WO2009093856A2 - 생물학적 의약품으로부터 마이코플라즈마를 검출하기 위한 ｐｃｒ 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 키트 - Google Patents

생물학적 의약품으로부터 마이코플라즈마를 검출하기 위한 ｐｃｒ 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 키트 Download PDF

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Suk Gil Song
Dong Wook Lee
Hye Ran Sung
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Nkbio Co., Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Definitions

  • the present invention relates to a PCR primer set for detecting mycoplasma, a kit for detecting mycoplasma including the same, and a method for detecting mycoplasma using the same.
  • Mycoplasma is a prokaryotes taxonomically belonging to the Mollicutes class and resides in various organs, such as the respiratory or genital organs of humans or animals, and causes serious diseases. To date, hundreds of species are known. .
  • Mycoplasma is resistant to antibiotics that inhibit cell wall synthesis, such as penicillin or streptomycin due to its lack of cell walls, and is not removed by filtration sterilization at a size of 0.15-0.8 ⁇ m and has a morphologically pleomorphic character. Microorganisms are difficult to observe using an optical microscope. In addition, mycoplasma infection is present in 30-50% of in vitro cultured cells and induces changes in cell metabolism, growth and survival, ultimately affecting the replication of infectious viruses as well as various biochemical and genetic characteristics. Known.
  • Efficient diagnostic methods that can rapidly and accurately detect contaminated mycoplasma during the manufacturing, storage and administration of advanced biologics such as cell therapy, gene therapy, stem cell therapy, and protein drug, which are being developed with the development of science and technology need.
  • Direct culture which is commonly used for the detection of mycoplasma, is susceptible to contamination of substrates and biomaterials in cell or tissue culture, and takes longer than two weeks to confirm the proliferation of mycoplasma, which has a slow growth rate. Due to the requirements, different cultures are required for different species. In addition, even if it is contaminated with mycoplasma, it is extremely difficult to confirm the growth of mycoplasma by direct culture because it does not induce cell morphology or color change of culture medium, and no symptoms may occur during infection.
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR polymerase chain reaction
  • mycoplasma particularly biologics such as cell therapy, gene therapy, stem cell therapy, and protein preparation.
  • An in-depth study was conducted on how to detect highly sensitive mycoplasmas.
  • a PCR primer specific for mycoplasma was developed, and the present invention was completed by experimentally confirming that mycoplasma can be detected quickly and accurately by using the PCR method using the same.
  • an object of the present invention is to provide a polymerase chain reaction primer set for detecting mycoplasma.
  • Another object of the present invention is to provide a mycoplasma detection method using a polymerase chain reaction.
  • Still another object of the present invention is to provide a polymerase chain reaction kit for detecting mycoplasma.
  • a mycoplasma detection method comprising the following steps: (a) extracting DNA from a sample; (b) at least one forward primer selected from the group of primers consisting of (i) the extracted sample DNA, (ii) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and 2, and (iii) SEQ ID NO: 3, Preparing a first polymerase chain reaction (PCR) solution comprising at least one reverse primer selected from a primer group consisting of a fourth sequence, a fifth sequence, and a nucleotide sequence of the sixth sequence; And (c) performing a first polymerase chain reaction.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the present inventors have a high sensitivity to mycoplasma, which may be contaminated during the manufacture, storage and administration of mycoplasma, especially biologics such as cell therapy, gene therapy, stem cell therapy, and protein preparation using polymerase chain reaction. In-depth research was conducted on how they can be detected. As a result, a PCR primer specific for mycoplasma was developed, and the present invention was completed by experimentally confirming that the mycoplasma can be detected quickly and accurately by using the PCR method using the same.
  • the detection method of the present invention can be applied to a sample that is expected to be contaminated with Mycoplasma.
  • Samples of the present invention may be, for example, cultured cells, proteins, or nucleic acids, or biological pharmaceuticals containing the same, such as brain, eye, heart, or intestine of animals or humans.
  • Mycoplasma detectable by the method of the present invention is known as Macoplasma asitidis ( M. arthritidis ) , Mycoplasma bovis ( M. bovis ) , Mycoplasma permentas ( M ) , which frequently cause mycoplasma infection during in vitro cell culture. fermentans ) , mycoplasma hyorhinis , mycoplasma neurolyticum , mycoplasma orail , mycoplasma pyrum , mycoplasma fullmonis.
  • Urogenital system such as M. pulmonis , M. salivarium , Acholeplasma laidlawii , and M.
  • mycoplasma genitalium M. genitalium
  • ureaplasma urealyticum Ureaplasma urealyticum
  • mycoplasma hominis Various mycoplasmas such as, but not limited to, mycoplasma hominis .
  • DNA extraction of the present invention may be made through various methods known in the art, and specific methods thereof are disclosed in Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), Documents are incorporated herein by reference.
  • PCR Polymerase chain reaction
  • primer refers to an oligonucleotide that is complementary to the 5 'and 3' terminal sequences adjacent to the target nucleic acid used in the polymerase chain reaction.
  • Primer primer for PCR specific to mycoplasma DNA contained in the first polymerase chain reaction solution of the present invention is (i) one or more omnidirectional selected from the primer group of the nucleotide sequence of the first sequence and the second sequence forward) and (ii) one or more reverse primers selected from the group of primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3, 4, 5, and 6, respectively.
  • the primer for the polymerase chain reaction of the present invention targets the internal transcribed spacer (ITS) region between species conserved 16S rDNA and 23S rDNA in the mycoplasma genome sequence, thereby targeting mycoplasma of various species. Can be detected.
  • ITS internal transcribed spacer
  • the primary polymerase chain reaction solution of the present invention contains the DNA extracted from the sample in step (a) as a template DNA of PCR.
  • the primary polymerase chain reaction solution of the present invention is a thermal stability obtained from DNA polymerase (e.g., Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus , Thermococcus literalis or Pyrococcus furiosus (Pfu) DNA polymerase), dNTP mixtures (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR buffers and DNA polymerase cofactors.
  • DNA polymerase e.g., Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus , Thermococcus literalis or Pyrococcus furiosus (Pfu) DNA polymerase
  • dNTP mixtures dATP, dCTP, dGTP, dTTP
  • PCR buffers e.g., PCR buffers and DNA polyme
  • the polymerase chain reaction solution of the present invention includes a primer set for internal control.
  • the internal control primer set is included to check a case where PCR is not normally performed due to PCR interference factors in a sample preparation process or a PCR process. That is, in the method of the present invention, if the polymerase chain reaction occurs normally, the specific gene region targeted by the internal control primer will be amplified, and if the polymerase chain reaction does not occur normally, the gene for the internal control primer is targeted. Since amplification will not occur, the normal polymerase chain reaction can be examined by confirming the amplification of the target gene region for internal control.
  • the internal control primer set of the present invention is a primer set for amplifying a part of the human glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (hGAPDH) gene.
  • the hGAPDH gene is a gene that is redundantly present in the human body and is very useful for determining whether the PCR reaction of the present invention has been performed normally.
