capable of forming a complex with a microorganism or nucleic acid, it is to provide a method for more efficiently concentrating the microorganism or extracting the nucleic acid.

Abstract

본 발명은 미생물 농축 또는 핵산 추출용 조성물 및 이를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 미생물 또는 핵산과 복합체를 형성할 수 있는 화합물을 이용하여, 보다 효율적으로 미생물을 농축하거나 핵산을 추출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

Description

미생물 농축 또는 핵산 추출용 조성물 및 이를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법
본 발명은 미생물 농축 또는 핵산 추출용 조성물 및 이를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 미생물 또는 핵산과 복합체를 형성할 수 있는 화합물을 이용하여, 보다 효율적으로 미생물을 농축하거나 핵산을 추출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
핵산은 질병 상태를 확인하기 위한 중요한 분석 수단이며, DNA 생체표지자(biomarker) 예를 들어, 단일염기다형성(SNP), 돌연변이 또는 DNA 메틸화는 연구자가 암의 원인을 찾도록 돕고 질병의 초기 단계 동안 질병의 상태를 진단하고 관찰하는 것은 물론 예후와 감시에 대한 큰 기회를 제공하는 데 중요한 실마리를 제공한다.
DNA와 같은 핵산은 단백질과 같은 다른 성분에 비해 매우 낮은 생리적 농도로 존재하기 때문에(예를 들어, 전혈 마이크로리터당 수십 나노그람의 DNA 대 수십 마이크로그람의 단백질), 임상 시료로부터 DNA를 효과적으로 추출하고 예비 농축하는 것은 증폭 및 검출과 같은 이후의 공정에 매우 중요하다.
기존의 미생물 검출을 위한 방법들은 환자 샘플 1 내지 2 ㎖에서 전체 용액을 다 이용하지 못하고, 그 중 일부만을 이용해서 핵산을 추출하고 이를 이용한 검출을 진행해 왔다. 많은 양의 미생물의 경우에는 큰 문제가 없지만, 적은 양의 미생물의 경우, 정확한 검출이 되지 못해서 추가적 감염병에 대한 조절에 문제가 생기는데, 1 내지 2 ㎖ 샘플에서 최대한 모든 미생물을 이용하기 위한 농축 방법에 대한 연구가 필요하다.
또한, 최근 들어 생명공학을 비롯한 진단의학, 약물의학, 대사의학 등 다양한 분야에서 고순도로 정제된 핵산의 사용량이 늘어남에 따라 다양한 생물시료로부터 보다 신속하고 순수하게 핵산을 분리하고자 하는 노력이 계속되고 있다.
그러나 현재까지 핵산의 분리 방법에 있어 가장 크게 발전한 부분은 유전체 DNA, 플라스미드 DNA, 메신저 RNA, 단백질, 세포 잔해 입자등 세포 용해 용액내에 포함된 여러 종류의 물질들로부터 특이적으로 핵산만을 흡착시키는 담체에 관한 기술 등 거의 모든 연구의 초점은 핵산을 흡착시키는 물질에 관한 연구와 개발에 집중되어 있는 한계가 있었다.
이에, 보다 신속하고 순수하게 핵산을 분리하기 위하여 무엇보다 세포 잔해 입자와 단백질 변성 응집물, 기타 다양한 세포 분해 물질들로부터 신속하게 원하는 핵산만을 분리할 수 있는 기술의 개발이 절실한 실정이다.
(선행기술문헌)
(특허문헌)
(특허문헌 1) KR 10-2016-0013613 A
본 발명의 목적은 화학식 1 화합물; 화학식 2의 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는, 미생물 농축용 조성물, 이를 이용한 미생물 농축 방법 및 키트; 핵산 추출용 조성물, 이를 이용한 핵산 추출 방법 및 키트; 및 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물, 이를 이용한 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법 및 키트를 제공하기 위한 것이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000002
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미생물 농축용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 미생물 농축 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물에 미생물이 함유된 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는 미생물 농축 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 핵산 추출 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계); 상기 개질된 대상물 상에 핵산 시료와 화학식 1 및 화학식 2의 화합물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 주입하고 핵산과 상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물 간의 복합체를 형성시키는 단계(제2단계); 및 상기 복합체가 형성된 대상물에 용출 완충액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계(제3단계)를 포함하는 핵산 추출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계); 상기 개질된 대상물 상에 미생물이 함유된 시료와 상기 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물을 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계(제2단계); 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 분리하는 단계(제3단계); 상기 분리된 핵산과 상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물 간의 복합체를 형성시키는 단계(제4단계); 및 상기 복합체가 형성된 대상물에 용출 완충액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계(제5단계)를 포함하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따른 미생물 농축용 조성물은 하기의 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000003
[화학식 2]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000004
여기서, R1 내지 R4는 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로시클로알킬기 및 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되고, X1 및 X2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 O 또는 S이고, 상기 치환기는 서로 독립적으로, 할로겐, 시아노기, 히드록실기, 치올기, 옥소, 니트로기, C1-C3 알킬기, C1-C3 알콕시기, C3-C6 시클로알킬기, 및 C3-C6 헤테로시클로알킬기 중 선택되는 것이다.
상기 미생물 농축용 조성물에 있어서 R1은 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로시클로알킬기 및 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되고, R2 내지 R4는 서로 동일하거나 상이하며, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기인 것일 수 있다.
바람직하게 상기 생물 농축용 조성물은 하기의 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 미생물 농축용 조성물에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기의 화학식 3으로 표시되는 화합물인 것일 수 있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000005
.
상기 미생물 농축용 조성물에 있어서, 상기 화학식 2의 화합물은 하기의 화학식 4로 표시되는 화합물인 것일 수 있다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000006
상기 미생물 농축용 조성물에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 바이러스 또는 세포인 것을 특징으로 하는 미생물 농축용 조성물.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 미생물 농축 키트은 상기 미생물 농축용 조성물을 포함하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 미생물 농축 방법은 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계); 및 상기 개질된 대상물 상에 미생물이 함유된 시료와 청구항 1의 조성물을 접촉시키는 단계(제2단계)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 미생물 농축 방법에 있어서, 상기 대상물은 표면에 아민기가 포함된 실란 화합물로 개질된 것일 수 있다.
상기 미생물 농축 방법에 있어서, 상기 실란 화합물은 하기 화학식 5로 표시되는 화합물인 것일 수 있다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000007
상기 식에서, R5 내지 R7은 각각 같거나 다를 수 있으며, C1-C4 알킬 또는 C1-C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R8은 아미노(C1-C10)알킬, 3-(2-아미노(C1-C4)알킬아미노)(C1-C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1-C4)알킬아미노)(C1-C4)알킬아미노](C1-C4)알킬 중 어느 하나이다.
상기 미생물 농축 방법에 있어서, 상기 실란 화합물은 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES), (3-아미노프로필)트리메톡시실란((3-aminopropyl)trimethoxysilane), (1-아미노메틸)트리에톡시실란((1-aminomethyl)triethoxysilane), (2-아미노에틸)트리에톡시실란((2-aminoethyl)triethoxysilane), (4-아미노부틸)트리에톡시실란((4-aminobutyl)triethoxysilane), (5-아미노펜틸)트리에톡시실란((5-aminopentyl)triethoxysilane), (6-아미노헥실)트리에톡시실란((6-aminohexyl)triethoxysilane), 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane; APDMS), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine), [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란([3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane; AEAPTMS) 및 3-[(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(3-[(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine; TMPTA)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 핵산 추출용 조성물은 하기의 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000008
[화학식 2]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000009
여기서, R1 내지 R4는 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로시클로알킬기 및 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되고, X1 및 X2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 O 또는 S이고, 상기 치환기는 서로 독립적으로, 할로겐, 시아노기, 히드록실기, 치올기, 옥소, 니트로기, C1-C3 알킬기, C1-C3 알콕시기, C3-C6 시클로알킬기, 및 C3-C6 헤테로시클로알킬기 중 선택되는 것이다.
바람직하게 상기 핵산 추출용 조성물은 하기의 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 핵산 추출용 조성물에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 핵산 추출 키트는 핵산 추출용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 핵산 추출방법은 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계); 상기 개질된 대상물 상에 핵산 시료와 청구항 11의 조성물을 주입하고 핵산과 화학식 1 및 화학식 2의 화합물 간의 복합체를 형성시키는 단계(제2단계); 및 상기 복합체가 형성된 대상물에 용출 완충액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계(제3단계)를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물은 화학식 1 화합물, 화학식 2의 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000010
[화학식 2]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000011
여기서, R1 내지 R4는 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로시클로알킬기 및 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되고, X1 및 X2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 O 또는 S이고, 상기 치환기는 서로 독립적으로, 할로겐, 시아노기, 히드록실기, 치올기, 옥소, 니트로기, C1-C3 알킬기, C1-C3 알콕시기, C3-C6 시클로알킬기, 및 C3-C6 헤테로시클로알킬기 중 선택되는 것이다.
바람직하게 상기 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물은 하기의 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 미생물 농축 및 핵산 추출 키트는 상기 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
제15항의 조성물을 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출 키트.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법은 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계); 상기 개질된 대상물 상에 미생물이 함유된 시료와 제15항의 조성물을 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계(제2단계); 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 분리하는 단계(제3단계); 상기 분리된 핵산과 상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물 간의 복합체를 형성시키는 단계(제4단계); 및 상기 복합체가 형성된 대상물에 용출 완충액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계(제5단계)를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 화학식 1 및 화학식 2의 화합물의 혼합물을 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법에 관한 것으로서, 상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물을 이용해서 미생물 농축이 가능한 기술을 제공한다.