  • the primer set for internal control of the present invention comprises (a) one or more forward primers selected from the group of primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 10 and 12, and (b) the sequence of SEQ ID NOs: 11 and 13 One or more reverse primers selected from the group of primers consisting of nucleotide sequences.
  • the polymerase chain reaction is performed by repeating a cycle including a denaturation step, an annealing step, and an elongation step.
  • cycle refers to the process of making one copy of a target nucleic acid. Temperature and time conditions in the denaturation, annealing and stretching steps may be appropriately selected by those skilled in the art and are not limited to specific ranges.
  • the polymerase chain reaction in the present invention is (i) a denaturation process for 25-35 seconds at 90-98 °C and (ii) 90-150 seconds at 60-70 °C 20-40 times of one cycle consisting of the annealing and elongation process.
  • the method of the present invention may further comprise a secondary polymerase chain reaction step for the first polymerase chain reaction product after step (c).
  • secondary polymerase chain reaction has the same meaning as “Nested PCR”, and the two terms are used interchangeably herein.
  • the second polymerase chain reaction using the first polymerase chain reaction product as a DNA template can significantly improve the sensitivity of mycoplasma detection compared to the case where only the first polymerase chain reaction is performed. have.
  • the secondary polymerase chain reaction solution of the present invention is (i) the first polymerase chain reaction product, (ii) the forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 sequence and ( iii) at least one reverse primer selected from the group of primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 8 and 9;
  • the primers included in the secondary polymerase chain reaction of the present invention are internal transcribed spacers between 16S rDNA and 23S rDNA which are species conserved in the mycoplasma genome, similar to the primers used in the primary polymerase chain reaction. Target the area.
  • the PCR reaction is carried out using the DNA product amplified in the first polymerase chain reaction as a template, it has a sequence capable of binding to the first amplified DNA product.
  • the secondary polymerase chain reaction solution of the present invention may include a primer set for internal control.
  • the internal control primers included in the secondary polymerase chain reaction solution are the same as those contained in the primary polymerase chain reaction solution, and (a) from the primer group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 10 and 12 One or more forward primers selected and (b) one or more reverse primers selected from the group of primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 11 and 13.
  • Secondary polymerase chain reaction solution of the present invention may include DNA polymerase, dNTP mixture (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR buffer, and DNA polymerase cofactor.
  • the method of the present invention can be subjected to a secondary polymerase chain reaction after the primary polymerase reaction. Since the second polymerase chain reaction and the reaction conditions thereof are the same as the first polymerase chain reaction, redundant description thereof is omitted to avoid excessive complexity of the specification.
  • the present invention is a sequence of the first sequence, the second sequence, the third sequence, the fourth sequence, the fifth sequence, the sixth sequence, the seventh sequence, the eighth sequence or the ninth sequence It provides a polymerase chain reaction (PCR) primer for detecting Mycoplasma represented by the nucleotide sequence.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the present invention provides an internal control of a polymerase chain reaction for detecting mycoplasma represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, 11, 12, or 13 It provides a PCR primer for control).
  • the present invention provides a mycoplasma polymerase chain reaction (PCR) kit (Kit) for detecting mycoplasma, comprising the following primer sets: (a) SEQ ID NO: 1st and 2nd One or more forward primers selected from the group of primers consisting of nucleotide sequences of sequences; And (b) a primer group consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, 4, 5, and 6, respectively.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the PCR kit of the present invention further comprises the following primer set: (a) an omnidirectional primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7; And (b) one or more reverse primers selected from the group of primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 8 and ninth.
  • the mycoplasma detection PCR kit of the present invention further includes a primer set for internal control.
  • the mycoplasma detection PCR kit of the present invention further comprises a primer set for internal control: (a) bases of SEQ ID NOs 10 and 12 At least one forward primer selected from the group of primers consisting of sequences, and (b) at least one reverse primer selected from the group of primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 11 and 13.
  • mycoplasma detection PCR kit of the present invention (c) dNTP mixture (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); (d) DNA polymerase; And (e) a buffer solution.
  • the polymerase chain reaction method using the primer for PCR of the present invention it is possible to detect mycoplasma of various species quickly, accurately and with high sensitivity. According to the present invention, it is possible to detect not only mycoplasma which is frequently contaminated in in vitro culture, but also mycoplasma which is known to cause infection, and in particular, preparation of cell therapy, gene therapy, stem cell therapy, protein preparation, injection, vaccine, etc. It can be used as a detection method that can replace the mycoplasma negative test required in the step.
  • FIG. 1 is a method for diagnosing the contamination of mycoplasma using nucleic acid amplification of two steps, a primary PCR and a secondary PCR using a Mycoplasma specific primer set according to the present invention.
  • Figure 2 is a target region of 16S rDNA gene and 23S rDNA gene, the target region of the mycoplasma detection primer set of the present invention and the primers of the first to ninth sequence sequence sequence (MP-F, MP-R, MN- It is a figure which shows the position to which F and MN-R) couple
  • FIG. 14 shows a comparison of the similarity between a portion of 14S of 16S rDNA genes, a portion of 23S rDNA genes, and a sequence of ITS regions between 16S rDNA and 23S rDNA genes.
  • Figure 4 is a multi-sequence alignment program Clustal of the ITS region between the 16S rDNA and 23S rDNA genes of 14 mycoplasma genes in order to design a reverse primer for mycoplasma nucleic acid amplification of the present invention
  • FIG. 5 is a sequence listing sequences prepared for determining the suitability of a part of a nucleotide sequence of a human glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (hGAPDH) gene and a PCR reaction as target genes for internal control. It is a figure which shows the position which the primer of 13 sequence binds.
  • hGAPDH human glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • Figure 6 is a view showing the results of the detection test for 14 kinds of mycoplasma by secondary PCR (nested PCR) reaction using the primer set of the present invention.
  • distilled water (1) -negative control group, immune cell culture solution (2) -negative, Acreplasma Ride Lowi ( Acholeplasma laidlawii (3), macoplasma asitidis ( M. arthritidis )(4), Mycoplasma Vorbis ( M. bovis (5), Mycoplasma permanents M. fermentans (6), Mycoplasma Zenitarium ( M. genitalium (7), Mycoplasma Hominis M. hominis )(8), Mycoplasma Hiorhinis M.
  • hyorhinis (9), Mycoplasma Neurotiqum M. neurolyticum (10), Mycoplasma Orail ( M. orale (11), M. pirum 12, M.pneumoniae (13), M. pulmonis 14, M. salivarium 15, U. urealyticum (16).
  • mycoplasma pneumoniae infecting the respiratory system of the human body and causing pneumonia ( M. pneumonia )
  • Mycoplasma zenitarium causes non-coccal urethritis in men M. genitalium ) And ureaplasma ureaticum Ureaplasma urealyticum )
  • mycoplasma hominis associated with female genital diseases such as cervix, fallopian tubes, and ovaries.
  • M. hominis And one kind of plasma plasma plasma ( Acholeplasma ( A. laidlawii Primer sets were designed to specifically detect multiple mycoplasma species, including)) simultaneously.
  • Prokaryote rDNA sequences such as mycoplasma are very well preserved.