또한 본 발명에 의하는 경우 농축된 미생물에서 바로 핵산 추출할 수 있는 방법으로 활용될 수 있다. 특히 미생물 농축과 핵산 추출 기술을 하나의 튜브(tube) 또는 칩(chip)에서 가능하게 함으로써, 외부로 오는 오염이나, 비용, 시간, 복잡성 등을 확연히 줄어들게 할 수 있다.
도 1은 본 발명을 이용한 Thin film sample (박막시료) 분석의 개략적 모식도를 나타낸 도면이다.(MIX: 화합물 A 및 화합물 B의 혼합물)
도 2는 박막 장치의 구성을 나타낸 분해도이다.
도 3은 화합물에 따른 DNA 추출 효율을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명을 이용한 병원균 농축과 동시에 핵산 추출 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
본 발명은 화학식 1의 화합물; 화학식 2의 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축용 조성물에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000012
[화학식 2]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000013
여기서,
R1 내지 R4 는 서로 동일하거나, 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로시클로알킬기 및 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되고,
X1 및 X2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 O 또는 S이고,
상기 치환기는 서로 독립적으로, 할로겐, 시아노기, 히드록실기, 치올기, 옥소, 니트로기, C1-C3 알킬기, C1-C3 알콕시기, C3-C6 시클로알킬기, 및 C3-C6 헤테로시클로알킬기 중 선택되는 것이다.
본 발명은 화학식 1 및 화학식 2의 화합물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미생물 농축용 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000014
[화학식 2]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000015
여기서,
R1 내지 R4는 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로시클로알킬기 및 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되고,
X1 및 X2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 O 또는 S이고,
상기 치환기는 서로 독립적으로, 할로겐, 시아노기, 히드록실기, 치올기, 옥소, 니트로기, C1-C3 알킬기, C1-C3 알콕시기, C3-C6 시클로알킬기, 및 C3-C6 헤테로시클로알킬기 중 선택되는 것이다.
일 구체예에서, 화학식 1 및 화학식 2의 상기 R1은 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로시클로알킬기 및 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되고, R2 내지 R4는 서로 동일하거나 상이하며, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기일 수 있다.
상기 할로겐기는 F, Cl, Br, 또는 I일 수 있다.
상기 알킬기는 직쇄 또는 분지쇄 일 수 있고, 구체적인 예로는 메틸, 에틸, 프로필, n-프로필, 이소프로필, 부틸, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, sec-부틸, 1-메틸부틸, 1-에틸부틸, 펜틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, t-펜틸, 헥실, n-헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 헵틸, n-헵틸, 1-메틸헥실, 시클로펜틸메틸, 시클로헥실메틸, 옥틸, n-옥틸, t-옥틸, 1-메틸헵틸, 2-에틸헥실, 2-프로필펜틸, n-노닐, 2,2-디메틸헵틸, 1-에틸프로필, 1,1-디메틸프로필, 이소헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 시클로알킬기는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 3-메틸시클로펜틸, 2,3-디메틸시클로펜틸, 시클로헥실, 3-메틸시클로헥실, 4-메틸시클로헥실, 2,3-디메틸시클로헥실, 3,4,5-트리메틸시클로헥실, 4-t-부틸시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 헤테로시클로알킬기는 O, S, Se, N, P 또는 Si 등의 헤테로 원자를 포함하는 것으로서, 단환 또는 다환인 것으로 포함한다.
상기 아릴기는 단환 또는 다환의 탄소수 6 내지 10의 불포화 방향족 고리화합물을 의미하고, 예를 들어, 페닐, 나프틸, 톨릴, 크실린 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 화학식 1의 화합물은 하기의 화학식 3으로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000016
.
상기 화학식 2의 화합물은 하기의 화학식 4로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 4]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000017
.
상기 미생물은 박테리아, 바이러스 또는 세포 등 음전하를 띄는 모든 미생물일 수 있다.
상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물은 혼합물로서 사용될 수 있다. 두 화합물의 비율은 예를 들어, 화학식 2에 대한 화학식 1의 중량비(화학식 1 : 화학식 2)로 0.1 내지 10:1, 0.5 내지 5:1, 또는 0.8 내지 2:1일 수 있다. 상기 화합물은 단일 물질인 경우에 비해 혼합물인 경우에 현저히 우수한 미생물 농축 효과 및 핵산 추출능을 나타내고, 상기 비율을 초과하는 경우 단일 물질에 가까워져 다시 효율이 감소할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 미생물 농축 키트를 제공한다. 상기 키트에는 효과적인 미생물 농축에 필요한 pH 조절 등을 위한 완충액 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계); 및 상기 개질된 대상물 상에 미생물이 함유된 시료와 상기 미생물 농축용 조성물을 접촉시키는 단계(제2단계)를 포함하는 미생물 농축 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 대상물은 표면에 실란 화합물로 개질된 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 실란 화합물은 하기 화학식 5로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000018
상기 식에서, R5 내지 R7은 각각 같거나 다를 수 있으며, C1-C4 알킬 또는 C1-C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R8은 아미노(C1-C10)알킬, 3-(2-아미노(C1-C4)알킬아미노)(C1-C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1-C4)알킬아미노)(C1-C4)알킬아미노](C1-C4)알킬 중 어느 하나이다.
보다 바람직하게는 상기 실란 화합물은 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES), (3-아미노프로필)트리메톡시실란((3-aminopropyl)trimethoxysilane), (1-아미노메틸)트리에톡시실란((1-aminomethyl)triethoxysilane), (2-아미노에틸)트리에톡시실란((2-aminoethyl)triethoxysilane), (4-아미노부틸)트리에톡시실란((4-aminobutyl)triethoxysilane), (5-아미노펜틸)트리에톡시실란((5-aminopentyl)triethoxysilane), (6-아미노헥실)트리에톡시실란((6-aminohexyl)triethoxysilane), 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane; APDMS), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine), [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란([3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane; AEAPTMS) 또는 3-[(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(3-[(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine; TMPTA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 더 바람직하게는 상기 실란 화합물은 본 발명의 실시예에서 기재한 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES) 또는 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(APDMS)이 가장 적합하다.
바람직하게는, 상기 미생물이 함유된 시료는 미생물에 감염된 것으로 의심되는 객체의 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액 및 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 핵산 추출용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 핵산 추출 키트를 제공한다. 상기 키트에는 시료 내 세포를 용해시켜 세포 내부로부터 핵산을 방출시키기 위한, 용해 완충액(lysis buffer) 또는 프로테아제(protease) 등이 추가로 포함될 수 있으며, 효과적인 핵산 추출에 필요한 pH 조절 등을 위한 완충액 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계); 상기 개질된 대상물 상에 핵산 시료와 상기 핵산 추출용 조성물을 주입하고 핵산과 상기 조성물 내의 화학식 1 및 화학식 2의 화합물 간의 복합체를 형성시키는 단계(제2단계); 및 상기 복합체가 형성된 대상물에 용출 완충액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계(제3단계)를 포함하는 핵산 추출방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 대상물은 표면에 실란 화합물로 개질된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 실란 화합물은 하기 화학식 5로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000019
상기 식에서, R5 내지 R7은 각각 같거나 다를 수 있으며, C1-C4 알킬 또는 C1-C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R8은 아미노(C1-C10)알킬, 3-(2-아미노(C1-C4)알킬아미노)(C1-C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1-C4)알킬아미노)(C1-C4)알킬아미노](C1-C4)알킬 중 어느 하나이다.
보다 더 바람직하게는 상기 실란 화합물은 본 발명의 실시예에서 기재한 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES) 또는 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(APDMS)이 가장 적합하다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 동시에 미생물 농축 및 핵산 추출하기 위한 조성물을 제공한다.
바람직하게는 상기 미생물은 박테리아, 바이러스 또는 세포 등 음전하를 띄는 모든 미생물일 수 있다.
바람직하게는, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출 키트를 제공한다. 상기 키트에는 효과적인 미생물 농축 및 핵산 추출에 필요한 pH 조절 등을 위한 완충액 등이 추가적으로 포함될 수 있으며, 시료 내 세포를 용해시켜 세포 내부로부터 핵산을 방출시키기 위한, 용해 완충액(lysis buffer) 또는 프로테아제(protease) 등이 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계); 상기 개질된 대상물 상에 미생물이 함유된 시료와 상기 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물을 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계(제2단계); 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 분리하는 단계(제3단계); 상기 분리된 핵산과 화학식 1 및 화학식 2의 화합물 간의 복합체를 형성시키는 단계(제4단계); 및 상기 복합체가 형성된 대상물에 용출 완충액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계(제5단계)를 포함하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 대상물은 표면에 실란 화합물로 개질된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 실란 화합물은 하기 화학식 5로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2021008541-appb-img-000020
상기 식에서, R5 내지 R7은 각각 같거나 다를 수 있으며, C1-C4 알킬 또는 C1-C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R8은 아미노(C1-C10)알킬, 3-(2-아미노(C1-C4)알킬아미노)(C1-C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1-C4)알킬아미노)(C1-C4)알킬아미노](C1-C4)알킬 중 어느 하나이다.
보다 더 바람직하게는 상기 실란 화합물은 본 발명의 실시예에서 기재한 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES) 또는 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(APDMS)이 가장 적합하다.