  • the nucleotide sequence eg, the ITS region between the 16S rDNA and the 23S rDNA gene
  • the length of the spacer region of the rDNA operon varies from species to species. Some of these spacer regions vary among species, even among mycoplasmas, while others are highly conserved.
  • the ITS region between 16S rDNA and 23S rDNA gene was selected as the target of the PCR reaction (see FIG. 2).
  • Each primer having a base sequence complementary to the base sequence selected as described above is shown in Table 2 below.
  • MP-F primer consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and 2 and MN-F primer consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 7 bind to the nucleotide sequence encoding the 16S rDNA gene in the mycoplasma gene. (Refer FIG. 2, FIG. 3).
  • the MP-R primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 to 6 and the MN-R primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and 9 of the base sequence is the base sequence encoding the 23S rDNA gene (See FIGS. 2 and 4).
  • PCR reaction using the primer set of the present invention specifically amplifies the ITS region between the 16S rDNA and 23S rDNA genes of 14 mycoplasmas.
  • hGAPDH human glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • the IC-P primer set was used for the primary PCR (primary PCR) reaction and the IC-N primer set was used for the secondary PCR (Nested PCR) reaction.
  • 5 shows a sequence portion to which primers of SEQ ID NO: 10, 11, 12, and 13 sequences are combined.
  • Centrifuge the cell culture or sample to be tested for detection of mycoplasma at 250 g for 3 minutes, take a supernatant, place in a new microtube, heat at 95 ° C for 5 minutes, and gently centrifuge to obtain primary PCR. Used as template in the reaction. The extracted DNA was stored at -20 ° C until use.
  • the primary PCR reaction was performed with 25 ⁇ l of total reactant. To reduce the error between the PCR reaction samples, the PCR reaction was performed by mixing all the reactants except the DNA extract to be used as a template. Was performed.
  • a h-Taq polymerase suitable for a multiplex PCR reaction is used, which minimizes the formation of primer dimers so as to optimize the detection of mycoplasma of multiple species.
  • 2X premix Solgent, SG6400 was used.
  • PCR was performed under the same conditions as the analytical sample with distilled water as a template in addition to the sample to be analyzed for each PCR reaction.
  • the master mixture was completed by calculating [(sample count + 2) X (amount of reactant required per sample)] for each of the five reactants above and mixing in one tube.
  • each 0.2 ml PCR tube 2 ⁇ l each of the negative control distilled water, the positive control solution and the DNA extract of the prepared sample were added, and 23 ⁇ l of the master mixture was added to each tube and mixed.
  • the primary PCR (primary PCR) reaction mixture prepared as above was repeated at 95 ° C. for 15 minutes using the Applied Byosystems, GeneAmp PCR system 9700 instrument for 15 minutes ⁇ [95 ° C., 30 seconds ⁇ 65 ° C., 2 minutes] 35 times After 5 minutes, the first PCR was performed.
  • the total amount of the reactants was performed in 25 ⁇ l.
  • the master mixture was mixed with all remaining reactants except the primary PCR reaction product to be used as a template. ) To perform the PCR reaction.
  • the master mixture for the secondary PCR (Nested PCR) reaction was prepared as follows. The amount of each reactant required per sample (based on 25 ⁇ l PCR reaction) is shown in Table 5.
  • the master mixture was completed by calculating [(sample count) X (amount of reactant required per sample)] for each of the five reactants above and mixing in one tube.
  • 0.5 ⁇ l of the first PCR reaction product was added to the bottom of each 0.2 ml PCR tube, and 24.5 ⁇ l of the master mixture was added to each tube and mixed.
  • mycoplasmas were banded between about 263 bp and 469 bp. However, in the case of Acholeplasma laidlawii , two bands of 469 bp or 259 bp can be identified (see Table 6 and FIG. 6).
  • sample used in the reaction is a cell derived from a human body or a culture medium thereof, and the secondary PCR (nested PCR) reaction for the detection of mycoplasma was successfully performed, 163 bp band will appear in all the reactants except the negative control distilled water.
  • PCR primer set for detecting mycoplasma from a biological drug according to the present invention and a kit for detecting mycoplasma comprising the same is a polymerase chain reaction primer set for detecting mycoplasma using a PCR primer specific for mycoplasma, a polymerase chain
  • a method for detecting mycoplasma using a reaction and a polymerase chain reaction kit for detecting mycoplasma it can be used to detect quickly, accurately and with high sensitivity without directly culturing mycoplasma of various species. have.

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Abstract

본 발명은 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응(PCR) 프라이머 세트, 이를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 키트 및 이를 이용한 마이코플라즈마 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 마이코플라즈마를 검출하기 위한 서열목록 제1서열 내지 제13서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 제공한다. 본 발명의 방법에 의하면, 폐나 생식기 등 인체 감염증을 유발하는 마이코플라즈마 뿐만 아니라 세포배양이나 생물의약품의 제조, 보관, 투여, 체외조작 및 배양에서 빈번하게 오염되는 마이코플라즈마를 직접 배양 방법에 의하지 않고 신속하고 정확하게 고민감도로 검출할 수 있다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정]　생물학적 의약품으로부터 마이코플라즈마를 검출하기 위한 ＰＣＲ 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 키트
본 발명은 마이코플라즈마 검출용 PCR 프라이머 세트, 이를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 키트 및 이를 이용한 마이코플라즈마 검출 방법에 관한 것이다.
마이코플라즈마(Mycoplasma)는 분류학적으로 Mollicutes class 에 속하는 원핵세균(prokaryotes)이며, 인간 또는 동물의 호흡기나 생식기 등의 각종 장기에 상주하며 심각한 질병을 일으키고, 현재까지 수백여 종(species)이 알려져 있다.
마이코플라즈마는 세포벽이 없어 페니실린이나 스트렙토마이신과 같은 세포벽합성을 저해하는 항생물질에 내성이 있고 크기가 0.15-0.8 ㎛ 정도로 여과멸균에 의하여 제거되지 않으며, 형태학적으로도 다형적(pleomorphic) 특성이 있어 광학현미경을 이용한 관찰이 어려운 미생물이다. 또한 체외 배양세포의 30-50％에서 마이코플라즈마의 감염이 존재하며 세포의 대사, 성장 및 생존율에 변화를 유도하여 궁극적으로 다양한 생화학적, 유전학적 특성변이는 물론 감염 바이러스의 복제에도 영향을 주는 것으로 알려져 있다.
과학기술의 발전에 따라 개발이 증가하고 있는 세포치료제, 유전자치료제, 줄기세포치료제, 단백질제제 등 첨단생물의약품의 제조, 보관 및 투여과정에서 오염되는 마이코플라즈마를 신속, 정확하게 검출할 수 있는 효율적인 진단법이 필요하다.
마이코플라즈마의 검출을 위해 통상적으로 사용되고 있는 직접배양법은 세포나 조직 배양시 기질이나 생체재료에 오염이 쉽게 되며 그 성장속도가 느린 마이코플라즈마의 증식을 확인하기 위해서는 2주이상의 긴 시간이 걸리고, 까다로운 영양요구성 때문에 종(species)에 따라 서로 다른 배양기법을 필요로 한다. 또한, 마이코플라즈마에 오염이 되었어도 세포의 형태변이나 배양용 배지의 색깔 변이를 유도하지 않고, 감염시 아무런 증상이 나타나지 않을 수 있으므로 직접배양법으로 마이코플라즈마의 증식을 확인하는 것은 극히 어렵다.
이에 최근 도입되는 마이코플라즈마 검출방법 중에서 가장 선호되는 방법은 유전물질인 핵산을 증폭하는 중합효소연쇄반응 (PCR; polymerase chain reaction)이다. PCR은 생체 내에 존재하는 적은 양의 DNA를 분리하여 주형으로 사용하고 표적 DNA 서열의 양 말단에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 프라이머 세트로 이용하여 표적 DNA 단편만을 짧은 시간 안에 수십만 배 이상 증폭시키는 기법이다. 이러한 PCR을 이용한 유전자 증폭방법을 이용하면 인체에 감염되어 있는 마이코플라즈마 또는 세포 혹은 조직의 체외 조작과 배양 과정중에서 고빈도로 오염되는 마이코플라즈마를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 중합효소연쇄반응 (PCR; polymerase chain reaction)을 이용하여 마이코플라즈마 (Mycoplasma), 특히 세포치료제, 유전자치료제, 줄기세포치료제, 단백질제제 등의 생물의약품의 제조, 보관 및 투여과정에서 오염될 수 있는 마이코플라즈마를 고감도로 검출할 수 있는 방법에 대해 심도 있는 연구를 행하였다. 그 결과 마이코플라즈마에 특이적인 PCR 용 프라이머를 개발하였고, 이를 사용한 PCR 방법을 이용하면 마이코플라즈마를 신속하고 정확하게 검출할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응 프라이머 세트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 중합효소연쇄반응을 이용한 마이코플라즈마 검출 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응 키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출 방법을 제공한다: (a) 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) (i) 상기 추출된 시료 DNA, (ii) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머, 및 (iii) 서열목록 제3서열, 제4서열, 제5서열 및 제6서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 1차 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)액을 제조하는 단계; 및 (c) 1차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계.
본 발명자들은 중합효소연쇄반응을 이용하여 마이코플라즈마(Mycoplasma), 특히 세포치료제, 유전자치료제, 줄기세포치료제, 단백질제제 등의 생물의약품의 제조, 보관 및 투여과정에서 오염될 수 있는 마이코플라즈마를 고감도로 검출할 수 있는 방법에 대해 심도 있는 연구를 행하였다. 그 결과 마이코플라즈마에 특이적인 PCR용 프라이머를 개발하였고, 이를 사용한 PCR 방법을 이용하면 마이코플라즈마를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다는 것을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명의 방법을 단계별로 나누어 설명한다.
(a) 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계
본 발명의 검출방법은 마이코플라즈마(Mycoplasma)가 오염되었을 것으로 예상되는 시료(sample)에 적용할 수 있다. 본 발명의 시료는 예를 들어 배양된 세포(cultured cell), 단백질, 또는 핵산, 또는 이를 포함하는 생물학적 의약제, 동물 또는 인간의 뇌(brain), 눈(eye), 심장(heart), 장(intestine), 신장(kidney), 간(liver), 허파(lung), 근육(muscle), 비장(spleen), 또는 정소(testis)로부터 얻은 조직(tissue), 혈액(blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 뇨액(urine), 타액(saliva), 땀(sweat), 정액(semen) 또는 점액(mucus) 등의 체액(body fluid)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 검출 가능한 마이코플라즈마는 체외 세포배양 시에 빈번하게 마이코플라즈마 감염을 일으키는 마아코플라즈마 아스리티디스(M. arthritidis), 마이코플라즈마 보비스(M. bovis), 마이코플라즈마 퍼멘타스(M. fermentans), 마이코플라즈마 히오르히니스(M. hyorhinis), 마이코플라즈마 뉴로리티쿰(M. neurolyticum), 마이코플라즈마 오레일(M. orale), 마이코플라즈마 피룸(M. pirum), 마이코플라즈마 풀모니스(M. pulmonis), 마이코플라즈마 살리바리움(M. salivarium), 아코레플라즈마 라이드로우이(Acholeplasma laidlawii) 및 인체 감염 시 폐렴을 일으키는 마이코플라즈마 뉴모니아(M. pneumonia), 비임균성 요도염과 같은 비뇨생식기계 질환을 유발하는 마이코플라즈마 제니탈리움(M. genitalium), 우레아플라즈마 우레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 마이코플라즈마 호미니스(M. hominis)와 같은 다양한 마이코플라즈마를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 DNA 추출은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있고, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
(b) 1차 중합효소연쇄반응액을 제조하는 단계
중합효소연쇄반응(PCR)은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 중합효소연쇄반응에서 이용되는 타깃 핵산에 인접해 있는 5'말단 서열 및 3'말단 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 본 발명의 명세서에서 용어 "전방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 중합효소연쇄반응에 의해 증폭되는 유전자의 일정 부위의 3'말단 및 5'말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.
본 발명의 1차 중합효소연쇄반응액에 포함되는 마이코플라즈마 DNA에 특이적인 PCR용 프라이머 세트는 (i) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 염기서열의 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향(forward) 프라이머와, (ii) 서열목록 제3서열, 제4서열, 제5서열 및 제6서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향(reverse) 프라이머로 이루어진다.
본 발명의 중합효소연쇄반응용 프라이머는 마이코플라즈마 게놈서열중에서 종(species) 보존적인 16S rDNA와 23S rDNA 사이의 ITS (internal transcribed spacer) 영역을 표적으로 하였기 때문에 다양한 종(species)의 마이코플라즈마를 특이적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 1차 중합효소연쇄반응액은 상기 단계 (a)에서 시료로부터 추출한 DNA를 PCR의 주형 DNA로서 포함한다.
또한, 본 발명의 1차 중합효소연쇄반응액은 DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 중합효소연쇄반응액에는 내부 컨트롤(internal control)용 프라이머 세트를 포함한다. 상기 내부 컨트롤용 프라이머 세트는 시료 준비 과정이나 PCR 과정에서 PCR 방해 요인들에 의해 PCR이 정상적으로 행해지지 않은 경우를 점검하기 위해 포함한다. 즉, 본 발명의 방법에서 중합효소연쇄반응이 정상적으로 일어났다면 상기 내부 컨트롤용 프라이머가 표적으로 하는 특정 유전자 부위가 증폭될 것이고, 중합효소연쇄반응이 정상적으로 일어나지 않았다면 내부 컨트롤용 프라이머가 표적으로 하는 유전자의 증폭도 발생하지 않을 것이므로, 정상적인 중합효소연쇄반응 여부는 내부 컨트롤용 프라이머 표적 유전자 부위의 증폭여부를 확인하면 검사할 수 있다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 내부 컨트롤용 프라이머 세트는 인간 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(human glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, hGAPDH) 유전자 일부를 증폭시키는 프라이머 세트이다. 상기 hGAPDH 유전자는 인체에 중복적(redundant)으로 존재하는 유전자로서 본 발명의 PCR 반응이 정상적으로 행해졌는지를 판별하는데 매우 유용하게 사용된다.