바람직하게는, 상기 미생물이 함유된 시료는 미생물에 감염된 것으로 의심되는 객체의 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액 및 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "대상물"은 박막장치, 자성 비드(magnetic bead), 링 공진기(ring resonator) 또는 나노입자(nanoparticle) 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 상기 대상물은 본 발명의 실시예서 기재한 입구홀과 출구홀이 각각 관통 형성된 상부박막; 상기 상부박막으로부터 이격 배치된 하부박막; 그 입구단 및 출구단이 상기 상부박막의 입구홀 및 출구홀에 각각 대응하여 연통하는 마이크로 채널이 내측에 패턴 형성되고, 상기 마이크로 채널의 입구부와 연통하는 주입로가 상기 입구단에 인접하도록 형성되며, 상기 상부박막과 하부박막 사이에 배치되는 마이크로 채널챔버; 및 상기 상부박막 및 하부박막의 각 측부를 밀봉하여 상기 마이크로 채널챔버를 밀봉시키는 밀봉수단을 포함하는 박막장치일 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 핵산 분석은 박막 장치 내에서 본 발명의 조성물의 유효성분인 화합물을 이용한 박막 분석으로서, 시료 용출/배양, 세척 및 용출의 세 단계를 포함하고 있으며, 원심분리하지 않고 수행한다. 예를 들어, 실란 화합물로서 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)을 통해 박막 장치를 개질하고, 이러한 개질로 인하여 소수성인 박막 장치를 친수성으로 전환시킨다.
상기 개질된 박막 장치 상에 핵산시료, 및 용출 완충액과 본 발명의 조성물을 주입한다. 상기 핵산의 아미노기와 화학식 1 및 화학식 2의 화합물 구조 내 이-기능성 아민 반응기와의 상호작용에 의해 핵산과 상기 화합물 사이에 가교 반응이 일어나고, 이를 이용하여 핵산과 상기 화합물 간의 복합체를 형성시키고 시료에서 DNA를 추출할 수 있다.
본 발명의 조성물 내 유효성분인 화합물은 이-기능성 이미도에스터(imidoesters) 및 이황화(disulfide) 또는 에터(ehter) 결합을 포함하고 있기 때문에, 가역적인 가교 구조를 형성할 수 있으므로, 세포, 단백질 및 핵산의 아미노 반응성 가교제로 사용될 수 있다.
[시험예 1: 핵산과의 결합력 시험]
1. 박막 장치 제작
레이저 컷팅 기기(Universal Laser Systems, Scottsdale, USA)를 이용하여 본 발명의 박막 장치를 제작하였다[도 2 참조]. 먼저, 상기 박막 장치는 상부 박막과 하부 박막, 그리고 상부 박막과 하부 박막 사이에 삽입된 마이크로 유체 챔버로 구성되며, 상기 마이크로 유체 챔버는 핵산 공급원으로부터 DNA를 추출하기 위해 챔버 내의 유로에 의해 서로 연결된 다수의 슬롯-형 마이크로 웰로 이루어져 있다.
상기 마이크로 유체 챔버를 제작하기 위해, 300 ㎛ 두께의 양면테이프(100 ㎛ 두께의 양면테이프 사이에 끼워진 100 ㎛ 두께의 폴리에스터 막)에 마이크로 유체 챔버 디자인을 레이저 컷팅 기기로 절단하여 마이크로 유체 챔버를 제작하였다. 박막(상부 및 하부)은 레이저 컷팅 기기를 이용하여 마이크로 유체 챔버와 동일한 치수로 절단하였다.
상기 상부 박막에 관통 구멍인 입구(inlet)와 출구(outlet)를 제작하였다. 레이저 컷팅 마이크로 유체 챔버의 상부 및 하부의 표면에 영구 접착제를 이용하여 각각 레이저 컷팅 박막(상부 및 하부)을 접착시켰다. 상기 마이크로 유체 챔버의 높이는 약 300 ㎛이며, 총 부피는 300 ㎕이었다(300 ㎕ 양, 8.4 cm × 3.7 cm).
핵산 공급원을 주입하기 위한 튜빙 어댑터는 3 mm 두께를 갖는 캐스트 아크릴 시트(MARGA CIPTA, Indonesia)를 양면테이프 한쪽 면에 부착하였고, 레이저 컷팅 기기로 절단 및 천공하여 제조하였다. 상기 제조된 튜빙 어댑터는 마이크로 유체 챔버의 유입구와 배출구에 각각 부착하였다. 이 후 미리 절단된 타이곤 튜빙(AAC02548; Cole-Parmer, Vernon Hills, USA)을 어댑터의 구멍에 위치시킨 후 에폭시를 사용하여 밀봉하였다.
이렇게 제작된 박막 장치는 다양한 용량의 핵산 시료들(100 ㎕, 300 ㎕, 및 500 ㎕)을 처리할 수 있는 장점이 있다.
2. 박막 장치 전처리
상기 박막 장치를 이용한 DNA 분석을 위하여, 박막 장치 내부를 10분 동안 산소 플라즈마로 처리한 후 상기 플라즈마 처리된 박막 장치를 65℃에서 10 내지 60분 동안 2% 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)을 함유한 수용액에 침지시킨 후 탈이온수로 완전히 세정하였다. 세정 후, 박막 장치를 경화(cure)시키기 위해, 상기 세정된 박막 장치를 신속하게 질소 기류 하에서 건조시켜 박막 장치를 아민으로 개질하였다.
Drop Shape Analyzer(DSA100, KRUSS, Germany)을 이용한 아민-개질된 박막 장치의 물 접촉각 측정을 통해 온도 및 배양시간에 따라 박막 장치의 친수성이 상당히 변화하였음을 알 수 있었다. 65 ℃에서 10분 동안 상기 박막 장치를 APTES로 실란화(silanization)한 후, 상기 박막 표면 친수성은 증가하였다(약 30 내지 40℃).