본 발명의 내부 컨트롤용 프라이머 세트는 (a) 서열목록 제10서열 및 제12서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머 및 (b) 서열목록 제11서열 및 제13서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향프라이머를 포함한다.
(c) 1차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계
본 발명에서 중합효소연쇄반응은 변성(denaturation) 단계, 어닐링(annealing) 단계 및 신장(elongation) 단계를 포함하는 사이클이 수회 반복되어 행해진다. 본 발명에서 용어 "사이클" 표적 핵산의 1 카피 (copy)를 생성하는 과정을 의미한다. 상기 변성, 어닐링 및 신장 단계에서의 온도 및 시간 조건은 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으며 특정의 범위로 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 상기 중합효소연쇄반응은 (i) 90-98℃에서 25-35초간의 변성(denaturation) 과정 및 (ii) 60-70℃에서 90-150초간의 어닐링(annealing) 및 신장(elongation) 과정으로 이루어지는 1 사이클을 20-40회 반복 수행하는 단계를 포함한다.
(d) 2차 중합효소연쇄반응액을 제조하는 단계
본 발명의 방법은 상기 단계 (c) 이후에 1차 중합효소연쇄반응 생성물에 대한 2차 중합효소연쇄반응 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명에서 "2차 중합효소연쇄반응"은 "네스티드 PCR (Nested PCR)"과 동일한 의미이며, 본 명세서에서는 이 두가지 용어를 혼용한다.
본 발명의 방법에서 1차 중합효소연쇄반응 생성물을 DNA 주형(template)으로 사용하여 2차 중합효소연쇄반응을 행함으로써 1차 중합효소연쇄반응만을 행한 경우에 비해 마이코플라즈마 검출 민감도를 현저히 향상시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 2차 중합효소연쇄반응액은 (i) 상기 1차 중합효소연쇄반응 생성물, (ii) 서열목록 제7서열의 염기서열로 이루어지는 전방향 프라이머 및 (iii) 서열목록 제8서열 및 제9서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함한다.
본 발명의 2차 중합효소연쇄반응에 포함되는 프라이머는 1차 중합효소연쇄반응에 사용되는 프라이머와 마찬가지로, 마이코플라즈마 게놈서열중에서 종(species) 보존적인 16S rDNA와 23S rDNA 사이의 ITS (internal transcribed spacer) 영역을 표적으로 한다. 또한, 1차 중합효소연쇄반응에서 증폭된 DNA 생성물을 주형으로 사용하여 PCR 반응을 행하므로, 1차 증폭된 DNA 생성물에 결합할 수 있는 서열을 갖는다.
본 발명의 2차 중합효소연쇄반응액에는 내부 컨트롤(internal control)용 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 2차 중합효소연쇄반응액에 포함되는 내부 컨트롤용 프라이머는 상기 1차 중합효소연쇄반응액에 포함된 것과 동일한 것으로서, (a) 서열목록 제10서열 및 제12서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머 및 (b) 서열목록 제11서열 및 제13서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향프라이머를 포함한다.
본 발명의 2차 중합효소연쇄반응액에는 DNA 중합효소, dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액, 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다.
본 발명의 2차 중합효소연쇄반응액에 포함되는 상기 성분들은 1차 중합효소연쇄반응액에 포함되는 성분들과 동일하므로, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 이들에 대한 내용은 중복하여 설명하지 않는다.
(e) 2차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계
본 발명의 방법은 1차 중합효소반응후에 이어서 2차 중합효소연쇄반응을 행할 수 있다. 2차 중합효소연쇄반응 및 이의 반응 조건은 1차 중합효소연쇄반응과 동일하므로, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 이에 대한 중복 설명은 생략한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열, 제2서열, 제3서열, 제4서열, 제5서열, 제6서열, 제7서열, 제8서열 또는 제9서열의 염기서열로 표시되는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 검출용 중합효소연쇄반응(PCR) 프라이머를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제10서열, 제11서열, 제12서열 또는 제13서열의 염기서열로 표시되는 마이코플라즈마를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 내부 컨트롤(internal control)용 PCR 프라이머를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 프라이머 세트를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응(PCR) 키트(Kit)를 제공한다: (a) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머; 및 (b) 서열목록 제3서열, 제4서열, 제5서열 및 제6서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 PCR 키트는 다음의 프라이머 세트를 더욱 포함한다: (a) 서열목록 제7서열의 염기서열로 이루어지는 전방향 프라이머; 및 (b) 서열목록 제8서열 및 제9서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 마이코플라즈마 검출용 PCR 키트는 내부 컨트롤(internal control)용 프라이머 세트를 더욱 포함한다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 마이코플라즈마 검출용 PCR 키트는 다음의 내부 컨트롤(internal control)용 프라이머 세트를 더욱 포함한다: (a) 서열목록 제10서열 및 제12서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머, 및 (b) 서열목록 제11서열 및 제13서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 마이코플라즈마 검출용 PCR 키트는 (c) dNTP 혼합물 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); (d) DNA 중합효소; 및 (e) 완충(buffer)용액을 더욱 포함한다.
본 발명의 PCR용 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응 방법에 의하면 다양한 종(species)의 마이코플라즈마를 신속하고 정확하며 고민감도로 검출할 수 있다. 본 발명에 의하면 체외 배양에 있어 빈번히 오염되는 마이코플라즈마 뿐만 아니라 감염증을 유발하는 것으로 알려져 있는 마이코플라즈마까지 검출이 가능하고, 특히 세포치료제, 유전자 치료제, 줄기세포치료제, 단백질제제, 주사제, 백신 등의 제조단계에서 필수적으로 요구하는 마이코플라즈마 부정 시험을 대체할 수 있는 검출 방법으로 이용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 마이코플라즈마(Mycoplasma) 특이적 프라이머 세트를 이용한 1차 PCR(Primary PCR)과 2차 PCR(Nested PCR) 두 단계의 핵산증폭법을 사용하여 마이코플라즈마의 오염여부를 진단하는 방법에 대한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 마이코플라즈마 검출용 프라이머 세트의 표적 영역인 16S rDNA 유전자와 23S rDNA 유전자 사이의 ITS 영역 및 서열목록 제 1 서열 내지 제 9 서열의 프라이머(MP-F, MP-R, MN-F, MN-R)가 결합되는 위치를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 마이코플라즈마 핵산증폭을 위한 전방향(forward) 프라이머를 설계하기 위하여 다중 서열정렬 프로그램인 Clustal W (http:// www.ccbb.re.kr/clustalW.php)를 이용하여 마이코플라즈마 14종의 16S rDNA 유전자 염기서열 일부와 23S rDNA 유전자 염기서열 일부 그리고 16S rDNA와 23S rDNA 유전자 사이의 ITS 영역의 염기서열의 유사성을 비교 분석한 도면이다.
도 4는 본 발명의 마이코플라즈마 핵산증폭을 위한 역방향(reverse)프라이머를 설계하기 위하여 마이코플라즈마 14종의 16S rDNA와 23S rDNA 유전자 사이의 ITS 영역과 23S rDNA 유전자 염기서열 일부를 다중 서열정렬 프로그램인 Clustal W (http://www.ccbb.re.kr/clustalW.php)를 이용하여 염기서열의 유사성을 분석한 도면이다.
도 5는 내부 컨트롤(internal control)의 표적유전자로 선정한 인간 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(hGAPDH) 유전자의 염기서열 일부 및 PCR 반응의 적합성여부를 판단하기 위해 제작한 서열목록 제10서열 내지 제13서열의 프라이머가 결합하는 위치를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 2차 PCR(nested PCR) 반응으로 14종의 마이코플라즈마에 대한 검출시험을 한 결과를 보여주는 도면이다. 도면에서 증류수(1)-음성대조군, 면역세포 배양액(2)-음성, 아코레플라즈마 라이드로우이(Acholeplasma laidlawii)(3), 마아코플라즈마 아스리티디스(M. arthritidis)(4), 마이코플라즈마 보비스(M. bovis)(5), 마이코플라즈마 퍼멘타스(M. fermentans)(6), 마이코플라즈마 제니탈리움(M. genitalium)(7), 마이코플라즈마 호미니스(M. hominis)(8), 마이코플라즈마 히오르히니스(M. hyorhinis)(9), 마이코플라즈마 뉴로리티쿰(M. neurolyticum)(10), 마이코플라즈마 오레일(M. orale)(11), M. pirum(12), M.pneumoniae(13), M. pulmonis(14), M. salivarium(15), U. urealyticum(16)이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 마이코플라즈마 검출용 프라이머의 설계
본 실시예에서는 인체의 호흡기에 감염되어 폐렴을 일으키는 마이코플라즈마 뉴모니아(M. pneumonia), 남성에게 비임균성 요도염을 유발하는 마이코플라즈마 제니탈리움(M. genitalium)과 우레아플라즈마 우레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum) 및 여성의 자궁경부나 난관, 난소 등 여성 생식기 질병과 연관이 있는 마이코플라즈마 호미니스(M. hominis)와 1종의 아코레플라즈마(Acholeplasma (A. laidlawii))를 포함한 다수의 마이코플라즈마 종(species)을 동시에 특이적으로 검출할 수 있도록 프라이머 세트를 설계하였다.
마이코플라즈마와 같은 원핵생물(prokaryote)의 rDNA 염기서열이 매우 잘 보존되어 있다. 이에 반하여, 이러한 rDNA 오페론(operon)의 간격(spacer) 영역의 염기서열 (ex. 16S rDNA와 23S rDNA 유전자 사이의 ITS 영역) 및 그 길이는 종(species)마다 차이가 있다. 이 간격(spacer) 영역 중 어떤 부분은 마이코플라즈마 사이에도 종(species)에 따라 변이가 있으며, 또 다른 부분은 매우 보존적(conserved)이다. 따라서, 16S rDNA와 23S rDNA 유전자 사이의 ITS 영역을 PCR 반응의 표적으로 선택하였다(도 2 참조).
1994년 Julie D. Thompson 등에 의해 개발된 다중 서열 정렬 프로그램인 Clustal W (http://www.ccbb.re.kr/clustalW.php)를 이용하여 14종의 마이코플라즈마의 16S rDNA 유전자 염기서열 일부와 23S rDNA 유전자 염기서열 일부 그리고 16S rDNA와 23S rDNA 유전자 사이의 ITS 영역의 염기서열의 유사성을 비교 분석하였다. 이 결과로부터 14종 마이코플라즈마에 공통적인 염기서열 부분을 선택하였다(도 3, 4 참조).
이 때 14종 마이코플라즈마의 염기서열이 공통적인 부분이지만 일부 염기가 100％ 일치하지 않은 경우, 다종의 마이코플라즈마와 결합될 수 있도록 일치되지 않는 일부 염기를 혼합염기(mixed base)로 대체하여 설계하였다(표 1 참조).
표 1 혼합 염기(mixed base) 구성
혼합염기 뉴클레오타이드
Y C 또는 T
W A 또는 T
R A 또는 G
상기와 같이 선택된 염기서열에 상보적인 염기서열을 가진 각 프라이머는 아래 표 2에 나타내었다.
표 2 마이코플라즈마 검출용 프라이머 세트
프라이머세트 명칭 서열번호 염기서열 (5'→3') 길이(mer)
MP-F OK 1089 1 ACACCA TGGGAG YTGGTA AT 20
OK 1094 2 AAAGTG GGCAAT ACCCAA CGC 21
MP-R OK 1110 3 GAGTTA GTTCCG TCCTTC ATCGCC T 25
OK 1111 4 CTTCAT CGCCTA TTAGTG CCAAGG C 25
OK 1112 5 CTTCAT CGCCTT TTAGTG CCAAGG C 25
OK 1090 6 CTTCWT CGACTT YCAGAC CCAAGG CAT 27
MN-F OK 1104 7 AAGGTA YCCCTA CGAGAA CGTGGG G 25
MN-R OK 1114 8 GACCCA AGGCAT CCACCA WAWACY CTT 27
OK 1119 9 CGCCTT TTRGTG CCAAGG CATCCA C 25
서열목록 제1서열 및 제2서열의 염기서열로 구성되는 MP-F 프라이머 및 서열목록 제7서열의 염기서열로 구성되는 MN-F 프라이머는 마이코플라즈마 유전자 중 16S rDNA 유전자를 암호화 하는 염기서열에 결합한다(도 2, 도 3 참조).
또한, 서열목록 제3서열 내지 제6서열의 염기서열로 구성되는 MP-R 프라이머 및 서열목록 제8서열 및 제9서열의 염기서열로 구성되는 MN-R 프라이머는 23S rDNA 유전자를 암호화하는 염기서열에 결합한다(도 2 및 도 4 참조).
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 행하면 14 종 마이코플라즈마의 16S rDNA와 23S rDNA 유전자 사이의 ITS 영역이 특이적으로 증폭된다.
실시예 2 : hGAPDH 유전자 증폭용 프라이머의 설계
마이코플라즈마 검출을 위해 행하는 PCR 반응이 정상적으로 수행되어졌는지 여부를 판정하기 위해, 인체에 중복적(redundant)으로 존재하는 인간 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소 (human glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, hGAPDH) 유전자를 내부 컨트롤(Internal control) 프라이머의 표적으로 설정하였다.
NCBI 사이트의 GenBank 데이터베이스를 검색하여 얻은 hGAPDH 유전자의 염기서열(GenBank accession number M17851)을 분석하고, 내부 컨트롤(internal control)로 사용하여도 마이코플라즈마 유래 산물과 혼동되지 않도록 마이코플라즈마 검출용 프라이머 세트에 의해 증폭되는 마이코플라즈마의 PCR 산물 크기를 고려하여 특이적으로 hGAPDH 유전자를 증폭 할 수 있도록 hGAPDH 유전자 염기서열의 540bp 내지 780bp 영역을 표적으로 하는 프라이머 세트를 고안하였다.