3. 체액으로부터 박막 시료 분석
본 발명에서는 앞서 제작된 박막 장치에 본 발명의 조성물을 적용하여 핵산과의 결합력을 시험하였다.
즉, 앞서 아민으로 개질된 박막 장치(300 ㎕ 양, 8.4 cm × 3.7 cm)를 이용하여 DNA를 추출하기 위해 먼저 최적화된 분석 용액을 준비하였다. 상기 최적화된 분석 용액은 100 mM 트리스-염산 (pH 8.0)을 함유하는 용출 완충액, 10 mM의 EDTA, 1% SDS, 10%의 트리톤 X-100을 하기의 표 1의 T1 내지 T3가 같은 농도가 되도록 혼합하여 준비한 후, 핵산 분석 시료로서 혈액 또는 소변 유래 각 시료 100 ㎕를 상기 분석 용액 200 ㎕와 혼합하였다. 상기 혼합물은 게놈성 DNA를 추출하기 위해 단백질 분해효소인 프로테이나제K를 처리하였다.
한편, 상기 화학식 3로 표시되는 화합물(하기에서 화합물 A), 상기 화학식 4로 표시되는 화합물(하기에서 화합물 B)에 대한 합성을 의뢰하여 입수하였다.
(mg/㎖) 화합물 A 화합물 B
T 1 50 50
T 2 100 0
T 3 0 100
상기 혼합된 핵산 분석 시료와 분석 용액이 혼합된 혼합액을 아민으로 개질된 박막 장치의 상부 기판 입구로 유입시키고, 마이크로 유체 챔버 내로 상기 혼합액이 이동하면서 상기 화합물의 2개의 아민기와 DNA가 결합하며 또한 박막 장치 내 개질된 아민기와 DNA가 결합하여 복합체를 형성하여 DNA를 분리할 수 있었다. 이때, 박막 장치는 핵산 분석 시료로부터 DNA를 충분히 추출하기 위하여 20분 동안 항온(56℃)을 유지한 배양기 또는 컨트롤러(Alpha Omega Instruments)를 포함한 열전냉각기(thermoelectric cooler; TEC) 중 어느 하나에 놓아 두었다.
생성된 복합체 외에 이물질을 제거하기 위해 PBS 완충액으로 세척한 후, 용출 완충액(10 mM의 중탄산나트륨, pH 10.6)을 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 양과 순도를 측정한 후 Enspire Multimode Plate Reader(PerkinElmer)를 이용하여 260 nm (DNA) 및 280 nm (단백질)에서의 시료의 광학 밀도 비율을 결정하였다. 종래 DNA 추출법과 본 발명의 조성물을 이용한 분석 결과를 비교하기 위해, 알려진 방법(Qiagen, Hilden, Germany)에 따라 QIAamp DNA mini kit를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 도 3과 같이, 혈액 및 소변에서 모두 성공적으로 핵산이 추출되었고, 그 중 T1의 경우 단일 화합물을 이용한 T2 및 T3에 비해 현저히 DNA 추출 효율이 높음을 확인하였다.
[시험예 2: 진핵세로포부터의 DNA 추출 시험]
5% CO2 분위기, 37 ℃ 습한 배양기에서 10 % 태아우아혈청(fetal calf serum; 이하 'FCS')을 보충한 고 글루코오스 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium; DMEM, DMEM Life Technology)의 플라스틱 배양 플레이트에서 두개의 진핵 세포인 HCT116 및 MCF를 각각 배양한 후, 시험예 1과 동일한 방법으로 분석 용액을 준비하여 진핵세로포부터 DNA를 추출하였다. 그리고, 비교를 위하여, 대조군으로서 QIAamp DNA 미니 키트를 이용하여 진핵세포로부터 DNA를 추출하였다. 본 실시예에서 사용한 HCT116 및 MCF는 미국 ATCC(https://www.atcc.org)에서 구입하여 사용하였다.
DNA의 양과 순도를 확인하기 위해 End-point PCR 및 실시간 PCR(real time-PCR)을 수행하였다. 일부 유전자(Actin)의 정방향 및 역방향 프라이머를 약 24 염기쌍의 정상 길이로 합성하였다. End-point PCR은 15분 동안 95℃에서 초기 변성 단계; 95℃에서 45초, 59℃에서 45초(Actin), 및 72℃에서 45초를 1사이클로하여 총 45 사이클; 및 72℃, 10분 동안 최종 연장 단계로 이루어져 있다. 5 내지 10 ㎕의 DNA를 1 × PCR 완충액(Qiagen), 2.5 mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.25 mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphate), 25 pmol의 각 프라이머, 및 Taq DNA 중합효소 1 유닛을 포함하는 총 부피 25 ㎕에서 증폭하였다.