위와 같은 조건을 충족하는 hGAPDH 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트는 아래 표 3에 나타내었다.
표 3 hGAPDH 유전자 증폭용 프라이머 세트
프라이머 세트 명칭 서열번호 염기서열(5'→3') 길이(mer) PCR 산물(bp)
IC-P OK 1124 10 CTCATG ACCACA GTCCAT GCCATC 24 210
OK 1125 11 CACCAC TGACAC GTTGGC AGTGG 23
IC-N OK 1126 12 ACTGCC ACCCAG AAGACT GTGGAT 24 163
OK 1127 13 GGACAC GGAAGG CCATGC CAGT 22
IC-P 프라이머 세트는 1차 PCR(Primary PCR) 반응에 사용하고 IC-N 프라미어 세트는 2차 PCR (Nested PCR)반응시에 사용하였다. 도 5에 서열목록 제10서열, 제11서열, 제12서열 및 제13서열의 프라이머가 결합되는 서열부위를 나타내었다.
실시예 3 : 마이코플라즈마 DNA 추출
마이코플라즈마 검출을 위해 시험하고자 하는 세포배양액 또는 시료를 250g에서 3 분간 원심분리하여 상층액을 취한 후, 새 마이크로 튜브에 넣고 95℃에서 5분간 가열하고, 살짝 원심분리하여 1차 PCR (Primary PCR) 반응에 주형으로 사용하였다. 추출한 DNA는 사용 전까지는 -20℃ 에서 보관하였다.
실시예 4 : 1차 PCR (Primary PCR) 수행
1차 PCR(Primary PCR) 반응은 총 반응물의 양을 25㎕로 수행하였으며, PCR 반응 샘플간의 오차를 줄이기 위하여 주형으로 사용할 DNA 추출물을 제외한 나머지 반응물을 모두 섞어 마스터 혼합물 (master mix)을 만들어서 PCR 반응을 수행하였다.
본 발명의 PCR 반응에는, 다종(species)의 마이코플라즈마 검출을 최적화할 수 있도록 프라이머 다이머(dimer)의 형성을 최소화시킨, 멀티플렉스(multiplex) PCR 반응에 적합한 h-Taq 중합효소(polymerase)를 사용한 2X premix (Solgent, SG6400)를 사용하였다.
PCR 반응 결과의 분석 및 판별이 용이하도록, 매 PCR 반응 시마다 분석하고자 하는 시료 외에 음성대조군으로서 증류수를 주형으로 하여 분석시료와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.
1차 PCR(Primary PCR) 반응을 위한 마스터 혼합물을 제조하였다. 1시료 당 필요한 각 반응물의 양(25㎕ PCR 반응물 기준)은 표 4와 같다.
표 4
성분 양
MP-F 프라이머(서열목록 제1서열, 제2서열) 1㎕
MP-R 프라이머(서열목록 제3서열 내지 제6서열) 1㎕
IC-P 프라이머(서열목록 제10서열 및 제11서열) 1㎕
2X multiplex PCR premix (dNTP mix, h-Taq DNA polymerase, h-Taq buffer, loading dye) (Solgent, SG6400) 12.5㎕
증류수 7.5㎕
위의 5가지 반응물 각각에 대하여 [(시료개수 + 2) X (1 시료 당 필요한 반응물의 양)]으로 계산하고 하나의 튜브에서 혼합하여 마스터 혼합물을 완성했다.
각각의 0.2 ㎖ PCR 튜브 바닥에 음성대조군인 증류수, 양성대조군(positive control) 용액 및 준비한 시료의 DNA 추출물 각각을 2 ㎕씩 넣고, 각 튜브에 완성한 상기의 마스터 혼합물 23 ㎕씩을 첨가하여 혼합하였다.
상기와 같이 준비된 1차 PCR (primary PCR) 반응 혼합물은 Applied Byosystems, GeneAmp PCR system 9700 기기를 사용하여 95℃, 15분 → [95℃, 30초 → 65℃, 2분] 35회 반복 → 72℃, 5분 반응시켜 1차 PCR을 수행하였다.
실시예 5 : 2차 PCR (Nested PCR) 수행
2차 PCR (Nested PCR) 반응은 총 반응물의 양을 25 ㎕로 수행하였으며, 1차 PCR (Primary PCR) 반응과 마찬가지로 주형으로 사용할 1차 PCR 반응산물을 제외한 나머지 반응물을 모두 섞어 마스터 혼합물(master mix)을 만들어서 PCR 반응을 수행하였다.
2차 PCR (Nested PCR) 반응을 위한 마스터 혼합물을 다음과 같이 제조하였다. 1시료 당 필요한 각 반응물의 양(25㎕ PCR 반응물 기준)은 표 5와 같았다.
표 5
성분 양
MN-F 프라이머(서열목록 제7서열) 1㎕
MN-R 프라이머(서열목록 제8서열 및 제9서열) 1㎕
IC-N 프라이머 세트(서열목록 제12서열 및 제13서열) 1㎕
2X multiplex PCR premix (dNTP mix, h-Taq DNA polymerase, h-Taq buffer, loading dye) (Solgent, SG6400) 12.5㎕
증류수 9㎕
위의 5가지 반응물 각각에 대하여 [(시료개수) X (1 시료 당 필요한 반응물의 양)]으로 계산하고 하나의 튜브에서 혼합하여 마스터 혼합물을 완성했다. 각각의 0.2 ㎖ PCR 튜브 바닥에 1차 PCR 반응산물을 0.5 ㎕씩 넣고, 각 튜브에 완성한 상기의 마스터 혼합물 24.5 ㎕씩을 첨가하여 혼합한다.
상기와 같이 준비된 2차 PCR (Nested PCR) 반응 혼합물은 Applied Biosystems, GeneAmp PCR system 9700 기기를 사용하여 95℃, 15분 → [95℃, 30초 → 68℃, 2분] 35회 반복 → 72℃, 5분 반응시켜 2차 PCR (Nested PCR)을 수행하였다.
실시예 6 : PCR 산물 전기영동 확인
2차 PCR (Nested PCR) 반응을 종료한 각 반응액 10 ㎕을 2.5％ NuSieve:Seckem 아가로스 겔 상에 로딩하여 150V 전압으로 전기영동 하였다. 전기영동한 아가로스 겔을 EtBr로 염색한 후, UV 광선투사기(trans-illuminator)로 조사하여 PCR 산물의 밴드 유무와 그 크기를 확인하였다(표 6 참조).
[규칙 제26조에 의한 보정 25.02.2009]　
표 6
Figure WO-DOC-TABLE-6
14 종의 마이코플라즈마는 약 263bp 내지 469bp 사이에서 밴드가 확인되었다. 단, 아코레플라즈마 라이드로우이(Acholeplasma laidlawii)의 경우는 469bp 또는 259bp의 두 밴드가 확인될 수 있다(표 6, 도 6 참조).
실시예 7 : 마이코플라즈마 검출의 적합성 판정
반응에 사용한 시료가 인체에서 유래한 세포 또는 그 배양액이고 마이코플라즈마의 검출을 위한 2차 PCR(nested PCR) 반응이 성공적으로 수행되었다면 음성대조군인 증류수를 제외한 모든 반응물에서 163bp 밴드가 나타날 것이다.
본 발명의 마이코플라즈마 검출방법을 수행한 결과 도 6에서와 같이 163bp의 내부 컨트롤(internal control) 밴드와 약 250bp 내지 470bp 크기의 밴드가 동시에 확인되었고, 이 결과는 시료중에 마이코플라즈마가 오염된 것을 나타내는 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 생물학적 의약품으로부터 마이코플라즈마를 검출하기 위한 PCR 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 키트는 마이코플라즈마에 특이적인 PCR용 프라이머를 이용하는 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응 프라이머 세트, 중합효소연쇄반응을 이용한 마이코플라즈마 검출방법 및 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응 키트를 제공함으로써, 다양한 종(Species)의 마이코플라즈마를 직접 배양하는 방법에 의하지 않고도 신속하고 정확하며 고민감도로 검출하는 데에 사용할 수 있다.

Claims (12)

  1. 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 검출 방법:
    (a) 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) (i) 상기 추출된 시료 DNA, (ii) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머(forward primer), 및 (iii) 서열목록 제3서열, 제4서열, 제5서열 및 제6서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 1차 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)액을 제조하는 단계; 및
    (c) 1차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c) 이후에 다음의 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출 방법:
    (d) (i) 상기 1차 중합효소연쇄반응 생성물, (ii) 서열목록 제7서열의 염기서열로 이루어지는 전방향 프라이머, 및 (iii) 서열목록 제8서열 및 제9서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 2차 중합효소연쇄반응액을 제조하는 단계; 및
    (e) 2차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (b) 또는 단계 (d)의 중합효소연쇄반응액에 다음의 내부 컨트롤(internal control)용 프라이머 세트가 더욱 포함되는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출 방법:
    (a) 서열목록 제10서열 및 제12서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머 및 (b) 서열목록 제11서열 및 제13서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (c) 또는 단계 (e)의 중합효소연쇄반응은 (i) 90-98 ℃에서 25-35 초간의 변성 (denaturation) 과정 및 (ii) 60-70 ℃에서 90-150 초간의 어닐링 (annealing) 및 신장 (elongation) 과정을 20-40회 반복하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 마이코플라즈마는 마아코플라즈마 아스리티디스(M. arthritidis), 마이코플라즈마 보비스(M. bovis), 마이코플라즈마 퍼멘타스(M. fermentans), 마이코플라즈마 히오르히니스(M. hyorhinis), 마이코플라즈마 뉴로리티쿰(M. neurolyticum), 마이코플라즈마 오레일(M. orale), 마이코플라즈마 피룸(M. pirum), 마이코플라즈마 풀모니스(M. pulmonis), 마이코플라즈마 살리바리움(M. salivarium), 아코레플라즈마 라이드로우이(Acholeplasma laidlawii), 마이코플라즈마 뉴모니아(M. pneumonia), 마이코플라즈마 제니탈리움(M. genitalium), 우레아플라즈마 우레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 또는 마이코플라즈마 호미니스(M. hominis)인 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출방법.
  6. 서열목록 제1서열, 제2서열, 제3서열, 제4서열, 제5서열, 제6서열, 제7서열, 제8서열 또는 제9서열의 염기서열로 표시되는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 검출용 중합효소연쇄반응(PCR) 프라이머.
  7. 서열목록 제10서열, 제11서열, 제12서열 또는 제13서열의 염기서열로 표시되는 마이코플라즈마를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 내부 컨트롤(internal control)용 중합효소연쇄반응 프라이머.
  8. 다음의 프라이머 세트를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응(PCR) 키트(Kit).
    (a) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머; 및
    (b) 서열목록 제3서열, 제4서열, 제5서열 및 제6서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머.
  9. 제 8 항에 있어서, 다음의 프라이머 세트를 더욱 포함하는 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응 키트:
    (a) 서열목록 제7서열의 염기서열로 이루어지는 전방향 프라이머; 및
    (b) 서열목록 제8서열 및 제9서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 내부 컨트롤(internal control)용 프라이머 세트를 더욱 포함하는 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응 키트.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 내부 컨트롤용 프라이머 세트는 다음의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응 키트.
    (a) 서열목록 제10서열 및 제12서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머, 및
    (b) 서열목록 제11서열 및 제13서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머.
  12. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, (c) dNTP 혼합물 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); (d) DNA 중합효소; 및 (e) 완충(buffer)용액을 더욱 포함하는 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응 키트.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106701959A (zh) * 2017-01-13 2017-05-24 贵州大学 一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒及其使用方法
US10640834B2 (en) 2014-09-10 2020-05-05 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Method for detecting mycoplasma
CN111856006A (zh) * 2020-06-22 2020-10-30 华中农业大学 牛支原体分泌蛋白MbovP274的应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102051678B1 (ko) * 2013-07-24 2019-12-03 솔젠트 (주) 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 세포치료제 또는 생물학적 의약품에 오염되는 마이코플라즈마를 검출하는 방법 및 이 방법에 사용하기 위한 키트
KR101798176B1 (ko) * 2014-12-16 2017-11-15 주식회사 엠디헬스케어 세균 유래의 나노소포체를 이용한 세균성 감염질환 원인균 동정방법
KR20200123246A (ko) 2018-05-18 2020-10-28 재단법인 아산사회복지재단 미토콘드리아 dna를 내부 기준 시료로 사용하는 마이코플라즈마 검출 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5693467A (en) * 1995-05-19 1997-12-02 The American Type Culture Collection Mycoplasma polymerase chain reaction testing system using a set of mixed and single sequence primers
KR20050017826A (ko) * 2003-08-11 2005-02-23 국윤호 마이코플라즈마의 탐지 및 동정
WO2005040420A1 (en) * 2003-10-15 2005-05-06 Dkfz Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Öfffentlichen Rechts Rapid determination and quantification of mycoplasma contamination using dna chip technology

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5693467A (en) * 1995-05-19 1997-12-02 The American Type Culture Collection Mycoplasma polymerase chain reaction testing system using a set of mixed and single sequence primers
KR20050017826A (ko) * 2003-08-11 2005-02-23 국윤호 마이코플라즈마의 탐지 및 동정
WO2005040420A1 (en) * 2003-10-15 2005-05-06 Dkfz Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Öfffentlichen Rechts Rapid determination and quantification of mycoplasma contamination using dna chip technology

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
THE JOURNAL OF MICROBIOLOGY vol. 44, no. 1, 2006, pages 42 - 49 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10640834B2 (en) 2014-09-10 2020-05-05 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Method for detecting mycoplasma
CN106701959A (zh) * 2017-01-13 2017-05-24 贵州大学 一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒及其使用方法
CN111856006A (zh) * 2020-06-22 2020-10-30 华中农业大学 牛支原体分泌蛋白MbovP274的应用
CN111856006B (zh) * 2020-06-22 2021-07-30 华中农业大学 牛支原体分泌蛋白MbovP274的应用

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