실시간 PCR(real time-PCR) 분석을 위해, 다음 단계가 LightCycler 2.0(로슈 다이어그노스틱스)에서 제공된 방법을 하기와 같이 변형하였다. 5 내지 10 ㎕의 DNA를 4 ㎕의 LightCycler FastStart DNA Master 믹스, 25 pmol의 각 프라이머, 1 × PCR 완충액 2 ㎕(큐아젠, 힐덴, 독일), 2.5 mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.25 mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphate), 및 증류수를 포함하는 총 부피 20 ㎕에서 증폭하였다. 95℃에서 10분 동안 처음 예비 처리한 후 95℃에서 10초, 59℃에서 30초(Actin), 및 72℃에서 10초를 1사이클로하여 총 50 사이클을 수행하고, 30초 동안 40℃에서 냉각 단계를 거쳤다. SYBR 녹색 신호를 가진 증폭된 생성물은 LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics)에서 수행하였다.
그 결과, 하기의 표 2와 같이 진핵세포에서도 성공적으로 핵산이 추출되었고, 추출된 핵산을 정량하여 비교한 결과, T1의 경우 단일 화합물을 이용한 T2 및 T3에 비해 현저히 DNA 추출 효율이 높음을 확인하였다.
(ng/㎕) 대조군 T1 T2 T3
HCT116 90.2 153.0 110.2 50.8
MCF7 59.5 180.5 155.8 90.3
[시험예 3: 박테리아 세포로부터의 DNA 추출 시험]
박테리아 세포에서도 DNA 추출 효율을 확인하였다.
최적화 반응을 위해, 100 mM 트리스-염산 (pH 8.0)을 함유하는 용출 완충액, 10mM의 EDTA, 1%의 SDS, 10%의 트리톤 X-100 및 리소자임 20 mg/㎖을 T1과 혼합하였다. 유효성을 검증하기 위해 일반적인 PCR을 수행하였다. 대장균(E. coli) XL1 블루 균주(한국미생물자원센터로부터 구입; https://kctc.kribb.re.kr)를 50 ㎍/㎖의 테트라사이클린(tetracycline)과 Luria-Bertani(LB) 배지에 접종하고, 쉐이킹 상태(shaking condition)로 37℃에서 하루 동안 배양하였고, 103∼107의 콜로니 형성 단위(colony forming unit; CFU)의 시료를 시험을 위해 사용하였다. 본 시험에 사용하기 위해 배양시킨 대장균(Escherichia coli), 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 고르도니에(Mycobacterium gordonae) 및 살모넬라 균주(Salmonella Strains), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 살모넬라 뉴폴트(Salmonella Newport), 살모넬라 세인트폴(Salmonella Saintpaul)) 및 브루셀라 오비스(Brucella Ovis)에서 박테리아 DNA를 추출하였다. 본 시험예에서 사용한 균주는 한국미생물자원센터(https://kctc.kribb.re.kr)로부터 구입하여 사용하였고, 모든 프라이머는 각 균주에서의 상용 프라이머를 사용하였다. 본 실시예에서 사용한 해당 균주의 상용 프라이머는 미국 IDT(https://www.idtdna.com)에서 구입하여 사용하였다.
박테리아 유전자의 유전학적 분석을 위해, 시험예 1과 같은 박막 분석을 이용하여 추출된 DNA와 Qiagen kit를 이용하여 추출된 DNA 각각 2 ㎕를 시험예 2와 같이 PCR을 수행하여 추출된 핵산을 정량하였다.
그 결과, 표 3과 같이 브루셀라 오비스(Brucella Ovis)로부터 추출된 DNA로 PCR 분석을 수행한 결과에서 T1을 이용하는 박막 분석의 경우 Qiagen 제품보다 우수한 것을 확인할 수 있었다.
(ng/㎕) 대조군 T1 T2 T3
Brucella Ovi 유래 DNA 80.2 133.3 92.5 60.3
[시험예 4: RNA 추출능 확인]
시험예 1과 동일한 방법으로 RNA를 추출하였고, 이를 이용하여 cDNA 합성 후 18S rRNA의 증폭을 통해 시험예 2와 같이 합성된 DNA양을 정량하였다.
그 결과, 표 4와 같이 대조군(Q)과 유사한 수준으로 T1(1)에 의해 RNA 추출이 잘 되었음을 확인하였다. 그리고, RNA 추출과 cDNA 합성을 하나의 박막 장치 상에서 진행할 수 있었고, 추후 18S rRNA의 증폭을 통해 이러한 방법이 잘 개발된 것을 확인하였다.
(ng/㎕) 대조군 T1 T2 T3
cDNA 45.5 102.5 62.3 40.1
[시험예 5: 병원균(대장균) 농축 및 핵산 추출]
앞서 제작한 박막 장치를 65℃에서 1시간 동안 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(APDMS)로 표면 처리하였다. 병원균을 농축시키기 위해서, T1과 함께 병원균 시료를 1∼2 ㎖ 주입하였으며 100 ㎕/min의 유속으로 상온에서 농축시켰다. 농축된 시료는 100 ㎕에 현탁하였다. 본 실시예에서는 병원균 시료로 대장균(E. coli)을 사용하였다. 한편, Qiagen DNA Kit으로 DNA를 추출하여 비교하였다.
그 결과, 도 4와 같이 T1으로 균체의 농축을 진행하면, 기존 Qiagen 방법으로 농축 단계 없이 핵산 추출을 하는 경우보다 RT-PCR Ct 값이 절대값(absolute)에 근접하게 단축되는 것을 확인하였다.
[시험예 6: 병원균(PIV3-RNA 바이러스) 농축]
본 발명에 따른 방법의 병원균(바이러스) 검출 효율을 확인하기 위하여 PIV3-RNA 바이러스 감염이 의심되는 4개의 샘플에 대하여 기존에 널리 사용되는 방법인 Qiagen 키트와의 비교 실험을 수행하였다.
즉, 각 샘플을 1 ㎖씩 취하여 Qiagen 키트로 추출하여 PIV3-RNA 바이러스 검출을 테스트한 경우와 본 발명에 따라 DTBP로 농축하여 추출 후 PIV3-RNA 바이러스 검출을 테스트한 경우를 비교하였다.
그 결과, 1 ㎖의 시료에서 PIV3-RNA 바이러스를 농축했을 때, 기존의 방식은 음성이거나 밴드 세기가 약하게 나타나고, T1을 이용한 본 발명의 분석 방식의 경우 기존 방식으로는 음성이던 샘플도 양성으로 보이거나 양성이던 샘플은 밴드 세기(intensity)를 확연히 증가시킨 것을 확인할 수 있었다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.
본 발명은 미생물 농축 또는 핵산 추출용 조성물 및 이를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 미생물 또는 핵산과 복합체를 형성할 수 있는 화합물을 이용하여, 보다 효율적으로 미생물을 농축하거나 핵산을 추출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

Claims (7)

  1. 화학식 1 화합물; 화학식 2의 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021008541-appb-img-000021
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2021008541-appb-img-000022
    여기서,
    R1 내지 R4는 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로시클로알킬기 및 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    X1 및 X2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 O 또는 S이고,
    상기 치환기는 서로 독립적으로, 할로겐, 시아노기, 히드록실기, 치올기, 옥소, 니트로기, C1-C3 알킬기, C1-C3 알콕시기, C3-C6 시클로알킬기, 및 C3-C6 헤테로시클로알킬기 중 선택되는 것이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기의 화학식 3으로 표시되고,
    상기 화학식 2의 화합물은 하기의 화학식 4로 표시되는 화합물인 것인 미생물 농축
    용 조성물:
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2021008541-appb-img-000023
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2021008541-appb-img-000024
  3. 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계); 및
    상기 개질된 대상물 상에 미생물이 함유된 시료와 청구항 1의 조성물을 접촉
    시키는 단계(제2단계)를 포함하는 미생물 농축 방법.
  4. 화학식 1 화합물; 화학식 2의 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 핵산 추출용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021008541-appb-img-000025
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2021008541-appb-img-000026
    여기서,
    R1 내지 R4는 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로시클로알킬기 및 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    X1 및 X2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 O 또는 S이고,
    상기 치환기는 서로 독립적으로, 할로겐, 시아노기, 히드록실기, 치올기, 옥소, 니트로기, C1-C3 알킬기, C1-C3 알콕시기, C3-C6 시클로알킬기, 및 C3-C6 헤테로시클로알킬기 중 선택되는 것이다.
  5. 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계);
    상기 개질된 대상물 상에 핵산 시료와 청구항 11의 조성물을 주입하고 핵산과 화학식 1 및 화학식 2의 화합물 간의 복합체를 형성시키는 단계(제2단계); 및
    상기 복합체가 형성된 대상물에 용출 완충액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계(제3단계)를 포함하는 핵산 추출방법.
  6. 화학식 1 화합물; 화학식 2의 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021008541-appb-img-000027
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2021008541-appb-img-000028
    여기서,
    R1 내지 R4는 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로시클로알킬기 및 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    X1 및 X2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 O 또는 S이고,
    상기 치환기는 서로 독립적으로, 할로겐, 시아노기, 히드록실기, 치올기, 옥소, 니트로기, C1-C3 알킬기, C1-C3 알콕시기, C3-C6 시클로알킬기, 및 C3-C6 헤테로시클로알킬기 중 선택되는 것이다.
  7. 대상물에 아민기를 도입하여 개질하는 단계(제1단계);
    상기 개질된 대상물 상에 미생물이 함유된 시료와 제15항의 조성물을 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계(제2단계);
    상기 농축된 미생물로부터 핵산을 분리하는 단계(제3단계);
    상기 분리된 핵산과 상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물 간의 복합체를 형성시키는 단계(제4단계); 및
    상기 복합체가 형성된 대상물에 용출 완충액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계(제5단계)를 포함하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법.
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